一种用于治疗和改善支气管呼吸困难的草药组合物

摘要

用作白三烯抑制剂、IL4合成抑制剂和Th1型免疫调节剂的药物组合物，所说的组合物包含有效量的得自萎叶(PB)和麻纹叶(M.k.)的叶或任何其它植物部分的冷冻干燥的水或醇提取物或得自这些提取物的生物活性级分，并且包含或不包含一种或多种可药用的成分。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于治疗和改善支气管呼吸困难的草药组合物。本发明涉及一种用于阻断5-脂肪氧化酶活性从而导致抑制白三烯合成、抑制IL4产生并增强IFNγ释放的草药制剂。更具体地讲，本发明描述了从麻纹叶(Murrya koenigii)和萎叶(Piper betle)的任何植物部分的提取物所获得的提取物或生物活性级分的分离、物理化学特性鉴定和生物学反应评估的方法，从而确立其在支气管呼吸困难的治疗和改善中所起的作用，其中所述的任何植物部分包括植物的叶、树皮、根和种子。

背景技术

呼吸问题包括伴有其它不适如哮喘、咳嗽、胸紧等等的轻度至十分严重的呼吸问题。尽管有预防措施、公众宣传和监测系统，但世界范围内有呼吸问题的人群一直在增加。在西方发达国家，尤其是在儿童中的确如此。申请人在其于2000年10月16日提交的序号为PCT/IN/00102的PCT专利申请中已经证明了使用麻纹叶的叶制剂可缓解并有可能治愈哮喘。在本发明中采取了双向策略。

呼吸疾病是由于免疫系统紊乱而产生的病理生理学症状的结果。直接症状包括支气管收缩、呼吸道的炎症和由于粘液分泌而导致的气管堵塞。对症的药物通过暂时缓解痛苦症状来提供缓解作用。

已证实麻纹叶提取物与得自萎叶的提取物合用可以表现出令人吃惊的结果。根据较早提交的未公开的PCT专利申请，萎叶的叶提取物表现出可使得自Th1型细胞的IFN-γ增加和得自Th2型细胞的IL-4下降。由于Th2型应答向Th1型的偏移将明显降低IgE(它是哮喘病症的主要操纵者)从肥大细胞的释放，所以这显然是一种有效的措施。因此，申请人随后提交的PCT专利申请PCT/IN00/00127与基于将得自麻纹叶和萎叶的任何植物部分的提取物联合用作治疗变应性哮喘的新药的本申请是一致的。

对症药物的开发者并没有很好地针对呼吸问题的根本原因。根据目前的知识，现在十分公认的是发现白三烯在呼吸问题症状的形成中是起主要作用的物质。

呼吸问题的主要症状可分为早期和晚期应答。早期应答在接触变应原的几分钟内发生并主要涉及介质如组胺、白三烯和前列腺素D2。这些介质的作用导致支气管收缩和粘液累积。晚期应答发生于几小时后并涉及另外的介质，包括IL-4、IL-5、IL-6以及TNF-α、嗜酸性粒细胞趋化因子(ECF)和血小板聚集因子(PAF)。这些介质的综合作用是募集包括嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞在内的炎性细胞。这些细胞能通过释放有毒的酶而造成明显的组织损伤。这些事件导致了由于粘液蛋白和细胞碎屑引起的支气管腔堵塞，从而使得基底膜增厚、液体聚集以及支气管平滑肌肥大。常常形成粘液栓并粘附到支气管壁上。粘液栓包含脱离的上皮细胞碎片、嗜酸性粒细胞、一些嗜中性粒细胞和被称为Curschmann′s螺旋(Immunology，J.Kuby；W.H.Freeman & Co.，New York；第3版，1997)的支气管组织螺旋的聚簇。鉴于目前有关支气管哮喘/支气管呼吸问题的临床表现机理，现代的药物研制策略着重于下述途径：

这些途径包括i)通过阻断5-脂肪氧化酶的酶活性而抑制白三烯的合成(Leqqis RA等人，New England，J.Med.323：，645，1990)。白三烯的形成起源于花生四烯酸的氧化，因此抑制这种反应可抑制白三烯的合成。此外，已经采用白三烯受体拮抗剂作为哮喘/呼吸问题的抗白三烯治疗(Tien F.C.，Medical J.Aust.171：378，1999)。目前许可的以抑制花生四烯酸氧化为基础的药物zelutin已经被广泛地引入到US市场。但是，其应用受到了肝毒性的限制。不建议小于14岁的儿童使用这种药物。此外，使用其它药物的患者在使用zelutin作为抗哮喘药时需要进行监测。ii)通过抗-IgE抗体(人源化)或通过阻断高亲合力的IgE受体——FcεR-I来中和IgE(Heusser C，Jardiu P.Current Oppinio Immunol.，9：805，1999)。因为Th2细胞因子的抑制可导致IgE产量的降低，所以另外的途径是以这些Th2细胞因子合成的抑制和Th1细胞因子形成的增加为基础的(Chung K.F.；Barens P.J.Thorax 54：825，1999)。

比较起来，以麻纹叶为基础的抗哮喘制剂已经被试用于小至7岁和老至80岁以及80岁以上的老人并且没有任何不良反应。

因此，对得自包括叶、树皮、根和种子在内的所有植物部分的提取物和麻纹叶提取物的级分进行测试以对生物活性级分进行鉴定。这些是以其抑制白三烯产生的能力为基础的。此外，还测试了各级分使Th2应答移向Th1型应答的能力。Th1和Th2应答分别是用γ-干扰素(Th1)和IL-4(Th2)产生来进行测量的。一些麻纹叶级分显示出表现为白三烯合成阻滞和γ-干扰素产生显著增加的5-脂肪氧化酶介导的花生四烯酸氧化的抑制，其又将抑制IL-4的产生。另一方面，大多数萎叶的叶提取物级分可促进Th2型应答向Th1型应答的偏移。因此，所选择的得自这两种植物一麻纹叶和萎叶的提取物级分的混合物可显著抑制白三烯的合成并将Th2应答移向Th1型应答，从而提出了一种用于治疗、缓解和改善支气管呼吸问题的独特的协同组合物。因此，该双向策略是这种新组合物的主要目标并且可将其看成是治疗患者支气管呼吸问题的最好形式。

本发明的目的

本发明的主要目的是要提供得自麻纹叶和萎叶的不同植物部分提取物的生物活性级分。

本发明的另一个目的是要提供一种包含得自麻纹叶和萎叶的叶或任何其它植物部分的提取物的组合的药物组合物。

本发明的另一个目的是要提供一种用于治疗呼吸问题的新组合物，该组合物包含得自麻纹叶和萎叶的植物部分的生物活性级分的组合。

本发明的另一个目的是要提供一种制备得自麻纹叶和萎叶的叶或任何其它植物部分的用于缓解、治疗和改善呼吸问题的提取物的方法。

本发明的另一个目的是要提供一种将用于缓解、治疗和改善呼吸问题的生物活性级分从麻纹叶和萎叶的植物部分分离出来的方法。

本发明的另一目的是要提供一种简单的将具有治疗、缓解和改善呼吸问题的生物活性的生物活性级分从麻纹叶和萎叶的所有植物部分中分离出来的方法。

本发明的另一个目的是要提供一种包含得自麻纹叶和萎叶的叶的提取物或得自麻纹叶和萎叶的其它植物部分的提取物的草药制剂，其中所说的提取物十分适合人类使用并能用于治疗、缓解和改善呼吸问题。

本发明的另一个目的是要提供一种简单、快速并且费用低廉的制备具有治疗、缓解和改善呼吸问题的生物活性的组合物的方法。

本发明的另一个目的是要提供一种草药组合物制剂，其包含活性因子和得自麻纹叶和萎叶的所有植物部分的生物活性级分，其中所说的活性因子和生物活性级分十分适于人类使用及治疗、缓解和改善呼吸问题。

本发明的另一个目的是要测试单独或联合的得自麻纹叶和萎叶的所有植物部分的具有抑制5-脂肪氧化酶介导的花生四烯酸氧化的活性并能促进Th2型应答向Th1型应答偏移的各生物活性级分。

本发明的另一个目的是要测试得自麻纹叶和萎叶的叶或其它植物部分的各提取物单独和联合时对5-脂肪氧化酶介导的花生四烯酸氧化的抑制活性和诱导Th2型应答向Th1型应答偏移的能力。

本发明的另一个目的是在存在单独和联合的麻纹叶和萎叶级分的情况下在体外(ex vivo)人全血系统中测定5-脂肪氧化酶介导的花生四烯酸的氧化。

本发明的另一个目的是在存在单独和联合的麻纹叶和萎叶级分的情况下在富含人多形核嗜中性粒细胞(PMN)的体外系统中测定5-脂肪氧化酶介导的花生四烯酸的氧化。

本发明的另一个目的是在存在单独和联合的麻纹叶和萎叶的叶提取物或它们的其它植物部分提取物的情况下在体外人全血系统中测定5-脂肪氧化酶介导的花生四烯酸的氧化。

本发明的另一个目的是用流式细胞仪来检测细胞内细胞因子的产生。

本发明的另一个目的是提供在存在单独和联合的得自麻纹叶和萎叶的所有植物部分的级分的情况下在体外人全血中分别作为Th1和Th2型应答标记物的IFN-γ和IL-4曲线。

发明概述

因此，本发明提供了一种用于阻断5-脂肪氧化酶活性从而可抑制白三烯合成、抑制IL4产生并增强IFNγ释放的草药制剂。

此外，本发明还提供了一种用于治疗和改善支气管呼吸困难的草药制剂。本发明还提供了一种制备麻纹叶和萎叶的叶或任何其它植物部分或种子的提取物和其选择性掺合物以评估生物学反应从而确定其在支气管呼吸困难的治疗和缓解中的作用的方法。

此外，本发明还提供了一种用于治疗和改善支气管呼吸困难的包含得自麻纹叶和萎叶的叶或任何其它植物部分或种子的生物活性级分和其选择性的掺合物的草药组合物。本发明的另一方面涉及一种对得自麻纹叶和萎叶的任何植物部分、包括叶、树皮、根和种子的生物活性级分进行分离、物理化学特性进行定性和生物学反应进行评估以确立其在支气管呼吸困难的治疗和改善中的作用的方法。

附图简要说明

图1描述了在存在或不存在得自麻纹叶(MK03、MK04、MK05)和萎叶(JB01C)的生物活性级分的情况下用佛波醇肉豆蔻酸醋酸酯(PMA)和钙离子载体(肌霉素)进行共培养后在体外人单核细胞中细胞内的IFN-γ流式细胞仪测定。我们的数据表明生物活性级分MK03、MK04、MK05和JB01C增强了IFN-γ产生。

图2描述了在存在或不存在级分MK03、MK04、MK05和JB01C的情况下用LPS进行共培养后在体外人嗜中性粒细胞中的细胞内IL-4的流式细胞仪测定。我们的数据表明，萎叶的级分JB01C显著减少了产生IL-4的细胞。另一方面，麻纹叶的级分MK03、MK04、MK05对IL-4产生的抑制仅有最低限度的影响。有趣的是，麻纹叶的生物活性级分MK03、MK04、MK05和萎叶的生物活性级分JB01C的组合十分显著地降低了IL-4的产生。

图3描述了在存在或不存在得自麻纹叶和萎叶的提取物的情况下与植物血球凝集素(phytohemmaglutinin)共培养后在体外人单核细胞中的细胞内IFN-γ和IL-4的流式细胞仪测定。我们的数据表明得自萎叶的提取物显著增加了IFN-γ阳性细胞并减少了IL-4阳性细胞。麻纹叶提取物减少了IL-4阳性以及IFN-γ阳性细胞。这两种提取物的组合将IFN-γ阳性细胞增至对照水平并仍然维持了降低的IL-4阳性水平。

本发明的详细描述

因此，本发明提供了一种用作白三烯抑制剂、IL4合成抑制剂和Th1型免疫调节剂的药物组合物，所说的组合物包含有效量的得自萎叶(PB)和麻纹叶(M.K)的叶或任何其它植物部分的冷冻干燥的水性或醇提取物或得自这些提取物的生物活性级分，并且包含或不包含一种或多种可药用的成分。

在一个实施方案中，得自植物麻纹叶(M.K)的生物活性级分被称为MK03、MK04和MK05。

在本发明的另一个实施方案中，得自植物萎叶(PB)的生物活性级分被称为JB01A、JB01B和JB01C。

在另一个实施方案中，所用的植物部分选自叶、茎、树皮、果实、种子或任何其它植物部分。

另一个实施方案涉及所用的可药用成分，其选自营养物如蛋白质、碳水化合物、糖、滑石粉、硬脂酸镁、纤维素、碳酸钙、淀粉-明胶糊和/或载体、赋形剂、稀释剂或溶剂。

另一个实施方案涉及通过吸入、口服、静脉内、肌内、皮下途径或任何其它适宜途径将所说组合物进行给药。

在另一个实施方案中，该口服途径是胶囊、糖浆、浓缩物、粉末或颗粒的形式并且通过口服途径给药的量高于静脉内途径的给药量。

在另一个实施方案中，M.K提取物的比例等于或高于萎叶提取物的量。

在另一个实施方案中，萎叶(PB)提取物与M.K提取物的比例在1∶1至1∶5的范围内。

在另一个实施方案中，该组合物是以1至20mg/kg体重的剂量水平至少一天一次给药至少4周来进行给药的。

在另一个实施方案中，该组合物由生物活性级分MK03、MK04和/或MK05所组成。

在另一个实施方案中，所说的组合物由生物活性级分JB01C、MK03、MK04和/或MK05所组成。

在另一个实施方案中，通过静脉内途径给药的生物活性级分的数量小于口服途径。

在另一个实施方案中，得自M.K的生物活性级分的比例等于或高于萎叶的生物活性级分。

在另一个实施方案中，得自萎叶提取物的生物活性级分与得自M.K提取物的生物活性级分的比例在1∶1至1∶5的范围内。

在另一个实施方案中，该组合物是根据呼吸病症以0.5至10.0mg/kg体重的剂量水平每天至少给药一次给药至少4周来进行给药的。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，该组合物给药至少4周到至多3个月的时间。

在另一个实施方案中，涉及一种组合物，其是用于阻断5脂肪氧化酶活性从而抑制白三烯合成、抑制白介素-4产生并作为Th1型免疫调节剂的得自麻纹叶的叶和其它植物部分的生物活性级分MK03、MK04和MK05的组合。

在本发明的另一个实施方案中，提供了一种组合物，其是用于阻断5脂肪氧化酶活性从而抑制白三烯合成、抑制白介素-4产生并增强γ干扰素释放的得自麻纹叶的叶和其它植物部分的生物活性级分MK03、MK04和MK03和得自萎叶的叶和其它植物部分的JB01C的组合。

在另一个实施方案中，所说的组合物是用于治疗支气管呼吸病症。

在另一个实施方案中，所说的组合物是用于治疗哺乳动物和动物。

在另一个实施方案中，所说的组合物是用于使Th2应答移向Th1应答。

在另一个实施方案中，所说的组合物是用于抑制全血的嗜中性粒细胞富集的组分中的5-脂肪氧化酶介导的花生四烯酸氧化。

在另一个实施方案中，所说的组合物是用于增强体外人全血中的IFN-γ并降低IL-4应答。

在另一个实施方案中，所说的组合物是用于增强体外人全血单核细胞(PMN)中的IFN-γ应答。

在另一个实施方案中，所说的组合物是用于降低人外周全血单核细胞中的IL-4应答。

本发明的另一个实施方案提供了一种用于阻断5脂肪氧化酶活性从而抑制白三烯合成、抑制了IL4产生并增强了IFNγ释放的草药组合物，所说的组合物包含有效量的得自萎叶和麻纹叶的叶或任何其它植物部分的提取物或萎叶(PB)和麻纹叶(M.K)的冷冻干燥提取物。

本发明的另一个实施方案涉及一种组合物，其中用于阻断5脂肪氧化酶活性从而抑制白三烯合成、抑制白介素-4产生的得自麻纹叶的叶和其它植物部分的被称为MK03的生物活性级分具有如下物理化学特性：

a)干燥的固体，熔点98-100℃，可溶于DMSO中；

b)薄层色谱在一种溶剂系统——氯仿和甲醇(19∶1)中显示出Rf为0.48的单一斑点；

c)在使用intersel ODS-3(4.6×250mm)分析柱，溶剂系统为甲醇，并且在210nm进行检测，流速为0.5ml/分钟时，HPLC分析显示出保留时间为8.5分钟的单峰。

HPLC：柱ODS-3(4.6×250mm)，流速-0.5ml/分钟；峰在210nm；保留时间-3.5分钟；溶剂系统—甲醇；

d)¹³C NMR，ppm(125MHz，CDCl₃)：153.34，153.29，148.94，140.73，134.78，131.58，128.61，124.22，120.36，119.97，118.23，118.02，117.39，116.63，108.36，104.39，97.16，78.03，40.68，25.67，25.60，22.70，17.53和15.97；和

e)级分‘MK03’似乎是一种纯的含氮化合物。

本发明的另一个实施方案涉及一种组合物，其中用于阻断5脂肪氧化酶从而抑制白三烯合成、抑制白介素-4产生的得自麻纹叶的叶和其它植物部分的生物活性级分即MK04具有如下物理化学特性：

a)可溶于二甲基亚砜中的黑色树胶状物质；

b)生物活性级分的TLC在氯仿和甲醇(19∶1)的溶剂系统中显示出Rf为0.38的单一斑点；

c)在使用intersel ODS-3分析柱，溶剂系统为甲醇并且流速为1.0ml/分钟，在254nm下进行检测时，生物活性级分的HPLC显示出保留时间为5.69分钟的一个峰；

d)NMR(300MHz，CDCl₃)δ0.94，1.30，1.60，2.04-2.10，2.27-2.34，2.78-2.82，3.53-3.81，3.85-3.92，4.00，4.24-4.26和5.26-5.41；和

e)级分MK04是一种糖脂。

本发明的另一个实施方案涉及一种组合物，其中用于阻断5脂肪氧化酶从而抑制白三烯合成、抑制白介素-4产生的得自麻纹叶的叶和其它植物部分的生物活性级分即MK05具有如下物理化学特性：

a)可溶于DMSO和水中的黑色固体；

b)TLC在正丁醇-醋酸-水(9∶5∶7)的溶剂系统中显示出Rf为0.66的单一斑点；

c)该级分的HPLC分析在保留时间为21分钟处显示一个峰，该HPLC的溶剂系统为甲醇-水(1∶9)，流速为0.5ml/分钟，并且在217nm下进行检测；

d)¹³C NMR，ppm(125MHz，D₂O)：175.82，169.22，159.00，147.63，147.02，144.76，135.72，131.28，131.10，129.90，129.63，129.20，128.20，127.59，123.30，116.81，116.39，115.80，114.79，81.77，76.26，76.15，74.20，73.79，73.64，73.49，72.84，72.16，71.34，70.29，69.89，68.83，67.96，63.71，63.14，58.22，56.62，56.19，54.47，54.42，54.37，41.90，36.87和20.93；和

e)级分MK05似乎是与糖类结合的芳族化合物。

本发明的另一个实施方案涉及一种组合物，其中用于增强γ干扰素释放的得自萎叶的叶和其它植物部分的生物活性级分、即JB01A具有如下物理化学特性：

a)白色固体物质并且既可溶于DMSO又可溶于水；

b)TLC在正丁醇-醋酸-水(9∶5∶7)的溶剂系统中显示出Rf为0.07的单一斑点；

c)HPLC在8.4分钟的保留时间处显示一个峰(JB01A，峰-1)，其使用的溶剂系统是水-甲醇(1∶9)，流速为0.5ml/分钟，在217nm下进行检测，并且使用的是intersel ODS-3分析柱；

d)¹³C NMR，ppm(125MHz，D₂O)：109.71，108.417，107.94，104.17，100.27，84.38，81.79，81.53，80.74，77.03，75.58，73.85，73.42，71.71，71.27，70.74，70.38，69.12，61.71，61.00和60.54；和

e)级分JB01A是低聚糖。

本发明的另一个实施方案涉及一种组合物，其中用于增强γ干扰素释放的得自萎叶的叶和其它植物部分的生物活性级分即JB01B具有如下物理化学特性：

a)既可溶于DMSO又可溶于水的白色固体；

b)TLC在正丁醇-醋酸-水(9∶5∶7)的溶剂系统中显示出Rf为0.27的单一斑点；

c)HPLC在8.8分钟的保留时间处显示一个峰(JB01B，峰-2)，其使用与上面相同的柱条件；

d)¹³C NMR，ppm(125MHz，D₂O)：169.48，104.30，98.86，98.55，92.60，81.82，76.98，76.07，74.57，73.52，73.23，71.78，71.46，70.02，69.84，69.74，69.30，68.92，68.77，67.01，66.43，62.95，62.02，61.61，48.67，44.62，38.88；和

e)级分JB01B是一种低聚糖衍生物。

本发明的另一个实施方案涉及一种组合物，其中用于增强γ干扰素释放的得自萎叶的叶和其它植物部分的生物活性级分即JB01C具有如下物理化学特性：

a)既可溶于DMSO又可溶于水的白色固体；

b)TLC在正丁醇-醋酸-水(9∶5∶7)的溶剂系统中显示出Rf为0.34的单一斑点；

c)HPLC在9.8分钟的保留时间处显示一个单峰(JB01C，峰-3)，其使用与上面相同的条件；

d)NMR(300MHz，D₂O)2.34.3.27，3.28，3.44-3.47，3.51，3.60-3.63，3.68，3.92-3.99，4.08，4.92和5.36；和

e)级分JB01C是一种低聚糖。

本发明的另一个实施方案涉及一种治疗个体支气管呼吸病症的方法，所说的方法包括给该个体施用有效量的包含得自萎叶(PB)和麻纹叶(M.K)的叶或任何其它植物部分的冷冻干燥的水或醇提取物或得自这些提取物的生物活性级分并且包含或不包含一种或多种可药用成分的药物组合物。

在另一个实施方案中，所说的组合物是通过口服、静脉内、肌内、吸入或皮下途径来进行给药的。

在另一个实施方案中，口服途径是胶囊、糖浆、浓缩物、粉末或颗粒的形式。

本发明的另一个实施方案提供了一种用作白三烯和IL4合成抑制剂以及Th1型免疫调节剂的药物组合物，所说的组合物包含有效量的一种或多种得自萎叶(PB)植物部分提取物的被称为JB01A、JB01B和JB01C的生物活性级分和得自麻纹叶(M.K)的叶提取物的被称为MK03、MK04和MK05的生物活性级分，并且包含或不包含可药用的添加剂。

本发明的另一个实施方案涉及一种治疗个体支气管呼吸病症的方法，所说的方法包括给该个体施用有效量的一种或多种得自萎叶(PB)的植物部分提取物的被称为JB01A、JB01B和JB01C的生物活性级分和得自麻纹叶(M.K)叶提取物的被称为MK03、MK04和MK05的生物活性级分并且还可同时使用或不使用一种或多种可药用的添加剂。

在本发明的一个实施方案中，将得自麻纹叶和萎叶的所有植物部分的生物活性级分与新抽取的人血液进行混合。

在本发明的另一个实施方案中，将体外人血液系统中的细胞用钙离子载体等进行活化。

在本发明的另一个实施方案中，该生物活性级分是用例如溶剂分馏法、TLC、HPTLC、HPLC等等技术从麻纹叶和萎叶的包括树皮、根、叶和种子在内的所有植物部分中分离出来的。

在本发明的另一个实施方案中，该得自所有植物部分的提取物是从新鲜或遮阳干燥的麻纹叶和萎叶制得的。

在本发明的另一个实施方案中，植物材料是用适宜溶剂如甲醇或水或缓冲液在渗漉器或现有技术中公知的装置中进行提取的。

在本发明的另一个实施方案中，麻纹叶和萎叶植物部分的提取物是在减压下进行浓缩的以保留活性成分。

还是在本发明的另一个实施方案中，将浓缩物冷冻干燥以除去残留的水和其它残余溶剂。

还是在本发明的另一个实施方案中，将冷冻干燥的固体用硅胶或Sephadex LH-20进行色谱处理以分离出纯级分。

还是在本发明的另一个实施方案中，发现分离出来的M.K和P.B的级分在体外人全血中是5-脂肪氧化酶介导的花生四烯酸氧化的抑制剂。

还是在本发明的另一个实施方案中，发现得自麻纹叶和萎叶的所有植物部分提取物的级分对于从Th2型应答向Th1应答的偏移有活性。

还是在本发明的另一个实施方案中，该生物活性级分选自可抑制全血的嗜中性粒细胞富集级分中5-脂肪氧化酶介导的花生四烯酸氧化的麻纹叶和萎叶的提取物。

还是在本发明的另一个实施方案中，该生物活性级分选自发现可增强体外人全血中的IFN-γ应答的麻纹叶和萎叶提取物。

还是在本发明的另一个实施方案中，该生物活性级分选自发现可增强体外人血嗜中性粒细胞(PMN)中的INF-γ应答的麻纹叶和萎叶提取物。

还是在本发明的另一个实施方案中，该生物活性级分选自发现可降低人外周血单核细胞中的IL-4应答的麻纹叶和萎叶提取物。

还是在本发明的另一个实施方案中，在全血培养并且在试验时溶解细胞后测试发现该得自麻纹叶和萎叶提取物的级分可作为5-脂肪氧化酶介导的花生四烯酸氧化的抑制剂并选择该级分来制备组合物。

还是在本发明的另一个实施方案中，用硅胶或Sephadex LH-20将该冷冻干燥的固体进行色谱处理以将存在于麻纹叶和萎叶的叶和所有其它植物部分中的可用来缓解、治疗和治愈呼吸问题的纯生物活性级分分离出来。

用下面的实施例来进行解释，不应将其看成是对本发明范围的限制。

实施例1

植物材料的收集

从West BengaL(印度)的不同区域，分别从灌木和攀援植物上收集麻纹叶和萎叶植物的叶和所有其它植物部分。将证明性标本存放在印度化学生物学研究所的药物化学部，4 Raja S.C.Mullick Road，Calcutta-700032。

实施例2

生物活性物质的制备

第I部分(麻纹叶)

收集麻纹叶的新鲜叶子和包括树皮、根和种子在内的所有其它植物部分，在从地方供应商那里获得后对其进行清洁并将其用水进行洗涤，将其用作原料。在混合物-混合器中，将410g麻纹叶的新鲜叶子和其它植物部分在甲醇(1000ml)中制成糊并将其放置在添加了1000ml甲醇的玻璃渗漉器(容量为5升)中。将其在室温下放置16小时(一整夜)。通过将提取物用Whatman No.1滤纸进行过滤收集渗漉液。将该提取过程重复四次并在旋转蒸发器中，在维持在40℃(水浴)下将合并的提取物在减压下蒸发至干。残留的固体残余物在外观上是粘性的，通过冷冻干燥将其进一步进行干燥。收率为25.63g(MKOC)。该分馏操作的流程图如流程图I所示。

流程图I

实施例3

将150g仔细用无菌水洗涤过的新鲜的麻纹叶的叶子用750ml玻璃蒸馏水在混合物-混合器中进行匀浆，然后将其在超声浴中超声5次，每次超声5分钟。用Whatman No.1滤纸进行过滤，分离出用水提取的物质。将该提取处理重复三次。将所合并的提取液冷冻干燥，得到重量为11g的粉末状物质(MKOC)。

实施例4第II部分(萎叶)提取物

从地方供应商那里收集萎叶的新鲜叶子或所有植物部分并将其用作原料。

将萎叶的新鲜叶子(1.5kg)用蒸馏水(5000ml)在混合物-混合器中进行匀浆，然后将其在超声浴中超声3次，每次超声15分钟。将其提取一整夜或16小时。用Whatman No.1滤纸进行过滤，分离出用水提取的物质。将该提取处理重复三次。将所合并的提取物在40℃、减压的条件下在闪蒸器中蒸发至干燥。然后在高真空下在干燥器中将残余物进行干燥，得到一种半固体(14.92g)(JB01)。该分馏操作的流程图如流程图II所示。

实施例5(麻纹叶的提取物和萎叶的提取物)

添加几滴水，将3g麻纹叶的提取物和3g萎叶的提取物均匀混和。将整个提取物在冷冻干燥器中蒸发至干燥。对这种提取物(MKOC+JB01)的生物活性进行试验。

实施例6(MK+PB)

在混合物-混合器中分别将200g各植物部分用300ml甲醇进行匀浆。然后将其在超声浴中超声3次，每次超声15分钟。将提取物用Whatman No.1滤纸过滤并收集滤液。将该提取过程重复三次。将合并的提取液冷冻干燥，得到6.32g半固体物质。

实施例7

将麻纹叶(70g)和萎叶(500g)的新鲜叶子进行混和并用蒸馏水充分洗涤。将其在混合物-混合器中用蒸馏水(300ml)进行匀浆。然后将其在超声浴中超声3次，每次超声15分钟。将提取物用Whatman No.1滤纸进行过滤并收集滤液。将该提取过程重复三次。将所合并的提取物冷冻干燥，得到一种半固体物质(10g)。然后对其生物活性进行试验(MKOc+JB01)。

因为在印度，两种植物的叶子都被广泛用于制备各种食物制剂，所以不需要担心其生物相容性和毒性。此外，两种植物都是普遍存在的。在这里已经证明了在麻纹叶和萎叶的叶子中存在可用于缓解、治疗和治愈呼吸问题的生物活性因子并且其制备快速、方便并且费用低廉。给动物食用叶提取物不会产生任何不利作用。

将一部分该提取物(4.00g)用使用sephadex LH-20柱的色谱法进行处理。在分离出来的级分中，发现被称为JB01A(0.17g或70mg)、JB01B(0.33g或330mg)和JB01C(0.94g或940mg)的三种物质有活性。

                   流程图II

                     萎叶

                      ↓

                  用甲醇或水

                   进行提取

                      ↓

                甲醇/水提取物(JB01)

                  用Sephadex LH-20

                   进行色谱处理

                      ↓

             i)JB-01A(峰-1)，低活性

             ii)JB-01B(峰-2)，低活性

             iii)JB-01C(峰-3)，高活性

实施例8

制备该生物活性因子的方法包括：

1.从地方供应商那里收集新鲜的叶子和所有其它植物部分

2.在遮光下将植物部分进行干燥至中等程度或用新鲜的植物部分作为原料

3.将干燥物粉末化或在现有技术公知的装置中将各植物部分分别匀化。

4.将粉末或匀浆放置在含有适宜溶剂的渗漉器中；选择烃类溶剂如石油醚(B.P.40-60℃)、石油醚(B.P.60-80℃)、戊烷、己烷、苯等，氯化溶剂如氯仿、二氯甲烷、四氯化碳等，醚类溶剂如二乙醚、四氢呋喃、二噁烷等，酮溶剂如丙酮、环戊酮等，酯溶剂如乙酸乙酯、甲酸乙酯等；所有的醇类如甲醇、乙醇、正丁醇等，水和缓冲液。

5.将渗透过的植物材料用渗漉器或目前现有技术中公知的装置或设备在1至120小时的时间内进行提取。

6.用目前现有技术中公知的装置或设备在减压下将溶剂蒸发。

7.在目前现有技术公知的装置或设备中将该物质进行冷冻干燥或干燥并将加工过的物质置于密封容器中在凉爽、干燥的地方保存。

8.用硅胶和Sephadex LH-20色谱法对各生物活性级分进行分离。

9.对提取物中存在的用作评估生物活性的标记的纯化合物进行鉴定。

10.将加工过的物质置于密封容器中在凉爽、干燥的地方保存。

11.对该材料的生物学活性进行评估

实施例9

对测定花生四烯酸氧化抑制的方法进了描述。

在24-孔组织培养板的各孔中放置500μl用PBS稀释了一半的肝素化的人外周血。向各孔中添加10μg/ml浓度的各提取物样品。然后将该细胞在37℃下在不定期振摇的条件下培养3小时。向各孔中加入10μl/ml的花生四烯酸溶液(12.2mg/ml无水乙醇的溶液，在-20℃下存储于氩气下中)，5分钟后，以20μg/ml的浓度向其中加入钙离子载体(A23187)，将其继续培养10分钟。用PBS将该细胞混悬液的体积调至2ml，用灵敏的Oxygraph仪对其氧含量进行监测。

实施例10

方法：

将500μl用PBS稀释了一半的肝素化的人外周血放置在24-孔组织培养板的各孔中。向各孔中加入1μg/ml浓度的各样品。在混合物的情况中，将级分以1∶1的比例进行混和以制备最终的制剂，将其以1.0μg/ml的浓度进行使用。然后在不定期振摇的情况下将该细胞在37℃下培养3小时。向各孔中加入10μg/ml的花生四烯酸溶液(12.2mg/ml无水乙醇的溶液，在-20℃下存储于氩气下中)，5分钟后，以20μg/ml的浓度向其中加入钙离子载体(A23187)，将其继续培养10分钟。用PBS将该细胞混悬液的体积调至2ml，用灵敏的Oxygraph仪对其氧含量进行监测。

实施例11

在不定期振摇的情况下，将500μl半稀释的人外周血用10μg/ml各提取物在37℃下培养3小时。然后向各孔中加入10μg/ml的花生四烯酸溶液(12.2mg/ml无水乙醇的溶液，在-20℃下存储于氩气下中)，5分钟后，以20μg/ml的浓度向其中加入钙离子载体(A23187)，将其继续培养10分钟。通过添加1ml PBS+500μl水将该细胞混悬液的体积调至2ml以溶解细胞。用灵敏的Oxygraph仪对氧含量进行监测。

实施例12

方法：

在不定期振摇的情况下，将500μl半稀释的人外周血用10μg/ml各提取物在37℃下培养3小时。在混合物的情况中，将级分以1∶1的比例进行混和以制备最终的制剂，将其以1.0μg/ml的浓度进行使用。然后向各孔中加入10μg/ml的花生四烯酸溶液(12.2mg/ml无水乙醇的溶液，在-20℃下存储于氩气下中)，5分钟后，以20μg/ml的浓度向其中加入钙离子载体(A23187)，将其继续培养10分钟。通过添加1ml PBS+500μl水将该细胞混悬液的体积调至2ml以溶解细胞。用灵敏的Oxygraph仪对氧含量进行监测。

实施例13

将肝素化的人外周血与等体积的在PBS中的2％的明胶溶液进行混和，并且当RBC沉积到底部时使其放置半小时。将包含嗜中性粒细胞富集的单核细胞的上层离心并将细胞团混悬于PBS中。将500μl这种细胞混悬液(3×10⁶个细胞/孔)用10μg/ml各样品在37℃下培养3小时。向各孔中加入10μg/ml(12.2mg/m1)的花生四烯酸溶液，5分钟后，以20μg/ml的浓度向其中加入钙离子载体(A23187)，将其再继续培养10分钟。用PBS将该细胞的体积调至2ml并用灵敏的Oxygraph仪对细胞混悬液的氧含量进行监测。

因此，已经对麻纹叶和萎叶提取物有关缓解、治疗和治愈呼吸问题的生物学活性进行了筛选，并且用薄层色谱法和HTPLC对进行了处理的提取物进行分析。将混和的提取物溶解并混悬于适宜的溶剂中，并用于试验系统(体外人全血)中以确定所规定的生物学反应。

实施例14

方法

将肝素化的人外周血与等体积的在PBS中的2％的明胶溶液进行混和，并且当RBC沉积到底部时使其放置半小时。将包含嗜中性粒细胞富集的单核细胞的上层离心并将细胞团混悬于PBS中。将500μl这种细胞混悬液(3×10⁶个细胞/孔)用1μg/ml各级分在37℃下培养3小时。在混合物的情况中，将各级分以1∶1的比例进行混和以制备最终的制剂，并将其以1.0μg/ml的浓度进行使用。然后向各孔中加入10μg/ml(12.2mg/ml)的花生四烯酸溶液，5分钟后，以20μg/ml的浓度向其中加入钙离子载体(A23187)，将其继续培养10分钟。用PBS将该细胞的体积调至2ml并用灵敏的Oxygraph仪对细胞混悬液的氧含量进行监测。

因此，已经对得自麻纹叶和萎叶的所有植物部分提取物的生物活性级分有关缓解、治疗和治愈呼吸问题的生物学活性进行筛选，并且用薄层色谱法和HPLC以及NMR谱对所处理的级分进行了分析，将所处理的级分溶解并混悬于适宜的溶剂中，并用于试验系统(体外人全血)中以确定所规定的生物学反应。

实施例15 

用流式细胞仪测定细胞内干扰素γ(IFN-y)和白介素-4(IL-4)

将肝素化的全血(0.1ml/24孔板的孔，由正常个体采集)在包含10％热灭活的胎牛血清和植物血球凝集素(PHA，10μg/ml)的总体积为1.0ml的Rosewell Park Memorial Institute(RPMI)培养基中在存在或不存在单独或联合的萎叶和麻纹叶的叶提取物(各自为1.0mg/ml)的情况下在5％CO₂中在37℃下进行培养。为了造成细胞内新合成的蛋白质的积聚，向该细胞中加入布雷菲德菌素A(10μg/ml)并使之维持4小时。在培养结束时，将细胞用溶解RBC的FACS^TM溶解溶液(Becton Dickinson，USA)进行处理。然后，将细胞进行洗涤，通过用4％多聚甲醛处理10分钟来对其进行渗透化。在用洗涤缓冲液(包含1％白蛋白、0.1％皂角甙和0.1％叠氮化钠的磷酸盐缓冲盐水[PBS])进行洗涤后，将渗透化的细胞用FITC-标记的抗-IFNγ单克隆抗体或PE-标记的抗-IL-4单克隆抗体在室温下在黑暗中处理20分钟。将细胞用缓冲液进行洗涤，然后将其重新混悬于包含1％多聚甲醛的PBS中以用于使用Cell Quest程序的用FACS Calibur(Becton Dickinson，USA)进行的单色流式细胞仪分析。每种样品收集一万个细胞并用对数刻度对荧光强度进行测量。为了确保仅检测到细胞内的IFNγ或IL-4，在渗透前将细胞用FITC-标记的抗IFNγ或PE标记的抗-IL-4抗体进行染色并且各染色给出小于0.2％的荧光细胞。不相关的同种型-匹配的对照抗体也仅产生小于0.1％的荧光细胞。

在存在或不存在得自麻纹叶和萎叶的提取物的情况下用植物血球凝集素进行共培养后用流式细胞仪测定在体外人单核细胞中的细胞内IFN-γ和IL-4。我们的数据表明得自萎叶的提取物增加了IFN-γ阳性细胞并显著降低了IL-4阳性细胞。麻纹叶提取物降低了IL-4阳性细胞以及IFN-γ阳性细胞。这两种提取物的组合将IFN-γ增加至对照水平并且仍然维持了降低的IL-4阳性水平。

实施例16

将一部分麻纹叶提取物(8.01g)用硅胶柱色谱进行处理，使得生物活性级分中的各种级分分离开来。这些级分被称为级分MK03(70mg)、MK04(270mg)和MK05(110mg)。

实施例17

MK03、MK04、MK05、JB01A、JB01B和JB01C的物理化学特性

级分MK03：

1.干燥的固体，熔点98-100℃，可溶于DMSO中；

2.薄层色谱在一种溶剂系统——氯仿和甲醇(19∶1)中显示出Rf为0.48的单一斑点；

3.在使用intersel ODS-3(4.6×250mm)分析柱，溶剂系统为甲醇，并且在210nm进行检测，流速为0.5ml/分钟时，HPLC分析显示出保留时间为8.5分钟的单峰。

HPLC：柱ODS-3(4.6×250mm)，流速-0.5ml/分钟；峰在210nm；保留时间-3.5分钟；溶剂系统-甲醇；

4.¹³C NMR，ppm(125MHz，CDCl₃)：153.34，153.29，148.94，140.73，134.78，131.58，128.61，124.22，120.36，119.97，118.23，118.02，117.39，116.63，108.36，10439，97.16，78.03，40.68，25.67，25.60，22.70，17.53和15.97；和

5.级分‘MK03’似乎是一种纯的含氮化合物。

级分MK04：

1.可溶于二甲基亚砜中的黑色树胶状物质；

2.生物活性级分的TLC在氯仿和甲醇(19∶1)的溶剂系统中显示出Rf为0.38的单一斑点；

3.在使用intersel ODS-3分析柱，溶剂系统为甲醇并且流速为1.0ml/分钟，在254nm下进行检测时，生物活性级分的HPLC显示出保留时间为5.69分钟的一个峰；

4.NMR(300MHz，CDCl₃)δ0.94，1.30，1.60，2.04-2.10，2.27-2.34，2.78-2.82，3.53-3.81，3.85-3.92，4.00，4.24-4.26和5.26-5.41；和

5.级分MK04是一种糖脂。

级分MK05：

1.可溶于DMSO和水中的黑色固体；

2.TLC在正丁醇-醋酸-水(9∶5∶7)的溶剂系统中显示出Rf为0.66的单一斑点；

3.该级分的HPLC分析在保留时间为21分钟处显示一个峰，该HPLC的溶剂系统为甲醇-水(1∶9)，流速为0.5ml/分钟，并且在217nm下进行检测；

4.¹³C NMR，ppm(125MHz，D₂O)：175.82，169.22，159.00，147.63，147.02，144.76，135.72，131.28，131.10，129.90，129.63，129.20，128.20，127.59，123.30，116.81，116.39，115.80，114.79，81.77，76.26，76.15，74.20，73.79，73.64，73.49，72.84，72.16，71.34，70.29，69.89，68.83，67.96，63.71，63.14，58.22，56.62，56.19，54.47，54.42，54.37，41.90，36.87和20.93；和

5.级分MK05似乎是与糖类结合的芳族化合物。

级分JB01A：

1.白色固体物质并且既可溶于DMSO又可溶于水；

2.TLC在正丁醇-醋酸-水(9∶5∶7)的溶剂系统中显示出Rf为0.07的单一斑点；

3.HPLC在8.4分钟的保留时间处显示一个峰(JB01A，峰-1)，其使用的溶剂系统是水-甲醇(1∶9)，流速为0.5ml/分钟，在217nm下进行检测，并且使用的是intersel ODS-3分析柱；

4.¹³C NMR，ppm(125MHz，D₂O)：109.71，108.417，107.94，104.17，100.27，84.38，81.79，81.53，80.74，77.03，75.58，73.85，73.42，71.71，71.27，70.74，70.38，69.12，61.71，61.00和60.54；和

5.级分JB01A是低聚糖。

级分JB01B：

1.既可溶于DMSO又可溶于水的白色固体；

2.TLC在正丁醇-醋酸-水(9∶5∶7)的溶剂系统中显示出Rf为0.27的单一斑点；

3.HPLC在8.8分钟的保留时间处显示一个峰(JB01B，峰-2)，其使用与上面相同的柱条件；

4.¹³C NMR，ppm(125MHz，D₂O)：169.48，104.30，98.86，98.55，92.60，81.82，76.98，76.07，74.57，73.52，73.23，71.78，71.46，70.02，69.84，69.74，69.30，68.92，68.77，67.01，66.43，62.95，62.02，61.61，48.67，44.62，38.88；和

5.级分JB01B是一种低聚糖衍生物。

级分JB01C：

1.既可溶于DMSO又可溶于水的白色固体；

2.TLC在正丁醇-醋酸-水(9∶5∶7)的溶剂系统中显示出Rf为0.34的单一斑点；

3.HPLC在9.8分钟的保留时间处显示一个单峰(JB01C，峰-3)，其使用与上面相同的条件；

4.NMR(300MHz，D₂O)2.34.3.27，3.28，3.44-3.47，3.51，3.60-3.63，3.68，3.92-3.99，4.08，4.92和5.36；和

5.级分JB01C是一种低聚糖。

实施例18

用流式细胞仪分析细胞内的干扰素γ(IFN-y)和白介素-4(IL-4)的试验描述

方法：将肝素化的全血(0.1ml/24孔板的孔，由正常个体采集)在包含10％热灭活的胎牛血清和佛波醇肉豆蔻酸醋酸酯(PMA)以及肌霉素或LPS的总体积为1.0ml的Rosewell Park Memorial Institute(RPMI)培养基中在存在或不存在单独或联用的得自萎叶和麻纹叶的所有植物部分的级分(各自为50μg/ml)的情况下在37℃下在5％CO₂中培养6小时。为了造成细胞内新合成的蛋白质的积聚，向该细胞中加入布雷菲德菌素A(10μg/ml)并使之维持4小时。在培养结束时，将细胞用溶解RBC的FACS^TM溶解溶液(Becton Dickinson，USA)进行处理。然后，将细胞进行洗涤，通过用4％多聚甲醛处理10分钟来对其进行渗透化。在用洗涤缓冲液(包含1％白蛋白、0.1％皂角甙和0.1％叠氮化钠的磷酸盐缓冲盐水[PBS])进行洗涤后，将渗透化的细胞用FITC-标记的抗-IFNγ单克隆抗体或PE-标记的抗-IL-4单克隆抗体在室温下在黑暗中处理20分钟。将细胞用缓冲剂进行洗涤，然后将其重新混悬于包含1％多聚甲醛的PBS中以用于使用Cell Quest程序的用FACS Calibur(Becton Dickinson，USA)进行的单色流式细胞仪分析。每种样品收集一万个细胞并用对数刻度对荧光强度进行测量。为了确保仅检测到细胞内的IFNγ或IL-4，在渗透前将细胞用FITC-标记的抗IFNγ或PE标记的抗-IL-4抗体进行染色并且各染色给出小于0.2％的荧光细胞。不相关的同种型-匹配的对照抗体也仅产生小于0.1％的荧光细胞。

实施例9的结果

级分％                     O2消耗的抑制％

无                                 -

MK0C                               81.1

JB01                               3

MK0C+JB01                          77.73

实施例11的结果

级分％                       O₂消耗的抑制％

无                                 -

MK0C                               89.62

JB01                               5.42

MK0C+JB01                          83.20

实施例13的结果

级分％                       O₂消耗的抑制％

无                                 -

MK0C                               88.76

JB01                               4.58

MK0C+JB01                          85.94

表示实施例10、12&14的结果的表1

生物活性级分           O₂消耗的抑制％ 实施例10 实施例12 实施例14无 - - -MK03 12.75 10.16 11.68MK04 86.42 76.57 87.40MK05 80.45 79.70 89.84JB01C 3 5.42 4.58MK03+MK04+MK05 81 89.62 88.76MK03+MK04+MK05+JB01C 77.73 83.20 85.94

实施例19

用麻纹叶的树皮和萎叶的叶提取物的组合研制的制剂用于治疗呼吸困难的评估结果。

(由注册的Auyrvedic医师执行)

患者性别/年龄呼吸的性质疾病的持续时间治疗周期改善A男性/46周期性喘息，在夜间呼吸困难，胸紧，在晚上咳嗽加剧，对家里的粉尘过敏和呼吸问题。对毛皮/抽烟过敏27年8周90％撤回了所有的吸入器(6puffs)B男性/39周期性喘息，偶尔胸紧，呼吸困难。14年8周80％没有呼吸问题偶尔残余的呼吸浅促

C男性/62周期性喘息，在夜间呼吸困难，偶尔胸紧。粉尘过敏引起呼吸问题。锻炼诱导呼吸困难50年7周70％没有喘息，没有锻炼诱导的呼吸问题。没有胸紧D女性/28咳嗽，特别是在晚上加剧，周期性喘息，周期性呼吸困难，周期性胸紧，病毒感染，对家里的尘螨和温度改变过敏20年8周90％不需要吸入器并且不需要使用其它药物E男性/87咳嗽，特别是在晚上加剧，周期性呼吸困难，周期性胸紧，病毒感染，对家里的尘螨和温度改变过敏30年8周90％目前不需要吸入器。不需要药物。卧床患者可以不需要借助任何帮助的在轮椅上活动。