抗IV型胶原酶单抗Fab’片段－多聚谷氨酸－平阳霉素免疫偶联物

摘要

本发明涉及一种免疫偶联物Fab’－PLG－PYM，该偶联物是由抗IV型胶原酶单克隆抗体3G11的Fab’片段、多聚谷氨酸(PLG)分子以及抗肿瘤抗生素平阳霉素(PYM)构成的，该偶联物具有靶向杀伤肿瘤细胞和显著抑制肿瘤的效果，可作为新型、高效抗肿瘤导向药物应用于肿瘤治疗。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种免疫偶联物Fab’-PLG-PYM，该偶联物是由抗IV型胶原酶单克隆抗体3G11的Fab’片段、多聚谷氨酸(PLG)分子以及抗肿瘤抗生素平阳霉素(PYM)构成的。所说偶联物具有靶向杀伤肿瘤细胞和显著抑制肿瘤的效果，可作为新型、高效抗肿瘤靶向药物应用于肿瘤治疗。

背景技术：

平阳霉素(PYM)是我国自主研发的一种糖肽类抗肿瘤抗生素，属于博莱霉素A5组分，在中国上世纪80年代初即用于头颈部鳞癌和恶性淋巴瘤等肿瘤的临床治疗。针对平阳霉素制备其与单克隆抗体的免疫偶联物国内已有不少报道，江敏等将PYM与大鼠单抗3A5以葡聚糖T-40(DT-40)偶联后，偶联物有强烈杀伤肝癌细胞的活性(中华微生物学和免疫学杂志，1991，11：230)；将PYM以DT-40与抗鼻咽癌单抗BAC₅偶联，偶联物的体外活性是游离PYM的6.8倍(癌症，2003，22：831)。本研究室先前还制备了抗IV型胶原酶单抗3G11(菌种保藏号：CGMCC No.0831)的活性Fab’片段，其分子量是完整单抗的1/3，并同样以DT-40为交联剂制备了单抗Fab’片段与PYM的偶联物，偶联物分子量为170kDa，也体现了较游离药物更强的抗肿瘤作用(中华医学杂志，2001，81：201)。尽管Fab’片段较全抗分子而言其与PYM形成的偶联物已裁小许多，但由于偶联剂DT-40的分子庞大，使整个偶联物分子的进一步小型化受到很大限制。因此有必要寻找更小的分子应用于单抗Fab’片段与PYM的偶联，以得到更加小型、高效的单抗靶向药物。

多聚谷氨酸是由谷氨酸分子聚合而成的单一氨基酸直链聚合分子，其中的多聚-α-L-谷氨酸(poly-α-L-glutamic acid，PLG)可与小分子药物连接形成聚合物。国外已有报道将PLG与不同抗肿瘤药物如柔红霉素(Journal of National Cancer Institute，1984，73：721)、紫杉醇(Cancer Research，1998，58，2404)、喜树碱(International Journal of Oncology，2001，18：331)等药物进行偶联，偶联物体内外均呈现出较好的抗肿瘤效果，其中一些已进入不同阶段的临床研究。许多证据表明，PLG因其无毒性、有良好的生物相容性和生物降解性已广泛应用于抗肿瘤药物的偶联。但迄今为止，国内外均未见到有关多聚谷氨酸用于平阳霉素及其同系物博莱霉素偶联的报道。值得注意的是，已报道的这些偶联物中PLG的大小在21～46kDa之间，就分子量而言与DT-40的差异并不显著，而本发明所采用的PLG其平均分子量仅为7,500Da，大大小于目前报道的PLG。在PYM偶联方面，与以往所用的交联剂DT-40相比，本发明使用的PLG分子很小且结构呈直链状，空间位阻小，反应专一完全，简单可控，产物单一易纯化，可能是一类合适的PYM靶向药物载体。本发明的研究表明，选用PLG加上SPDP构建的抗IV型胶原酶单抗活性片段Fab’与PYM的偶联物Fab’-PLG-PYM，其制备路线明确，反应完全且易控制，偶联产物单一，副产物少，便于下游纯化，偶联物不但较以往大大减小，分子量仅为66kDa，还具有明显的抗肿瘤作用，有望成为新型的抗肿瘤单抗靶向药物。

发明内容：

本发明所说的Fab’-平阳霉素偶联物是以多聚谷氨酸(PLG)作为药物中间载体，连同交联剂N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二巯基)丙酸酯(SPDP)分子一起将单克隆抗体3G11的Fab’活性片段与抗肿瘤抗生素平阳霉素(PYM)进行偶联构成的，偶联物的分子量约为66 kDa，其中Fab’、PLG和PYM的分子比约为1∶1∶4.2。

具体内容包括：

单抗3G11的Fab’片段制备及纯化；

Fab’片段与PYM偶联物的制备及纯化；

偶联物Fab’-PLG-PYM的鉴定和各组分的分子比计算；

偶联物Fab’-PLG-PYM的免疫活性测定；

偶联物Fab’-PLG-PYM对体外培养的肿瘤细胞的生长抑制作用检测；

偶联物Fab’-PLG-PYM对小鼠皮下移植肝癌22的治疗作用评价。

发明效果：

本发明的优点和积极效果在于提供了一种平阳霉素与单抗构建的新的靶向免疫偶联物。平阳霉素是临床常用的抗肿瘤药物，以多聚谷氨酸分子作为药物载体构建的平阳霉素与单抗活性Fab’片段偶联物具有分子量小、技术路线明确可控的优点，其体外对肿瘤细胞有靶向杀伤作用，体内抗肿瘤作用明显强于游离平阳霉素，还能显著延长动物的生存期，有望开发成为新型抗肿瘤靶向药物，具有良好的应用前景。

附图说明：

图1：Fab’-PLG-PYM偶联物经凝胶纯化后的SDS-PAGE检测

其中：1为蛋白分子量标准

      2为F(ab’)₂

      3为Fab’

      4为Fab’-PLG-PYM

图2：Fab’-PLG-PYM偶联物对抗原IV型胶原酶的免疫反应性

其中：1为Fab’

      2为Fab’-PLG-PYM

图3：PYM及Fab’-PLG-PYM偶联物对KB细胞的细胞毒作用

其中：1为PYM

      2为Fab’-PLG-PYM

图4：PYM及Fab’-PLG-PYM偶联物对PG细胞的细胞毒作用

其中：1为PYM

      2为Fab’-PLG-PYM

图5：PYM及Fab’-PLG-PYM偶联物对小鼠移植肝癌22的抑制作用

其中：1为对照

      2为10mg/kg剂量的PYM

      3为10mg/kg剂量的PLG-PYM

      4为5mg/kg剂量的Fab’-PLG-PYM

      5为10mg/kg剂量的Fab’-PLG-PYM

图6：PYM及Fab’-PLG-PYM偶联物对移植肝癌22小鼠生存时间的延长作用

其中：1为对照

      2为10mg/kg剂量的PYM

      3为10mg/kg剂量的PLG-PYM

      4为5mg/kg剂量的Fab’-PLG-PYM

      5为10mg/kg剂量的Fab’-PLG-PYM

具体实施方式：

以下所列实施例是为本领域技术人员更好地理解本发明，但不限制本发明。

实施例1：单抗3G11的Fab’片段制备及纯化

亲和纯化的单抗3G11用0.05M Tris-HCl(含2mM EDTA，pH 7.5)充分透析后浓度调整为4～6mg/ml，37℃预温30min后，按酶/底物(E/S，w/w)＝3∶110的用量加入同样预温的无花果蛋白酶Ficin(购自Sigma公司)，并加入终浓度为1mM的半胱氨酸激活反应，置37℃缓慢搅拌反应4h。产物经Sephadex G-150凝胶层析纯化后得到F(ab′)₂片段。F(ab′)₂片段以0.1M Tris-HCl(含10mM EDTA，pH 7.5)透析后超滤浓缩成2～5mg/ml，以10mM的β-MeSH室温还原1h，反应液立即经PD-10柱脱盐，以预先吹过氮气的PBS-EDTA缓冲液洗脱得到Fab’片段(菌种保藏号：CGMCC No.0831)，分子量约为53kDa(图1)。

实施例2：Fab’片段与平阳霉素偶联物Fab’-PLG-PYM的制备及纯化

选取平均分子量为7,500Da，聚合度为50的PLG(Sigma公司产品)用于偶联实验。将PLG与5～8倍过量的SPDP(Sigma公司产品)反应，室温搅拌1h后PD-10柱脱盐纯化，生成的SPDP衍生化的PLG通过脱水剂EDC与适量PYM(天津制药厂产品)进行缩合，PYM对PLG约5倍过量，室温反应2h，以20mM PBS-EDTA(含150mM NaCl、2mM EDTA，pH 7.4)缓冲液充分透析，得到偶联物PLG-PYM。将该偶联物与新鲜制备的Fab’片段混合，前者约对Fab’3倍过量，室温充氮气反应1h，反应液经离心浓缩，0.45μm滤膜去除沉淀后进行Sephacyl S-200凝胶层析纯化，得到的终产物为Fab’-PLG-PYM免疫偶联物。

实施例3：Fab’-PLG-PYM偶联物的鉴定及各组分的分子比计算

将Fab’-PLG-PYM进行非还原SDS-PAGE电泳检测(图1)，采用12％的分离胶，结果表明，偶联物经凝胶纯化后纯度达到80％以上，其平均分子量约为66kDa。以分光光度法测定偶联物中各组分的含量并计算分子比。结果表明，偶联物中Fab’、PLG和PYM的分子比约为1∶1∶4.2。由于Fab’分子量约为53kDa，选用的PLG平均分子量为7,500Da，故按上述的分子比求得的偶联物分子量亦为66kDa，与电泳所得结果一致。

实施例4：Fab’-PLG-PYM偶联物的免疫活性测定

将Fab’和Fab’-PLG-PYM调整到蛋白浓度一致后以常规间接ELISA法测定免疫活性(图2)。结果表明，偶联物保持了对抗原IV型胶原酶的免疫反应性，但与Fab’相比活性有所降低。

实施例5：Fab’-PLG-PYM偶联物对体外培养的肿瘤细胞的生长抑制作用检测

分别以克隆形成法和四氮唑蓝(MTT)法检测偶联物Fab’-PLG-PYM对体外培养的人口腔鳞癌KB细胞和人高转移巨细胞肺癌PG细胞的细胞毒作用。结果表明，Fab’-PLG-PYM对KB和PG细胞的半数克隆抑制浓度IC₅₀分别为1.91μM和0.27μM，而游离PYM的IC₅₀分别为0.27μM和0.18μM(表1)，表明尽管Fab’-PLG-PYM对肿瘤细胞的抑制作用弱于游离PYM，但对靶细胞PG的细胞毒性明显强于非靶细胞KB，体现了对靶细胞的选择性杀伤作用。MTT法同样证明了偶联物对两种细胞作用的差异(图3、图4、表1)。

表1  Fab’-PLG-PYM偶联物体外对不同细胞的增殖抑制作用

    组别                IC₅₀(μM)  KB^#  PG^#  KB^##  PG^##  PYM  Fab’-PYM  1.98  7.47  2.47  4.94  0.27  1.91  0.18  0.27

#为MTT法：##为克隆形成法

实施例6：Fab’-PLG-PYM偶联物对小鼠皮下移植肝癌22的治疗作用评价

将6～8周龄的雌性昆明小鼠随机分组，试验第0天取小鼠肝癌H22腹水，以生理盐水稀释成细胞数为5×10⁶/ml，按0.2ml/只接种于昆明小鼠腋窝皮下。实验第3天开始治疗，隔天给药共6次，均为尾静脉注射0.2ml/只。对照组给予生理盐水，其余各组分别给予的PYM(10mg/kg)、PLG-PYM(10mg/kg)和Fab’-PLG-PYM(5mg/kg和10mg/kg)。实验期间，每3～4天测量一次肿瘤的长径a和短径b，以公式V＝ab²/2计算瘤体积，绘制肿瘤生长曲线，计算抑瘤率。观察动物至100天，绘制动物生存曲线。结果表明，给药组动物的肿瘤体积明显小于对照组，而给药组中Fab’-PLG-PYM偶联物对肿瘤的抑制作用明显强于PYM和PLG-PYM(图5)。实验第22天，对照组肿瘤为6.59±3.43cm³，PYM组为2.80±2.52cm³，抑制率为60.6％，Fab’-PLG-PYM 5mg/kg和10mg/kg剂量组肿瘤分别为1.15±0.90cm³和0.65±0.65cm³，抑制率分别为82.5％和90.1％，显示了偶联物高效靶向的抗肿瘤作用(表2)。

             表2 Fab’-PLG-PYM偶联物对小鼠肝癌22的肿瘤抑制作用^#

    组别剂量(mg/kg)平均体重变化(g)肿瘤体积(cm³)(X±SD)  抑制率(％)对照PYMPLG-PYMFab’-PLG-PYM    -    10    10    5    +17.6    +11.5    +10.7    +9.4    6.59±3.43    2.80±2.52    1.23±1.01    1.15±0.90    -    60.6^*    81.3^**    82.5^**

Fab’-PLG-PYM   10   +8.0    0.65±0.65    90.1^**

#肿瘤接种后第22天的记录结果，动物无死亡。

^*p＜0.01与对照组比较

^**p＜0.01与PYM组比较

观察动物至接种后100天，结果表明，偶联物可显著延长动物的生存时间(图6)，100天时10mg/kg剂量的Fab’-PLG-PYM组仍有2只动物存活，中位生存时间达到80天，比对照组(中位生存时间为46天)生命延长了73.9％，而PYM组的中位生存时间为51天，只延长了10.9％。整个试验期间动物的体重正常增长，状态良好，表明动物可耐受所有剂量。