实时定量检测上皮生长因子受体基因表达水平的试剂盒和方法

摘要

本发明提供了一种体外定量检测靶细胞中上皮生长因子受体EGFR基因表达水平的方法，该方法包括以下步骤：从靶细胞中抽提RNA并获得cDNA；在EGFR基因序列第1744－1871位核苷酸区间内选择引物和Taqman探针，并根据EGFR基因序列第1520－2016位核苷酸制备标准品，应用Taqman技术对EGFR基因表达进行实时定量PCR分析。本发明还提供了用于实时定量PCR检测靶细胞中EGFR基因表达水平的试剂盒。

说明书

技术领域

本发明涉及医学肿瘤学领域。具体地说，本发明描述了一种上皮生长因子受体(EGFR)基因表达的实时定量PCR检测新方法。

背景技术

肿瘤细胞失控性增殖和侵袭转移等恶性生物学行为是一个需要多基因参与的复杂事件，这些基因在时间和空间上的协同作用受细胞内信号传递链的调控。因而选择性地控制若干关键性信号分子的作用、干扰信号传递链的正常运行，是二十一世纪肿瘤化疗的一个发展方向。

上皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)是上述信号传递链的一个重要环节。EGFR属于I型受体酪氨酸激酶(Receptor Tyrosine Kinase，RTK)家族，该受体在多种恶性实体肿瘤中表达增高(表1)。根据上海市肿瘤研究所的最新统计资料，这些肿瘤的发病率居上海市区恶性肿瘤的前10位，占恶性肿瘤总发病率的80％。

                        表1 EGFR在恶性实体肿瘤中的表达

肿瘤类型肺癌乳腺癌  胃  癌  肝  癌  肠  癌  食  管  癌  前  列  腺  癌  膀  胱  癌  胰  腺  癌  肾  癌阳性率40～8014～91  33  ～  74  47  ～  68  25  ～  77  43  ～  89  40  ～  80  35  ～  86  30  ～  50  50  ～  90

EGFR与erbB2，erbB3和erbB4共同组成RTK家族的一个分支，称为EGFR家族。这类受体的蛋白结构大体可以分为3个功能区，即细胞表面的配基结合区、跨膜区和细胞内的酪氨酸激酶区。这些受体在生理状态下以单体形式存在，但与配基结合时可以形成同源或异源二聚体。同源二聚体是指2个相同的受体(如EGFR/EGFR)聚合，而异源二聚体则为不同受体成员间的聚合。EGFR受体可与多种配基特异性结合，这些多肽生长因子包括上皮生长因子(Epidermal growth factor，EGF)，转化生长因子-α(Transforming growth factor-α，TGFα)，二性调节素(Amphiregulin，AR)，β-细胞素(Betacellulin，BTC)，上皮调节素(Epiregulin，EPR)和结合肝素的EGF样生长因子(Heparin-binding EGF-like growth factor，HB-EGF)。EGFR与配基结合形成受体二聚体后其酪氨酸激酶即被活化，使受体发生自身磷酸化，磷酸化的受体可以与含有SH2(Src同源区2)功能区的信号传递蛋白结合并通过磷酸化使其活化，其中最主要的信号传递蛋白包括c-Src，JAK和STAT。上述信号传递蛋白均为酪氨酸蛋白激酶，其活化后借助磷酸化级联反应，通过MAPK-ERK、PI3K-AKT和Src-STAT三个不同的信号通路将受体信号传递到核内，从而启动基因表达。EGFR受体活化的主要生物学效应是刺激细胞增殖。当细胞恶变时EGFR受体或其配基过表达，从而通过自分泌(Autocrine)或旁分泌(Paracrine)方式刺激细胞形成失控性增殖。此外，EGFR过度活化还可以启动多种蛋白水解酶和促血管生成因子(如VEGF)的表达，从而加速癌细胞转移。因此，EGFR过表达者通常预后较差。

近年来，以EGFR为治疗靶点的分子靶向治疗(Molecular Targeting Therapy)引起了国内外肿瘤界的普遍关注，目前已有多种靶向药物正在进行临床试验(表2)，这些靶向药物大致可以分为2类：(1)受体特异性单抗，如IMC-C225(Erbitux)。(2)小分子受体酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，如ZD1839(Iressa或Gefitinib)。这类药物的主要作用机理是抑制受体聚合或TK磷酸化，从而阻断受体的信号转导。它们与细胞毒化疗药物的不同之处是对治疗靶点具有高度选择性，因而必须选择受体阳性肿瘤进行治疗才能获得预期疗效，尤其是抗体类靶向药物，其疗效与受体表达水平呈正相关。多数学者主张在用药前应进行受体检测，选择受体高表达肿瘤进行治疗。

目前EGFR的检测技术大体分为二类，一是检测受体的蛋白表达，如免疫组化和免疫印迹，二是检测受体的信使RNA(mRNA)表达，如逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)和实时定量PCR(Quantitative Real-time PCR)。这些方法的一个共同点是需要足够大小(直径＞5mm)的肿瘤组织才能进行检测，但晚期肿瘤多处于破裂出血等高危状态，对其进行活检获取所需的肿瘤组织有可能出现严重的医疗意外，患者可能因此不愿承担风险。此外，对术后复发病人，一些转移病灶因处于特殊的解剖部位(如脑转移等)而不适宜这类手术。因而有必要寻找替代(Surrogate)材料，能够客观地反映原发肿瘤中的受体表达状况。

               表2 EGFR受体特异性靶向药物

  药物治疗靶点特性研究现状  Erbitux   ABX-EGF  Iressa  Tarceva   EKB-569   GW-2016  CI-1033   PKI-166 EGFR EGFREGFREGFR EGFR EGFR、ErbB2EGFR各成员 EGFR、ErbB2 人-鼠嵌合抗体 人源化单抗喹唑啉类、可逆性TKI喹唑啉类、可逆性TKI 喹唑啉类、不可逆性TKI喹唑啉类、可逆性TKI喹唑啉类、不可逆性TKI吡咯嘧啶类、可逆性TKIIII期临床II期临床批准上市III期临床I期临床 I期临床I期临床 I期临床

发明内容

为了解决上述问题，本发明第一方面提供了一种体外定量检测靶细胞中上皮生长因子受体EGFR基因表达水平的方法，该方法包括以下步骤：

(1)从靶细胞中抽提RNA并获得cDNA；

(2)在EGFR基因序列第1744-1871位核苷酸区间内选择引物和Taqman探针，并根据EGFR基因序列第1520-2016位核苷酸制备标准品，应用Taqman技术对EGFR基因表达进行实时定量PCR分析。

本发明另一方面提供了一种用于实时定量PCR检测靶细胞中EGFR基因表达水平的试剂盒，所述试剂盒包含特异性上游引物、下游引物、DNA标准品以及Taqman探针，其中所述特异性上游和下游引物和Taqman探针在EGFR基因序列第1744-1871位核苷酸区间内进行选择，所述DNA标准品根据EGFR基因序列第1520-2016位核苷酸进行制备。

针对上述问题本发明者研究并开发出了高度敏感和特异性的实时定量PCR方法和试剂盒，该方法能够对含5个癌细胞以上肿瘤组织进行EGFR mRNA检测，从而解决肿瘤穿刺活检标本中微量癌细胞的检测问题。约四分之三的晚期肿瘤病人血液可以检出游离癌细胞。将这些微转移癌细胞分离纯化后应用实时定量PCR方法进行EGFR mRNA检测，可以解决无法获得肿瘤穿刺活检标本病人的检测问题。因而本发明专利适用于对微量肿瘤活检材料以及血液微转移肿瘤细胞中EGFR基因表达进行定量分析，有助于临床医生有针对性地采取分子靶向治疗措施。

附图简述

图1显示了EGFR基因表达的RT-PCR分析结果，其中泳道1为引物1的反应产物(以cDNA为模板)(504bp)；泳道2为引物2反应产物(以引物1反应产物为模板)(176bp)；泳道3为引物2反应产物(以cDNA为模板)(176bp)；M为分子量标记，其中横线从上到下依次表示500bp，200bp和100bp。

图2显示了SPC-A1肺癌细胞EGFR受体表达的流式细胞分析结果。

图3A和3B显示了EGFR基因表达的实时定量PCR检测的标准曲线。

图4A和4B显示了GAPDH的实时定量PCR检测的标准曲线。

具体实施方案

本发明第一方面提供了一种体外定量检测靶细胞中上皮生长因子受体EGFR基因表达水平的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)从靶细胞中抽提RNA并获得cDNA；

(2)在EGFR基因序列第1744-1871位核苷酸区间内选择引物和Taqman探针，并根据EGFR基因序列第1520-2016位核苷酸制备标准品，应用Taqman技术对EGFR基因表达进行实时定量PCR分析。

实时定量PCR是根据Taqman技术发展起来的一项新颖的基因检测方法，其原理是将靶基因特异性的一组引物和荧光标记的Taqman探针与模板cDNA进行杂交，然后在多聚酶链反应过程中利用Taq酶的3’-核酸外切酶活性水解探针3’-端的荧光淬灭基团，获得荧光激发信号，后者与模板量呈正相关。Taqman探针的制备以及荧光淬灭基团和荧光报告基团的选择对于本领域技术人员而言是众所周知的。

本发明者根据Genbank数据库中公开发表的EGFR(X00588)和GAPDH(M33197)基因序列，采用美国赛百盛公司提供的引物设计软件，通过在EGFR基因序列第1744-1871位核苷酸区间和第1520-2016位核苷酸区间分别设计了2组引物，PCR扩增后获得了相应的条带。对扩增产物进行核苷酸序列测定，证实扩增产物序列与文献报道完全一致，说明上述引物对选定的基因具有高度特异性。

本发明的方法能对EGFR表达进行绝对定量的实时定量PCR检测方法。具体而言，本发明者采用引物1(例如表3中的SEQ ID NO：6、7)进行PCR扩增得到双链DNA片段，经纯化后作为定量PCR分析的标准品。以引物2(例如表3中的SEQ ID NO：8、9)及探针(例如表3中的SEQ ID NO：10)组合进行定量PCR检测，经过反应条件优化，获得了线性结果。实验证明，采用该项技术对EGFR和GAPDH基因表达进行检测，标准曲线的相关系数(R)均大于0.999。上述试剂保存于-70C在6个月内非常稳定，不同实验间的误差小于5％。

然而，本领域技术人员应当能够理解，列举上述具体的两组引物和探针仅仅是为了描述本发明，它们并不起任何限制性的作用。本领域技术人员在阅读了本说明书后，能够采用常规的手段在EGFR基因序列第1744-1871位核苷酸区间内通过适当选择其他引物来合成DNA标准品，也能够在EGFR基因序列第1744-1871位核苷酸区间内选择其它合适的引物和探针来达到本发明的目的。

应用上述试剂对4个人体肿瘤细胞株(SK-BR3、H460、H1299和A549)进行了检测，证明这些细胞表达不同水平的EGFR基因。进一步采用流式细胞仪对上述细胞表面EGFR蛋白表达进行分析，证实定量PCR检测到的mRNA表达与蛋白表达一致。

本发明者还对55例原发肺癌组织、10例肺癌活检组织和60例肺癌病人外周血进行了定量PCR分析，结果显示上述样本中EGFR阳性表达率分别为43.6％，50.0％和51.2％，说明以微量活检组织和外周血癌细胞为材料进行EGFR基因表达分析，可以作为判断原发肿瘤中该基因表达水平的依据。

因此，本发明第二方面还提供了一种用于实时定量PCR检测靶细胞中EGFR基因表达水平的试剂盒，所述试剂盒包含特异性上游引物、下游引物、DNA标准品以及Taqman探针，其中所述特异性上游和下游引物和Taqman探针在EGFR基因序列第1744-1871位核苷酸区间内进行选择，所述DNA标准品根据EGFR基因序列第1520-2016位核苷酸进行制备。

以下借助非限制性实施例详细描述本发明。

实施例1：引物设计及PCR产物测序

1.1材料与方法

人体肺癌细胞株SPC-A1及SPC-L1购自中科院上海生化细胞所。胎牛血清及RPMI1640培养液为GIBCO公司产品。Trizol RNA抽提试剂盒购自上海申能博采生物科技有限公司提供。RevertAid^TM第一链cDNA合成试剂盒购自立陶宛MBI Fermentas公司。PCR引物由上海申友生物技术有限责任公司合成。10mM dNTP、Pfu高保真DNA聚合酶(5Unit/μl)购自上海申能博采公司。PCR产物测序由上海申友公司完成。

根据Genbank数据库中公开发表的EGFR(X00588)和GAPDH(M33197)基因序列，采用美国赛百盛公司提供的引物设计软件，分别设计了2组引物(表3)。

                             表3 PCR引物及探针序列

  基因引物  核苷酸  位置  序列  (5’-3’)    Tm(℃)    产物    (bp)  GAPDH上游1  44-63  cac atc gct cag aca cca tg  (SEQ ID NO：1)    61.35    468下游1  491-511  agg cat tgc tga tga tct tga  (SEQ ID NO：2)    60.76上游2  65-84  gga agg tga agg tcg gag tc  (SEQ ID NO：3)    61.03    219下游2  243-262  gaa gat ggt gat ggg att tc  (SEQ ID NO：4)    56.78探针    FAM-caa gct tcc cgt tct cag cc-TAMRA    (SEQ ID NO：5)    64.51  EGFR上游1  1520-  1540  taa cat cct tgg gat tac gct  (SEQ ID NO：6)    56.62    504下游1  1996-  2016  gta ctt cca gac cag ggt gtt  (SEQ ID NO：7)    56.53上游2  1744-  1761  ccc agg gac tgc gtc tct(SEQ  ID NO：8)    61.59    176下游2  1851-  1871  cac tct ggg tgg cac tgt atg  (SEQ ID NO：9)    60.99探针    FAM-ccg gaa tgt cag ccg agg cag-TAMRA    (SEQID NO：10)    71.86

选择活跃增殖期细胞按试剂盒要求抽提总RNA，采用紫外分光光度计(Biophotometer，德国Eppendorf公司)测定A260及A280。

取2μg RNA按试剂盒要求合成cDNA，反应体积为20μl。

PCR反应混合液为：1μl cDNA，上游及下游引物1(50μM)各1μl，dNTP 1μl，Pfu酶1μl，加DEPC-H₂O至50μl，石腊油30μl覆盖。PCR反应条件为：95℃变性5min；95℃1min，56或60℃1min，72℃1min，35个循环；72℃延伸7min。

PCR产物经1.6％琼脂糖电泳100V 30min，RB染色摄片。阳性产物的测序采用上游引物，由上海申友公司协助完成。

1.2结果

图1结果显示，在给定的反应条件下，引物1能扩增出单一条带。取引物1PCR产物，采用引物2进行第二轮PCR扩增，也获得了单一条带，其PCR产物大小与应用cDNA直接扩增所得结果相同，说明引物2对所选定的基因具有高度特异性。测序后证实，扩增产物的核苷酸序列与预期序列完全一致。

实施例2：肿瘤细胞中EGFR基因和蛋白表达的相关性

2.1材料与方法

人体肺癌细胞株H460由美国德州大学MD Anderson癌症中心Paul J Chiao教授惠赠。人体肺癌细胞株SPC-A1及SPC-L1，人体乳腺癌细胞株SK-BR3购自中科院上海生化细胞所。H460及SK-BR3细胞采用含10％胎牛血清的DMEM培养液，SPC-A1及SPC-L1细胞采用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液。

PCR产物纯化试剂盒购自上海申能博彩公司。定量PCR引物(引物2)及荧光素标记探针由上海申友公司合成。荧光定量PCR试剂盒购自大连宝生物工程公司。

EGFR特异性抗体C225及荧光素FITC标记的羊抗鼠IgG抗体购自美国NeoMarker公司。

应用引物1对SPC-A1细胞RNA进行RT-PCR扩增，扩增产物经PCR产物纯化试剂盒纯化后采用紫外分光光度计测定双链DNA含量，纯化产物中的基因拷贝数按下述公式计算：

基因拷贝数/μl＝[A260/13.2×片断长度(kb)]×6.02×10¹¹

定量PCR反应母液：10×PCR反应缓冲液2.5μl，250mM MgCl₂ 0.75μl，100μM上游及下游引物2各0.1μl(400nM)，50μM荧光素标记探针0.1μl(200nM)，10mM dNTP 0.5μl，热启动Taq(TaKaRa Ex Taq HS)酶0.25μl(1.25U)，加DEPC-H₂O至23μl。上述反应母液保存于-70℃。

定量PCR反应液：23μl反应母液中加入2μl cDNA。

定量PCR反应条件：50℃预热300秒；95℃变性300秒；95℃20秒，60℃60秒，40个循环，60℃检测；37℃30秒。

定量PCR仪为LightCycler(瑞士Roche公司)。

流式细胞分析：取活跃增殖期细胞，调整至10⁷细胞/ml。在5ml塑料离心管内分别加入100μl细胞及1μg抗体，置冰浴30min后用磷酸缓冲液(PBS，pH7.4)离心洗涤2次，重悬细胞于100μl PBS中(内含10％牛血清及5μg荧光素FITC标记的羊抗鼠Ig G)，冰浴30min后用PBS离心洗涤2次，上机分析(美国Beckman-Coulter公司EPICS XL型流式细胞仪)。

2.3结果

A、标准曲线分析

在基因拷贝数为10⁵-10⁸范围内，应用本方法能够给出线性结果，其标准曲线的相关系数R均＞0.999(见图3和图4)。此外，反应母液保存于-70℃条件下在6个月内非常稳定，不同实验间误差≤5％。

B、肿瘤细胞中EGFR基因及蛋白表达分析

不同的人体肿瘤细胞表达EGFR基因有明显差异。若以内参照基因GAPDH拷贝数作为基准，各细胞株的表达值(EGFR拷贝数/10³GAPDH拷贝数)见表4。

为了进一步分析mRNA表达水平与蛋白表达水平的相关性，本发明者采用流式细胞分析技术检测了上述细胞表面EGFR蛋白的表达(图2例举了阳性表达细胞SPC-A1的流式细胞仪分析结果)。表4结果表明，细胞表面EGFR蛋白的荧光指数(FI)和阳性细胞百分率与实时定量PCR检测到的基因表达值之间存在较好的相关性。因此，应用实时定量PCR检测上述基因的mRNA表达，可以反映其蛋白的表达水平。

   表4肿瘤细胞中EGFR基因及蛋白表达的相关性

    细胞株    EGFR基因    (拷贝/10³GAPDH)    EGFR蛋白    阳性率(％)    SPC-A1    SPC-L1    SK-BR3    H460    44.79    43.99    41.43    4.05    99.8    99.6    98.7    3.3

实施例3：实时定量PCR检测的敏感性分析

3.1材料与方法

人体肺癌细胞SPC-A1培养在含10％胎牛血清的RPMI培养液中。Trizol RNA抽提试剂盒及糖原购自上海申能博采生物科技有限公司。RevertAid^TM第一链cDNA合成试剂盒购自立陶宛MBI Fermentas公司。EGFR及GAPDH定量PCR分析试剂见实施例2。

取活跃增殖期细胞，调整至1×10⁵，1×10⁴，1×10³及1×10²细胞/ml。各浓度细胞分别取50μl，加入800μl Trizol及10μl糖原，按试剂盒方法抽提RNA。所得的RNA溶解于10μl DEPC-H₂O中供cDNA合成，反应体积为20μl。

各取2μl cDNA进行定量PCR检测，反应条件见实施例2。

3.2结果

表5结果显示，应用本方法在5-5000个肿瘤细胞范围内能够获得线性检测结果。实验结果表明，定量PCR检测EGFR基因表达的敏感性为5个肿瘤细胞/样本。

     表5 EGFR基因表达的定量PCR检测

    实验    细胞数量    EGFR(Ct值)    实验一       实验二       5000    500    50    5    5000    500    50    5    25.62    27.89    31.85    34.72    23.52    24.76    30.37    35.77

实施例4：肺癌组织EGFR基因表达的定量PCR分析

4.1材料与方法

55例非小细胞肺癌，男性42例，女性13例。所有肿瘤组织均经病理检查证实，组织类型为腺癌22例，鳞癌20例，腺鳞癌13例。病理分期为I期18例，II期12例，III期25例。

10例正常肺组织取自距离肺癌病灶5cm以上的手术切除肺叶，经病理检查不含癌组织。

实验所用试剂及方法详见实施例2和3。

4.2结果

10例正常肺组织中EGFR表达值为244.89±146.73(单位：拷贝数/10³GAPDH拷贝)。55例肺癌组织中EGFR表达值为768.47±1128.92。以正常肺组织EGFR均数+2标准差(540)作为阳性标准，则肺癌中EGFR阳性率为43.6％(24/55例)，其中EGFR表达值大于阳性标准2倍(1080)的高表达者8例，占14.5％。

实施例5：肺癌活检组织中EGFR基因表达的定量PCR分析

5.1材料与方法

10例肺癌患者在知情同意下接受活检手术，其中5例为纤维支气管镜下获得的活检及毛筛样本，2例为锁骨上淋巴结穿刺样本，3例为胸水。所有活检材料均经病理检查，其中1例气管镜活检组织和1例胸水中未找到癌细胞，其余组织均为肺腺癌。

活检材料保存在生理盐水中，经1500rpm离心2min后去上清，组织材料于-70℃保存待测。胸水经1500rpm离心10min后去上清，细胞沉淀重悬于5ml生理盐水中，然后每样本中加入50μl EPCAM(上皮细胞粘附分子)抗体交联的免疫微球(挪威Dynal Biotech ASA公司)，在室温下以30rpm转速颠倒混匀2小时，按试剂盒要求分离阳性细胞组分。-70℃保存待测。

实验所用试剂及方法详见实施例2和3。

5.2结果

活检材料首先进行GAPDH和端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA检测，若未检测到GAPDHmRNA，表明其中不含细胞成分。GAPDH mRNA检测阳性的样本进行hTERT mRNA检测，若hTERT mRNA高于正常肺组织阳性标准(10拷贝/10³GAPDH拷贝)，则表明为癌性组织(资料未列)。

10例样本1例胸水中不含细胞成分，1例气管镜活检组织不含癌细胞，检测结果与病理检查吻合。8例癌性活检组织中4例EGFR表达低于阳性标准，4例为阳性表达，阳性率为50.0％，其中2例为高表达，占25.0％。

实施例6：肺癌病人外周血微转移癌细胞中EGFR基因表达的定量PCR分析

6.1材料与方法

60例IIIb-IV期肺癌患者，男性38例，女性22例，组织类型为腺癌55例，肺泡细胞癌5例，其中40例未接受过手术治疗，20例为术后复发。

27例健康志愿者，男性20例，女性7例，均为在校大学生。

所有人员均在知情同意下采集外周血5ml，10U/ml肝素抗凝。

血液样本经1500rpm离心10min后去血浆，用生理盐水加至5ml，然后每样本中加入50μl EPCAM抗体交联的免疫微球(挪威Dynal Biotech ASA公司)，在室温下以30rpm转速颠倒混匀2小时，按试剂盒要求分离阳性细胞组分。-70℃保存待测。

实验所用试剂及方法详见实施例2和3。

6.2结果

27例健康人血液样本中20例不含细胞成分，其余7例样本不含癌细胞。

60例肺癌血液样本11例不含细胞成分，其余49例中6例不含癌细胞，因而癌细胞检出率为71.7％(43/60例)。此43例中EGFR低于阳性标准的有21例，占48.8％，阳性表达的有22例，占51.2％，其中高表达的有18例，占41.9％。

表6列举了肿瘤原发组织、活检组织和外周血癌细胞中EGFR基因表达的检测结果。实验结果揭示，EGFR的阳性检出率在不同来源的样本中基本相同，说明以微量活检组织和外周血癌细胞为材料进行EGFR基因表达分析，可以作为判断原发肿瘤中该基因表达水平的依据。但外周血癌细胞中EGFR高表达的比例显著高于原发肿瘤和活检组织，提示肿瘤组织中EGFR高表达的癌细胞具有较强的转移能力。

        表6肿瘤原发组织、活检组织和外周血癌细胞中EGFR基因表达

       样本来源  原发肿瘤  活检组织  外周血      例数    55    8    43                    EGFR基因表达(％)  正常范围  31(56.4)  4(50.0)  21(48.8)    阳性表达    24(43.6)    4(50.0)    22(51.2)  高表达  8(14.5)  2(25.0)  18(41.9)

注：EGFR正常范围为＜540；阳性表达为≥540；高表达为≥1080。

虽然上面结合实施例对本发明进行了具体描述，但是熟悉本领域的专业技术人员均了解，在不违背本发明的原则和精神的情况下，根据本说明书及所附权利要求书中公开的内容，可对本发明做出各种变动和改进。因此，所有这些变动和改进均应包括在所附权利要求书中所要求的保护范围之内。

序列表

<110>董，强刚

<120>实时定量检测上皮生长因子受体基因表达水平的试剂盒和方法

<130>041069

<160>10

<170>PatentIn version 3.1

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<213>人工序列

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<221>misc_feature

<223>引物

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<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>6

taacatcctt gggattacgc t                                             21

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>7

gtacttccag accagggtgt t                                             21

<210>8

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>8

cccagggact gcgtctct                                                 18

<210>9

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>9

cactctgggt ggcactgtat g                                             21

<210>10

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>探针

<400>10

ccggaatgtc agccgaggca g                                             21