在增强的多核苷酸递送的电穿孔中减少金属毒性的方法

摘要

本发明提供了多种通过侵入电极在组织中激发脉冲电场将多核苷酸从体内导入健康组织中的方法，其能够增强多聚核苷酸向组织细胞的递送，同时能减少由于金属污染物从上述电极中的释放而引起的对电穿孔组织的局部副作用和对电穿孔生物体的副作用。在一实施例中，本发明方法应用金、金合金、或其它金属作为电极，使引入电穿孔组织的有毒的金属量降至最少。在另一实施例中，本发明方法可通过将DNA给予合适的靶组织细胞而应用于基因治疗中，并且通过给予DNA疫苗而诱导免疫反应。

说明书

技术领域

本发明涉及电脉冲技术增加细胞的通透性的应用，尤其涉及利用可控电场用于通过电穿孔疗法(EPT)在体内将核苷酸，诸如基因导入细胞，即，细胞穿孔疗法(CPT)的方法及装置，在所述治疗程序中，使用由不在受治疗者体内引入显著量的有毒材料制成的电极。

背景技术

20世纪70年代研究发现，电场可被用来给细胞进行打孔，而不造成永久性的损伤。该发现使得将小分子或大分子插入细胞质中成为可能。因而，人们知道包括那些用于编码基因的多聚核苷酸及其它药物化合物能够通过上述过程整合入活细胞中，上述过程被称为电穿孔。当在体外应用电穿孔技术时，该基因或其它分子与活细胞在缓冲介质中被混合，并应用低脉冲的高电场。此时细胞膜变得瞬间多孔，多核苷酸或其它分子能够进入该细胞膜。

电穿孔技术已被应用到治疗过程中，包括癌症化疗的加强。在某些类型癌症的治疗过程中，化疗药物是在细胞内起作用的，所以必须有足够的全身剂量，这样才能达到足够高的细胞内药物浓度杀死癌细胞，在这种情况下不杀死超量的正常细胞通常是难以实现的。假如该化疗药物在低剂量的全身浓度下，能够选择性递送到癌细胞内并达到一高细胞内浓度，就能实现在不杀死机体难以承受的正常细胞情况下杀死癌细胞的目标。某些最有潜能的抗癌药物，诸如博莱霉素，并不能有效地穿透细胞膜。然而，肿瘤细胞的电穿孔技术通过使电穿孔的细胞膜瞬间通透，而使博莱霉素选择性地进入电穿孔的细胞内。

典型的肿瘤电穿孔治疗是通过将肿瘤细胞置于至少一对电极之间，利用产生的电场将抗癌药物直接注入到肿瘤中而实现的。电极的结构和电场强度必须满足当肿瘤细胞电穿孔发生时并不显著影响周围的其它正常细胞。近体表的肿瘤例如皮肤癌，通过将非侵入性盘状电极置于肿瘤的反面，而使电极间的电场环绕在肿瘤周围，能够使正常组织在电场中的暴露维持在最低限度。盘状电极间的电场是相同的；电极间的距离能够测量，产生所需场强的电压加在电极之间，其按照公式E＝V/d而得的，(E＝每厘米电压下的电场强度，V＝以伏特表示的电压，d＝以厘米表示的距离)。采用非侵入性电极而进行的体内电穿孔通常仅限于小的非侵入电极能够被安置的近体表肿瘤，例如组织表皮。即使采用外科手术的方法来治疗，应用盘状电极治疗大的或深部(内部)的肿瘤通常是困难或有时是不可能的。此外电极间的距离超过约1厘米时也是没有实用性的，因为必须加足够大的电压才能达到所需的电场强度，会产生机体难以承受的副作用。美国专利第5,439,440号和其它相关专利披露了一种用于体内电穿孔的电极系统，其中该侵入性电极能够插入肿瘤内，该种侵入性电极能够插入深部的肿瘤内部，并对大肿瘤体积产生所需的电场强度。在相关的美国专利第5,273,525号中，一种改装后注射器能用于注射分子，包括大分子，用作电穿孔所用的注射针头，同时也能够作为电极使用。该种结构使得电极能够置于表面下，并且可以用于位于与针头电极相临或处于针头电极之间的组织细胞的电穿孔。在本发明的描述中，术语“针头电极”是指任何侵入性电极。

当金属针头电极被置于健康组织时，也可用于进行各种目的的基因治疗。在进行这种应用时，包裹或裸露的DNA被注射入正常组织中，接着注射位点即发生电穿孔。然而，最佳的递送DNA进入细胞的电穿孔条件，不同于最佳的递送低分子量治疗药物的条件。一般来讲，在较低的额定场强(100-400V/cm)下的相对较长的脉冲(毫秒)与适用于递送低分子量药物的相对较短的脉冲(微秒)及较高的额定场强(1000-1500V/cm)相比，更适合于DNA的递送(Dev，S.B.et al.，IEEE Transactions on Plasma Science 28(1)：206-223(2000))。典型的DNA递送脉冲与药物递送脉冲相比能够造成更高量的电流累积。高量的累积电流(Amp·sec＝Coulombs，C)能够增加电极的电化学效果，例如电极所含某种金属成分的溶解，或电极的固体金属残片的脱落。

以基因治疗或DNA免疫为目的增强电穿孔基因递送至正常组织的优化条件包括在额定场强(100-400V/cm)的条件下，10-80ms持续时间的脉冲。然而，DNA递送也能够在更加宽的范围内实现，即1-100ms及50-2000V/cm。将通常用于DNA递送所需的在200V电压下的60ms的脉冲与通常用于博莱霉素递送所需的在500V电压下的100μs的脉冲相比，用于DNA递送脉冲所产生的电荷迁移量(库仑)是用于博莱霉素递送所产生的电荷迁移量的240倍。因而，在提供的所有其它电和组织条件基本相同的情况下，电穿孔技术在基因治疗或DNA接种中被用来递送基因给正常组织时，电极金属的溶解量是该技术递送药物用于治疗肿瘤时的240倍。在长脉冲条件下，含不同金属成分的特定金属针头电极释放的有毒金属量对于组织或器官通常是有毒的。此外，在电穿孔的脉冲条件下，金属碎片会从电极上脱落下来，导致电化学过程的发生，如腐蚀。溶解了的金属离子及从电极上脱落的金属粒子被沉积在组织中，并产生局部的毒副作用。例如，当选用不锈钢针头作为加强电穿孔递送基因给健康组织时，我们立即观察到了临近针式插入和穿刺位点(沿针的痕迹)组织脱色的现象，或许是由于金属的污染。同时。我们也观察到针头金属本身发生氧化、腐蚀、金属碎片(剥落或脱落)的现象。金属污染物可以进入到淋巴和血液循环系统，产生全身毒性。在利用抗癌药物及电穿孔技术(如博莱霉素)治疗肿瘤时，与基因治疗和DNA接种过程中的金属污染相比，人们并未引起广泛关注，这是因为所释放的金属至少比基因治疗和DNA接种过程低两个数量级，并且对于肿瘤和健康组织产生所引起的毒副作用，并不被认为危害健康。

在相对高的场强(1.2-3.0kV/cm)和短脉冲(50-500μs)条件下(T.Tomov and I.Tsoneva，Bioelectrochemistry 51：207-209(2000))，已经检测到了扁平不锈钢电极释放的铁离子。铁离子的释放量已经被发现与脉冲持续时间及场强的平方成正比。并没有不锈钢电极的其它成分溶解的相关报道，特别对于铬和镍离子的细胞毒性给予了比铁更大的关注，但是并未对如何避免由电极产生的潜在毒性提出建议。

因此，目前本领域需要寻找更好的用于实施递送多核苷酸增强电穿孔的方法，其中针式电极被安置在健康组织中。本发明通过提供将多核苷酸导入健康细胞和其它正常组织，而使从电极中释放的有毒金属的毒副作用最小化的方法，从而解决了本领域的上述及其它的问题。

发明内容

在本发明的第一实施例中，提供了电穿孔技术的方法，所述方法包括将至少两个针式电极接在预先选择的组织上，其中该针式电极部分或其接触组织的表面部分由金、或金合金组成、或在适合电穿孔细胞递送多核苷酸进入所述细胞的条件下显示低毒性的金属。所有所述金属或合金此后简称为“金”。

在另一实施例中，本发明的方法包括通过一种选自于由肌内、真皮内、皮下、粘膜下组成的途径或通过其它任何组织将有效量的至少一种多核苷酸导入受试者的靶组织，并通过至少两个针式电极激发脉冲电场，其中位于靶组织的电场需有足够的场强，能够促进多核苷酸进入该靶组织的细胞中，例如当前任何基因治疗方法如本领域熟知的DNA接种。该脉冲电场可以和在此描述的多核苷酸导入同时激发或在该多核苷酸导入之后激发。

在另一实施例中，接触健康组织的针式电极部分可以含有金或具有至少在一非金的金属基座上的金的涂层或电镀，本发明中的术语金包含在本发明所述应用中不产生任合难以接受的副作用的金合金。例如金涂层或电镀应有的平均厚度为10μm。本发明的方法中，优选针式电极中至少有一个电极是中空的，使得多核苷酸能够从该中空的电极导入组织中。虽然本发明所指电极为金针式电极，但本领域的技术人员应了解，任何具有金属特性，如导电性等与金相似，并且其被导入组织中，而不产生毒性和造成组织褪色的金属或含金属的材料可以被用于在针式电极中代替金针。

在另一实施例中，脉冲电场的脉冲波长在约100微秒至约100毫秒的范围内。优选地，经含金针式电极所给的额定场强有足够的强度，能够与多核苷酸的导入同时释放，使得多核苷酸以比无电穿孔时更大的程度进入靶组织。例如，额定场强可以在约50V/cm至5000V/cm的范围内，优选为约200V/cm至约400V/cm。

在另一实施例中，本发明方法特别适用于在肌肉或皮肤中导入多核苷酸。本发明方法采用含金的针式电极，该针式电极不会造成金属成分的释放而致组织褪色。

在另一实施例中，本发明方法用于在不导入有毒的金属或不导入对组织有毒剂量金属的条件下导入多核苷酸进入健康组织，其用来将免疫有效量的至少一种编码抗原的多核苷酸递送进入靶组织，如肌肉或皮肤，使得该多核苷酸进入靶组织细胞并在此表达，目的是产生接种个体对多核苷酸编码的抗原的免疫反应。与健康组织接触的针式电极有至少两个，其中针式电极与组织接触的部分是镀金或由金组成的，并且脉冲电场在有足够强度的靶组织中激发，使多核苷酸进入靶组织细胞中并在此表达，目的是产生接种个体对多核苷酸编码的抗原的免疫反应。

可选地，编码抗原的多核苷酸的免疫原性与其它免疫方式相比可以通过事先或同时或在导入多核苷酸并激发电场的几天内，给靶组织导入有效佐剂而得到加强激发。本发明的方法中，多核苷酸与有效佐剂在导入其中之前可以互相在化学上缔合或不缔合，假如在化学上不缔合，则彼此相互独立给药。在一个相关的实施例中，利用本发明方法的联合提供一种安全有效增强多种抗原免疫源性，而不向健康组织或其它应用免疫方案的个体组织中引入针式电极释放的中毒剂量的金属或金属离子的方法。

因而，在一个实施例中，编码抗原的多核苷酸通过肌肉注射引入受治疗者的靶组织中，脉冲电场通过两个针式电极与健康组织接触而产生，其中针式电极接触组织的部分是金的。脉冲电场需有足够的场强和持续时间并且能够与核苷酸的导入基本上同时进行，这样能使多核苷酸进入靶组织细胞，并在此表达，以使受治疗者对于多核苷酸编码的抗原产生免疫反应；与此同时或在导入多核苷酸几天内，将有效量的佐剂粒子导入靶组织，其中该多核苷酸和佐剂粒子在导入前化学结构是互相不相关的。与其它应用此多核苷酸编码的抗原进行的免疫方式相比，本发明方法所引起的免疫反应能够得到加强。

本发明在此所披露的这些与其它实施例对于本领域的普通技术人员是显而易见的。在本发明中所引用的所有文献、专利、专利申请全部结合于此作为参考。

除有其它说明外，本发明适用于化学、生物化学、分子生物学、免疫学、药理学等技术领域内的传统方法，这些技术在文献中都有详细的说明，参见如，Remington’s Pharmaceutical Sciences，18thEdition(Easton，Pa.：Mack Publishing Company，1990)；Methods InEnzymology(S.Colowick and N.Kaplan，eds.，Academic Press，Inc.)；以及Handbook of Experimental Immunology，Vols.I-IV(D.M.Weirand C.C.Blackwell，eds.，1986，Blackwell Scientific Publications)；以及Sambrook and Russell.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(3rd Edition，2000)。

具体实施方式

在本发明的描述过程中，下列术语将被采用，并如下加以定义。

“惰性”意指一种稳定的成分，它被导入体内时，不会以任何可感知的方式与机体发生反应。

“多核苷酸”意指核酸的多聚物，例如DNA、cDNA、mRNA、及RNA，它们可以是线性的、松散环状的、超螺旋或者紧密的以及单股或双股的。多核苷酸同时还可以有一个或多个经或未经化学修饰过的支链，该多核苷酸不经载体即可运输(即，如“裸露”的多核苷酸)，或者经如本技术领域所熟知的合适的载体运输。特别值得注意的是在本发明的范围中所述的多核苷酸同时也包括寡核苷酸。除以裸露的形式存在外，该多核苷酸还可以以配剂的形式或修饰后的形式存在。例如多核苷酸可以与保护性的、相互影响的、非缩聚(PINC)聚合物混合后配剂(Fewell，J.G，et al.，Gene therapy forthe treatment of hemophilia B using PINC-formulated plasmiddelivered to muscle with electroporation. Molecular Therapy，3：574-583(2000))或多核苷酸还可被添加一个肽或其它化学基团，例如一种标记分子进行修饰(Zelphati，O.，et al，PNA-dependent genechemistry：Stable coupling of peptides and Oligonucleotides to plasmidDNA，Biotechniques 28：304-310；312-314；316(2000))。

“化学缔合的”意指化学合成的、化学添加的、带有或在上包被的、吸附的、或其它化学缔合的。例如核酸被粒子包被或吸附就是核酸与粒子的化学缔合，缔合意指共价键或非共价键。

“皮肤组织”意指角质层下的表皮和真皮。

“皮内的”和“皮内地”意指插入，但不在皮肤的表面及表层，例如皮内途径包括，但不限于表皮细胞的肿瘤组织。

“肌内处理”和“肌内地”意指进入肌肉组织的实质，即进入肌床。

“粘膜内处理”和“粘膜内地”意指进入粘膜或含有多种管腔结构粘膜组织，包括但不限于需氧消化的及尿生殖管。

“皮下处理”和“皮下地”意指进入皮下组织。

“免疫反应”意指使个体发生免疫或形成免疫反应的过程。

“抗体”意指动物，包括人类，由抗原诱发产生的免疫或保护性蛋白，其特征在于免疫蛋白与抗原具有特异性反应。

“基本上同时”意指多核苷酸和脉冲电场同步进入，意指同时，或彼此的进入在几分钟至几小时内。

“抗原”意指含有一个或多个表位的分子，其能够刺激宿主免疫系统使其产生体液抗体反应或当抗原被递送时所产生的细胞抗原特异性免疫反应。一般来讲，表位包含约3-15个，通常约5-15个氨基酸。用于本发明目的的抗原可源于已知的病毒、细菌、寄生虫及真菌中的任一种，本术语同时也包括其它几种肿瘤抗原中的任一种。此外，本发明目的中的“抗原”包含对原始序列，以及蛋白、多肽或多糖进行以下诸如缺失、插入及替换(一般来讲在自然条件下是稳定的)修饰后产生的物质，其具有激发免疫反应的能力。这些修饰物可以有目的的经原位直接诱变而得，也可是偶然的例如通过宿主突变产生抗原。

对一种抗原或组分的“免疫反应”是指被试验者对存在于该有益成分中的分子所产生的体液和/或细胞免疫反应。本发明中“体液免疫反应”是指经抗体分子调节的免疫反应，而“细胞免疫反应”是指经T-淋巴细胞和/或其它血液白细胞调节的免疫反应。细胞免疫的一个重要方面包括一种经溶细胞的T-细胞(“CTLs””)产生的抗原-特异性反应。CTLs对于肽抗原具有特异性，该肽抗原被递送入与之相缔合的由主要组织相溶性复合物(MHC)编码并在细胞表面表达的蛋白中。CTLs能帮助诱导和促进细胞内微生物在细胞内的破坏，或受所述微生物感染细胞的溶解。细胞免疫的另一方面包括由辅助性T-细胞完成的抗原特异性反应。辅助性T-细胞能起到帮助增强非特异性效应器细胞抑制与MHC分子缔合的细胞在其表面释放肽抗原的作用并集中其活性。“细胞免疫反应”还指由激活的T-细胞和/或其它血液白细胞产生的细胞因子、趋化因子及其它分子等，包括那些源于CD4+及CD8+的T细胞。

本发明方法中的编码抗原的多核苷酸“增强免疫原性”，在与同等量的多核苷酸在无粒子/脉冲电场辅助影响的条件下相比，加快了免疫反应的发生(即指增强了免疫反应的动力学)，或具有更强的激发免疫反应的能力。因而，本发明中用于诱导免疫反应的方法可以显示“增强的免疫原性”，因为所产生的抗原具有更加强大的免疫原性，或在被导入的受试验者中研究发现，需要更少量的编码抗原的多核苷酸就足以诱发免疫反应，或者因为在导入后能够更加快速达到，但不限于抗体滴度的免疫反应。在本发明中，增强的免疫反应相对于其它免疫方法而言，其优选还具有免疫反应动力学加快的优点，其以免疫反应出现的加快，如以抗体滴度的升高为证据。所述增强的免疫原性当加入多核苷酸和脉冲电场后可应用本领域技术人员已知的标准分析方法如放射免疫和ELISA检测到，或者以多核苷酸和粒子作为动物对照组并与本发明方法进行免疫反应的比较。

术语“辅助效应量”指本发明方法中应用的佐剂的达到辅助效果，即产生理想的免疫反应和相应的治疗效果所需的数量。所需的准确量依不同的试验对象而变，依赖于物种，年龄，受试者的大体条件，样品处理条件的严格程度，以及编码所需抗原的特定核苷酸，实施方式，是肌肉还是皮肤，佐剂的类型等。任何单一个体的大致“有效”剂量可通过本领域的常规实验检测得出。

包含编码抗原的多核苷酸的成分应含有所需多核苷酸的“免疫有效量”，即在该成分中应含有一定量的多核苷酸，当在粒子和脉冲电场联合的条件下，受试者体内产生的编码抗原应足以使其产生具有预防、减少或消除症状作用的免疫反应。大致的有效剂量可通过本领域技术简单测得。因而，通过常规方法所检测到的“免疫有效量”的域值较宽。

此处所用的“诱导免疫反应”特指以下(i)可以预防传统疫苗的感染和复染，(ii)减轻或消除症状，以及(iii)基本或完全消除可疑病原体。因而，用于诱导免疫反应的方法或许在预防(感染前)或治疗(感染后)中都将起作用。

“药学可接受”或“药理学可接受”指一种物质在生物学或其它方面是可接受的，该物质可以佐剂配方的形式进入个体，不产生任何未预见的生物学效应或并不与此组成中所含的任何其它成分反应而产生副作用。

“受试者”意指任何哺乳动物，包括但不限于人和其它灵长类动物，包括非人类灵长类，如黑猩猩及其它类人猿和猴种；饲养动物，如牛、绵羊、猪、山羊及马；驯养哺乳动物如狗和猫；实验动物包括啮齿类动物如小鼠、大鼠和几内亚猪、驯养宠物、和饲养动物，如家禽等。本术语未对年龄加以限定，因而成年和新生动物都可以作为本发明方法的受试对象。在此描述的本发明方法适合于上述的所有哺乳动物，因为以上所有哺乳动物的免疫系统是相似的。

根据本发明的实施例，当金针式电极被用来在健康组织中激发脉冲电场时，即使脉冲波长最后能够达到100毫秒，对于导入用于基因治疗和DNA接种过程中的多核苷酸和其它分子也是有利的，其能够使被治疗组织免受电极中释放的金属或金属离子引起的毒性影响。

例如，为了引起以基因治疗和DNA接种为目的的肌肉组织中细胞的电穿孔，在本发明方法中应用的脉冲电场将具有额定场强在约50V/cm至约2500V/cm之间，优选约200V/cm至约400V/cm。脉冲电场应用的脉冲波长在进入肌肉中时将在1-100毫秒(msec)的范围内，优选2-60毫秒并且约1-6脉冲被应用于频率为0.1-1000Hz。电脉冲的波型可为单峰或双峰。本发明方法进行DNA接种的基因治疗为目的的皮肤多核苷酸导入时，脉冲电场将产生约1-12个电压在50V至200V的脉冲，每个脉冲持续时间约100微秒至100毫秒，频率为0.1-1000Hz。

为了使肌肉中脉冲电场的激发与DNA接种或用于基因疗法的多核苷酸的导入基本上同时进行，针式电极优选有2、4或6个电极。金或包被金的电极形状，可以是成对的，极性相反的一对，平行箭头、三角形、长方形、正方形、或任意其它合适的几何形状。

为了使皮肤中脉冲电场的激发与DNA接种的导入基本上同时进行，几种侵入性电极可以被采用。当电穿孔技术应用于皮肤表层时，长度由小于1微米到几微米之间的短的针式电极更为适用，因为这样可以穿过皮肤的角质层、表皮及真皮达到一定的深度。而电穿孔技术应用于肌肉时，优选使用更长的针式电极。

下面的表1中提供了本发明方法中的电穿孔技术实际应用中的几种优化条件，其中用于电穿孔的针式电极中含金，这样场强在健康组织中激发后，不会使针式电极在该组织中释放大量有毒金属。

表1

  导入  位点  电极  类型    场强  脉冲数    脉冲长度  施加的  电压  频率  (Hz)肌肉2-针式电极低150-200V/cm1-3同一脉冲长60毫秒N/A 0.1-10肌肉4-针式电极低150-200V/cm1-3同一脉冲长60毫秒N/A 0.1-10肌肉6-针式电极低150-200V/cm6同一脉冲W/电极颠倒长20-60毫秒N/A 0.1-10皮肤细胞内短电极低150-200V/cm1-6同一脉冲长100微秒-60毫秒 0.1-50

本发明方法还可应用于粘膜组织作为靶组织，例如口腔和鼻粘膜。所应用的电荷参数，基本上与此前所阐明的皮肤组织的相同。通过于粘膜下注射裸露的、配剂的或修饰后的多核苷酸或局部应用可以将多核苷酸导入粘膜组织及细胞，或粘膜下的细胞，接着采用微小的含金的，例如是由多个短的针式电极构成的侵入性电极进行电穿孔。(美国专利第5,810,762号；Glasspool-Malone，J.，et al.Efficient nonviral cutaneous transfection. Molecular Therapy2：140-146(2000)；Zhang，L.，et al. Enhanced delivery of naked DNA tothe skin by non-invasive in vivo electroporation.Biochim.Biophys.Acta 1572(1)：1-9(2002))。技术人员可以直接通过实验来确定递送DNA疫苗到特定的粘膜组织的最优条件。

在此描述的方法提供了一种用于治疗多种恶性肿瘤的手段。例如，本发明方法还可被用来增加对于可疑癌症产生的特异性蛋白所发生的体液和细胞调节的免疫反应，特异性蛋白例如激活的致癌基因、胎抗原、或激活标记。这些肿瘤抗原包括但不限于，任何一种MAGEs(黑色素瘤相关抗原E，melanoma associated antigen E)，包括MAGE 1，2，3，4等。(Boon，T.Scientific American(March 1993)：82-89)；任何一种酪氨酸酶；MART 1(被T细胞识别的黑色素瘤抗原，melanoma antigen recognized by T cells)；突变的ras；突变的p53；p97黑素瘤抗原；CEA(癌胚抗原)，及其它。显而易见，本发明可用来预防或治疗多种疾病。

组合物一般还包括一种或多种“药学可接受的赋型剂或载体”，如水、盐、甘油、聚乙二醇、透明质酸、乙醇等。此外，其它辅助物质，如润湿剂或乳化剂，pH缓冲物质等，都可存在于载体中。

下面是对用于完成本发明的具体实施方式的特定实施例的举例说明，在下面的实施例的脉冲电场中全部选用金电极，其只是为了说明目的，而不以任何方式用来限定本发明的范围。

实施例1

本实验目的是量化电穿孔脉冲对于不锈钢针式电极完整性的影响。本实验通过观察针所通过轨迹的组织是否变色而完成，研究表明，在适合导入多核苷酸的脉冲条件下，进行体内电穿孔实验之后，能够发现电极老化的迹象，这些老化迹象包括原有光滑和有光泽的针式电极表面变得粗糙、多坑和发生剥落，从最初的银色变为深棕色及黑色，并且锋利的针尖变钝。随着电极所递送的脉冲数增加，电极老化的现象越发明显，在大约递送30个脉冲后，肉眼即可见针式电极直径减少。因此，通常关于不锈钢电极是化学惰性的，并且在电穿孔条件下与电穿孔位点是生物相容的假设得到怀疑。

制造电极的不锈钢，约含有74％的铁(Fe)、18％的铬(Cr)及8％的镍(Ni)。众所周知，即使少量的铬和镍也会造成局部组织毒性，并且当可溶解的铬和镍经由血液或淋巴系统进入全身时，即会造成全身毒性。为确定从不锈钢针式电极中脱落的金属量，以前的文献中已经描述的从六-针阵列的电极中取出的六个样品(G.A.Hofmann et al.，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems16：523-569(1999))浸入到USP级磷酸盐缓冲液中，浸入深度13mm，以及200V电压的方波电穿孔脉冲，其分别具有25ms及60ms的持续时间，以2Hz的频率被应用。对照样品同样进行准备，但不递送电脉冲。用加入的酸将电穿孔样品中观察到的固体碎片溶解。测试样品的金属离子量接着通过电感耦合等离子体质谱(InductiveCoupled Plasma Mass Spectrometry)(ICPMS)来检测，结果列于表2。本实验令人惊奇的结果表明，在被分析的溶液中检测到的金属离子总量比基于现有生物化学成文法律所规定所计算出的期望的最大溶解量多5倍并且检测到了电荷的迁移(利用库仑计)。对于这个令人惊奇的发现一种可能的解释是该溶解量是由于来自于该电极表面的固体离子的错误定位。而事实上所认为的相对惰性和抗腐蚀的不锈钢电极不仅被已知的电解过程影响，而且在其表面发生了结构蜕变而导致固体金属粒子的脱落。这一不期望的现象或许是由于该针式电极暴露在几十微秒的高电流密度或高场强中造成的。有趣的是，在更高的场强强度和电流密度情况下，而脉冲持续时间缩短时，如用于体内递送博莱霉素时，其对不锈钢电极的破坏程度与用于体内递送多核苷酸的电条件相比大大减少。换而言之，电极中释放的高量金属，其是电化学领域技术人员所预期数值的几倍，这是应用该种电极进行电穿孔治疗的直接结果的新发现。

对溶解后的金属的原子价态进行了检测。值得注意的是，在体内电穿孔过程中可以产生高价态的Cr和Ni，其毒性比其低价态更大，因此，其金属离子的可生物利用量的毒副作用可能比Ni和Cr在二价状态时还要高。

金属脱落的线性外推的结果表明在电极大约经过三千次60毫秒脉冲，或大约经过七千次25毫秒脉冲后电极即完全破碎(针口径22，长13mm)。然而，线性外推在这种情况下或许是不正确的并且针的老化实际上随脉冲数量的增加而加剧。

表2

样品      电压    持续时间    电荷                 金属溶解毫克数

           V         ms        mC

                                         Fe           Cr           Ni

 1        -          -         -                       忽略

 2        200        25        128        0.104        0.024        0.012

 3        200        60        224        0.222        0.061        0.025

 4        -          -         -                       忽略

 5        200        25        128        0.103        0.024        0.012

 6        200        60        224        0.225        0.062        0.026

实施例2

本实验的目的是找到针式电极的合适组分，这样在体内递送多核苷酸的电穿孔条件下，从电极上脱落的有毒金属的相对数量减少。如实施例1所示，不锈钢针式电极能够脱落相当量的有毒金属，其包括最初关注的Cr和Ni的金属离子及金属颗粒两种形式。而Fe并未得到显著关注，已知Cr和Ni能够产生各种毒性，在医学文献中有所报道，还知道Ni对于很多人能够导致过敏症。

电穿孔所需的针式电极必须满足一定的性能要求，其必须具有在不施加不适当压力的前提下，能容易地插入肌肉和其它组织、穿透皮肤的机械性能。针必须有足够的硬度，不致插入时被压弯(在针的阵列中针之间彼此平行)，同时也不能过于脆以致遇到坚硬的障碍(如骨骼)，或当意外地遇到弯曲力时即破裂。针还必需能容易及经济地生产，另外，针必需具有足够的导电性及生物相容性。在电穿孔过程中任何从电极上电解的粒子或产物必需都不能明显提高局部或全身毒性。

我们测试了一系列的针头，钨或不锈钢作为基底金属，用不同的镀金方法包被金，其检测方法包括机械以及电化学检测。电化学检测是通过事先将未用过的针头阵列浸入到1cm USP级的磷酸盐缓冲液中，并应用电压为200V以2Hz的频率及不同微秒的脉冲持续时间的方波脉冲六次。每次脉冲后电极的极性颠倒，此后，用ICPMS方法分析盐溶液中的金(Au)、钨(W)、Fe、Ni及Cr成分。某些测试的针头的分析结果列于表3中。在电穿孔后，与不锈钢电极相比，ss/金#3针式电极显示Cr、Fe及Ni在溶液中的含量降低。Au的浓度为897ppb，其毒性可忽视。W/金#3类型的针式电极显示出溶液中的Cr、Fe及Ni含量基本可忽略。钨和金的浓度相对于毒性点是不显著的。上述结果表明，通过选择具有合适的机械和电学性能的材料用于针式电极，可以显著减少电穿孔治疗中使用不锈钢电极所带来的相关的毒副作用，该电极可以容易及经济地生产，且其对于利用电穿孔治疗过程治疗的受治疗者只给予很小的毒性。

表3

针类型    电穿孔脉冲后盐溶液中的金属(ng/ml，ppb)  不锈钢(ss)ss/金#3W/金#3  Cr       Fe      Ni      W     Au 5,600   19,700   2,510    6     2 886     1,080    1,540    1     897 3       120      3        88    1920

实施例3

本实验的目的是为了当测试是在模仿体内进行电穿孔将多核苷酸导入靶细胞的条件下进行时，评估电极的各种金属成分的相容性。评估了三种不同类型的针，盐水作为对照。未镀金的304不锈钢针、表面镀金的304不锈钢针、及表面镀金的钨针，以4针阵列的形式检测。在该阵列中四个针被装配在0.86×0.5cm的矩形的四角的非导电性把手上。四个针都与脉冲激发器相连，这样就可使每对的两个反相电极同时激发脉冲。每对电极的正负极间的距离是0.86cm，两对电极间的距离是0.5cm。每个阵列的四个针均浸入12ml盐水中，其深度为2.8cm且在200V电压每次60毫秒下用方波以2Hz(赫兹)频率脉冲10次。在脉冲之后，每个样本取6ml用于细胞毒性检测及6ml用于化学分析。对于毒性检测，每6ml样本与2ml含50％小牛血清4x MEM(最小必需的培养基)相混合，并用NaHCO₃将pH值调至7.2(“检测溶液”)。将L929细胞接种在6孔细胞培养板上，并在含10％的小牛血清的1x MEM中于5％的CO₂/空气的环境中37℃下培养至80-90％融合。将培养基从孔中取出，在每个孔中加入每个检测溶液的每次2ml的三份样品。在对活细胞用中性红染色后通过显微镜下评价将六孔板温育48±3小时。每三个取样样品为一组所得值取平均并记录。同时进行细胞毒性试验的阳性和阴性对照检测。表4描述了用于评价试验结果的标准。表5中列出了细胞毒性的得分。从结果中可以看出，未镀金的不锈钢针显示出相当大的细胞毒性，而镀金的不锈钢针和钨针都未显示出可检测到的细胞毒性。

表4

级别反应性反应区的描述0无离散的细胞质内颗粒，无细胞溶解。1微弱不多于20％的细胞呈圆型，松散、粘附状态，并且无细胞质内颗粒，偶而有溶解细胞。2轻微不多于50％的细胞呈圆型，且细胞质内无颗粒；无大量的细胞溶解和细胞间空区。3中等不多于70％的细胞呈圆型和/或溶解。4强烈细胞几乎全部被破坏。

表5

样品识别  级别，  试验#1  级别，  试#2  级别，  试验#3  平均  级别盐水对照    0    0    0    0镀金的钨    0    0    0    0镀金的304不锈钢    0    0    0    0未镀金的304不锈钢    4    4    4    4