一种快速质粒抽提纯化试剂盒及其应用

摘要

本发明公开了一种快速质粒抽提纯化试剂盒及进行细菌质粒抽提纯化的方法，其试剂盒包括下列独立存在的液体：无碱含酶菌体裂解液，DNA结合柱前处理液，DNA质粒结合液，清洗液，洗脱液。使用本试剂盒进行细菌质粒抽提纯化的方法包括如下步骤：裂解菌体；前处理DNA结合柱；结合质粒DNA；清洗；洗脱。使用本发明试剂盒及质粒抽提纯化方法，可在3－5分钟内快速有效地完成质粒抽提纯化工作，大大缩短抽提时间；所得到的质粒DNA，经使用分光光度计检测，A

说明书

                            技术领域

本发明涉及一种快速质粒抽提纯化试剂盒及其应用，尤其是涉及一种细菌质粒抽提纯化试剂盒及其应用。

                            背景技术

细菌的质粒是DNA重组的重要载体和工具，分离纯化质粒是现代分子生物技术必不可少的手段。现有质粒的分离主要有两个方法：一是由Birnbiom和Doly创造的碱裂解法，二是由Holmes和Quigley发明的煮沸法，还有一些在此基础上发展而来的其它方法如：PEG法、氯化铯密度梯度离心法等。目前普遍使用的质粒抽提方法是以碱裂解方法为基础结合二氧化硅DNA亲和性质，加清洗液用离心或真空抽提的方法得到纯化的质粒，此方法创造性地改进了质粒的抽提纯化过程，它已广泛地应用于当前医学、农学及其它分子生物学研究领域。目前市场上所流行的各种“miniprep”、“midiprep”、“maxiprep”都是商家所提供的各种质粒纯化试剂盒，其中以Qiagen公司的最为经典，其试剂盒包括七种独立存在的不同液体试剂，用它进行质粒纯化，具体包括以下步骤：收集菌体、重悬、碱裂解、中性化、长时间离心除杂质、DNA结合、洗净、洗脱等。这一方法缩短了抽提纯化质粒的时间，使质粒纯化的方法相对以往的方法简单而有效，一般所花抽提纯化时间约为30分钟，因此为科研人员提供了更多的方便，节约了时间。然而，这一方法需要进行菌体的重悬、中性化和长时间的离心等繁杂步骤，花费的时间仍然较长，所花成本也较高，不太适合大量样品的抽提，也限制了其自动化的进程。CN1546516A公开了一种质粒DNA提取和纯化方法，提取和纯化时间也很长，效率低。

                            发明内容

本发明的目的在于克服现有质粒抽提纯化方法存在的缺陷，提供一种构成简单，抽提纯化操作简便，效率更高的质粒抽提纯化试剂盒及质粒抽提纯化方法。

本发明的目的是采用以下技术方案实现的：

本发明试剂盒至少包括下列四种独立存在的液体：菌体裂解液，DNA结合柱前处理液，DNA质粒结合液，清洗液；优选方案是还配置有洗脱液。

所述菌体裂解液配方：葡萄糖10mM-1M，三氨基甲烷盐酸20mM-1M，乙二胺四乙酸10mM-500mM，碳酸氢钠100mM-500mM，曲拉通1％-50％(体积/体积)，十二烷基磺酸钠1％-25％(重量/体积)，溶菌酶2mg/ml-1g/ml，核糖核酸酶5-50mg/ml。

所述DNA结合柱前处理液配方：氯化锂或氯化钠10mM-5M，氢氧化钾或氢氧化钠100mM-2M，十二烷基磺酸钠5％-20％(重量/体积)，盐酸0.01M-2.5M。

所述DNA质粒结合液的配方：盐酸胍1M-6M，氯化钠10mM-100mM，吗啉代乙烷磺酸10mM-100mM，异丙醇；四者体积配比：40∶40∶10∶10。

所述清洗液配方：三氨基甲烷盐酸1-50mM，乙醇70-85％(体积)。

所述洗脱液为pH8-9浓度8-12mM的三氨基甲烷盐酸；当试剂盒中没有配备此种洗脱液时，可以纯水代替此种洗脱液进行洗脱。

将各原料按配比混合，即可制备成所述各种溶液。

使用本试剂盒进行细菌质粒抽提纯化的方法如下：

裂解菌体：将40-100μl裂解溶液加入300-1000μl(OD600＞2)培养菌液，混合放置40-80秒钟；

前处理DNA结合柱：将150-300μl DNA结合柱前处理溶液加入DNA结合柱中，以10000-15000转离心8-20秒，弃除溶液；

结合质粒DNA：将200-400μl DNA质粒结合溶液加入裂解菌液之中，上下翻倒离心小管8-12次，混合，加入已经处理过的DNA结合柱之中，以10000-15000转离心10-30秒；

清洗：加入清洗溶液700-900μl，以10000-15000转离心8-20秒，弃除离心液，再离心50-80秒钟。

洗脱：加入30-40μl洗脱液于DNA结合柱中心，以10000-15000转离心20-40秒，即可得到高纯度质粒DNA。

使用本发明试剂盒及质粒抽提纯化方法得到的质粒DNA，经使用分光光度计检测，A₂₆₀/A₂₈₀值为1.7-2.0。

使用本发明试剂盒及质粒抽提纯化方法从培养的菌体中提取高纯度的质粒，可用于下列各种实验，如：酶切重组、测序、PCR等等。

本发明摒弃了以往质粒抽提所用碱裂解法，采用温和变性剂及酶裂解法，不必离心收集菌体，直接利用高浓度(OD600＞2)培养菌液(如大肠杆菌DH5α、XL1-Blue等)进行裂解；采用全新溶液配方前处理二氧化硅纤维膜，使蛋白、RNA细菌膜片等杂质更易清除，而且质粒DNA更易结合；还省去了现有广泛使用的经典方法中的重悬、中性化等步骤；正是由于上述原因，使用本发明之试剂盒及质粒抽提纯化方法，可在3-5分钟内快速有效地完成质粒抽提纯化工作，大大缩短抽提时间，从而可为研究人员节省大量实验时间；还可以用于大批量样品抽提，在紧急情况下抽提纯化质粒；此法还为质粒抽提的自动化和大规模化奠定了技术基础。

                          具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

裂解液的配方为：葡萄糖10mM，三氨基甲烷盐酸20mM，乙二胺四乙酸10mM，碳酸氢钠100mM，曲拉通1％(体积/体积)，十二烷基磺酸钠1％(重量/体积百分比)，溶菌酶2mg/ml，核糖核酸酶5mg/ml。做每个样品需取60μl放入离心小管内。

DNA结合柱前处理液的配方为：氯化锂10mM，氢氧化钠0.001M，十二烷基磺酸钠5％，盐酸0.01M。做每个样品取250μl放入结合柱中。

DNA质粒结合液的配方为：盐酸胍6M，氯化钠100mM，吗啉代乙烷磺酸100mM，异丙醇，四者体积之比为：40∶40∶10∶10。做每个样品取350μl放入结合柱中。

清洗液的配方为：三氨基甲烷盐酸1mM，再加入无水乙醇80％(体积)。做每个样品取750μl放入结合柱中。

洗脱液为：三氨基甲烷盐酸8mM，pH8。每个样品取量为40μl。

使用本试剂盒，进行质粒抽提纯化的步骤如下：

(1)将裂解溶液60μl加入800μl(OD600＞2)大肠杆菌DH5α培养液，混合放置80秒钟，同时进行第二步；

(2)将250μl前处理溶液加入DNA结合柱中，10000转离心20秒，弃除溶液；

(3)将350μ1 DNA结合溶液加入裂解菌液之中，上下翻倒离心小管12次，混合，加入已经处理过的DNA结合柱之中，离心30秒(15000转)；

(4)加入清洗溶液750μl，15000转离心20秒，弃除离心液，再离心80秒钟；

(5)加入40μl洗脱液于结合柱中心，15000转离心40秒，得到高纯度质粒DNA。

经使用分光光度计对抽提纯化所得质粒DNA进行检测，A₂₆₀/A₂₈₀值为1.7。

实施例2

裂解液的配方为：葡萄糖500mM，三氨基甲烷盐酸200mM，乙二胺四乙酸100mM，碳酸氢钠200mM，曲拉通10％(体积/体积百分比)，十二烷基磺酸钠10％(重量/体积百分比)，溶菌酶20mg/ml，核糖核酸酶0.5mg/ml。做每个样品取50μl放入离心小管内。

DNA结合柱前处理液的配方为：氯化钠2M，氢氧化钾0.1M，十二烷基磺酸钠10％(重量/体积百分比)，盐酸0.5M。做每个样品取200μl放入结合柱中。

DNA质粒结合液的配方为：盐酸胍2.5M，氯化钠3mM，吗啉代乙烷磺酸50mM，异丙醇100％(体积)，四者体积比例：40∶40∶10∶10。做每个样品取300μl放入结合柱中。

清洗液的配方为：三氨基甲烷盐酸10mM，加入无水乙醇80％(体积)。做每个样品取600μl放入结合柱中。

洗脱液为pH8.5浓度10mM的氨基甲烷盐酸。每个样品取量为35μl。

使用本试剂盒，进行质粒抽提纯化的步骤如下：

(1)将50μl裂解溶液加入500μl(OD600＞2)大肠杆菌DH5α培养液，混合，放置60秒钟，同时进行第二步；

(2)将200μl前处理溶液加入DNA结合柱中，12000转离心10秒，弃除溶液；

(3)将300μl结合溶液加入裂解菌液之中，上下翻倒离心小管10次，混合，加入已经处理过的DNA结合柱之中，12000转离心10秒；

(4)加入清洗溶液600μl，12000转离心10秒，弃除离心液，再离心60秒钟；

(5)加入35μl洗脱液于结合柱中心，12000转离心30秒，即得到高纯度质粒DNA。

经使用分光光度计对抽提纯化所得质粒DNA进行检测，A₂₆₀/A₂₈₀值为2.0。

实施例3

裂解液的配方为：葡萄糖1M，三氨基甲烷盐酸1M，乙二胺四乙酸500mM，碳酸氢钠500mM，曲拉通50％(体积/体积)，十二烷基磺酸钠25％(重量/体积)，溶菌酶1mg/ml，核糖核酸酶50mg/ml。做每个样品取40μl放入离心小管内。

DNA结合柱前处理液的配方为：氯化锂5M，氢氧化钾2M，十二烷基磺酸钠20％(重量/体积)，盐酸2.5M。做每个样品取150μl放入结合柱内。

DNA质粒结合液的配方为：盐酸胍1M，氯化钠10mM，吗啉代乙烷磺酸10mM，异丙醇，四者体积比例为：40∶40∶10∶10。做每个样品取250μl放入结合柱内。

清洗液的配方比为：三氨基甲烷盐酸50mM，再加入乙醇85％(体积)。做每个样品取500μl放入结合柱内。

洗脱液为纯净水。每个样品取量为30μl。

使用本试剂盒，进行质粒抽提纯化的步骤如下：

(1)将40μl裂解溶液加入300μl(OD600＞2)XL1-Blue培养液，混合放置40秒钟，同时进行第二步。

(2)将150μl前处理溶液加入DNA结合柱中，10000转离心8秒，弃除溶液。

(3)将250μl结合溶液加入裂解菌液之中，上下翻倒离心小管8次，混合，加入已经处理过的DNA结合柱之中，离心10秒(10000转)。

(4)加入清洗溶液500μl，10000转离心8秒，弃除离心液，再离心50秒钟。

(5)加入30μl纯净水于结合柱中心，10000转离心20秒，即得到高纯度质粒DNA。

经使用分光光度计对抽提纯化所得质粒DNA进行检测，A₂₆₀/A₂₈₀值为1.8。

上述实施例中所使用的DNA结合柱为长沙安比奥生物技术有限公司生产的Miniprep DNA结合柱。