四氟苄基衍生物及含有其成分的用于治疗和预防中枢神经系统的急慢性神经变性疾病的药物组合物

摘要

本发明涉及四氟苄基衍生物及含有其成分的用于治疗和预防中枢神经系统的急慢性神经变性疾病和眼科疾病的药物组合物。本发明的四氟苄基衍生物可有效地用于预防和治疗诸如帕金森症、亨廷顿症及阿耳茨海默氏症的慢性神经变性疾病，诸如癫痫的脑变性疾病和诸如中风的缺血性脑病。

说明书

                       技术领域

本发明涉及四氟苄基衍生物以及将其作为药物有效成分的药物组合物，更具体地，涉及一种对神经病学疾病和眼科疾病的治疗和预防具有医疗效果的新型四氟苄基衍生物。

                       背景技术

当代医学的进步延长了人类的生命，而由此导致老年急慢性神经性疾病的上升，例如阿耳茨海默氏症、中风、帕金森症等。这些神经性疾病以疾病进程中特定神经元变性的不断发展为特征。由于成熟神经元细胞在其死亡后不能再生，在上述神经性疾病中神经元的死亡可能导致大脑基本功能(包括识别、感觉和行动功能)的不能治愈的损伤以及由此产生的经济和社会的过重负担。

在各种神经性疾病中，兴奋毒性(exicitotoxicity)、氧化应激(oxidativestress)和细胞凋亡(apoptosis)被认为是神经元死亡的主要途径，并通过各途径特定的信号传导途径进行传播。

谷氨酸盐作为有兴奋性神经递质通过N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体介导缓慢兴奋突触传递和通过海人藻酸(kainate)或α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸(AMPA)受体介导快速兴奋突触传递。神经元在静息状态时，Mg²⁺以电位调控(voltage-dependent)方式阻塞NMDA受体通道。当刺激(物)引起膜去极化时，Mg²⁺从上述NMDA通道中被释放出来，使得该通道容许Ca²⁺和Na⁺通过。NMDA受体的活化作用在包括学习和记忆的生理过程中起着重要的作用[Siegel G.J.et al.，Basic Neurochemistry，6^thedition，Lippincott Williams&Wilkins，315-333(1999)]。除了生理作用，NMDA受体的短时过度活化作用能造成迅速发展的神经元死亡，而近20年来对NMDA受体介导的神经毒性的机理进行了广泛的研究。

在1969年，Olney等人报道口服monodium谷氨酸盐造成了小鼠和猴子大脑中神经元细胞的死亡[Olney，J.W.和Sharpe，L.G.，Science，166：386-388(1969)；Olney，J.W.和Ho，O.L.，Nature，227(258)：609-611(1970)]，表明谷氨酸盐(所述兴奋性神经递质)介导了癫痫中神经元的兴奋性和死亡[Olney，J.W.，Int.Rev.Neurobiol.，27：337-62：337-362(1985)]。通过NDMA受体的活化作用并依靠Ca²⁺的进入，谷氨酸盐的给药可导致培养的脑皮质神经元的死亡[Choi，D.W.，J.Neurosci.，7(2)369-379(1987)]。谷氨酸盐的神经毒性(或兴奋毒性)被认为是中风和癫痫中神经元死亡的主要途径[Choi.D.W.，Neuron，1：623-634(1988)]。大脑血液供应的中断导致氧和葡萄糖的缺乏，致使能量(ATP)不足、依赖ATP的离子通道的功能紊乱及增加谷氨酸盐释放的膜去极化作用。能量缺乏也降低了神经胶质细胞对谷氨酸盐的摄取。因此，谷氨酸盐在突触间隙中不正常地累积[Choi，D.W.and Rothman，S.M.，Annu.Rev.Neurosci.，13：171-182(1990)；Benveniste，H et al.，J.Neurochem.，43(5)：1369-1374(1984)]。过度累积的谷氨酸盐主要通过NMDA受体的活化作用导致神经元细胞的死亡。实际上，据报道给予NMDA受体拮抗剂可减少缺氧-缺血脑损伤后的神经元死亡[Goldberg，M.P.et al.，J.Pharmac.Exp.Ther.，243：784-791(1987)；Simon et al.，Science 226：850-852(1984)；Sheardown，M.J.et al.，Science 247：571-574(1990)]。

广泛的证据表明兴奋毒性还促成神经变性疾病中神经元的死亡。亨廷顿症(HD)的关键病理特征包括GABAergic神经元的变性和纹状体(striatal)区域的NADPH含心肌黄酶的神经元的选择性舍弃。在纹状体内注射NMDA或喹啉酸(NMDA受体激动剂)后观察到这些HD的病理特征[Ferrante，R.J et al.，Science，230(4625)：561-563(1985)；Beal，M.F.et al.，Nature，321(6066)：168-171(1986)；Koh，J.Y.et al.，Science，234(4772)：73-76(1986)]。肌萎缩性脊髓侧索硬化(ALS)伴随着上运动神经元和下运动神经元的变性，其特征为神经性萎缩、虚弱和肌束抽搐。尽管ALS的发病机理有待于解答，但人们推测兴奋毒性参与了ALS过程。尤其是ALS患者表现出谷氨酸盐的合成和运输的缺陷和细胞外谷氨酸盐水平的升高[Rothstein，J.D.，Clin.Neurosci.，3(6)：348-359(1995)；Shaw，P.J.andInce，P.G.，J.Neurol.，244 Suppl 2：S3-14(1997)]。

尽管NMDA受体介导的兴奋毒性是中风和神经变性疾病的成因，NDMA受体拮抗剂的治疗潜力受制于在大脑中的意料不到的副反应。尤其是NDMA受体拮抗剂的全身给药削弱了大脑的正常功能，并可造成成年大鼠大脑的大范围神经元损伤[Olney et al.，Science 244：1360-1362(1989)]。上述神经精神病理学副作用是由高亲和性的NMDA受体拮抗剂(如苯环己哌啶)和相关的NMDA受体拮抗剂(如MK-801(地佐环平(dizocilpine maltate)、替来他明(tiletamine)和克他命)产生的，且可通过给予具有低亲和性和快速动力学反应的通道阻断型NMDA受体拮抗剂来克服[Rogawski，Amino Acids 19：133-149(2000)]。

自由基介导神经性疾病及全身性组织损伤中发生的神经元死亡[Halliwell，B.and Gutteridge，J.M.，Mol.Aspects.Med.，8(2)：89-193(1985)；Siesjo，B.K.et al.，Cerebrovasc.Brain Metab.Rev.，1(3)：165-211(1989)；Schapira，A.H.，Curr.Opin.Neurol.，9(4)260-264(1996)]。自由基是在缺氧-缺血或外伤性大脑及脊髓损伤后在脑的变性区域产生的。清除自由基的抗氧化剂或操作(maneuvers)能够降低由缺氧-缺血或外伤性损伤造成的大脑损伤。[Flamm，E.s.et al.，Stroke，9(5)：445-447(1978)；Kogure，K.et al.，Prog.Brain Res.63：237-259(1985)；Chan，P.H.J.Neurotrauma.，9 Suppl 2：S417-423(1992)；Faden，Pharmacol.Toxicol.78：12-17(1996)]。广泛的证据表明自由基在神经变性疾病中大脑变性区域内产生自由基，其产生可能由于ALS中的Cu/Zn超氧化物歧化酶的点突变[Rosen et al.，Nature 362：59-62(1993)]，还原谷胱甘肽、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶的减少，帕金森症中塞梅林氏神经节(substatia nigra)中铁的增加[Sofic，E.et al.，J.Neural Transm.，74：199-205(1988)；Fahn，S.and Cohen，G.，Ann.Neurol.，32(6)：804-812(1992)]，脂质、核苷酸及蛋白的氧化，变性的神经组织中铁的增加，由患阿耳茨海默氏症大脑中的β-淀粉状蛋白产生的自由基[Schubert，D.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92(6)：1989-1993(1995)；Richardson，J.S.et al.，Ann.N.Y.Acad.Sci.777：362-367(1996)]，以及HD中线粒体的功能障碍[Dexter，D.T.et al.，Ann Neurol.32Suppl：S94-100(1992)]。因此，抗氧化剂对此类神经变性疾病具有神经保护作用[Jenner，Pathol.Biol.(Paris.)44：57-64(1996)；Beal，Ann.Neurol.38：357-366(1995)]。

锌(Zn²⁺)是一种过渡金属，其在大脑中大量存在并起到动力学作用。在细胞内部，锌与金属蛋白结合控制蛋白的酶活性和结构稳定性。此外，锌通过与各种转录因子结合来调节基因的表达。在CNS中，锌位于谷氨酸盐能性(glutamatergic)神经元的突触终端，以活性依赖的形式被释放，并调节各种神经递质受体及离子通道的活性。

在癫痫、缺血、外伤和阿耳茨海默氏症(AD)中观察到Zn²⁺介导神经变性过程。将海人藻酸(诱发癫痫的兴奋毒素)进行中枢给药，引起Zn²⁺迁移进入几个前脑区域的后突触变性神经元中。在缺血性和外伤性脑病中也发现锌迁移到邻近神经元中，对其迁移的阻塞可抑制神经元细胞的死亡[Frederickson，C.J.and Bush，A.I.，Biometals.14：353-366(2001)；Weiss et al.，Trend.Pharmacol.Sci.21：395-401(2001)]。已知锌通过Ca²⁺可透过的NMDA和AMPA/KA受体、电位开关的Ca²⁺通道或锌运输蛋白质进入神经元，并通过产生活性氧类物质的NADPH氧化酶的活化作用来诱导神经元的死亡。在AD的细胞外斑(extracellular plaque)和变性神经元中发现Zn²⁺，其很可能参与AD中神经元的变性[Suh et al.，Brain Res.852：274-278(2000)；Bush et al.，Science 265：1464-1467(1994)；Lee et al.，Proc.Natl.acad.Sci.U.S.A.99：7705-7710(2002)]。因此，已经提出将抑制锌的释放和毒性作为治疗和预防阿耳茨海默氏症的新策略[Fredrickson andBush，Biometals；14：353-66(2001)]。

如上所述，在神经系统的各种急性和神经变性疾病中，NMDA受体-介导的兴奋毒性、氧化应激和锌参与引起神经元的死亡。因此，需要发展阻断每种神经元死亡途径的有效治疗药物来治疗此类灾难性的神经性疾病。

我们曾研究并开发了对兴奋毒性或氧化应激具有多重神经保护效果的神经保护药物，并成功地发明了可用于治疗中风、外伤和某些神经变性疾病的四氟苄基衍生物。

                       发明公开

由本发明人进行的关于治疗中枢神经系统紊乱的研究形成了本发明，研究发现了对神经性疾病的细胞培养和生物模型中出现的各种形式的神经元死亡具有神经保护活性的新型四氟苄基衍生物。

因此，本发明的一个目的是提供一种新型四氟苄基衍生物。

本发明的另一目的是提供用于治疗和预防神经性疾病和眼科疾病的药物学上有效的组合物。

本发明的一个方面提供一种以如下化学式1表示的新型四氟苄基衍生物：

[化学式1]

其中，R₁、R₂和R₃为氢或卤素，

R₄为羟基、烷基、烷氧基、卤素、卤代烷氧基、烷酰氧基(alkanoyloxy)或硝基，及

R₅为羧酸、C₁-C₄烷基取代的羧酸酯、酰胺(carboxyamide)、磺酸、卤素或硝基。

本发明的另一个方面，提供了一种用于治疗和预防神经性疾病和眼科疾病的药物组合物，其包括所述的四氟苄基衍生物或其药物可接受的盐作为有效成分。

本发明提供一种以如下化学式1表示的新型四氟苄基衍生物或其药物可接受的盐。

[化学式1]

其中，R₁、R₂和R₃为氢或卤素，

R₄为羟基、烷基、烷氧基、卤素、卤代烷氧基、烷酰氧基或硝基，及

R₅为羧酸、C₁-C₄烷基取代的羧酸酯、酰胺、磺酸、卤素或硝基。

在本文中，烷基基团为C₁-C₄烷基，且优选为C₁-C₂烷基。上述烷基具体包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基或叔丁基。

烷氧基基团为C₁-C₄烷氧基，且优选为C₁-C₂烷氧基。上述烷氧基具体包括甲氧基、乙氧基或丙氧基。

卤素可以被氟、氯、溴或碘取代。

烷酰氧基是指C₂-C₁₀的烷酰氧基，优选为C₃-C₅的烷酰氧基。上述烷酰氧基具体包括乙酰氧基(ethanoyloxy)、丙酰氧基(propanoyloxy)或环己基碳酰氧基(cyclohexanecarbonyloxy)。

在羧酸酯中的碳可以被甲基、乙基、异丙基或丁基所取代的。

化学式1中所示的化合物中特别重要的化合物如下：

2-羟基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基-苄氨基)苯甲酸(在下文中用“2-羟基-TTBA”表示)，

2-硝基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸，

2-氯-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸，

2-溴-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸，

2-羟基-5-(2，3，5，6-四氟-4-甲基苄氨基)苯甲酸，

2-甲基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸，

2-甲氧基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸，

5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基-苄氨基)-2-三氟甲基苯甲酸，

2-硝基-4-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯酚，

2-氯-4-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯酚(在下文中用“2-氯-TTP”表示)，

2-羟基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酰胺(在下文中用“2-羟基-TTA”表示)，

2-羟基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯磺酸(在下文中用“2-羟基-TTS”表示)，

2-羟基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸甲酯，

2-乙酰氧基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸(在下文中用“2-乙基-TTBA”表示)，

2-丙酰氧基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸(在下文中用“2-丙基-TTBA”表示)，或

2-环己基碳酰氧基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸(在下文中用“2-环己基-TTBA”表示)。

但是，上述化合物仅是本发明的代表，本发明还可包括更多化合物。

本发明提供如化学式1所示的四氟苄基衍生物，及用于治疗和预防神经性疾病和眼科疾病的包括药物可接受的盐形式的上述有效成分的药物组合物。

作为用于医药用途的药物，化学式1所示的化合物的盐是无毒的，并且是药物可接受的。可以应用各种盐来制备药物可接受的盐，包括本发明的无毒化合物。

本发明化合物的药物可接受的盐包括碱金属(如锂、钠或钾)，和碱土金属(如钙或镁)。通过将药物可接受的无毒酸(如盐酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、乙酸、柠檬酸、酒石酸、碳酸或磷酸)的溶液与本发明的化合物反应制备酸加合盐。

本发明的化学式1化合物可以用于治疗脑血管和神经系统疾病和症状中的常规或病理性神经变性疾病。具体而言，上述化学式1所示的化合物用于预防和治疗血栓栓塞、缺血性中风、出血性中风、脑血管痉挛、脑老化、外伤性脑损伤、外伤性脊髓损伤、心搏停止、动脉低血压(hypotention)、低血糖症、缺氧症和组织缺氧。此外，本发明的化学式1化合物可有效地用于缓解神经变性疾病，如亨廷顿症、阿耳茨海默氏症、老年痴呆、Pick′s症、Korsakov′s综合症、小脑退化症(olivopontocerebellardegeneration)、肌萎缩性脊髓侧索硬化(ALS)、帕金森症、唐氏综合症、戊二酸血症(Glutaric acidaemia)、癫痫症、多发梗塞性痴呆(multi-infarctdementia)和脑炎。他们被用于治疗眼科疾病，如青光眼、黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、眼色素层炎。此外，他们被用于预防和治疗药物成瘾、抑郁症和疼痛。

本发明的组合物可进行口服给药、静脉内注射或非口服给药，并可以制成各种形式，如片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、无菌溶液、悬浮液或直肠给药的栓剂。可以使用药物载体加上药物稀释溶液将所述组合物的主要有效成分制成固体片剂，所述载体(如常用的片剂成分)例如玉米糊精、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、脱钙磷酸盐(decalciumphosphate)或树脂。应用适当工业领域中公知的涂覆方法等可将本发明中药物组合物的片剂或丸剂制成方便给药的缓释形式。例如，片剂或丸剂可以由内部给药成分和外部给药成分组成。可以在所述片剂或丸剂的内部给药成分之外包裹外部给药成分。本发明组合物的用于口服给药或注射的液体形式包括溶液、适当调节口味的糖浆、水溶性悬浮液、非水溶性悬浮液、食用油制成的乳状液(所述食用油包括棉油、芝麻油、椰子油或花生油)、酏剂及类似药物载体。在制造水溶性悬浮液中可以使用黄胶、阿拉伯胶、褐藻酸钠盐、葡聚糖、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮或合成或天然橡胶(如明胶)作为适当的分散或悬浮助剂。

根据各种相关因素如疾病、年龄、性别、体重和患者疾病的程度等来确定治疗神经变性的药量。

可以通过如下反应方案来合成本发明的四氟苄基衍生物。但是，所述方案中所示的化合物仅是本发明的代表，本发明可包括更多化合物。

[反应方案1]

所述的四氟苄基衍生物由下列反应合成。首先，将3位和4位氢分别被R₅和R₄所取代的硝基苯化合物在3大气压下氢化12小时(反应条件a)。所生成的苯胺化合物与2，3，5，6-四氟-4-甲基苄基溴，在DMF中在三乙胺存在的条件下反应12小时，获得目标物四氟苄基衍生物(反应条件b)。

在上述方案中，R₁、R₂和R₃表示氢或卤素；R₄表示羟基、烷基、烷氧基、卤素、卤代烷氧基、烷酰氧基、硝基；R₅表示羧酸、羧酸酯、酰氨、磺酸、卤素和硝基基团。

[反应方案2]

为合成R₄为羟基，且R₅为酰胺基的化合物，首先通过在催化量的c-H₂SO₄存在下与三氟甲基乙酸酐反应将5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟苄氨基)苯甲酸上的羟基和胺基用三氟取代基保护起来(反应条件a)。然后，将所生成的2-羧基-5-[2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基-苄基]-(2，2，2-三氟乙酰基)氨基]苯基酯化合物与SOCl₂反应，其后与碳酸铵反应获得2-氨基甲酰基-4-[2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基-苄基-(2，2，2-三氟乙酰基)氨基]苯基酯化合物(反应条件b)，然后将其用HCl溶液水解获得目标酰胺化合物(反应条件c)。在此方案中，R₁、R₂、R₃和R₄是相同基团，其为上文所定义的，而R₅为C₁-C₄取代的烷基基团。

                     <合成实施例1>

2-羟基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸(2-羟基-TTBA)的制备

在室温和氮气环境下，将5-氨基水杨酸(1.02g，6.66mmole，购自Aldrich Chemical Company，USA，A7，980-9)和三乙胺(1ml)溶于干燥的DMF(80ml)中，向溶液中加入2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄基溴(1.23g，7.18mmole)(Aldrich，40，640-6)。将反应混合物在室温条件下搅拌2小时，然后在真空下除去溶剂。用乙酸乙酯将反应混合物稀释，然后用乙酸乙酯萃取反应混合物。有机层用水和盐水洗涤，其后用无水MgSO₄干燥。蒸出溶剂后，残余物在醚/正己烷(1∶10)中重结晶，获得白色固体物质2-羟基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸1.60g(收率64％)。

mp 179℃，

¹H-NMR：8.0(s，1H)，7.3(d，1H)，6.7(t，1H)，5.5(s，2H)，

IR(KBr压片)：3386，1741，1500cm^-1，

C₁₅H₈F₇NO₃的元素分析

    ％C    ％H    ％N    ％F    ％O    计算值    47.01    2.10    3.66    34.70    12.53    测量值    47.00    2.03    3.69

                         <合成实施例2>

2-硝基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸的制备

按照与合成实施例1相似的步骤，使用5-氨基-2-硝基苯甲酸(1.03g，5.65mmole)和2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄基溴(1.01g，6.04mmole)(ACROS，33074-0010)，获得浅黄色固体2-硝基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸1.50g(收率76.3％)。

mp 121℃，

¹H-NMR：8.0(d，1H)，7.3(s，1H)，6.7(d，1H)，5.5(s，2H)，

IR(KBr压片)：3417，1703，1504cm^-1，

C₁₅H₇F₇N₂O₄的元素分析

  ％C  ％H  ％N  ％F  ％O    计算值  43.71  1.71  6.80  32.36  15.53    测量值  43.37  1.68  6.50

                           <合成实施例3>

2-氯-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸的制备

按照与合成实施例1相似的步骤，使用5-氨基-2-氯苯甲酸(1.02g，5.94mmole)(ACROS，32525-5000)，DMF(50ml)和2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄基溴(1.16g，6.99mmole)，获得淡棕色固体2-氯-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸2.04g(收率85.5％)。

mp 58℃，

¹H-NMR：7.26(d，1H)，7.24(s，1H)，6.7(d，1H)，4.12(s，2H)，

IR(KBr压片)：3402，1720，1494，1434，929cm^-1，

HPLC(0.01％TFA-乙酸乙酯(TFA-ethyl acetate)∶0.1％TFA-水＝80∶20，Rt＝4.2分)：97％纯度，

C₁₅H₇ClF₇NO₄的元素分析

  ％C  ％H  ％N  ％F  ％O  计算值  44.85  1.76  3.49  33.11  7.97  测量值  44.83  2.31  3.43

                       <合成实施例3>

2-溴-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸的制备

(4-1)5-氨基-2-溴苯甲酸的制备

将溶于甲醇中的2-溴-5-硝基苯甲酸(1.10g，4.06mmol)(Aldrich，38，184-5)和活化的Pd-C(43.62mg，0.41mmol)(Aldrich，20，569-9)混合物在30psi的氢气压力下氢化4小时。混合物过滤后，将滤液浓缩获得浅黄色固体5-氨基-2-溴苯甲酸0.80g(收率91.2％)。

IR(KBr压片)：3111，2558，2499，1716，1676cm^-1。

(4-2)2-溴-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸的制备

按照与合成实施例1相似的步骤，通过使用由合成实施例(4-1)制备的5-氨基-2-溴苯甲酸(1.05g，6.12mmole)、DMF(50ml)和2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄基溴(1.16g，6.99mmole)，获得浅黄色固体2-溴-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸2.02g(收率76.9％)。

mp 70℃，

¹H-NMR：7.42(d，1H)，7.3(s，1H)，6.9(d，1H)，5.5(s，2H)，

IR(KBr压片)：3438，1695，1491，1425，939cm^-1，

HPLC(0.1％TFA-乙酸乙酯∶0.1％TFA-水＝80∶20，Rt＝4.5分)99％纯度，

C₁₅H₇BrF₇NO₂的元素分析

  ％C  ％H  ％N  ％Br  ％F  ％O    计算值  40.38  1.58  3.14  17.91  29.81  7.17    测量值  44.62  1.57  3.79

                       <合成实施例5>

2-羟基-5-(2，3，5，6-四氟-4-甲基苄氨基)苯甲酸的制备

按照与合成实施例1相似的步骤，通过使用4-甲基-2，3，5，6-四氟-苄基溴(1.23g，7.18mmole)(Aldrich，40，646-6)代替2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄基溴，获得白色固体2-羟基-5-(2，3，5，6-四氟-4-甲基苄氨基)苯甲酸1.60g(收率64.0％)。

mp 212℃，

¹H-NMR：8.0(s，1H)，7.3(d，1H)，6.7(t，1H)，5.5(s，2H)，2.2-2.3(s，3H)，

IR(KBr压片)：3386，1741，1500cm^-1，

C₁₅H₁₁F₄NO₃的元素分析

  ％C  ％H  ％N  ％F  ％O    计算值  54.72  3.37  4.25  23.08  14.58    测量值  54.90  3.60  4.06

                         <合成实施例6>

2-甲基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸的制备

(6-1)2-甲基-5-硝基苯甲酸的制备

在0℃下，向溶有2-甲基苯甲酸(3.05g，22.3mmole)(ACROS，13904-0010)的c-HNO₃(20ml)中小心加入浓H₂SO₄(15ml)。所得溶液在100-120℃回流5小时。待反应混合物冷却至室温，加入50ml碎冰。将所得沉淀过滤，水洗并干燥，获得3.90g(收率97.5％)2-甲基-5-硝基苯甲酸白色固体。

IR(KBr压片)：1531，1350cm^-1。

(6-2)5-氨基-2-甲基苯甲酸的制备

按照与合成实施例(4-1)相似的步骤，通过使用由合成实施例(6-1)制备的2-甲基-5-硝基苯甲酸(4.10g，22.6mmole)，获得2.01g(收率60.0％)5-氨基-2-甲基苯甲酸白色固体。

IR(KBr压片)：3437，3336，1633，1400cm^-1。

(6-3)2-甲基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸的制备

按照与合成实施例1相似的步骤，通过使用5-氨基-2-甲基苯甲酸(2.06g，15.0mmole)、DMF(60ml)、TEA(4ml)和2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄基溴(5.52ml，17.7mmole)，获得1.50g(收率27.0％)2-甲基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸黄色固体。

mp 84℃，

¹H-NMR：7.32(s，1H)，7.3(d，1H)，6.9(d，1H)，5.5(s，2H)，2.2(s，3H)，

IR(KBr压片)：3417，1716，1496cm^-1，

C₁₆H₁₀F₇NO₂的元素分析

  ％C  ％H  ％N  ％F  ％O    计算值  50.41  2.64  3.53  33.48  12.08    测量值  50.40  2.60  3.39

                         <合成实施例7>

2-甲氧基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸的制备

(7-1)2-甲氧基-5-硝基苯甲酸的制备

按照与合成实施例(6-1)相似的步骤，通过使用2-甲氧基苯甲酸(2.10g，13.79mmole)(ACROS，17375-2000)，获得2.50g(收率97.0％)2-甲氧基-5-硝基苯甲酸白色固体。

IR(KBr压片)：3099，2986，2965，1736，1547cm^-1。

(7-2)5-氨基-2-甲氧基苯甲酸的制备

按照与合成实施例(4-1)类似的步骤，通过使用由合成实施例(7-1)制备的2-甲氧基-5-硝基苯甲酸(4.10g，22.6mmole)，获得1.90g(收率98.0％)5-氨基-2-甲氧基苯甲酸棕色固体。

IR(KBr压片)：1394，1220cm^-1。

(7-3)2-甲氧基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸的制备

按照与合成实施例1相似的步骤，通过使用5-氨基-2-甲氧基苯甲酸(2.10g，12.7mmole)、DMF(50mL)、TEA(6ml)和2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄基溴(2.00ml，14.0mmole)，得到1.50g(收率31.5％)2-甲氧基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸黄色固体。

mp 94℃，

¹H-NMR 7.42(s，1H)，6.4(d，1H)，6.2(d，1H)，5.5(s，2H)，3.73(s，3H)，

IR(KBr压片)：3429，1730，1496cm^-1。

C₁₆H₁₀F₇NO₃的元素分析

  ％C  ％H  ％N  ％F  ％O    计算值  48.38  2.54  3.53  33.48  12.08    测量值  47.50  2.20  3.39

                          <合成实施例8>

5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)-2-三氟甲氧基苯甲酸的制备

(8-1)5-硝基-2-三氟甲氧基苯甲酸的制备

按照与合成实施例(6-1)相似的步骤(Lancaster，15687)，通过使用2-三氟甲氧基苯甲酸(2.10g，9.81mmole)，获得1.40g(收率55.0％)5-硝基-2-三氟甲氧基苯甲酸白色固体。

IR(KBr压片)：1488，1354cm^-1。

(8-2)5-氨基-2-三氟甲氧基苯甲酸的制备

按照与合成实施例(4-1)相似的步骤，通过使用由合成实施例(8-1)制备的5-硝基-2-三氟甲氧基苯甲酸(1.40g，5.34mmole)，获得1.02g(收率90.0％)的5-氨基-2-三氟甲氧基苯甲酸浅黄色固体。

IR(KBr压片)：1627，1369cm^-1。

(8-3)5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)-2-三氟甲氧基苯甲酸的制备

按照与合成实施例1相似的步骤，通过使用5-氨基-2-三氟甲氧基苯甲酸(1.35g，6.23mmole)、DMF(50ml)、TEA(6ml)和2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄基溴(1.10ml，6.73mmole)，获得2.25g(收率81.0％)5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)-2-三氟甲氧基苯甲酸黄色固体。

mp 38℃，

¹H-NMR 7.3(s，1H)，7.12(d，1H)，6.8(d，1H)，5.5(s，2H)，

IR(KBr压片)：3383，1712，1504，1446，929cm^-1。

C₁₆H₇F₁₀NO₃的元素分析

  ％C  ％H  ％N  ％F  ％O    计算值  42.59  1.56  3.0  42.10  10.64    测量值  41.24  2.20  3.39

                      <合成实施例9>

2-硝基-4-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯酚的制备

按照与合成实施例1相似的步骤，通过使用4-氨基-2-硝基苯酚(1.00g，6.49mmole)、DMF(30ml)、TEA(0.5ml)和2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄基溴(1.30g，7.78mmole)，获得1.00g(收率40.0％)的2-硝基-4-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯酚微红色固体。

mp 126-128℃，

¹H-NMR(DMSO-d₆)δ4.23(d，2H)，6.93(m，2H)，7.12(s，1H)，

¹³C NMR(DMSO-D₆)δ36.36，105.48，120.63，122.64，123.32，136.17，140.86，142.34，144.06，144.83，146.44，151.23，

IR(纯的)：3391，3255，1545，1339cm^-1，

C₁₄H₇F₇N₂O₃的元素分析

  ％C  ％H  ％N  ％F  ％O  计算值  43.65  2.09  7.27  28.46  13.69  测量值  43.68  2.05  7.26

                      <合成实施例10>

2-氯-4-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯酚的制备

按照与合成实施例1相似的步骤，通过使用4-氨基-2-氯苯酚(3.00g，19.6mmole)、DMF(80ml)、TEA(0.5ml)和2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄基溴(1.40g，8.36mmole)，获得2.00g(收率76.0％)的2-氯-4-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯酚黄色固体。

mp 52℃，

¹H-NMR(CDCl₃)6.9(d，1H)，6.7(s，1H)，6.5(d，1H)，4.4(s，2H)，

IR(KBr压片)3382，1687，1617，1586cm^-1，

C₁₄H₇F₇ClNO的元素分析

  ％C  ％H  ％N  ％Cl  ％F  ％O    计算值  42.00  1.89  3.75  9.49  35.59  4.28    测量值  45.23  1.49  3.74

                          <合成实施例11>

2-羟基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酰胺的制备

(11-1)2-羧基-4-[2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基-苄基]-(2，2，2-三氟乙酰基)氨基]苯基三氟乙酸酯的制备

在10℃和氮气环境下，向2-羟基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸(2.00g，5.12mmole)和三氟乙酸酐(15ml)溶液中加入C-H₂SO₄(0.50ml)。反应混合物在室温下搅拌20分钟，然后用冰(10g)冷却。真空除溶剂后，将残余物溶于乙酸乙酯(50ml)中。有机层用下列物质洗涤，水(20ml×2)、10％NaHCO₃(20ml×3)、0.5N HCl(20ml×2)和水(20ml)。该有机层用无水Na₂SO₄干燥。蒸出溶剂后，残余物在乙酸乙酯/己烷(1∶10)中重结晶，获得1.40g(收率47％)的2-羧基-4-[2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基-苄基]-(2，2，2-三氟乙酰基)氨基]苯基三氟乙酸酯黄色固体。

mp 174-180℃，

¹H-NMR(DMSO-d₆)δ5.16(d，2H)，6.94(d，1H)，7.44(d，1H)，7.81(s，1H)，

¹³C-NMR(DMSO-d₆)δ43.03，113.2，114.3，117.2，117.8，118.9，128.7，130.2，135.5，141.8，143.8，144.3，146.2，146.3，155.2，155.5，161.6，170.5，

IR(纯的)：1711，1673，1498，1331，724cm^-1。

(11-2)2-氨基甲酰-4-[2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄基-(2，2，2-三氟乙酰基)氨基]苯基三氟乙酸酯的制备

在40℃和氮气环境下，向2-羧基-4-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄基-(2，2，2-三氟乙酰基)氨基)苯基三氟乙酸酯(600mg，1.05mmole)的无水二氯甲烷(15ml)溶液中加入SOCl₂(1.18ml，21.0mmole)。反应混合物搅拌1小时后，真空除去溶剂。所得残余物用无水二氯甲烷(60ml)溶解，并加入碳酸铵(分析含量＞30％，2.00g)。反应混合物搅拌1小时后，过滤除去剩余的碳酸铵。有机层水洗(40ml×3)，然后用无水Na₂SO₄干燥。蒸出溶剂后，残余物在二氯甲烷/己烷(1∶10)中重结晶，获得370mg(收率61％)的2-氨基甲酰-4-[2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄基-(2，2，2-三氟乙酰基)氨基]苯基三氟乙酸酯白色固体。

mp 179-180℃，

¹H-NMR(DMSO-d₆)δ5.05(d，2H)，6.91(d，1H)，7.20(d，1H)，7.62(s，1H)，

¹³C NMR(DMSO-d₆)δ42.31，114.05，114.39，117.25，118.28，118.60，127.47，128.43，134.14，141.66，143.72，144.20，146.26，155.48，161.19，170.32，

IR(纯的)3415，3202，1692，1673，1498，1331cm^-1。

(11-3)2-羟基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酰胺的制备

在40℃和氮气环境下，向溶于甲醇(8ml)和水(3ml)的2-氨基甲酰-4-[2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄基-(2，2，2-三氟乙酰基)氨基]苯基三氟乙酸酯(300mg，0.52mmole)溶液中加入c-HCl(2.0ml)。将反应混合物搅拌24小时后，真空除去有机溶剂。残余物用乙酸乙酯(20ml×3)萃取。有机层用水洗，其后用无水Na₂SO₄干燥。蒸出溶剂后，残余物在二氯甲烷/己烷中重结晶，获得120mg(收率60％)的2-羟基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酰胺白色固体。

mp 143-145℃，

¹H-NMR(DMSO-d₆)δ4.37(s，2H)，6.63(d，LH)，6.76(d，1H)，7.14(s，1H)，

¹³C NMR(DMSO-d₆)6 36.25，111.20，112.36，117.44，121.71，123.29，123.46，139.87，141.61，143.55，145.86，146.07，153.12，171.56，

IR(纯的)3453，3415，3202，1692，1673，735cm^-1。

                   <合成实施例12>

2-羟基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯磺酸的制备

按照与合成实施例1相似的步骤，通过使用4-氨基-2-羟基苯磺酸(1.00g，5.30mmole)、DMF(10ml)、TEA(1.0ml)和2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄基溴(0.88g，5.30mmole)，获得0.61g(收率28.0％)的2-羟基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯磺酸黄色固体。

mp：约300℃，

¹H-NMR(DMSO-D₆)δ4.28(s，2H)，5.58(m，2H)，6.82(s，1H)，

¹³C NMR(DMSO-D₆)δ32.08，106.41，111.39，112.10，119.15，119.33，119.51，126.11，135.09，137.17，139.17，139.70，139.89，140.40，140.59，141.61，

IR(纯的)：3427，3227，1492，1331，1196，1135，628cm^-1。

                      <合成实施例13>

2-羟基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸甲酯的制备

(13-1)5-氨基-2-羟基苯甲酸甲酯的制备

在0℃条件下，向5-氨基水杨酸(3.00g，19.6mmole)的甲醇(80ml)溶液中加入c-H₂SO₄(8ml)。将反应混合物回流6小时后，真空除去溶剂。所得残余物用乙酸乙酯和水分层。有机层用水洗涤(40ml×3)，并用无水MgSO₄干燥。蒸出溶剂后，将残余物在乙酸乙酯/己烷中重结晶，获得2.50g(收率76％)的5-氨基-2-羟基苯甲酸甲酯的黄色固体。

¹H-NMR(CDCl₃)δ7.2(s，1H)，6.7(d，1H)，6.6(d，1H)，

IR(KBr压片)：3406，3327，2950，1672，1616，1492，1440，788cm^-1。

(13-2)2-羟基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸甲酯的制备

按照与合成实施例1相似的步骤，通过使用5-氨基-2-羟基苯甲酸甲酯(2.00g，11.9mmole)、DMF(60ml)、TEA(0.5ml)和2，3，5，6-四氟-4-甲基苄基溴(2.60g，14.3mmole)，获得3.20g(收率85.0％)的2-羟基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸甲酯浅黄色固体。

mp：127℃，

¹H-NMR(CDCl₃)δ7.15(s，1H)，6.9(d，1H)，6.7(d，1H)，4.5(s，2H)，3.9(s，3H)，

IR(KBr压片)：3382，1687，1617，1586cm^-1，

C₁₆H₁₀F₇NO₃的元素分析

  ％C  ％H  ％N  ％F  ％O    计算值  48.38  2.54  3.53  33.48  12.08    测量值  48.12  2.54  3.43

                     <合成实施例14>

2-乙酰氧基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸的制备

(14-1)5-叔丁氧基羰基氨基-2-羟基苯甲酸的制备

室温下，将溶于DMF(20.0ml)的5-氨基水杨酸(1.01g，6.59mmole)、Di-BOC(2.87g，13.1mmol)和TEA(1.0ml)的混合物搅拌2小时。将反应混合物浓缩后，残余物溶于乙酸乙酯。将有机层水洗并用无水Na₂SO₄干燥。在蒸出溶剂后，将残余物在乙酸乙酯/己烷中重结晶，获得1.42g(收率84％)的5-叔丁氧基羰基氨基-2-羟基苯甲酸白色固体。

mp：282℃，

¹H-NMR(DMSO-d₆)δ7.9～8.0(s，1H)，7.4～7.5(d，1H)，6.8～6.9(d，1H)，1.4～1.6(s，9H)，

¹³C NMR(DMSO-d₆)δ171.93，156.50，152.97，131.06，126.36，119.39，117.03，113.13，79.05，28.42。

(14-2)2-乙酰氧基-5-叔丁氧基羰基氨基苯甲酸的制备

向溶有5-叔丁氧基羰基氨基-2-羟基苯甲酸(1.02g，4.02mmole)的DMF(20.0ml)溶液中加入乙酰氯(39mg，4.83mmole)和碳酸钾(555mg，4.02mmole)。将反应混合物在室温下搅拌4小时。反应混合物浓缩后，将残余物溶于乙酸乙酯中。有机层用水和盐水洗涤，并用无水Na₂SO₄干燥。蒸出溶剂后，残余物在乙酸乙酯/己烷中重结晶，获得0.62g(收率52％)的2-乙酰氧基-5-叔丁氧基羰基氨基苯甲酸白色固体。

mp：76-78℃，

¹H-NMR(DMSO-d₆)δ7.9～8.0(s，1H)，7.4～7.5(d，1H)，6.8～6.9(d，1H)，2.0～2.1(s，3H)，1.4～1.6(s，9H)，

¹³C NMR(DMSO-d₆)δ171.88，165.59，156.49，144.71，131.27，124.06，79.64，28.441，21.13。

(14-3)2-乙酰氧基-5-氨基苯甲酸的制备

将2-乙酰氧基-5-叔丁氧基羰基氨基苯甲酸(1.01g，3.42mmole)溶于TFA/CH₂Cl₂(20.0ml.1∶1v/v)中，在室温下将混合物搅拌30分。混合物浓缩后，将残余物溶于乙醚中。将剩余的残渣在乙酸乙酯/己烷中重结晶，获得0.65g(收率97％)的2-乙酰氧基-5-氨基苯甲酸白色固体。

mp：133-136℃，

¹H-NMR(DMSO-d₆)δ7.5～7.6(s，1H)，7.2～7.3(d，1H)，7.0～7.1(d，1H)，2.1～2.2(s，3H)，

¹³C NMR(DMSO-d₆)δ170.83，165.57，143.40，124.41，123.45，121.09，118.64，113.98，30.98。

(14-4)2-乙酰氧基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸的制备

按照与合成实施例1相似的步骤，通过使用由合成实施例(14-3)制备的2-乙酰氧基-5-氨基苯甲酸(0.81g，4.10mmole)、DMF(15ml)、TEA(0.1ml)、四丁基碘化铵(5mg)和2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄基溴(1.02ml，6.15mmole)，获得0.92g(收率53.0％)的2-乙酰氧基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸白色固体。

mp：185-187℃，

¹H-NMR(DMSO-d₆)δ21.6(s，3H)，4.46(s，2H)，6.82(d，1H)，6.88(d，1H)，7.17(s，1H)，

¹³C NMR(DMSO-d₆)δ21.64，3637，114.36，116.97，123.94，127.78，124.81，141.40，142.44，144.44，145.04，145.84，146.85，166.35，170.18，

IR(KBr压片)3410，1747，1705，1489cm^-1，

C₁₇H₁₀F₇NO₄的元素分析

  ％C  ％H  ％N  ％F  ％O    计算值  48.01  2.37  3.29  31.27  15.05    测量值  48.05  2.39  3.29

                      <合成实施例15>

2-丙酰氧基-5-(2、3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸的制备

(15-1)5-叔丁氧基羰基氨基-2-丙酰氧基苯甲酸的制备

依照与合成实施例(14-2)相似的步骤，通过使用丙酰氯(446mg，4.82mmole)，获得0.71g(收率57.0％)的5-叔丁氧基羰基氨基-2-丙酰氧基苯甲酸白色固体。

mp：137-142℃，

¹H-NMR(DMSO-d₆)δ7.9～8.0(s，1H)，7.4～7.5(d，1H)，6.8～6.9(d，1H)，2.5～2.6(t，2H)，1.4～1.6(s，9H)，1.0～1.2(q，3H)，

¹³C NMR(DMSO-d₆)δ172.689，165.598，152.804，144.674，137.287，124.045，79.618，28.358，27.259，9.080。

(15-2)5-氨基-2-丙酰氧基苯甲酸的制备

按照与合成实施例(14-3)相似的步骤，通过使用5-叔丁氧基羰基氨基-2-丙酰氧基苯甲酸(1.01mg，3.26mmole)，获得0.67g(收率97.0％)的5-氨基-2-丙酰氧基苯甲酸白色固体。

mp：213-220℃，

¹H-NMR(DMSO-d₆)δ7.5～7.6(s，1H)，7.2～7.3(d，1H)，7.0～7.1(d，1H)，2.4～2.6(t，2H)，1.0～1.2(q，3H)，

¹³C NMR(DMSO-d₆)δ172.78，165.35，145.54，137.100，124.90，124.76，124.23，121.72，27.32，9.10。

(15-3)2-丙酰氧基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸的制备

按照与合成实施例(14-4)相似的步骤，通过使用由实施例(15-2)中制备的5-氨基-2-丙酰氧基苯甲酸(0.32g，1.53mmole)、DMF(10ml)、TEA(0.05ml)、四丁基碘化铵(3mg)和2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄基溴(0.38ml，2.30mmole)，获得0.34g(收率51.0％)的2-丙酰氧基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸白色固体。

mp：188-191℃，

¹H-NMR(丙酮-d₆)δ1.17(t，3H)，2.06(q，2H)，4.67(s，2H)，6.94(m，2H)，7.37(s，1H)，

¹³C NMR(丙酮-d₆)δ8.65，27.41，36.34，114.76，117.27，123.57，124.16，124.59，141.56，142.44，145.29，145.31，165.29，172.77，

IR(KBr压片)3414，1745，1702，1491cm^-1，

C₁₈H₁₈F₇NO₄的元素分析

  ％C  ％H  ％N  ％F  ％O    计算值  49.22  2.75  3.19  30.27  14.57    测量值  49.20  2.76  3.20

                          <合成实施例16>

2-环己基碳酰氧基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸的制备

(16-1)5-叔丁氧基羰基氨基-2-环己基碳酰氧基苯甲酸的制备

按照与合成实施例(14-2)相似的步骤，通过使用环己基碳酰氯(707mg，4.82mmole)，获得0.72g(收率49.0％)的5-叔丁氧基羰基氨基-2-环己基碳酰氧基苯甲酸白色固体。

mp：68-74℃，

¹H-NMR(DMSO-d₆)δ7.9～8.0(s，1H)，7.4～7.5(d，1H)，6.8～6.9(d，1H)，2.4～2.6(t，1H)，1.0～2.0(m，19H)。

(16-2)5-氨基-2-环己基碳酰氧基苯甲酸的制备

按照与合成实施例(14-3)相似的步骤，通过使用5-叔丁氧基羰基氨基-2-环己基碳酰氧基苯甲酸(1.01mg，2.78mmole)，获得0.70g(收率96.0％)的5-氨基-2-环己基碳酰氧基苯甲酸白色固体。

mp：116-121℃，

¹H-NMR(DMSO-d₆)δ7.5～7.6(s，1H)，7.4～7.5(d，1H)，6.9～7.0(d，1H)，2.4～2.6(t，1H)，1.0～2.0(m，10H)，

¹³C NMR(DMSO-d₆)173.87，170.74，165.60，160.09，158.61，158.27，143.14，140.71，130.03，124.66，123.44，121.70，119.12，118.61，113.81，42.42，31.25，28.94，25.65，22.38，14.29。

(16-3)2-环己基碳酰氧基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸的制备

按照与合成实施例(14-4)相似的步骤，通过使用由合成实施例(16-2)制备的5-氨基-2-环己基碳酰氧基苯甲酸(1.03g，3.95mmole)、DMF(15ml)、TEA(0.10ml)、四丁基碘化铵(10mg)和2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄基溴(1.01ml，5.92mmole)，获得0.95g(收率49.0％)的2-环己基碳酰氧基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸白色固体。

mp：190-193℃，

¹H-NMR(丙酮-d₆)δ1.20～1.57(m，6H)，1.64～1.81(m，4H)，2.53(m，1H)，4.67(s，2H)，6.90(d，1H)，6.96(d，1H)，7.36(s，1H)，

¹³C NMR(丙酮-d₆)δ25.57，26.07，36.23，43.13，114.67，117.21，122.21，122.36，124.45，124.56，142.32，142.74，144.21，145.24，146.82，165.29，173.96，

IR(KBr压片)3402，1724，1707，1491cm^-1，

C₂₂H₁₈F₇NO₄的元素分析

  ％C  ％H  ％N  ％F  ％O    计算值  53.56  3.68  2.84  26.96  12.97    测量值  53.58  3.65  2.85

                    附图的简要说明

通过下面结合附图的详细说明，可以更清楚地理解本发明的上述及其它目的、特征及其它优点，其中：

图1a.2-羟基-TTBA对NMDA-诱导的兴奋毒性的作用

将小鼠皮质细胞培养物(DIV 12-14)暴露于300μM NMDA中10分钟，单独地或含有3-300μM的2-羟基-TTBA。24小时后，通过测量释放到浸泡介质中的LDH的水平来分析神经元的死亡状况(平均数±SEM(每种条件n＝9-12个培养孔)，调节LDH的平均流出值，假清洗24小时后(＝0)，以及持续暴露于500μM NMDA(＝100))。*表示明显不同于媒介物对照组，使用ANOVA(方差分析)和Student-Neuman-Keuls检验p＜0.05。

图1b.2-羟基-TTS、2-羟基-TTA、2-乙基-TTBA、2-丙基-TTBA或2-环己基-TTBA对NMDA-诱导的兴奋毒性的作用。

将小鼠皮质细胞培养物(DIV 12-14)暴露于300μM NMDA中10分钟，单独地(□)或含有3-300μM的2-羟基-TTS(●)、2-羟基-TTA(○)、2-乙基-TTBA()、2-丙基-TTBA()或2-环己基-TTBA(■)。24小时后，通过测量释放到浸泡介质中的LDH的水平来分析神经元的死亡状况(平均数±SEM(每种条件n＝9-12个培养孔)，调节LDH的平均流出值，假清洗24小时后(＝0)，以及持续暴露于500μM NMDA(＝100))。*表示明显不同于媒介物对照组，使用ANOVA和Student-Neuman-Keuls检验p＜0.05。

图2a.2-羟基-TTBA阻断NMDA进程

对处于-60mV的皮质神经元使用300μM NMDA可引起通常的NMDA-诱导的内向进程(NMDA进程)。连续使用各种浓度的2-羟基-TTBA能以浓度依赖的方式(n＝8)降低由300μM NMDA引起的响应。图上显示了2-羟基-TTBA对NMDA进程的剂量响应关系；其IC₅₀值接近35μM，且希尔系数(Hill coefficient)为0.91。

图2b.用2-羟基-TTBA预处理不影响NMDA进程。

将皮质神经元用100μM 2-羟基-TTBA处理，彻底洗涤，其后应用300μM NMDA。用2-羟基-TTBA预处理不影响NMDA-诱导的内向进程(inward currents)，表明只有当受体被激动剂(n＝6)活化时2-羟基-TTBA才发挥其阻断作用。

图3a.2-羟基-TTBA对FeCl₂诱导的氧化应激的作用。

将小鼠皮质细胞培养物(DIV 12-14)持续暴露于50μM Fe²⁺，单独地或含有0.1-100μM的2-羟基-TTBA(●)或trolox(维生素E的具有膜透过性的形式)(○)。24小时后，通过测量释放到浸泡介质中的LDH的水平来分析神经元的死亡状况(平均数±SEM(每种条件n＝9-12个培养孔)，调节LDH的平均流出值，假清洗24小时后(＝0)，以及持续暴露于500μM NMDA(＝100))。*表示明显不同于媒介物对照组，使用ANOVA和Student-Neuman-Keuls检验p＜0.05。

图3b.2-羟基-TTS、2-羟基-TTA、2-氯-TTP、2-乙基-TTBA、2-丙基-TTBA或2-环己基-TTBA对FeCl₂诱导的氧化应激的作用。

将小鼠皮质细胞培养物(DIV 12-14)持续暴露于50μM Fe²⁺，单独的(◆)或含有1-30μM的2-羟基-TTS(●)、2-羟基-TTA(○)、2-氯-TTP()、2-乙基-TTBA()、2-丙基-TTBA(■)或2-环己基-TTBA(□)之中。24小时后通过测量释放到浸泡介质中的LDH的水平来分析神经元的死亡状况(平均数±SEM(每种条件n＝9-12个培养孔)，调节LDH的平均流出值，假清洗24小时后(＝0)，以及持续暴露于500μM NMDA(＝100))。*表示明显不同于媒介物对照组，使用ANOVA和Student-Neuman-Keuls检验p＜0.05。

图4.2-羟基-TTBA对SNP-诱导的氧化应激的作用。

将小鼠皮质细胞培养物(DIV 12-14)持续暴露于5μM硝普钠(SNP)，单独地(●)或含有0.1-10mM的阿司匹林(○)、1-100μM的trolox()或0.1-10μM的2-羟基-TTBA()。24小时后，通过测量释放到浸泡介质中的LDH的水平来分析神经元的死亡状况(平均数±SEM(每种条件n＝9-12个培养孔)，调节LDH的平均流出值，假清洗24小时后(＝0)，以及持续暴露于500μM NMDA(＝100))。*表示明显不同于媒介物对照组，使用ANOVA和Student-Neuman-Keuls检验p＜0.05。

图5.2-羟基-TTBA对锌毒性的作用。

将小鼠皮质细胞培养物(DIV 12-14)暴露于300μM Zn²⁺，单独地或含有3-300μM的2-羟基-TTBA之中30分钟。24小时后，通过测量释放到浸泡介质中的LDH的水平来分析神经元的死亡状况(平均数±SEM(每种条件n＝9-12个培养孔)，调节LDH的平均流出值，假清洗24小时后(＝0)，以及持续暴露于500μM NMDA(＝100))。

图6a.2-羟基-TTBA的自由基清除活性

将2-羟基-TTBA(●)或trolox(○)与溶于乙醇中的100μM 1，1-二苯基-2-苦基偕腙肼(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazil)(DPPH，一种稳定的自由基)反应10分钟。通过测定在517nm处DPPH水平的下降来确定其自由基清除活性。*表示明显不同于媒介物对照组，使用ANOVA和Student-Neuman-Keuls检验p＜0.05。

图6b.2-羟基-TTS、2-羟基-TTA或2-氯-TTP的DPPH分析。

将2-羟基-TTS(●)、2-羟基-TTA(○)、2-氯-TTP()或对照组()与100μM溶于乙醇中的DPPH反应。通过测定在517nm处DPPH水平的下降来确定自由基清除活性。*表示明显不同于媒介物对照组，使用ANOVA和Student-Neuman-Keuls检验p＜0.05。

图7a.2-羟基-TTBA降低ALS动物模型的脊髓神经元的死亡。

对过表达变异型SOD1-G93A的肌萎缩性脊髓神经侧索硬化(ALS)小鼠从两个月时开始给予媒介物(A)或2-羟基-TTBA(B，10mg/kg/天通过饮水)8周，其由曙红染色的脊髓切片的明亮背景的显微照片。

图7b.2-羟基-TTBA降低ALS动物模型的脊髓神经元的死亡。

对使用媒介物(对照组)或2-羟基-TTBA处理的ALS小鼠脊髓的(灰质)背角和(灰质)腹角用曙红染色，通过对其存活的神经元进行计数(平均数±S.E.M(每种条件n＝5只动物))来分析图7a.中的变性神经元。*表示明显不同于媒介物对照组，使用独立t-测试(independent t-test)p＜0.05。

图8a.2-羟基-TTBA腹膜内给药降低脑缺血性损伤。

通过闭塞右中脑动脉和两条颈总动脉对成年大鼠造成暂时脑缺血60分钟，在再灌注(reperfusion)后5分钟、30分钟或1小时腹腔内注射媒介物或50 mg/kg 2-羟基-TTBA。在用2％的2，3，5-三苯基氯化四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazolium chloride)(TTC)对脑部切片染色24小时后分析梗塞体积，平均值±SEM(每种条件下n＝8-11只大鼠)。*表示明显不同于媒介物对照组，使用ANOVA和Student-Neuman-Keuls检验p＜0.05。

图8b.2-羟基-TTBA腹膜内给药降低脑缺血性损伤。

通过闭塞右中脑动脉和两条颈总动脉对成年大鼠造成暂时脑缺血60分钟，在再灌注后5分钟腹腔内注射媒介物(对照组)或50mg/kg或100mg/kg 2-羟基-TTBA。在用2％的2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)对脑部切片染色24小时后分析梗塞体积，平均值±SEM(每种条件下n＝7-8只大鼠)。*表示明显不同于媒介物对照组，使用ANOVA和Student-Neuman-Keuls检验p＜0.05。

图8c.2-羟基-TTBA静脉内注射给药降低脑缺血性损伤。

通过闭塞右中脑动脉和两条颈总动脉对成年大鼠造成暂时脑缺血60分钟，在闭塞后30分钟或再灌注后5分钟、30分钟、1小时、2小时或4小时静脉内注射媒介物(对照组)或5mg/kg 2-羟基-TTBA。24小时后分析梗塞体积，平均值±SEM(每种条件下n＝8-11只大鼠)。*表示明显不同于媒介物对照组，使用ANOVA和Student-Neuman-Keuls检验p＜0.05。

图8d.2-羟基-TTBA静脉内注射给药降低脑缺血性损伤。

通过闭塞右中脑动脉和两条颈总动脉对成年大鼠造成暂时脑缺血60分钟，在再灌注后5分钟静脉内注射媒介物(对照组)或1mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg或20mg/kg的2-羟基-TTBA。24小时后分析梗塞体积，平均值±SEM(每种条件下n＝8-10只大鼠)。*表示明显不同于媒介物对照组，使用ANOVA和Student-Neuman-Keuls检验p＜0.05。

图8e.2-羟基-TTBA口服给药降低脑缺血性损伤。

通过闭塞右中脑动脉和两条颈总动脉对成年大鼠造成暂时脑缺血60分钟，在再灌注后5分钟口服给予媒介物(对照组)或10mg/kg或20mg/kg的2-羟基-TTBA。24小时后分析梗塞体积，平均值±SEM(每种条件下n＝8-10只大鼠)。*表示明显不同于媒介物对照组，使用ANOVA和Student-Neuman-Keuls检验p＜0.05。

图9a.在全脑缺血后恢复流通72小时时2-羟基-TTBA对线粒体ROS形成的作用。

在外科失血前24小时将染色体示踪剂(Mitotracker)CM-H₂X ROS注射入大鼠侧脑室，其后动物接受10分钟的短暂前脑缺血，在再灌注后5分钟腹膜内注射媒介物(对照组)或2-羟基-TTBA(50mg/kg)。2小时后分析线粒体ROS水平，平均值±S.E.M.(在每种条件下，从海马结构(hippocampal formation)的CA1部分随机选取n＝50-70个神经元)。*表示明显不同于媒介物对照组，使用独立t-测试p＜0.05。

图9b.在全脑缺血后恢复流通72小时时2-羟基-TTBA预防CA1部分的神经元死亡。

成年大鼠经受10分钟的短暂全脑缺血，在再灌注后5分钟腹膜内注射媒介物(对照组)或2-羟基-TTBA(50mg/kg)。三天后通过对甲酚紫染色的存活神经元进行计数来分析CA1中变性的神经元数量(平均值±S.E.M)。*表示明显不同于媒介物对照组，使用独立t-测试p＜0.05。

图10a.2-羟基-TTBA降低MPTP注射三天后塞梅林氏神经节中多巴胺能神经元的死亡。

明亮背景的显微照片显示，C57/BL6小鼠的假手术对照组(A)或每天单次注射1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP，40mg/kg，SC)(单独地(B)，或在MPTP给药之前腹腔内注射(每天两次)2-羟基-TTBA(C，25mg/kg；D，50mg/kg))三天后用抗酪氨酸羟化酶(TH)抗体进行免疫染色(immunostained)的塞梅林氏神经节中多巴胺能神经元。

图10b.2-羟基-TTBA降低MPTP注射三天后塞梅林氏神经节中多巴胺能神经元的死亡。

在如上文所述每天单次注射(MPTP，40mg/kg，SC)(单独地或结合使用2-羟基-TTBA进行预处理)三天后在塞梅林氏神经节切片中TH-阳性的多巴胺能神经元的量。*表示明显不同于媒介物对照组，使用ANOVA和Student-Neuman-Keuls检验p＜0.05。

图10c.2-羟基-TTBA降低MPTP注射七天后塞梅林氏神经节中多巴胺能神经元的死亡。

明亮背景的显微照片显示，C57/BL6小鼠的假手术对照组(A)或每天单次注射1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP，40mg/kg，SC)(单独地(B)或在MPTP给药之前腹腔内注射(每天两次)2-羟基-TTBA(C，25mg/kg；D，50mg/kg))七天后用抗酪氨酸羟化酶(TH)抗体免疫染色的塞梅林氏神经节中的多巴胺能神经元。

图11.2-羟基-TTBA防止外伤性损伤后脊髓的(灰质)背角神经元中线粒体ROS的产生。

成年大鼠在脊髓T8节段上受到压迫性外伤(单独(对照组)或在损伤后立即注射2-羟基-TTBA(50mg/kg，ip)和染色体示踪剂CM-H₂X ROS)。动物在两天后安乐死，脊髓切片用NeuN抗体(神经元标记蛋白)进行免疫染色，通过检测氧化的染色体示踪剂CM-H₂X的荧光强度来分析背角神经元(DHN)中线粒体ROS的水平，平均值±S.E.M.[每种条件下的大鼠n＝12(每只大鼠5个脊髓切片)]。*表示明显不同于媒介物对照组，5使用独立-t测试p＜0.05。

通过使用2-羟基-TTBA、2-羟基-TTS、2-羟基-TTA、2-氯-TTP、2-乙基-TTBA、2-丙基-TTBA和2-环己基-TTBA的实验性实施例对本发明进行了如下具体描述，上述化合物的制备如合成实施例中所述。

但下面所描述的实施例仅是本发明代表，其还可包括更多的实施例。

                       <实施例1>

神经元和神经胶质的混合皮质细胞培养物

为进行混合神经元-神经胶质培养，从14-16天的乳鼠(E14-16)的大脑中分离出小鼠大脑皮质，轻轻粉碎并接种在用100μg/ml聚-D-赖氨酸和4μg/ml昆布氨酸预涂覆的24孔涂板上(2×10⁵细胞/板)。将培养物保持在37℃、潮湿的、5％CO₂气体环境中。平面培养基包括添加有5％马血清、5％胎牛血清、26.5mM碳酸氢盐、2mM谷氨酸盐和21mM葡萄糖的Eagles最低必需培养基(MEM，Earles盐，未供给谷氨酸盐)。

体外培养7-8天后(DIV 7-8)，用10μM阿拉伯呋喃糖苷(arabinofuranoside)胞嘧啶(Ara-C)来终止神经胶质的过度生长。对DIV12-15皮质细胞培养物进行药物处理。在如前所述的神经中毒损伤24小时后，通过检测释放到浸泡介质中的乳酸脱氢酶(LDH)的量来评价全部的神经元细胞损伤[Koh and Choi，J Neurosci Methods 20：83-90，1987]。

                      <实施例2>

2-羟基-TTBA、2-羟基-TTS、2-羟基-TTA、2-乙基-TTBA、2-丙基-TTBA或2-环己基-TTBA对兴奋毒性的抑制效果

在如实施例1所述的混合神经元-神经胶质培养DIV 13-15时，将皮质细胞培养物暴露于300μM NMDA中10分钟，单独地或结合3-300μM2-羟基-TTBA、10-300μM 2-羟基-TTS、30-300μM 2-羟基-TTA、30-300μM2-乙基-TTBA、10-300μM 2-丙基-TTBA或10-300μM 2-环己基-TTBA。24小时后，通过测量释放到浸泡介质中的LDH的量来评价神经元的死亡状况。*表示明显不同于媒介物对照组，使用ANOVA和Student-Neuman-Keuls检验p＜0.05。

将皮质细胞培养物暴露于300μM NMDA中10分钟，使神经元在其后的24小时中大幅死亡(约75-80％的神经元死亡)。在剂量为10-300μM时，2-羟基-TTBA以药物依赖的方式阻断NMDA-诱导的神经元死亡(图1a)。

同时给予30-300μM剂量的2-羟基-TTS、2-羟基-TTA、2-乙基-TTBA、2-丙基-TTBA或2-环己基-TTBA也预防了NMDA-诱导的神经元死亡(图1b)。

                      <实施例3>

2-羟基-TTBA对NMDA-诱导的内向进程的阻断作用

如上文所述在室温下对皮质细胞培养物进行全细胞记录[Seo et al.，J.Pharmacol.Exp.Ther.，299：377-384(2001)]。对保持在-70mV的培养的皮质神经元使用300μM NMDA后立即引起通常的NMDA-诱导的内向进程(NMDA进程)。使用2-羟基-TTBA浴能够立即以剂量依赖方式抑制NMDA-引起的进程(n＝7-15神经元/条件，IC₅₀值＝30.55±2.96μM)(图2a)。单独使用100μM 2-羟基-TTBA对进行中的进程没有效果，并对随后用300μM NMDA处理后的细胞响应的效果很小(图2b)，这表明只有当NMDA受体被活化时(n＝6)2-羟基-TTBA才表现出拮抗作用。

                      <实施例4>

2-羟基-TTBA、2-羟基-TTA、2-羟基-TTS、2-氯-TTP、2-乙基-TTBA、2-丙基-TTBA或2-环己基-TTBA阻断氧化性神经元死亡

(4-1)抑制FeCl₂诱导的自由基毒性

将混合的皮质细胞培养物(DIV 13-15)持续暴露于50μM FeCl₂(其通过Fenton反应产生羟基自由基)，单独地或结合指定剂量的2-羟基-TTBA、2-羟基-TTS、2-羟基-TTA、2-氯-TTP、2-乙基-TTBA、2-丙基-TTBA、2-环己基-TTBA或trolox(一种维生素E类似物)。24小时后，通过上述LDH分析来分析神经元细胞的死亡。*表示明显不同于媒介物对照组(FeCl₂)，使用ANOVA和Student-Neuman-Keuls检验p＜0.05。

暴露于FeCl₂中的神经元细胞培养物在其后的24小时中发生大幅的神经元死亡。2-羟基-TTBA和trolox以剂量依赖方式预防FeCl₂-诱导的自由基神经毒性。然而，在预防自由基神经毒性方面2-羟基-TTBA比trolox强30倍(图3a)。此外，2-羟基-TTBA的合成衍生物(2-羟基-TTS、2-羟基-TTA、2-氯-TTP、2-乙基-TTBA、2-丙基-TTBA或2-环己基-TTBA)在预防FeCl₂-诱导的自由基神经毒性中显示出比trolox更强的神经保护作用(图3b)。

(4-2)抑制SNP(硝普钠)细胞毒性

将混合的皮质细胞培养物持续暴露于5μM SNP(一氧化氮(NO)给体)，单独地或包含0.1-10μM 2-羟基-TTBA、1-10μM trolox或100-10,000μM阿司匹林之中。24小时后，通过LDH分析来分析神经元细胞的死亡。*表示明显不同于媒介物对照组(SPN)，使用ANOVA和Student-Neuman-Keuls检验p＜0.05。

给予SNP造成全部神经元细胞死亡和一些神经胶质细胞死亡。在2-羟基-TTBA和trolox存在下SPN毒性被彻底阻断。在预防NO毒性上前者比后者强100倍。阿司匹林作为2-羟基-TTBA的一种结构组分不会降低SNP的细胞毒性。

(4-3)抑制锌神经毒性

为诱导锌(Zn²⁺)神经毒性，在HEPES-缓冲控制盐溶液(HCSS)中将混合的皮质细胞培养物暴露于100μM ZnCl₂ 30分钟，单独地或包含3-300μM 2-羟基-TTBA，所述缓冲溶液包括120mM NaCl、5mM KCl、1.6mMMgCl₂、2.3mM CaCl₂、15mM葡萄糖、20mM HEPES和10mM NaOH。暴露后，将培养物洗涤3次，并用调节至25mM葡萄糖和26.2mM碳酸氢钠的MEM进行替换。24小时后，通过分析LDH来分析神经元细胞的死亡。*表示明显不同于媒介物对照组(SNP)，使用ANOVA和Student-Neuman-Keuls检验p＜0.05。

同时用2-羟基-TTBA进行处理，在10-300μM剂量时以剂量依赖的方式预防锌-诱导的神经元死亡(图5)。

(4-4)2-羟基-TTBA、2-羟基-TTA、2-羟基-TTS或2-氯-TTP的DPPH分析

为检验清除自由基的效果，将1-100μM 2-羟基-TTBA、2-羟基-TTA、2-羟基-TTS、2-氯-TTP或trolox与溶于乙醇的100μM DPPH(2，2-二苯基-1-苦基偕腙肼自由基，一种稳定的自由基)反应。孵育30分钟后，通过分光光度计检测517nm处DPPH吸收的相对减少，平均值±SEM(每种条件下n＝3试管)。*表示明显不同于媒介物对照组(单独DPPH)，使用ANOVA和Student-Neuman-Keuls检验p＜0.05。

与抗氧化剂trolox比较，2-羟基-TTBA在较低的剂量时可降低DPPH水平，表明2-羟基-TTBA是强于trolox的直接抗氧化剂(图6a)。其它合成衍生物也能降低DPPH的水平(图6b)。

                    <实施例5>

2-羟基-TTBA预防ALS小鼠的脊髓神经元的死亡

具有G93A人SOD1突变的转基因小鼠(B6SJL-TgN(SODL-G93A)1Gur)(ALS的动物模型(ALS小鼠))是从Jackson Laboratories(ME，USA)获得的。通过饮用水瓶对2个月的野生型及ALS转基因小鼠给药2-羟基-TTBA(10mg/kg每天)8周。然后使动物安乐死，并通过苏木精和曙红染色对脊髓进行处理用于组织学检验。嗜曙红染色显示，未经2-羟基-TTBA处置的ALS小鼠的脊髓运动神经元(对照组)明显发生变性，而该变性在2-羟基-TTBA处置的ALS小鼠中降低(图7a)。

通过对灰质腹角(VH)和背角(DH)的嗜曙红神经元进行计数来分析变性神经元的数量。给予2-羟基-TTBA显著预防了ALS小鼠脊髓灰质背角和腹角神经元的变性(图7b)。*表示明显不同于媒介物对照组，使用独立t-测试p＜0.05。

                    <实施例6>

2-羟基-TTBA预防缺氧-缺血性脑损伤

(6-1)诱导大鼠的短暂局部脑缺血

用水合三氯乙醛将Sprague-Dawley大鼠麻醉，并如前所述通过闭塞其中脑动脉(MCAO)使其产生局部脑缺血[Tamura et al.，J.Cerebr.BloodFlow Metab.1：53-60(1981)]。通过使3mm直径的穿颅术喙(craniotomyrostral)到达卵圆孔将两条颈总动脉(CCAs)和右中脑动脉(rMCA)暴露在外科显微镜下。用显微夹子将CCAs和rMCA闭塞。60分钟后释放所述夹子，并在显微镜下观察rMCA中血流的恢复。

(6-2)60分钟MCAO后2-羟基-TTBA减少梗塞体积

对动物进行MCAO 60分钟，单独或在再灌注后指定时间点给予2-羟基-TTBA(50mg/kg，i.p.)。注射盐水作为对照组。24小时后使动物安乐死，取出其大脑并在脑基质中按冠状线方向切割成7个2mm的切片。将脑切片置于2％的2，3，5，-三苯基氯化四氮唑溶液中，然后在10％福尔马林中过夜。检测梗塞形成区域(用白色标出)(TINA图像分析系统)，并通过加和连续2mm厚的切片中显白色的梗塞体积来计算梗塞形成的体积，平均值±SEM(每种条件n＝8-12只大鼠)(图8a)。注意到在再灌注后达1小时延迟给予(ip)2-羟基-TTBA，显著减少梗塞体积。较高剂量的2-羟基-TTBA(100mg/kg，ip)也表现出相似的抵御60分钟MCAO的保护作用(图8b)。

进行额外的实验来检验静脉注射2-羟基-TTBA(5mg/kg)抵御60分钟MCAO的效果。再灌注后在指定的时间点将2-羟基-TTBA给药。再灌注后达4小时延迟注射2-羟基-TTBA显著减少了60分钟MCAO后24小时内形成的梗塞体积，平均值±SEM(每种条件n＝8-12只大鼠)(图8c)。

静脉注射2-羟基-TTBA的剂量-响应实验显示，在低至1mg/kg的剂量时2-羟基-TTBA可减少梗塞体积。当剂量高于2.5mg/kg时观察到2-羟基-TTBA的保护效果，平均值±SEM(每种条件n＝8-12只大鼠)(图8d)。

同样检验了口服给予2-羟基-TTBA的保护效果。尤其是再灌注后5分钟给予2-羟基-TTBA(10或20mg/kg，p.o.)能减少60分钟MCAO后24小时的梗塞体积，平均值±SEM(每种条件n＝8-12只大鼠)(图8e)。

                    <实施例7>

2-羟基-TTBA预防短暂前脑缺血后的CA1神经元细胞死亡

(7-1)诱导大鼠全脑缺血

将雄性成年Sprague-dawley大鼠(250-300g)用三氯乙醛麻醉，并如上文所述接受四血管闭塞(封闭两条颈总动脉和椎动脉)[Pulsinelli andBrierley，stroke 10：267-272(1979)]。

(7-2)2-羟基-TTBA抑制全脑缺血后线粒体ROS的形成

大鼠接受脑室内注射0.4nmol染色体示踪剂CM-H₂X ROS。24小时后，大鼠接受四血管闭塞10分钟。再灌注后，大鼠立即接受腹膜内注射盐水(对照组)或2-羟基-TTBA(50mg/kg)。2小时后通过测定线粒体中氧化的染色体示踪剂CM-H₂X ROS的荧光强度来分析线粒体的ROS水平。给予2-羟基-TTBA减少了短暂全脑缺氧后2小时线粒体ROS的产生。

(7-3)2-羟基-TTBA抑制短暂前脑缺血后CA1区域的神经元细胞死亡

对接受四血管闭塞10分钟的大鼠随后给予盐水(对照组)或2-羟基-TTBA(50mg/kg，ip)。3天后使动物安乐死，并在苏木精和曙红染色后分析CA1区域的神经元死亡(平均值±SEM，每种条件n＝12只大鼠)。给予2-羟基-TTBA预防短暂全脑缺血后发展的延时神经元细胞死亡(图9b)。*表示明显不同于对照组，使用独立t测试p＜0.05。

                    <实施例8>

2-羟基-TTBA抑制MPTP(1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶)注射后塞梅林氏神经节中多巴胺能神经元的死亡

(8-1)2-羟基-TTBA抑制多巴胺能神经元

C57/BL6小鼠(雌性，8周)接受注射40mg/kg MPTP(s.c.)，单独地或每天每12小时在MPTP注射前30分钟给予25或50mg/kg 2-羟基-TTBA(ip)。3或7天后，所有动物用三氯乙醛麻醉，并先后用PBS和4％多聚甲醛进行穿心灌注。立即取出大脑并在固定剂(fixative)中浸泡8-10小时。将所述固定剂用30％蔗糖代替，在4℃孵育2天，并在-70℃储存。用滑动式切片机(TPI，Inc.，MO)将所述大脑切割成厚度为30μm的切片。然后将切片在4℃储存于0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4，30％(v/v)甘油，30％乙二醇)中直到使用。将所述切片用抗-TH(酪氨酸氢化酶)抗体进行免疫染色，用二氨基联苯胺(diaminobenzidine)着色，其后在光学显微镜下观察分析多巴胺能神经元的变性。

用MPTP处理的小鼠在其后的3天中在塞梅林氏神经节中显示出显著的多巴胺能神经元变性。所述的腹膜内注射2-羟基-TTBA显著减少了多巴胺能神经元的变性(图10a和10b)。在给予MPTP 7天后同样观测到2-羟基-TTBA的保护作用(图10c和10d)。

                    <实施例9>

外伤性脊髓损伤后抑制脊髓中线粒体ROS的产生

通过压迫背部脊髓使Sprague-Dawley大鼠(250-300g，雌性)遭受外伤性脊髓损伤。将脊髓T8节段在背侧暴露以20g力压迫10分钟，然后立即将线粒体CM-H₂X ROS注射入脊髓中。将2-羟基-TTBA(50mg/kg，ip)或媒介物对照组(对照组)与线粒体CM-H₂X ROS一起注射。如上文所述，在用抗-NeuN抗体(神经元特异性标记物)进行免疫标记，48小时后分析灰质背角神经元中线粒体ROS的水平。给予2-羟基-TTBA显著减少外伤性脊髓损伤后脊髓神经元中线粒体ROS的产生(图11)(平均值±SEM，每种条件N＝12只大鼠)。*表示明显不同于对照组，使用独立t测试p＜0.05。

综上所述，本发明的四氟苄基衍生物或其药物可接受的盐可用作NMDA受体拮抗剂、抗氧化剂和锌神经毒性抑制剂。

可应用四氟苄基衍生物或其药物可接受的盐的具体疾病如下所述。

下列应用实施例是本发明的部分实施例。本发明不限于应用实施例。

<应用实施例1>中风

脑血液供应中断或中风主要通过在突触间隙中由谷氨酸盐(兴奋性神经递质)累积诱导的CA²⁺-透过性谷氨酸盐受体的过度活化来诱导神经元死亡。大量文献表明NMDA受体拮抗剂减少由缺血性中风(占中风的80％)引起的神经元细胞死亡[Simon et al.，Science，226：850-852(1984)；Park etal.，Ann Neurol.，24：543-551(1988)；Wieloch，Science，230：681-683(1985)；Kass et al.，Exp.Neurol.，103：116-122(1989)；Weiss et al.，Brain Res.，380：186-190(1986)]。也有报道称ROS和锌是中风后神经元死亡的主要机制。抗氧化剂或锌毒性抑制剂保护中风的动物模型的缺血性损伤[Flamm，E.S.et al.，Stroke，9(5)：445-447(1978)；Kogure，K.et al.，Prog.Brain Res.，63：237-259(1985)；Chan，P.H.，J.Neurotrauma.，9 Suppl2：S417-423(1992)]。因此，显示抗兴奋毒性、抗氧化应激和抗锌毒性的多重保护作用的本发明化合物可以用作治疗中风的药物。

<应用实施例2>外伤

外伤性脑损伤(TBI)和外伤性脊髓损伤(TSCI)后的神经元细胞变性与兴奋毒素密切相关。在TBI患者体内喹啉酸(一种存在于人体内的NMDA受体激动剂)上升50-500倍[Sinz et al.，J.Cereb.Blood Flow Metab.，18：610-615(1988)]。有报导称NMDA受体拮抗剂可减少TBI和TSCI后的神经元死亡[Faden et al.，J Neurotrauma，5：33-45(1988)；Okiyama et al.，JNeurotrauma，14：211-222(1997)]。抗氧化剂还可抑制TBI或TSCI后的组织损伤[Faden&Salzman，Trends Pharmacol.Sci.，13：29-35(1992)]。因此，显示抗兴奋毒性和抗氧化应激的多重保护作用的本发明化合物可以用作TBI和TSCI的治疗药物。

<应用实施例3>癫痫症

给予海人藻酸(一种AMPA激动剂和海人藻酸谷氨酸盐受体)诱导包括海马结构的若干大脑区域的癫痫发作和神经元细胞死亡。NMDA受体拮抗剂在许多引起癫痫的动物模型中表现出抑制惊厥和癫痫发作的作用。[Anderson et al.，J.Neurophysiol，57：1-21(1987)；Wong et al.，NeurosciLett.，85：261-266(1988)；Mc Namara et al.，Neuropharmacology，27：563-568(1988)]。抗氧化剂抑制癫痫发作和癫痫发作诱导的神经元死亡[He et al.，Free Radic.Biol.Med.22：917-922(1997)；Kabuto et al.，Epilepsia，39：237-243(1998)]。因此，显示抗兴奋毒性和抗氧化应激的多重保护作用的本发明化合物可以用作癫痫和由癫痫诱导的神经元死亡的治疗药物。

<应用实施例4>肌萎缩性骨髓侧索硬化

ALS患者表现出细胞外谷氨酸盐水平增加和星形胶质细胞中谷氨酸盐的运输缺陷。向脊髓中给予谷氨酸盐受体拮抗剂模拟ALS患者脊髓中的病理变化[Rothstein et al.，Clin Neurosci.，3：348-359(1995)；Ikonomidouet al.，JNeuropathol Exp Neurol，55：211-224(1996)]。除了兴奋毒性，许多证据表明氧化应激参与ALS中神经元的死亡[Cookson&Shaw，BrainPathol.，9：165-186(1999)]。事实上，利鲁唑(riluzole，一种FDA许可的用于ALS患者的新型药物)的主要药理学作用包括预防兴奋毒性和氧化应激[Obrenovitch，Trends.Pharmacol.Sci.19：9-11(1998)；Noh et al.，Neurobiol.Dis.，7：375-383(2000)]。因此，显示抗兴奋毒性和抗氧化应激的多重保护作用的本发明化合物可以用作ALS的治疗药物。

<应用实施例5>帕金森症(PD)

PD是一种神经变性疾病，通过塞梅林氏神经节中多巴胺能神经元的选择性死亡表现为运动功能紊乱。许多NMDA受体拮抗剂保护多巴胺能神经元抵御多巴胺能神经毒素MPTP(1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶)[Lange et al.，Naunyn Schmiedebergs Arch.Pharmacol.348：586-592(1993)；Brouillet and Beal.Neuroreport.4：387-390(1993)]。NMDA受体拮抗剂也能改善左旋多巴(levodopa)诱导的运动障碍，因此可改善左旋多巴的治疗效果[Papa and Chase，Ann.Neurol.39：574-578(1996)；Marin et al.，BrainRes.736：202-205(1996)]。氧化应激及兴奋毒性被证明是PD患者体内神经元细胞死亡的主要机制[Schapira et al.，biochem.Soc.Trans.，21：367-370(1993)]。因此，显示抗兴奋毒性和抗氧化应激的多重保护作用的本发明化合物可以用作PD的治疗药物。

<应用实施例6>亨廷顿症(HD)

HD是一种进行性的神经变性疾病，主要影响纹状体(striata)中较小或中等尺寸的中间神经元。给予NMDA受体激动剂后可在体内和体外观察到HD的这些病理特征，这些特征提高了NMDA受体介导的神经毒性造成HD中选择性神经元死亡的可能性[Koh et al.，Science 234：73-76(1986)；Beal et al.，Nature 321：168-171(1986)；Beal et al.，J.Neurosci.11：1649-1659(1991)]。由于积累的证据显示氧化应激(例如线粒体功能紊乱和产生ROS)导致HD中观察到的神经元死亡，因此抑制ROS的药物有可能用于治疗HD。[Jenner，Pathol.Biol.44：57-64(1996)；Albers&Beal，J.Neural.Transm.Suppl.，59：133-154(2000)]。因此，显示抗兴奋毒性和抗氧化应激的多重保护作用的本发明化合物可以用作HD的治疗药物。

<应用实施例7>阿耳茨海默氏症(AD)

大脑皮质及海马结构中谷氨酸能性神经元以及基底(basal)前脑中胆碱能神经元的变性、淀粉斑块的细胞外沉积、及细胞内神经原纤维缠结是AD的病理学特征。已报道，在AD中自由基的过度生成产生脂质过氧化反应、8-羟基脱氧鸟嘌呤核苷、蛋白羰基、硝化作用或蛋白的氧化交联，这表明氧化应激是AD中神经元死亡的主要成因[Vitek et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，91：4766-4770(1994)；Smith et al.，Trends.Neurosci.，18：172-176(1995)，Mol.Chem.Neuropathol.，28：41-48(1996)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，94：9866-9868(1997)；Montine et al.，J.Neuropathol.Exp.Neurol.，55：202-210(1996)]。事实上，已经在AD患者体内对抗氧化剂的疗效进行了广泛研究。Zn²⁺在AD患者的大脑中(扁桃体(amygdala)、海马体、顶下小叶(inferior parietal lobule)、顶部和中部颞颥脑回(superior andmiddle temporal gyri))累积，主要在淀粉斑块的中央和周围，并引起β淀粉质的聚集[Bush et al.，Science 265：1464-1467(1994)；Lovell et al.，J.Neurol.Sci.，158：47-52(1998)]。因此，显示抗氧化应激和抗ZN²⁺毒性的保护作用的本发明化合物可以用作AD的治疗药物。

<应用实施例8>眼科疾病和白内障

在青光眼中，眼内压力上升阻碍了血液流入视网膜中，造成视网膜缺血，并诱导谷氨酸盐过度释放入突触间隙中。一旦释放，谷氨酸盐通过在后突触(post-synaptic)神经元中打开钙通道并提高细胞内Ca²⁺的浓度来诱导NMDA受体介导的兴奋毒性。也可以通过在再灌注过程中增加活性氧类物质的产生来造成视网膜细胞的变性。[Osborne N.N.et al.，Surv.Opththalmol.，43 suppl.，1：S102-28(1999)；Hartwick A.T.，Optom.Vis.Sci.，78：85-94(2001)]。给予NMDA受体拮抗剂或抗氧化剂来抑制青光眼动物模型中视网膜的变性[Gu.Z.et al.，Nippon Ganka Gakkai Zasshi，104：11-6(2000)；Vorwerk C.K.et al.，Surv Ophthalmol.，43 suppl.，1：S142-50(1999)；Schwartz M.et al.，Eur.J.Ophthalmol.，9 Suppl.，1：S9-11(1999)]。

在视网膜病和斑点变性(macular degeneration)中，神经元变性可以通过抑制兴奋毒性和氧化应激(此类疾病的主要成因)来阻断[Lieth E.et al.，Clin.Experiment Ophthalmol.，28(1)：3-8(2000)；Moor P.et al.，Exp.EyeRes.，73：45-57(2001)；Winkler B.S.et al.，Mol.Vis.，5：32(1999)；Simonelli F.et al.，Clin.Chim.Acta.，320：111-5(2002)]。

白内障是一种伴随晶状体不透明的老年疾病。氧化应激被认为是白内障的主要媒介。实际中已经使用抗氧化剂来治疗白内障[Varma et al.，Curr.Eye Res.3：35-57(1984)；Anderson et al.，Adv.Exp.Med.Biol.，366：73-86(1994)]。

因此，显示抗兴奋毒性和抗氧化应激的多重保护作用的本发明化合物可以用作眼科疾病的治疗药物。

<应用实施例9>药物成瘾

在凸出至伏隔核的中脑腹侧被盖区内的中脑边缘(mesolimbic)多巴胺能神经元的活化是需要神经元兴奋性的药物成瘾过程所必需的。[Self D.W.and Nestler E.J.，Annu.Rev.Neurosci.，18：463-95(1995)]。多方面的证据支持可以使用NMDA受体拮抗剂来减少神经元对滥用药物的适应性，并已经被建议作为药物成瘾的新型治疗药剂[Boening et al.，Alcohol Clin.Exp.Res.，25：127S-131S(2001)；Vorel et al.，Science，292：1175-8(2001)]。

<应用实施例10>抑郁症

三环抗抑郁剂和MAO(单胺氧化酶)抑制剂(抗抑郁剂)可增强去甲肾上腺素和5-羟色胺的神经传递。现有的治疗药物通过与其它神经系统相互作用诱导许多副作用，并且对30％的抑郁症患者没有治疗效[Pacher etal.，Curr.Med.Chem.，Feb.8(2)：89-100(2001)]，近来发现NMDA受体拮抗剂可用作抑郁症的新型治疗药物[Le D.A.and Lipton S.A.，DrugsAging，18：717-724(2001)；Petrie et al.，Pharmacol.Ther.，87：11-25(2000)]。

<应用实施例11>疼痛

与外科手术、癌症患者和外伤等相关的外周损伤和神经组织损伤后神经传递的增强造成神经性疼痛[Hempenstall K.and Rice A.S.，Curr.Opin.Investig.Drugs.，Mar；3(3)：441-8(2002)；McDonnell et al.，Curr.Oncol.Rep.，2：351-7(2000)]。由于NMDA受体的活化作用是神经性疼痛过程必需的，有报道称NMDA受体拮抗剂可用作治疗神经性疼痛的治疗药物[Parson C.G.，Eur.J.Pharmacol.，429：71-8(2001)；Hewitt，Clin.J.Pain.，16：S73-9(2000)]。

<应用实施例12>多发性硬化、脑膜炎、脑炎或脑积水

氧化应激在多发性硬化、脑膜炎、脑炎或脑积水的发病机理中起作用。在多发性硬化患者的体内抗氧化剂(如视黄醛、a-维生素E、b-胡萝卜素和抗坏血酸)的水平降低[Calabrese，V et al.，Int.J.Clin.Pharmacol.Res，14(4)：119-123(1994)；Besler H.T.et al.，Nutr.Neurosci.5(3)：215-220(2002)；Nutr.Neurosci.6(3)：189-196(2002)]。在脑膜炎患者及其动物模型[Maurizi C.P.，Med.Hypotheses，52(1)：85-87(1999)；Christen S.et al.，Free Radic.Biol.Med，31(6)：754-762(2001)；Kastenbauer S.et al.，Neurology，58(2)186-191(2002)]、脑炎病毒感染模型[Fujii，S.et al.，Virology，256(2)：203-212(1999)；Raung S.et al.，Neurosci.Lett.，315(1-2)：9-12(2001)]、及脑积水患者[Nuss J.I.et al.Am.J.Vet Res.，28(127)：1909-1913(1967)；Vannucci R.C.et al.，Dev.Med.Child.Neurol.，22(3)：308-316(1980)；Radwanska-Wala B.et al.，Pathol.Res.Pract.，198(6)：421-423(2002)]中发现ROS产生和神经元细胞死亡的增加。因此，显示抗氧化应激保护作用的本发明化合物可以用作治疗由多发性硬化、脑膜炎、脑炎或脑积水引起的神经元死亡的药物。

本发明是以说明的方式进行描述的，且应该理解，所用术语具有描述性质而不具有限定作用。依照上述教导可以对本发明进行各种修改和变化。因此，可以理解，在所附权利要求范围内可以不同于以上具体描述的方式实施本发明。

                        工业实用性

如上文中所述，四氟苄基衍生物或其药物可接受的盐，以及含有上述物质作为有效成分的药物组合物可预防和治疗如上所述的神经变性疾病(例如肌萎缩性脊髓侧索神经硬化、帕金森症、亨廷顿症或阿耳茨海默氏症)，神经元痉挛性疾病(如癫痫症等)，以及由中风、外伤或脑积水造成的脑损伤，由青光眼和视网膜疾病引起的眼科疾病，由药物成瘾和抑郁症引起的精神疾病，神经性疼痛，由脑膜炎和脑炎引起的炎症。