公开/公告号CN1643141A
专利类型发明专利
公开/公告日2005-07-20
原文格式PDF
申请/专利权人 查尔莫斯技术许可公司;
申请/专利号CN03806771.4
发明设计人 安－索菲·桑德博格;托马斯·安德利德;
申请日2003-03-21
分类号C12N9/16;
代理机构11139 北京科龙寰宇知识产权代理有限责任公司;
代理人孙皓晨
地址 瑞典哥德堡斯特纳中心S－41292
入库时间 2023-12-17 16:21:02
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2014-05-14
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C12N9/16 授权公告日:20091223 终止日期:20130321 申请日:20030321
专利权的终止
2010-06-02
专利权的转移 IPC(主分类):C12N9/16 变更前: 变更后: 登记生效日:20100423 申请日:20030321
专利申请权、专利权的转移
2009-12-23
授权
授权
2005-09-14
实质审查的生效
实质审查的生效
2005-07-20
公开
公开
发明背景
本发明涉及一种具有植酸酶活性的啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，尤其涉及一种经过改造、作为发酵用途啤酒酵母，应用上述改造酵母的发酵产物，来源于使用上述酵母的植酸酶，以及由此获得的包括肌醇在内的肌醇磷酸盐衍生物。
铁元素缺乏(缺铁)不仅在发展中国家影响着为数众多的婴儿、儿童和妇女，也是唯一在所有发达国家中呈明显流行的营养缺乏，是一种世界范围内最常见的营养不良症之一。铁和可能包括锌的缺乏不仅流行于以谷物和豆类为主要食物来源的发展中国家，而且也时常侵害到工业化国家中的脆弱人群，如对其存在高量需求的育龄妇女，婴儿和成年人。由于生物利用率低下，在发展中国家中，铁元素缺乏会延缓正常的婴儿脑发育，增加早产几率而影响受孕和弱化分娩前后的母婴健康状况。锌元素缺乏会阻滞正常的儿童发育并且严重地削弱免疫系统导致感染几率增加。机体的生长需要高量的钙元素。一生中的骨骼量决定于起始量(成骨材料最大值)和随后的流失，这两种因素都与随后发育中的骨质疏松直接相关。
尽管通常意识不到铁元素微量和中量缺乏，但其对诸如体力、生理和心理耐受度以及生活质量等界定不佳的指标确有影响。
慢性失血是铁元素缺乏的最主要原因。粗略计算，由于流汗和细胞剥落导致的不可避免铁损失每天在1-2mg之间。对男人而言，只要平均从每天食物中摄入的10-15mg铁中吸收10％就可以平衡这些损失。然而对妇女来说，月经将使得每日铁损失量再增加1mg，使得她们更加难于达到铁平衡状态。
已经完备建立多种血液学和生物化学的测试，来检查和诊断个人和估计人群的铁元素缺乏情况。
任何从食物中摄入的铁元素量都由三个因素决定：铁元素数量，食物的组分和小肠粘膜上部的蠕动情况。铁生物利用率的变动(从食物中吸收的铁元素总量与被机体利用量的比率)远远比食物中所含的铁元素数量更加重要。无论其饮食组分如何，肉类、禽类和鱼中的血红素铁很容易被吸收，而非血红素铁的吸收则显著地受到食物中其他成分的影响。目前已经鉴定出了一些影响铁吸收的助催化剂和抑制剂。铁的生物利用率最终决定于食物中催化剂和抑制剂的相对数量。
尽管铁是地壳表面含量第二丰富的元素，它的低水溶性使得它的代谢吸收成为一个很大的问题。环境中的铁元素大多以非水溶性盐的形式存在。尽管胃中的酸性环境有助于将其中的一部分转换为可吸收形式，但此过程的效率是有限的。
很多植物都能产生诸如植酸(有机多聚磷酸)等的强螯合物，作为铁吸收过程中的有效抑制剂，比如谷物和豆类植物。
锌元素在超过300种酶类中都是重要成分，这些酶具有修复伤口，保持成人的生殖能力和儿童的正常发育，合成蛋白质，增值细胞，保持视力，促进免疫，防护自由基及其他广泛的功能。
锌元素缺乏多发于肉类缺乏、锌元素生物利用率低的个人和人群，在以富含植酸的未加工谷物为主要食物的世界贫穷地区，发生几率更高。素食主义者及乳素食主义者都大量摄入植酸，所以常常伴随着较高几率的锌元素缺乏。关于人锌元素缺乏的最早的报道发生于上个世纪60年代末70年代初埃及和伊朗的青年男孩女孩中，症状是严重发育障碍，伴随着性发育成熟延迟的性机能减退。其原因在于长期摄入未经发酵含有高植酸浓度的全麦面包和很少的动物蛋白。在摄入锌元素和其他营养成分后，发育和性成熟的状况大大得到了改善。食物中的锌元素缺乏后来也在许多国家的儿童中有过描述，如土耳其、中国和南斯拉夫。怀孕妇女是另一类易受侵袭的人群。
除了以上的症状，锌元素缺乏还有其它的临床表现，如免疫抑制，康复困难，皮炎和对神经心理功能的损伤等。
对锌元素缺乏的诊断由于还不存在相关的指数而存在困难，目前主要是通过测量血浆和血清中锌水平指数来进行判断。在中度和严重缺锌的情况下，这些指数会有所下降。
饮食数据和骨健康间接测试都指出，钙元素的生物利用率在日常摄入量低时至关重要，尤其是在骨形成和消失阶段。钙元素的生物利用率在富含植酸的未加工植物中很低。
谷物，油料种子和豆类为大多数人来提供了食物蛋白，卡路里，维生素和矿物质。谷物中含有磷、钾、镁、钙、痕量的铁和其他矿物质。每100g大麦和小麦各含有钙50mg和36mg，每100g大麦、粟、燕麦和小麦中各含有铁6mg、6.8mg、4.6mg和3.1mg。
肌醇六磷酸(Inositol hexaphosphate，IP6)广泛存在于自然界中，是真核生物细胞肌醇磷酸盐中的最主要部分。在植物中，IP6是磷的最主要储存形式，尤其是在谷物和豆类的籽实。在谷物中，植酸盐存在于糠和胚芽中，而在豆类中则存在于胚乳的蛋白质体中。负电性极强的IP6可与矿物质和蛋白质形成多种复合体，通常称为植酸盐。植酸盐被认为是一种在营养物质反营养物质，它可与营养物质形成沉淀复合物从而强烈地降低对铁、锌、钙和镁等的吸收。在人身上实验已经证实植酸对铁、锌和钙的吸收剂量依赖抑制作用，除此之外，肌醇五磷酸已被证实是铁和锌的吸收抑制剂，而且有文献指出IP6可以抑制消化酶的可溶性、可消化性和活性(Reddy et al.Reduction inantinutritional and toxic components in plant foods by fermentation.Food Res.Int.27，281-290.)。将谷物和豆类食物中的植酸降解到较低水平就可以显著的提高人对铁和锌的吸收，要提高铁的吸收就意味着植酸的降解要完全。这样的话，一旦谷物和豆类中的植酸被降解了，它们就成了相当好矿物质来源。
植酸酶使得植酸的降解成为可能。在某些谷物中，天然的植酸酶在浸泡、萌发、制麦和发酵过程中都具有活性。植酸的降解可以通过优化这些过程，选择特异的发酵剂或者是添加植酸酶来完成。也有实验证明植酸的降解是靠来源于植物或微生物有活性的植酸酶在人的胃和小肠中完成的，从而促进了铁和锌的吸收。这样看来，在食物消化过程中摄入一些有活性的植酸酶也是一种降解植酸的好办法。在胃肠消化道的生理条件下，微生物来源的植酸酶比植物来源的植酸酶更加稳定。
为了降低无机磷酸的添加从而减少动物粪便中的过量磷酸(比如EP-B 1-0 649600)，可以用含有植酸的土曲霉菌(Aspergillus)来生产植酸酶活性增强的多种饲料。
考虑到IP6在自然界中分布是如此之广，某些微生物可能具有将IP6降解并利用水解磷酸的能力。对某些细菌(Riederer et al.(1991)Removal of N-glycosylationsites of the yeast acid phosphatase severely affects protein folding.J.Bacteriol.173，3539-3546)和真菌(Shieh et al.(1968)Survey of microorganism forthe production of extracellular phytase.Appl.Microbiol.16，1348-1351；Dvorakova et al.(1997)Characterization of phytase produced by Aspergillusniger.Folia Microbiol.42，349-352；Wyss et al.(1998)Comparison of thethermostability properties of three acid phosphatases from molds：Aspergillusfumigatus phytase，A.niger phytase，and A.niger pH2.5 acid phosphatase.Appl.Environ.Microbiol.64，4446-4451)来说，合成所谓分泌性的植酸酶是可以实现的，例如磷酸酶将IP6水解成肌醇五磷酸(IP5)和无机正磷酸(Pi)。来源于曲酶属(Aspergillus sp)的植酸酶通常被用于动物饲料，以改善磷酸和矿物质的生物利用率，很多分子酶工程方面的研究都致力于获得更好的效果(Wyss et al.(1999)Biophysicalcharacterization of fungal phytases(myo-inositol hexakisphosphatephosphohydrolases)：molecular size glycosylationl pattern，and engineeringof proteolytic resistance.Appl.Environ.Microbiol.65，359-366.)。对人而言，目前还没有相应的酶(食品级)得到应用。酵母是人类食物中普遍认为安全的(generallyregarded as safe)微生物，所以可以通过对它的研究来改进人群的营养状态。直接食用面包等采用天然酵母发酵的食品，其中的植酸酶活性太低以至于不能显著的影响到铁的吸收(Turk et al.(1996)Reduction in the levels of phytate during wholemealbread making；Effect of yeast and wheat phytases. J. Cereal Science.23，257-264)。
以前的关于酵母的专利，Pichia rhodanensis(JP2000050864，Arxulaadeninivorans(JP2000050863)，Candida boidinii(EP 0 931 837)，(Saccharomycescerevisiae(WO2001036607)可能都包括表达植酸酶的基因。
Greiner等人用面包酵母植酸酶得到了立体专一的肌醇六磷酸，(Greiner et al，J.Agric.Food Chem.(2001)49(5)，2228-2233)。
Nakamura等人描述用面包酵母对肌醇进行脱磷酸化的过程，(Nakamura，et al，Biosci.Biotechnol.Biochem(2000)，64(4)，841-844)。
Turk等人描述了植酸是植物中磷的储存形式，讨论了它对于矿物质生物利用率副作用的影响，并表明可利用两种可以产生植酸酶的商业化啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)来降低植酸(Turk et al，J.Agric.Food Chem.(2000)，48(1)，100-104.)。尽管当其他磷缺乏时，植酸酶是从肌醇利用磷的唯一途径，他们还是对更高效植酸酶的筛选和研发充满期望。
Moore等人(Moore，E.，et al，J.Ind.Microbiol.14(5)：396-402(1995，May))讨论了啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中四种酸性磷酸酶基因pho3，pho5和pho11的分子克隆，表达和对降解植酸的磷酸水解酶活性的评估；同时采用PCR方法将黑曲霉(Aspergillus niger)中一种可抑制的酸性磷酸酶克隆到米曲霉(A.oryzae)，AO7中。通过对转化过的A.oryzae培养液进行调节，使植酸酶的活性增加两倍至六倍，随后将这些酶添加到禽类饲料中，并观察到了磷的增加。于是Moore等人考虑将来源于啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和黑曲霉(Aspergillus niger)中的磷酸水解酶表达基因一起转化到曲霉菌(Aspergillus sp)中。尽管这些基因正是从啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中挑选到的，他们却没有考虑到在啤酒酵母中对这些磷酸水解酶基因进行过量表达。
通过基因组表达分析，Ogawa等人通过基因表达分析(Ogawa，N.，et al，Mol.Biol.Cell，11(12)：4309-21，(2000，Dec))讨论了啤酒酵母中磷酸盐积累系统的新组分和聚磷酸盐的代谢，他们声称PHO调控途径是酵母中磷酸盐获取的必须途径。当细胞外磷酸盐浓度低时，有几个基因就被这个途径转录诱导了，包括pho4，pho80和pho85。然而没有任何对pho基因家族基因进行过量表达和缺失来研究不同情况下植酸酶对于肌醇的活性。
对啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的PHO基因家族已经有了深入的研究(Yoshida et al.(1989)Function of the PHO regulatory genes for repressibleacid phosphatase synthesis in Saccharomyces cerevisiae.Mol.Gen.Genet.217，40-46；Ogawa et al.(2000)New components of a system for phosphateaccumulation and polyphosphate metabolism in Saccharomyces cerevisiae revealedby genomic expression analysis.Mol.Biol.Cell.11，4309-4321)，然而这些并不是以IP6为底物进行研究的。PHO3，PHO5，PHO10和PHO11等编码分泌性磷酸酶的结构基因都似乎是针对于水解细胞外有机磷酸化合物，来使得酵母在缺乏无机磷酸的环境中进行生长。在这些基因中只有PHO3不受到无机磷酸的抑制，PHO3基因受外部环境中硫胺的抑制(Praekelt et al.(1994)Regulation of THI4(MOL1)，a thiamine-biosyntheticgene of Saccharomyces cerevisiae.Yeast.10，481-490)。于是PHO3基因被认为主要是对硫胺磷酸和硫胺焦磷酸进行水解(Nosaka et al.(1989)A possible role foracid phosphatase with thiamin-binding activity encoded by PHO3 in yeast.FEMSMicrobiol.Lett.51，55-59；Nosaka(1990)High affinity of acid phosphataseencoded by PHO3 gene in Saccharomyces cerevisiae for thiamin phosphates.Biochim.Biophys.Acta.1037，147-154)。
PHO5基因通常被认为是编码分泌性酸性磷酸酶的主要成分，而PHO10和PHO11基因则编码分泌性酸性磷酸酶的次要成分(Rogers，D.T.，Lemire，J.M.and Bostian，K.A.(1982)Acid phosphatase polypeptides in Saccharomyces cerevisiae areencoded by a differentially regulated multigene family.Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America.79，2157-2161；Lemire et al.(1985)Regulation of repressible acid phosphatase genetranscription in Saccharomyces cerevisiae.Mol.Cell Biol. 5，2131-2141)，它们是组成性表达的，尽管表达量很低。除了酶本身，PHO系统还有一些调控蛋白，比如Pho4p和Pho2p就是PHO5、PHO10和PHO11基因的转录激活蛋白(Vogel et al.(1989)Thetwo positively acting regulatory proteins Pho2p and Pho4p physically interactwith PHO5 upstream activation regions.Mol.Cell.Biol.9，2050-2057)。
有一项研究涉及到特定的酵母中编码磷酸酶基因的植酸酶活性水平(Moore et al.(1995)Molecular cloning，expression and evaluation of phosphohydrolases forphytate-degrading activity.J.Ind.Microbiol.14，396-402)。然而在那项工作中，酵母基因都在曲霉菌(Aspergillus)中表达，这就导致了在诸如拷贝数、糖基化程度、分泌情况和这些基因对啤酒酵母植酸酶活性有多大贡献等许多方面上不确定性。相对的研究由Han等人完成，Han et al.(1999)Expression of an Aspergillus nigerphytasegene(phyA)in Saccharomyces cerevisiae.Appl.Environ.Microbiol.65，1915-1918，他们将黑曲霉(Aspergillus niger)中的植酸酶基因在啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中进行表达，来为这个众所周知的基因探索另外一种表达系统。
发明概述
广义的认为，本发明包括一种旨在制备植酸酶活性提高的啤酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)方法，该方法是通过对向啤酒酵母中进行PHO5、PHO10、PHO11、PHO2、PHO4、PHO23、和/或DIA3单/复基因的插入以过量表达这些基因，和/或对PHO80，和/或PHO85调控抑制基因的单/复缺失来实现改变，其基因插入可以发生在酵母染色体上，也可以是通过转化含有这些基因的质粒来完成。改良菌株过量表达了PHO5、PHO10、PHO11、PHO2、PHO4、PHO23、和/或DIA3中的一个或多个基因.
一优选实施方案包括一种制备植酸酶活性提高的啤酒酵母菌株(Saccharomycescerevisiae)的方法，其特征在于是通过对向啤酒酵母中进行PHO5、PHO10、PHO11、PHO2、PHO4、PHO23、和/或DIA3单/复基因的插入以过量表达这些基因，和对PHO80，和/或PHO85等调控抑制基因的单/复缺失的修饰来实现，其基因插入可以发生在酵母染色体上，也可以是通过转化含有这些基因的质粒来完成。
一优选实施方案中，改造啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)对PHO5进行过量表达。
另一优选实施方案中，改造啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)对PHO10进行过量表达。
再一优选实施方案中，改造啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)对PHO11进行过量表达。
另一优选实施方案中，改造啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)对PHO2过量表达。
另一优选实施方案中，改造啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)对PHO4过量表达。
另一优选实施方案中，改造啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)对DIA3过量表达。
再一优选实施方案中，改造啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是这样一种菌株，其特征在于对PHO80进行缺失进而得到突变体pho80Δ。
另一优选实施方案中，改造啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)过量表达PHO2同时缺失PHO80。
另一优选实施方案中，改造啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)过量表达PHO4同时缺失PHO80。
另一优选实施方案中，改造啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)过量表达PHO5同时缺失PHO80。
另一优选实施方案中，改造啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)过量表达PHO10同时缺失PHO80。
另一优选实施方案中，改造啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)过量表达PHO11同时缺失PHO80。
另一优选实施方案中，改造啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)过量表达PHO23同时缺失PHO80。
另一优选实施方案中，改造啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)其特征在于过量表达DIA3同时缺失PHO80。
另一优选实施方案中，改造啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)过量表达PHO2和PHO5同时缺失PH080。
另一优选实施方案中，改造啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)过量表达PHO5和PHO10同时缺失PHO80。
另一优选实施方案中，改造啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)过量表达PHO4和PH05同时缺失PH080。
另一优选实施方案中，改造啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)过量表达PHO4和PHO10同时缺失PHO80。
另一优选实施方案中，改造啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)过量表达PHO5、PHO10和PHO11同时缺失PHO80。
为了更大程度的增加植酸酶的活性，PHO基因家族中的另一些基因，像编码植酸酶或转录调节子的基因，如PHO2和PHO4，可能最终必须进行单一的过量表达，或者同如突变pho80和pho85一样其他的遗传改造进行过量表达。
另一优选实施方案中，本发明改造啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是一种菌株，其特征在于对PHO85进行缺失进而得到突变体pho85Δ。
本发明再一优选实施方案中，改造啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)过量表达正调控基因PHO2。
本发明再一优选实施方案中，改造啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)过量表达正调控基因PHO4。
为与扩展本发明相一致，本发明还包括采用以上任何一种的啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株得到发酵产物，其肌醇六磷酸含量降低。
在一实施方案中，发酵产物是面包产品。
按照另一实施方案，发酵产物是优选适合于婴儿的稀粥产品。
在再一实施例中，发酵产物是酿造产品。
本发明另一方面在于提供了制备植酸酶的方法，其特征是采用以上一个或多个菌株上述菌株在生长培养基中进行培养以辅助植酸酶表达，并将植酸酶分离。
与本发明再一方面相一致，采用本植酸酶制备方法可用于向食品和饲料中作为添加剂加入以改善矿物质的利用。
与本发明再一方面相一致，采用本植酸酶制备方法可用于制备低浓度肌醇六磷酸的专一异构体。
本发明再一方面在于提供了制备植酸酶的方法，其特征是采用以上一个或者多个上述菌株在优化生长培养基中进行培养以获得植酸酶表达，在添加肌醇六磷酸后酵母植酸酶活性得到低浓度的肌醇磷酸盐产物。
除了为人类生产发酵产物，本发明酵母菌株还可以用于生产动物饲料，以提高矿物质的吸收和降低粪便中的磷酸盐含量。以IP6形式存在的磷不能被小肠再吸收，所以动物饲料中使用了大量的无机磷酸盐。IP6和粪便中多余的磷酸盐导致了肥料中过高的磷的浓度/量。
除了应用于食品和饲料，酵素植酸酶还可以用来制造特异的用于药理学用途的肌醇磷酸盐。一个例子是1，2，6IP3(肌醇3-磷酸)，它具有刺激胰岛素释放，降低血小板凝集和抗炎症的功能，这样的肌醇磷酸盐可以开发为药物。
食品和饲料可以添加酵素植酸酶以取得以上所详细描述的效果。
本发明的再一方面是培育改造啤酒酵母并将所得植酸酶酵素分离。因植酸酶以胞外形式存在，可轻易将其分离出来。添加植酸酶的首要用途在于提高机体对铁和锌的生物利用率。
本发明还包括具有植酸酶活性增强的改造啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，将其命名为YM-p5和YD80。
附图简述
图1：啤酒酵母(S.cerevisiae)SKQ2n(正方形)与细胞外肌醇六磷酸(IP6，三角形)浓度的生长时间函数图。
图2：植酸钠酸性化学水解产物(第一线)和啤酒酵母(S.cerevisiae)培养物上清液(第二线和第三线)在培养15小时后的HPIC层析谱。
图3A与图3B：啤酒酵母(S.cerevisiae)生长(正方形)亲本株系YS18(空心符号)与啤酒酵母(S.cerevisiae)YMR4pho5Δ pho3Δ双缺失突变体(实心符号)生长情况和细胞外IP6浓度(圆形)的HPIC层析谱。
图4：在CBS培养基中以IP6为唯一磷源，酵母培养物上清液中肌醇六磷酸(IP6)浓度的生长函数图。
图5：在YPD复杂培养基中将IP6作为加入磷源，酵母培养物上清液中肌醇六磷酸(IP6)浓度的生长函数图。
图6：用于转化YS18和YMR4的含有PHO5的pYX212质粒构建。
图7A和图7B：转化含有PHO5的pYX212质粒前后，以细胞外IP6浓度作为啤酒酵母(S. cerevisiae)YMR4(A)和YS18(B)的生长时间的函数图。
图8：PHO5过量表达菌株、pho80Δ和pho85Δ缺失突变体间植酸降解活性的比较图。
图9：pho2Δ缺失突变体植酸降解活性比较图。
图10：细胞外对硝基苯磷酸(pNPP，正方形)和IP6(三角形)浓度与以2％葡萄糖作为碳链和能量来源的CBS培养基中啤酒酵母(S.cerevisiae)SKQ2n的生长函数图。
图11：肌醇六磷酸(IP6；三角形)和无机磷酸(Pi；正方形)浓度(以μl/g表示)作为两种小麦面团发酵的时间的函数图；以及
图12：在添加了0.25Mm IP6和30Mm Pi的YPD培养基中，pho80Δ缺失突变体SD80(不含有PHO80的YS18)和啤酒酵母(S.cerevisiae)YS18植酸降解活性图。
本发明详述
可参考以下非本发明限制性实施例对本发明加以描述。
材料与方法
生物
啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SKQ2n(Bataille et al.(1987)Identification of polypeptides of the carbon metabolism machinery on thetwo-dimensional map of Saccharomyces cerevisiae.Location of 23 additionalpolypeptides.Yeast.3，11-21)。S.cerevisiae YS18(MATα；his3-11，3-15；leu2-3，2-112；ura3Δ5；canR)和S.cerevisiae YMR4是如上所述两种常用的啤酒酵母(S.cerevisiae)，由Riederer和Hinnen等人构建的(Riederer et al.(1991)Removal ofN-glycosylation sites of the yeast acid phosphatase severely affects proteinfolding.J.Bacteriol.173，3539-3546.)。在本发明中YS18和YMR4都被转化了含有PHO5的质粒(见下文)，将所得转化菌株分别命名为YS-p5和YM-p5。YS-p5菌株于2002年4月18日保存于德国的DSMZ中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，38124 Braynshweig)，所得保存编号为DSM-No.14929。
缺失了PHO10基因的YS18和YMR4菌株分别被命名为YS10和YM10。YS18菌株也被用于构建命名为YD80的pho80Δ菌株。另外，pho80Δ、pho85Δ和pho2Δ等突变菌株都从德国EUROSCARF机构获得。pho80(YOL001w)，pho85(YPL031c)和pho2(YDL106c)菌株都来源于实验室用的BY4741菌株(MATα；his3Δ1，leu2Δ0，met15Δ0，ura3Δ0)。PHO80、PHO85和PHO2基因通过kan∷MX4破裂试剂盒插入失活。
酵母培养物在YPD平板(酵母汁10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g和琼脂20g，加1公升水)上维持培养，在甘油中长期保存于-70℃。大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α用于扩增含有插入PHO5基因的质粒(见下文)。所采用的酵母菌株和它们相关基因的表达情况见表1。
表1、在抑制/非抑制性培养基中，本专利所使用的啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)株系及其相关基因型和分泌性磷酸酶的表达情况。
a)可能产生少量的组成性表达，
b)在由TPll启动子控制的pYX212质粒上
生长培养基和培养条件
如前所述，实验中大多采用的都是由CBS酵母必需(Centralbuear voorSchimmelcultures Delft，荷兰)培养基进行调整后的配方((Albers et al.(1996) Influenceof the nitrogen source on Sacchaomyces cerevisiae anaerobic growth and productformation.Appl.Environ.Microbiol.62，3187-3195))使用硫酸胺作为氮源(7.5mg/ml)。磷源则采用植酸钠形式的肌醇六磷酸盐(IP6)C6H6(OPO3Na2)6：0.5或0.25mg/ml)，无机磷酸(KH2PO4：3.5mg/ml)，对硝基苯磷酸(pNPP，终浓度为2.25或0.25mM)三者之一或者是它们的混合物。根据添加的磷源，培养基被命名为CBSIP6，CBSPi，CBSIP6+Pi和CBSpNPP。CBSIP6和CBSpNPP中还需要添加KCl(3mg/ml)以补偿无机磷源(KH2PO4)有却在有机磷源中缺乏的钾。在所有实验中，需要添加葡萄糖(如上所述2％(w/v)或1％(w/v))作为碳源和能量源。适当时候还可以添加120mg/l的组氨酸、亮氨酸和尿素。实验大多是在添加了如结果和图例所示适当磷源的YPD培养基中进行的(每升中有酵母汁10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g)。在以CBS为基础的培养基中应用了pH5.3的琥珀酸/氢氧化钠缓冲体系。IP6，pNPP，维生素，生长因子和FeCl2等采用0.2μm过滤灭菌，其余成分采用高温灭菌。将初次培养约20小时的发酵剂培养于接种于含有100ml实验培养基的250ml烧瓶里，此培养基每个实验培养基组分相同。接种浓度为OD610＝0.2。在30℃、210rpm的旋转摇床上进行培养，采用分光光度计(Hitachi，U-100)波长610nm(OD610)监测生长情况。针对于PHO3基因表达的实验也依上所述在CBS培养基中进行，区别在于不添加硫胺，但添加或不添加硫胺单磷酸(为了避免对硫胺磷酸酶PHO3基因的抑制)。
PHO5过量表达菌株的构建
本实验过程中所采用的酶和化学试剂均购自美国新英格兰生物实验室公司(NewEngland Biolabs Inc.，USA)。用于扩增PHO5基因的PCR引物购自瑞典生命技术公司(LifeTechnologies AB，Taby，Sweden)。按照标准程序从啤酒酵母(S.cerevisiae)YS18菌株中提取DNA。引物核酸序列用大写字母表示，增加的限制性核酸酶位点用小写字母表示。
PHO5过量表达的引物序列
-正向引物：
5’：CGGAATTCATGTTTAAATCTGTTGTTTATTC，见所附序列号NO：1
-反向引物：
3’：CGCTCGAGCTATTGTCTCAATAGACTGGC，见所附序列号NO：2
下划线的序列分别为EcoRI和Aval(产生与用XhoI酶切pYX212质粒相同的粘末端)限制酶的识别位点。其余序列与PHO5基因起点(ATG)和末端互补。
PCR反应体系为100μl反应混合物，使用VENT聚合酶，按标准程序进行。
PHO5基因的PCR产物按PCR纯化试剂盒说明书纯化(Qiagen，Cat，No.28104，MerckEurolab AB，Sweden)，取出50μl用Aval和EcoRI在EcoRI缓冲液中37℃消化12小时，PCR酶切反应产物随后在TAE缓冲液中与DNA梯形条带(DNA ladder)一起在已经制备好的琼脂糖凝胶进行电泳检测。将适当的DNA条带切下并再次利用DNA Gel Extraction Kit(Qiagen，Cat.No.28704)试剂盒进行回收。随后将16μl纯化的插入片断(PHO5)、2μl T4 DNA连接酶缓冲液(10X)、1μl连接酶和2μl载体DNA(pYX212)混合到一起进行连接，连接混合物体系为20μl。含有大肠杆菌(E.coli)AmpR抗性和啤酒酵母(S.cerevisiae)URA3选择标记的pYX212质粒已被EcoRI和XhoI酶切(产生与AVAI相匹配的末端)。将2μl DNA连接产物加入到40μl冰预冷的大肠杆菌E.coli DH5α感受态中，用电穿孔仪(Gene Pulser II，Biorad)，在电容25μF，电压2.5kV以及脉冲控制器设置在200Ω的条件下进行电穿孔转化，转化的细胞涂布于100μg/ml氨卞青霉素抗性的NB平板上。挑取阳性克隆在NB液体培养基中过夜培养，按标准程序提取质粒。
插入PHO5之后的pYX212质粒序列：
GAATTCATGTTTAAATCTGTTGTTTATTCAATTTTAGCCGCTTCTTTGGCC
AATGCAGGTACCATTCCCTTAGGCAAACTAGCCGATGTCGACAAGATTGG
TACCCAAAAAGATATCTTCCCATTTTTGGGTGGTGCCGGACCATACTACT
CTTTCCCTGGCGACTATGGTATTTCTCGTGATTTGCCTGAAGGTTGTGAA
ATGAAGCAACTGCAAATGGTTGGTAGACATGGTGAAAGATACCCTACTGT
CAGTCTGGCTAAGACTATCAAGAGTACATGGTATAAGTTGAGCAATTACA
CTCGTCAATTCAACGGCTCATTGTCATTCTTGAACGATGATTACGAGTTT
TTCATCCGTGATGACGATGATTTGGAAATGGAAACCACTTTTGCCAACTC
GGACGATGTTTTGAACCCATACACTGGTGAAATGAACGCCAAGAGACAT
GCTCGTGACTTCTTGGCTCAATACGGTTACATGGTCGAAAACCAAACCAG
TTTCGCCGTTTTTACCTCTAATTCTAAGAGATGTCATGACACTGCTCAATA
TTTCATTGATGGTTTAGGTGACCAATTCAACATCACCTTGCAGACTGTCA
GTGAAGCTGAATCCGCTGGTGCCAACACTTTGAGTGCTTGTAACTCATGT
CCTGCTTGGGACTACGATGCCAATGATGACATTGTAAATGAATACGACAC
AACCTACTTGGATGACATTGCCAAGAGATTGAACAAGGAAAACAAGGGT
TTGAACTTGACCTCAACTGACGCTAGTACTTTATTCTCGTGGTGTGCATT
TGAAGTGAACGCTAAAGGTTACAGTGATGTCTGTGATATTTTCACCAAGG
ATGAATTAGTCCATTACTCCTACTACCAAGACTTGCACACTTATTACCAT
GAGGGTCCAGGTTACGACATTATCAAGTCTGTCGGTTCCAACTTGTTCAA
TGCCTCAGTCAAATTATTAAAGCAAAGTGAGATTCAAGACCAAAAGGTTT
GGTTGAGTTTTACCCACGATACCGATATCCTAAACTTTTTGACCACCGCT
GGTATAATTGACGACAAAAACAACTTAACTGCCGAATACGTTCCATTCAT
GGGCAACACTTTCCACAGATCCTGGTACGTTCCTCAAGGTGCTCGTGTCT
ACACCGAAAAATTCCAATGTTCTAACGACACCTACGTCAGATACGTCATT
AACGATGCTGTTGTTCCAATTGAAACCTGTTCCACTGGTCCAGGGTTCTC
TTGTGAAATCAATGACTTCTACGACTATGCTGAAAAGAGAGTAGCCGGTA
CTGACTTCCTAAAGGTCTGTAACGTCAGCAGCGTCAGTAACTCTACTGAA
TTGACCTTCTACTGGGACTGGAACACTACTCATTACAACGCCAGTCTATT
GAGACAATAGCCCGGGTATCCGTATGATGTGCCTGACTACGCATGATATCTC
GAGCTCAGCTAGCTAACTGAATAAGGAACAATGAACGTTTTTCCTTTCTCTTG
TTCCTAGTATTAATGACTGACCGATACATCCCTTTTTTTTTTTGTCTTTGTCTAG
CTCCAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTCAATTCACTGGCCGTCGTTT
TACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCA
GCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTA.ATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATC
GCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCGACGCGCCCTG
TAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCT
ACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTC
GCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGG
GTTCCGATTTAGTGGTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTG
ATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACG
TTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACT
CAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGC
CTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACA
AAATATTAACGTTTACAATTTCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTG
CGGTATTTCACACCGCATAGGGTAATAACTGATATAATTAAATTGAAGCTCTA
ATTTGTGAGTTTAGTATACATGCATTTACTTATAATACAGTTTTTTAGTTTTGC
TGGCCGCATCTTCTCAAATATGCTTCCCAGCCTGCTTTTCTGTAACGTTCACCC
TGTACCTTAGCATCCCTTCCCTTTGCAATAGTCCTCTTCCAACAATAATAATG
TCAGATCCTGTAGAGACCACATCATCCACGGTTCTATACTGTTGACCCAATGC
GTCTCCCTTGTCATCTAAACCCACACCGGGTGTCATAATCAACCAATCGTAAC
CTTCATCTCTTCCACCCATGTCTCTTTGAGCAATAAAGCCGATAACAAAATCT
TTGTCGCTCTTCGCAATGTCAACAGTACCCTTAGTATATTCTCCAGTAGATAG
GGAGCCCTTGCATGACAATTCTGCTAACATCAAAAGGCCTCTAGGTTCCTTTG
TTACTTCTTCTGCCGCCTGCTTCAAACCGCTAACAATACCTGGCCCCAGCACA
CCGTGTGCATTCGTAATGTCTGCCCATTCTGCTATTCTGTATACACCCGCAGA
GTACTGCAATTTGACTGTATTACCAATGTCAGCAAATTTTCTGTCTTCGAAGA
GTAAAAAATTGTACTTGGCGGATAATGCCTTTAGCGGCTTAACTGTGCCCTCC
ATCGAAAAATCAGTCAATATATCCACATGTGTTTTTAGTAAACAAATTTTGGG
ACCTAATGCTTCAACTAACTCCAGTAATTCCTTGGTGGTACGAACATCCAATG
AAGCACACAAGTTTGTTTGCTTTTCGTGCATGATATTAAATAGCTTGGCAGCA
ACAGGACTAGGATGAGTAGCAGCACGTTCCTTATATGTAGCTTTCGACATGAT
TTATCTTCGTTTCCTGCAGGTTTTTGTTCTGTGCAGTTGGGTTAAGAATACTGG
GCAATTTCATGTTTCTTCAACACTACATATGCGTATATATACCAATCTAAGTCT
GTGCTCCTTCCTTCGTTCTTCCTTCTGTTCGGAGATTACCGAATCAAAAAAATT
TCAAAGAAACCGAAATCAAAAAAAAGAATAAAAAAAAAATGATGAATTGAA
TTGAAAAGCTGTGGTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCAT
AGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGC
TTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCT
GCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGG
CCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTA
GACGTGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCAATTCCACGGACTATAGACTAT
ACTAGTATACTCCGTCTACTGTACGATACACTTCCGCTCAGGTCCTTGTCCTTT
AACGAGGCCTTACCACTCTTTTGTTACTCTATTGATCCAGCTCAGCAAAGGCA
GTGTGATCTAAGATTCTATCTTCGCGATGTAGTAAAACTAGCTAGACCGAGAA
AGAGACTAGAAATGCAAAAGGCACTTCTACAATGGCTGCCATCATTATTATCC
GATGTGACGCTGCAGCTTCTCAATGATATTCGAATACGCTTTGAGGAGATACA
GCCTAATATCCGACAAACTGTTTTACAGATTTACGATCGTACTTGTTACCCAT
CATTGAATTTTGAACATCCGAACCTGGGAGTTTTCCCTGAAACAGATAGTATA
TTTGAACCTGTATAATAATATATAGTCTAGCGCTTTACGGAAGACAATGTATG
TATTTCGGTTCCTGGAGAAACTATTGCATCTATTGCATAGGTAATCTTGCACG
TCGCATCCCCGGTTCATTTTCTGCGTTTCCATCTTGCACTTCAATAGCATATCT
TTGTTAACGAAGCATCTGTGCTTCATTTTGTAGAACAAAAATGCAACGCGAGA
GCGCTAATTTTTCAAACAAAGAATCTGAGCTGCATTTTTACAGAACAGAAATG
CAACGCGAAAGCGCTATTTTACCAACGAAGAATCTGTGCTTCATTTTTGTAAA
ACAAAAATGCAACGCGAGAGCGCTAATTTTTCAAACAAAGAATCTGAGCTGC
ATTTTTACAGAACAGAAATGCAACGCGAGAGCGCTATTTTACCAACAAAGAA
TCTATACTTCTTTTTTGTTCTACAAAAATGCATCCCGAGAGCGCTATTTTTCTA
ACAAAGCATCTTAGATTACTTTTTTTCTCCTTTGTGCGCTCTATAATGCAGTCT
CTTGATAACTTTTTGCACTGTAGGTCCGTTAAGGTTAGAAGAAGGCTACTTTG
GTGTCTATTTTCTCTTCCATAAAAAAAGCCTGACTCCACTTCCCGCGTTTACTG
ATTACTAGCGAAGCTGCGGGTGCATTTTTTCAAGATAAAGGCATCCCCGATTA
TATTCTATACCGATGTGGATTGCGCATACTTTGTGAACAGAAAGTGATAGCGT
TGATGATTCTTCATTGGTCAGAAAATTATGAACGGTTTCTTCTATTTTGTCTCT
ATATACTACGTATAGGAAATGTTTACATTTTCGTATTGTTTTCGATTCACTCTA
TGAATAGTTCTTACTACAATTTTTTTGTCTAAAGAGTAATACTAGAGATAAAC
ATAAAAAATGTAGAGGTCGAGTTTAGATGCAAGTTCAAGGAGCGAAAGGTGG
ATGGGTAGGTTATATAGGGATATAGCACAGAGATATATAGCAAAGAGATACT
TTTGAGCAATGTTTGTGGAAGCGGTATTCGCAATATTTTAGTAGCTCGTTACA
GTCCGGTGCGTTTTTGGTTTTTTGAAAGTGCGTCTTCAGAGCGCTTTTGGTTTT
CAAAAGCGCTCTGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAG
GAACTTCAAAGCGTTTCCGAAAACGAGCGCTTCCGAAAATGCAACGCGAGCT
GCGCACATACAGCTCACTGTTCACGTCGCACCTATATCTGCGTGTTGCCTGTA
TATATATATACATGAGAAGAACGGCATAGTGCGTGTTTATGCTTAAATGCGTA
CTTATATGCGTCTATTTATGTAGGATGAAAGGTAGTCTAGTACCTCCTGTGAT
ATTATCCCATTCCATGCGGGGTATCGTATGCTTCCTTCAGCACTACCCTTTAGC
TGTTCTATATGCTGCCACTCCTCAATTGGATTAGTCTCATCCTTCAATGCTATC
ATTTCCTTTGATATTGGATCATATGCATAGTACCGAGAAACTAGTGCGAAGTA
GTGATCAGGTATTGCTGTTATCTGATGAGTATACGTTGTCCTGGCCACGGCAG
AAGCACGCTTATCGCTCCAATTTCCCACAACATTAGTCAACTCCGTTAGGCCC
TTCATTGAAAGAAATGAGGTCATCAAATGTCTTCCAATGTGAGATTTTGGGCC
ATTTTTTATAGCAAAGATTGAATAAGGCGCATTTTTCTTCAAAGCTGCGGCCG
CACTCTCACTAGTACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCC
CTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAAT
AACCGTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCA
ACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTT
GCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTG
CACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAG
TTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTAT
GTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGCTCGCCG
CATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGC
ATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCAT
GAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAG
GAGCTAACCGCTTTTTTGGACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCG
TTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACG
ATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTAC
TTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTT
GCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAA
ATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCA
GATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAA
CTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAA
GCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAA
AACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCA
TGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTA
GAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTG
CTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAA
GAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACC
AAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTG
TAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCC
AGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGG
ATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTT
GGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAA
AGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGC
AGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGG
TATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTG
TGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCT
TTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTT
ATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCG
GTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGG
AAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAA
TGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACG
CAATTAATGTGAGTTACCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATG
CTTCCGGCTCCTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGG
AAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCGAAATACGACTCACTATAGGG
CGAATTGGGTACCGGGCCGGCCGTCGAGCTTGATGGCATCGTGGTGTCACGCT
CGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTT
ACATGATCCCCCATGTTGTGAAAAAAAGCGGTTAGCTCTTCGGTCCTCCGATC
GTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGGAAC
TGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTG
TACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTG
CCCGGCGTCAACACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAGTG
CTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCT
GTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCAT
CTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCC
GCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCC
TTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGATACAT
ATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCC
GAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTAT
AAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCAAGAATTGGGGATCTACGT
ATGGTCATTCTTCTTCAGATTCCCTCATGGAGAAGTGCGGCAGATGTATATGA
CAGAGTCGCCAGTTTCCAAGAGACTTTATTCAGGCACTTCCATGATAGGCAAG
AGAGAAGACCCAGAGATGTTGTTGTCCTAGTTACACATGGTATTTATTCCAGA
GTATTCCTGATGAAATGGTTTAGATGGACATACGAAGAGTTTGAATCGTTTAC
CAATGTTCCTAACGGGAGCGTAATGGTGATGGAACTGGACGAATCCATCAAT
AGATACGTCCTGAGGACCGTGCTACCCAAATGGACTGATTGTGAGGGAGACC
TAACTACATAGTGTTTAAAGATTACGGATATTTAACTTACTTAGAATAATGCC
ATTTTTTTGAGTTATAATAATCCTACGTTAGTGTGAGCGGGATTTAAACTGTG
AGGACCTCAATACATTCAGACACTTCTGACGGTATCACCCTACTTATTCCCTT
CGAGATTATATCTAGGAACCCATCAGGTTGGTGGAAGATTACCCGTTCTAAGA
CTTTTCAGCTTCCTCTATTGATGTTACACTCGGACACCCCTTTTCTGGCATCCA
GTTTTTAATCTTCAGTGGCATGTGAGATTCTCCGAAATTAATTAAAGCAATCA
CACAATTCTCTCGGATACCACCTCGGTTGAAACTGACAGGTGGTTTGTTACGC
ATGCTAATGCAAAGGAGCCTATATACCTTTGGCTCGGCTGCTGTAACAGGGA
ATATAAAGGGCAGCATAATTTAGGAGTTTAGTGAACTTGCAACATTTACTATT
TTCCCTTCTTACGTAAATATTTTTCTTTTTAATTCTAAATCAATCTTTTTCAATT
TTTTGTTTGTATTCTTTTCTTGCTTAAATCTATAACTACAAAAAACACATACAG
G序列号NO：3
下划线标识为引物序列，
粗体标识插入的PHO5基因序列。
应用与上述相同的引物对已得到的PHO5基因序列进行了PCR验证以及随后进行EcoRV酶切随后进行电泳验证，随后应用标准的LiOAc啤酒酵母(S.cerevisiae)转化方法将其转化入酵母菌株YS18和YMR4中。在含有适当氨基酸但缺乏尿素的YNB平板(DIFCO，美国)上对含有插入片断载体的转化酵母进行筛选，并将阳性的转化子分别命名为YS-p5和YM-p5。
基因缺失菌株的构建
PHO10基因缺失菌株是通过PCR介导的基因置换来实现的，(Baudin et al.(1993)Asimple and efficient for direct gene deletion in Saccharomyces cerevisiae.NucleicAcids Res.21，3329-3330)，采用来源于酵母(Saccharomyces pombe)的HIS5基因至来自于啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的HIS3作为选择标记。采用质粒pFA6a-HIS3MX6作为模板DNA(Wach et al.(1994)New heterologous modules for classical or PCR-basedgene disruptions in Saccharomyces cerevisiae.Yeast.10，1793-1808)。
PHO10基因缺失的引物
5’-CGATAGATTCAAGCTCAGTTTCGCCTTGGTTGTAAAGTAGGCAGCTGAAGCTT CGTACGC-3’，序列号NO：4
5’-GGTCTATTTACTGTTTTAATAAAGTGTCGTTGTAGTGCTTGGGGCAGATGATG TCGAGGCG-3’，序列号NO：5
利用这些寡核苷酸作为引物用来构建基因的缺失盒。下划线序列与模板的HIS5基因序列互补，未划线的部分与PHO10基因的侧翼序列互补。PHO10基因的缺失是通过PCR置换方法，用来源于酵母(Saccharomyces pombe)的HIS5基因对应于啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的HIS3作为选择标记，采用质粒pFA6a-HIS3MX6作为模板DNA完成的。
通过同源重组缺失PHO10基因的PCR产物序列。
CGATAGATTCAAGCTCAGTTTCGCCTTGGTTGTAAAGTAGCCAGCCTGGAAGCTTCGT
ACGCTGCAGGTCGACGGATCCCCGGGTTAATTAAGGCGCGCCAGATCTGTTTA
GCTTGCCTCGTCCCCGCCGGGTCACCCGGCCAGCGACATGGAGGCCCAGAAT
ACCCTCCTTGACAGTCTTGACGTGCGCAGCTCAGGGGCATGATGTGACTGTCG
CCCGTACATTTAGCCCATACATCCCCATGTATAATCATTTGCATCCATACATTT
TGATGGCCGCACGGCGCGAAGCAAAAATTACGGCTCCTCGCTGCAGACCTGC
GAGCAGGGAAACGCTCCCCTCACAGACGCGTTGAATTGTCCCCACGCCGCGC
CCCTGTGAGAAATATAAAAGGTTAGGATTTGCCACTGAGGTTCTTCTTTCATA
TACTTCCTTTTAAATCTTGCTAGGATACAGTTCTCACATCACATCCGAACATA
AACAACCATGGGTAGGAGGGCTTTTGTAGAAAGAAATACGAACGAAACGAA
AATCAGCGTTGCCATCGCTTTGGACAAAGCTCCCTTACCTGAAGAGTCGAATT
TTATTGATGAACTTATAACTTCCAAGCATGCAAACCAAAAGGGAGAACAAGT
AATCCAAGTAGACACGGGAATTGGATTCTTGGATCACATGTATCATGCACTGG
CTAAACATGCAGGCTGGAGCTTACGACTTTACTCAAGAGGTGATTTAATCATC
GATGATCATCACACTGCAGAAGATACTGCTATTGCACTTGGTATTGCATTCAA
GCAGGCTATGGGTAACTTTGCCGGCGTTAAAAGATTTGGACATGCTTATTGTC
CACTTGACGAAGCTCTTTCTAGAAGCGTAGTTGACTTGTCGGGACGGCCCTAT
GCTGTTATCGATTTGGGATTAAAGCGTGAAAAGGTTGGGGAATTGTCCTGTGA
AATGATCCCTCACTTACTATATTCCTTTTCGGTAGCAGCTGGAATTACTTTGCA
TGTTACCTGCTTATATGGTAGTAATGACCATCATCGTGCTGAAAGCGCTTTTA
AATCTCTGGCTGTTGCCATGCGCGCGGCTACTAGTCTTACTGGAAGTTCTGAA
GTCCCAAGCACGAAGGGAGTGTTGTAAAGAGTACTGACAATAAAAAGATTCT
TGTTTTCAAGAACTTGTCATTTGTATAGTTTTTTTATATTGTAGTTGTTCTATTT
TAATCAAATGTTAGCGTGATTTATATTTTTTTTCGCCTCGACATCATCTGCCCC
AAGCACTACAACGACACTTTATTAAAACAGTAAATAGACC
序列号NO：6
下划线部分代表引物(或与引物互补)的序列，
斜体部分代表与PHO10相对应的基因序列(SGD)。
PCR反应体系为100μl，采用VENT聚合酶，从备好的琼脂糖上切割适当条带并电泳纯化粗目的片断。采用乙酸锂方法对YMR4和YS18进行转化，分别得到YM10和YS10。通过菌落PCR和所提取的基因组DNA，PCR来进行对基因缺失进行鉴定。
PHO80基因的缺失是通过基于PCR的基因失活完成的，主要依据参考文献(Baudin etal.，(1993)″A simple and efficient for direct gene deletion in Saccharomycescerevisiae.″Nucleic Acids Res.21，3329-3330和Goldstein and McCusker，(1999)″Newheterologous modules for classical or PCR-based gene disruptions in Saccharomycescerevisiae.″Yeast，10，1793-1808)。首先构建了一个具有PHO80基因5’和3’侧翼序列选择标记的缺失片断。在转化时通过同源重组作用将PHO80的ORF和潮霉素B磷酸转移酶(hph)进行了交换。采用Goldstein等人含有潮霉素B磷酸转移酶(hph)选择标记的pAG32质粒作为模板。对PHO80基因的缺失而言，根据SGD(http://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces/)进行了引物的设计，而对hph区域则是根据(Gritz和DAVAIs(1983)″Plasmid encoded hygromycin B resistance：thesequence of hygromycin B phosphotransferase gene and its expression in Escherichiacoli and Saccharomyces cerevisiae.″Gene. 25，178-188.)来进行的。
PHO80基因的缺失
正向引物：
5’-CAGCGTATATTGGCTTTCCTTTAATCTAATGCCCCAAGCCCACATACGATTTAGGTGACAC-3’序列号NO：10
反向引物：
5’-GGAGTTCTCAAGCTCATCTCGAAGTGTTTTCTGTCGCTTATGAATACGACTCACTATAGGGTG-3’序列号NO：11
下划线的部分互补于pAG32质粒中的hph(Goldstein and McCusker，1999，Yeast 15：1541-1553)，其余是缺失的基因互补于PHO80基因(SGD)。以含有可选标记潮霉素B磷酸转移酶(hph)的pAG32质粒(Goldstein and McCusker，1999)为模板。正向引物(FW)与非编码链互补，起始于pAG32质粒中hph起始(ATG)上游483bp处，PHO80基因的上游315bp处。反向引物(BW)与编码链互补，起始于在pAG32质粒hph中止末端下游311bp处，在啤酒酵母(S.cerevisiae)中结束于PHO80基因下游267bp处。
PCR反应体系中包括-Thermopol缓冲液，0.1μg/μl(BSA)乙酰牛血清白蛋白，0.2mMdNTPs，0.5μM引物以及2单位VENT聚合酶。每个反应中大约加入0.7μg/ml的模板DNA。在进行PCR反应之后，用琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖凝胶浓度为0.7％，电压为100V，于TBE缓冲液中进行，电压为100V)分离PCR产物(再用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)对目的片断进行纯化。
所得PCR产物用于以同源重组方法对PHO80基因进行缺失
CAGCGTATATTGGCTTTCCTTTAATCTAATGCCCCAAGCCCACATACGATTTA
GGTGACACTATAGAACGCGGCCGCCAGCTGAAGCTTCGTACGCTGCAGGTCG
ACGGATCCCCGGGTTAATTAAGGCGCGCCAGATCTGTTTAGCTTGCCTCGTCC
CCGCCGGGTCACCCGGCCAGCGACATGGAGGCCCAGAATACCCTCCTTGACA
GTCTTGACGTGCGCAGCTCAGGGGCATGATGTGACTGTCGCCCGTACATTTAG
CCCATACATCCCCATGTATAATCATTTGCATCCATACATTTTGATGGCCGCAC
GGCGCGAAGCAAAAATTACGGCTCCTCGCTGCAGACCTGCGAGCAGGGAAAC
GCTCCCCTCACAGACGCGTTGAATTGTCCCCACGCCGCGCCCCTGTAGAGAAA
TATAAAAGGTTAGGATTTGCCACTGAGGTTCTTCTTTCATATACTTCCTTTTAA
AATCTTGCTAGGATACAGTTCTCACATCACATCCGAACATAAACAACCATGGG
TAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAAGTTTCTGATCGAAA
AGTTCGACAGCGTCTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAATC
TCGTGCTTTCAGCTTCGATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCTGCGGGTA
AATAGCTGCGCCGATGGTTTCTACAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACTT
TGCATCGGCCGCGCTCCCGATTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGAATTC
AGCGAGAGCCTGACCTATTGCATCTCCCGCCGTGCACAGGGTGTCACGT
TGCAAGACCTGCCTGAAACCGAACTGCCCGCTGTTCTGCAGCCGGTCGC
GGAGGCCATGGATGCGATCGCTGCGGCCGATCTTAGCCAGACGAGCGGG
TTCGGCCCATTCGGACCGCAAGGAATCGGTCAATACACTACATGGCGTG
ATTTCATATGCGCGATTGCTGATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGTG
ATGGACGACACCGTCAGTGCGTCCGTCGCGCAGGCTCTCGATGAGCTGA
TGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCCGAAGTCCGGCACCTCGTGCACGCGGA
TTTCGGCTCCAACAATGTCCTGACGGACAATGGCCGCATAACAGCGGTC
ATTGACTGGAGCGAGGCGATGTTCGGGGATTCCCAATACGAGGTCGCCA
ACATCTTCTTCTGGAGGCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACGCG
CTACTTCGAGCGGAGGCATCCGGAGCTTGCAGGATCGCCGCGGCTCCGG
GCGTATATGCTCCGCATTGGTCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGA
CGGCAATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGCAATC
GTCCGATCCGGAGCCGGGACTGTCGGGCGTACACAAATCGCCCGCAGAA
GCGCGGCCGTCTGGACCGATGGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAGTGG
AAACCGACGCCCCAGCACTCGTCCGAGGGCAAAGGAATAATCAGTACTGA
CAATAAAAAGATTCTTGTTTTCAAGAACTTGTCATTTGTATAGTTTTTTTATAT
TGTAGTTGTTCTATTTTAATCAAATGTTAGCGTGATTTATATTTTTTTTCGCCTC
GACATCATCTGCCCAGATGCGAAGTTAAGTGCGCAGAAAGTAATATCATGCG
TCAATCGTATGTGAATGCTGGTCGCTATACTGCTGTCGATTCGATACTAACGC
CGCCATCCAGTGTCGAAAACGAGCTCGAATTCATCGATGATATCAGATCCACT
AGTGGCCTATGCGGCCGCGGATCTGCCGGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTCA
TAAGCGACAGAAAACACTTCGAGATGAGCTTGAGAACTCC，序列号：NO：12
粗体表示hph基因的ORF，下划线表示部分与PHO80基因互补的引物序列。
采用如Gottshling实验室网站所述的方法(http://www.there.org/gottschling/yeast/ytrans.html)，用上述纯化片断对YS18进行电穿孔转化。转化子在30℃，1ml 1M山梨糖醇和1ml 2x YPD混合培养基中培养2小时，表达药物抗性基因，然后涂布于选择培养基(YPD，0.9mg/ml潮霉素B)上。对几天后出现的克隆进行PCR鉴定。这样得到的菌株命名为YD80(MATα；his3-11，3-15；leu2-3，2-112；ura3Δ5；canR；pho80Δ∷hph)。
2.5结合pho80Δ缺失和PHO4，PHO5过量表达菌株的构建
采用啤酒酵母标准乙酸锂(LiOAc)转化方法将上述包含PHO5插入基因的pYX212质粒转化到YD80中。同时采用以下引物对PHO4基因进行PCR克隆扩增。
PHO4基因过量表达引物
正向引物(JP42)
5’-CGGAATTCATGGGCCGTACAACTTCTGAGG-3’序列号NO：7
反向引物(JT42)
5’-CGCTCGAGTCACGTGCTCACGTTCTGCAG-3’序列号NO：8
下划线序列补于是pYX212质粒中EcoRI和XhoI的酶切位点，其余部分分别补于PHO4基因(SGD)的起始和结束区域。
包含PHO4插入基因的pYX212质粒序列
GAATTCATGGGCCGTACAACTTCTGAGGGAATACACGGTTTTGTGGACG
ATCTAGAGCCCAAGAGCAGCATTCTTGATAAAGTCGGAGACTTTATCACC
GTAAACACGAAACGGCATGATGGGCGCGAGGACTTCAACGAGCAAAACG
ACGAGCTGAACAGTCAAGAGAACCACAACAGCAGTGAGAATGGGAACGA
GAATGAAAATGAACAAGACAGTCTCGCGTTGGACGACCTAGACCGCGCC
TTTGAGCTGGTGGAAGGTATGGATATGGACTGGATGATGCCCTCGCATG
CGCACCACTCCCCAGCTACAACTGCTACAATCAAGCCGCGGCTATTATAT
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CTTGGTCGCTACTGCTACTTCCACCACATCCGCTAACAAAGTCACTAAA
ACAAGAGTAATAGTAGTCCGTATTTGAACAAGCGCAGAGGTAAACCCGG
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TCGAACAGCACAAGACGCGTATCACCGGTCACGGCCAAGACCAGCAGCA
GCGCAGAAGGCGTGGTCGTAGCAAGTGAGTCTCCTGTAATCGCGCCGCA
CGGATCGAGCCATTCGCGGTCGCTGAGTAAGCGACGGTCATCGGGCGCG
CTCGTGGACGATGACAAGCGCGAATCACACAAGCATGCAGAGCAAGCAC
GGCGTAATCGATTAGCGGTCGCGCTGCACGAACTGGCGTCTTTAATCCC
CGCGGAGTGGAAACAGCAAAATGTGTCGGCCGCGCCGTCCAAAGCGACC
ACCGTGGAGGCGGCCTGCCGGTACATCCGTCACCTACAGCAGAACGTGA
GCACGTGACTCGAGCTCAGCTAGCTAACTGAATAAGGAACAATGAACGTTTT
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GTCTTTGTCTAGCTCCAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTCAATTCAC
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CCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGC
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GCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCC
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GATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGA
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AATCGTAACCTTCATCTCTTCCACCCATGTCTCTTTGAGCAATAAAGCCGATA
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GTTCCTTTGTTACTTCTTCTGCCGCCTGCTTCAAACCGCTAACAATACCTGGCC
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CCGCAGAGTACTGCAATTTGACTGTATTACCAATGTCAGCAAATTTTCTGTCT
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GGCAGCAACAGGACTAGGATGAGTAGCAGCACGTTCCTTATATGTAGCTTTC
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AATACTGGGCAATTTCATGTTTCTTCAACACTACATATGCGTATATATACCAA
TCTAAGTCTGTGCTCCTTCCTTCGTTCTTCCTTCTGTTCGGAGATTACCGAATC
AAAAAAATTTCAAAGAAACCGAAATCAAAAAAAAGAATAAAAAAAAAATGA
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ATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCC
CTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCT
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GCAAAGGCAGTGTGATCTAAGATTCTATCTTCGCGATGTAGTAAAACTAGCTA
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AGGAGATACAGCCTAATATCCGACAAACTGTTTTACAGATTTACGATCGTACT
TGTTACCCATCATTGAATTTTGAACATCCGAACCTGGGAGTTTTCCCTGAAAC
AGATAGTATATTTGAACCTGTATAATAATATATAGTCTAGCGCTTTACGGAAG
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ATTTTGTCTCTATATACTACGTATAGGAAATGTTTACATTTTCGTATTGTTTTC
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TTTTGGTTTTCAAAAGCGCTCTGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAAC
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CGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCAT
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GTATTTATTCCAGAGTATTCCTGATGAAATGGTTTAGATGGACATACGAAGAG
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GTAACAGGGAATATAAAGGGCAGCATAATTTAGGAGTTTAGTGAACTTGCAA
CATTTACTATTTTCCCTTCTTACGTAAATATTTTTCTTTTTAATTCTAAATCAAT
CTTTTTCAATTTTTTGTTTGTATTCTTTTCTTGCTTAAATCTATAACTACAAAAA
ACACATACAG，见序列号NO：9
粗体表示PHO4基因序列
下划线部分代表引物序列
采用上述方法含PHO4的pYX212质粒转化为YD80。
样品制备，肌醇磷酸盐和pNPP
在生长过程中隔段时间取1.5ml细胞悬液，以13000rpm离心3分钟收集细胞。1毫升上清液转移到一个新的微离心管中，加入150μl 4M HCl进行酸化处理。此时盐酸浓度大约为0.5M，足以使上清液中潜留的所有酶变性失活。如果不经过高温，在这样的条件下肌醇磷酸盐是不会进行化学酸性水解的。将样品冻存于冰箱中直至对IP：s和pNPP进行分析。在2ml 0.5M HCl中对1mM植酸钠(Na-IP6)进行化学水解制备峰值鉴别参照样本。这些样本都在110℃加热15小时以获得肌醇磷酸盐的异构物混合体，制备完成后保存于冰箱待用做参照样本。
发酵面包制备，磷酸提取和分析
为了在常规环境中分析Pi和IP6的含量，将面包酵母和两种不同种类的面团相混合。所用两种面粉：一种是全麦面粉(100％来源于小麦；例如全颗粒最终全成为面粉成分)，另一种是常用的面粉(60％来源于小麦)。麦团混合物中包括300g面粉，10g蔗糖，3gNaCl，20g商业面包酵母(Swedish Yeast Company)和200g自来水。从实验0点开始后每15分钟取出20g面团与40ml 0.5HCl进行混合(室温下这样的盐酸浓度可以使酶失活，但不会水解IP6)。在室温下对这样的混合物进行3小时的磁力搅拌以提取Pi和IP6，将提取物离心后的上清液收集并冻存于冰箱待用。待分析时，将样品解冻并取1ml上清液于13000xg离心5分钟，再次离心后的上清液用mQ水适当稀释后，用前面段落所述HPIC层析法对肌醇磷酸盐进行分析。对Pi的离子层析采用Dionex(Sunnyvale，CA，USA)4500i，50μl循环进样器，PAX-100防护分析柱，阴离子微膜抑制器(Anion Micro Membrane Supressor)和传导率探头进行分析。样品用水进行线性稀释，以200mM为梯度增加NaOH的浓度，从开始的6％增加到35分钟结束时的50％NaOH。
结果
在野生型酵母中植酸酶活性的表达和抑制
在以IP6为唯一磷源的合成培养基中，酵母可以高效的降解IP6。((Turk et al.(2000)Inositol hexaphosphate hydrolysis by baker’s yeast.Capacity，kinetics，anddegradation products.J.Agric.Food Chem.48，100-104.))为了检测啤酒酵母((S.cerevisiae))对细胞外IP6的水解是否受到无机磷酸(Pi)的抑制，使用了添加IP6的(CBSIP6+Pi)的酵母必需培养基Pi(26mM)。在IP6+Pi的混合培养基中，所有的待测啤酒酵母(S. cerevisiae)SKQ2n，CBS7764，CBS7765，YS18，BY4741和YMR4均未检测到IP6的降解，说明了细胞外的高浓度无机磷酸(Pi)可以有效地抑制植酸酶活性。参见图1所示，通过高压液相色谱HPIC检测得到啤酒酵母(S.cerevisiae)SKQ2n(正方形)与细胞外肌醇六磷酸(IP6；三角形)浓度的生长函数。细胞生长于添加了2％葡萄糖(质量/体积)作为碳源和能量源的CBS合成培养基中。实心符号代表作为唯一磷源的肌醇六磷酸(IP6)；空心符号代表采用肌醇六磷酸和无机磷酸(Pi)作为混合磷源。肌醇六磷酸(IP6)标准偏差量(Error bar)数据在多次重复实验中表现最大偏差。数据来源于多次实验中具有代表性的数值。在缺乏无机磷酸时(Pi)，培养基中IP6浓度以及SKQ2n菌株Pi呈递情况的典型变化情况可见于图1。
在此实验中，在20小时之内，CBSIP6培养基中的IP6都被完全降解了，而CBSIP6+Pi的混合培养基中IP6则没有被降解。对所有的菌株而言，由发酵呼吸期的指数幂回归分析计算出的生长速度，在CBSIP6培养基、CBSIP6+Pi混合培养基或CBSPi培养基中生长速度是一样快的，说明啤酒酵母(S.cerevisiae)可以有效的利用作为磷源的IP6。
同类的实验也被用于对仅添加了IP6(YPDIP6)的YPD培养基和添加了IP6和无机磷酸Pi(YPDIP6+Pi)的YPD复合丰富培养基进行比较。YPD实验的数据与CBS培养基的数据一致，都说明IP6的降解在YPDIP6培养基中不受影响，而植酸酶活性在YPDIP6+Pi混合培养基中受到抑制(数据未显示)。然而，对某些菌株(如YS18)来说，Pi诱导的抑制，在YPD中比CBS中更弱一些，因为还会检测到一些特定组成型的，不可忽略的植酸酶活性。
IP6降解过程中形成的肌醇磷酸盐
对酵母水解的IP6及其水解产物的定性定量的测定是通过HPIC进行的。植酸钠(第一条线)的化学水解，与啤酒酵母(S.cerevisiae)15小时培养物的上清液(第二条和第三条线)的HPIC层析图谱如图2所示。啤酒酵母(S.cerevisiae)在以IP6为唯一磷源(第二条线，粗体)的CBS培养基中表现出植酸酶的活性，而在以IP6和Pi为混合磷源的CBS培养基中却表现出Pi诱导的植酸酶活性抑制作用。各峰顺序：1：SO4-2；2：Ins(1，2，6)P3：Ins(1，2，5，6)P4；4：Ins(1，2，4，5，6)P5；5：IP6。
层析结果显示出肌醇环的位置对酵母植酸酶的活性有特异的促进作用。在啤酒酵母(S.cerevisiae)的CBSIP6培养基中IP3，IP4和IP5都只有一种异构体能够检出。(图2，第二线)。这些异构体相对应的化学水解产物(图2，第二线，所有峰已有鉴定)排列分别为I(1，2，4，5，6)P5，I(1，2，5，6)P4，I(1，2，6)P3()。水解产物第2个峰可能是I(1，2，6)P3和I(1，2，3)P3的混合物，然而I(1，2，3)P3可以从酵母样本中排除，因为3-位已经缺失。对实验室菌株和野生型菌株进行检测也发现了相同形式的IP异构体现象。图2中较低的第三线表示啤酒酵母(S.cerevisiae)在CBSIP6+Pi培养基中混合培养15小时后细胞外IP：s的组成成分。在这样的培养物中，由于IP6(第5峰)的浓度在整个实验中一直居高不下，所以无法检测到过低浓度的肌醇磷酸盐(肌醇磷酸盐的降解产物)，证明了Pi导致了细胞外植酸酶活性的抑制。
PHO基因缺失突变体
由PHO5编码的大多数分泌型酸性磷酸酶都与植酸的水解有关。降解细胞外IP6时，PHO5缺失突变体在与其亲本菌株相比时效率较低。为了实现这个目的，采用了pho3Δpho5Δ双缺失突变体YMR4。使用这种突变体可以评估缺失PHO3和PHO5基因的效果。然而该突变体并没有被影响，可能是因为这些基因并不是太重要，因为他们会被硫胺(存在于CBS培养基中)抗结，其主要产物是一种硫胺磷酸酶(Praekelt et al.(1994)Regulation of THI4(MOL1)，a thiamine-biosynthetic gene of Saccharomyces cerevisiae.Yeast.10，481-490.)。
图3A和图3B是啤酒酵母(S.cerevisiae)亲本菌株YS18(空心符号)和啤酒酵母(S.cerevisiae)YMR4pho3Δpho5Δ双缺失突变体(实心符号)的生长(正方形)与细胞外IP6(圆圈)浓度的HPIC图。
图3A表明采用的是以IP6+Pi为混合磷源(抑制条件)葡萄糖作为碳源和能量源的合成培养基。图3B表明采用的是以IP6为唯一磷源(脱-抑制条件)葡萄糖作为碳源和能量源的合成培养基。数据来源于两次具有代表性重复实验的平均数。
在重复实验中，YMR4与其亲本菌株YS18具有相同的细胞外IP6水解效率(图3B)。另外从图3A还可以看出，在CBSIP6+Pi混合培养基(抑制条件)中，YMR4突变体和YS18的生长情况与不受Pi诱导抑制的情况未受影响。对两种菌株来说，接种24小时后，CBSIP6+Pi混合培养基中还有94％的初始IP6(图3A)。而同一时间，在CBSIP6培养基中也检测不到任何的IP6和低量肌醇磷酸盐IP：s(图3B)。对PHO5基因在CBSIP6培养基中对突变体的生长速率进行了独立性检测。计算出在呼吸-发酵期指数(在含葡萄糖的CBSIP6培养基中)生长速率为0.33h-1，YMR4和其亲本YS18的培养阶段为2.1小时。这并不是说Pho5p和Pho3p不能水解IP6，这只是证明对酵母总植酸酶活性来说，它们并不是必需的。
通过PCR和同源重组可以使YMR4和YS18中的PHO10缺失，从而得到pho3Δpho5Δpho10Δ三缺失突变体YM10和pho10Δ单缺失突变体YS10。图4表述的是以IP6为唯一磷源，酵母培养物上清液中IP6浓度的生长函数。灰色圆圈：YS18的亲本菌株，含有全部的PHO基因；实心正方形：YMR4pho3Δpho5Δ双缺失突变体；实心三角形：YM10pho5Δpho3Δpho10Δ三缺失突变体；空心菱形：YS10pho10Δ单缺失突变体。数据来源于两个分别培养样本的平均值，标准偏差量(error bar)表示它们之间的偏差。在CBSIP6和YPDIP6培养基对这些菌株进行培养，在生长过程中用HPIC检测IP6的浓度。在CBS培养基中，YS10中并未影响IP6的降解，说明PHO10对总植酸酶的活性也是多余的(图4)。
与YS18和YMR4相比，即使是仅保留一个分泌型磷酸酶基因Pho11p的YM10，它的净细胞外植酸酶活性不受影响。在CBS培养基中，这个突变体中仅表现出微小但明显的IP6降解效率降低(图4)。然而在复合培养基YPD中，三缺失突变体表现出对细胞外IP6浓度的极大降低但保持了正常的生长率(图5)，说明在Pho10p具有植酸酶活性的同时至少应存在另外一个酶。
图5描述的是在YPD复合培养基中将IP6作为加入磷源，酵母培养物上清液中肌醇六磷酸(IP6)浓度的生长函数。灰色圆圈：YS18亲本菌株，具有全部PHO基因；实心正方形：YMR4pho3Δpho5Δ双缺失突变体；实心三角形：YM10pho3Δpho5Δpho10Δ三缺失突变体；空心菱形：YS10pho10Δ单缺失突变体。数据来源于两个分别培养样本的平均值，标准偏差量(error bar)表示它们之间的偏差。
图6描述的是用于转化YS18和YMR4的pYX212包含插入PHO5质粒图谱。由丙糖磷酸异构酶糖酵解启动子(TPI1)控制PHO5的表达，采用酵母的URA3和AmpR基因作为选择标记。
为了检测PHO5单独表达对细胞外IP6降解的效果，用含有组成型糖酵解启动子(TPI1)控制的插入PHO5基因的pYX212质粒转化YMR4和YS18。(图6)
这样得到的菌株分别命名为YM-p5和YS-p5(见表1)。在添加了适当磷源的YPD培养基中对这些菌株进行实验。细胞的生长与胞外IP6浓度呈时间函数。图7A和图7B描述的是细胞外IP6浓度与啤酒酵母(S.cerevisiae)YMR4(A)和YS18(B)在转化pYX212-PHO5质粒前后的比较。空心符号：没有转化质粒的菌株，实心符号：含有pYX212-PHO5质粒的菌株。实验在含有2％葡萄糖的YPD培养基中进行，或者仅加入IP6(圆圈)，或者加入IP6和Pi(三角形)。数据来源于两至三次独立实验的平均值，标准差不超过5％。从YM-p5和YS-p5得到的数据来看，PHO5所编码的基因具有植酸酶活性(图7A，图7B)。
正常抑制情况下(YPDIP6+Pi)，YM-p5和YS-p5都有较高的IP6降解率(图7A，图7B中的实心三角形)，说明在这些突变体中都有组成型的植酸酶活性表达，采用没有转化质粒的突变体作为对照(空心三角形)。与CBS培养基中相比，对照亲本菌株在YPD培养基受到较弱的抑制作用，而对带转化质粒细胞的抑制则会增强。YM-p5在24小时能可以降解63％起始浓度的IP6，而对照菌株YMR4在相同时间内只能降解22.5％(图6)。同时还分析了在YPDIP6非抑制培养基中的IP6降解速率。在这些条件下，YM-p5中可以表达PHO10，PHO11和插入的PHO5基因，而YS-p5中可以表达PHO5，PHO10，PHO11和插入的PHO5基因。这些数据确实表明PHO5在两种菌株中都可以增加IP6的净降解率(图7A，图7B)。在YS-p5中的降解效果尤其好，因为在基因组和质粒上都包含了PHO5基因。综合比较PHO5过量表达菌株与缺失基因菌株对比其亲本菌株的实验结果(图3和图4)，说明Pho5p，Pho10p和至少另一个酶，我们认为是Pho11p，就是所有的植酸酶。
调控基因PHO80，PHO85和PHO2的缺失
PHO基因家族与酵母植酸酶活性相关，所以对调控基因PHO80和PHO85进行缺失后会获得组成型的植酸酶表达活性。
图8比较的是PHO5过量表达菌株、pho80Δ和pho85Δ缺失突变体相互之间的植酸降解活性。如图所示细胞外IP6浓度与和转有pYX212-PHO5质粒的YS18-p5(三角形)，pho80Δ缺失突变体(正方形)和pho85Δ缺失突变体(圆圈)啤酒酵母(S. cerevisiae)的生长时间函数。在2％葡萄糖YPD培养基中分别只加入IP6(实心符号)或IP6和Pi(空心符号)完成实验。数据来源于两次独立实验的平均值，标准差小于5％。
如图8所示，这些突变体都表现出高效的IP6降解能力，而且完全组成性地证明PHO基因家族与啤酒酵母(S.cerevisiae)中的植酸酶活性相关。与YS18-p5(PHO5过量表达)菌株相比，pho80Δ和pho85Δ突变体对IP6的净降解率要高一些(图8)。pho80Δ中的生长率维持恒定，而pho85Δ却显著降低。一些pho80Δ和pho85Δ菌株来源于BY4741(EUROSCARF保藏)，而另一些pho80Δ中菌株(图12)却来源于对YS18进行缺失构建得到的YD80。在这个菌株中再度确认了高效的细胞外植酸酶活性。
图9描述的是pho2Δ缺失突变体对植酸的降解活性。作为比较，也表示出了pho80Δ缺失菌株和具有全部PHO基因的BY4741。将细胞外的IP6浓度与在YPD中的生长时间做函数。符号的解释见图。磷的来源在括号中注明。除了IP6的数据，OD610数据作为pho2Δ缺失突变体和它的亲本菌株BY4741的生长数值。数据来源于两次独立实验的平均值，且标准差小于5％。
PHO2和PHO4都被认为是对PHO5、PHO10和PHO11分泌型磷酸酶具有正调控作用。通过比较发现pho2Δ缺失突变体缺乏完全的植酸酶活性，从而证明植酸酶活性是PHO基因家族的一个重要组成部分。通过对PHO2和/或PHO4进行过量表达可以进一步增强植酸酶活性。
PHO3基因的表达
与PHO5、PHO10和PHO11的表达一样，PHO3的表达也可以增加细胞外IP6的降解速率。为此，在去除了硫胺的CBS培养基中对亲本菌株YS18进行培养，已知可以抑制PHO3表达(Nosaka et al.(1989) A possible role for acidphosphatase with thiamin-bindingactivity encoded by PHO3 in yeast.FEMS Microbiol.Lett.51，55-59；Nosaka(1990)High affinity of acid phosphatase encoded by PHO3 gene in Saccharomyces cerevisiaefor thiamin phosphates.Biochim.Biophys.Acta.1037，147-154.)。将正常CBSIP6(含有硫胺)培养基设为对照，以确保在无论有无硫胺磷酸的时候，酵母不会受到硫胺缺乏的负调控。YS18的生长率和对IP6的降解率在所用三种培养基中没有显著差异，说明PHO3对酵母植酸酶活性几乎没有或少有影响(数据未显示)。
IP6和pNPP的竞争性降解
已经有文献经常采用苯基磷酸和对硝基苯磷酸(pNPP)作为底物对啤酒酵母中的PHO基因家族进行研究(Monod et al.(1989) Functional analysis of the signal-sequenceprocessing site of yeast acid phosphatase.Eur.J.Biochem.182，213-221；Slmyrevaet al.(1996) Biochemical properties and excretion behavior of repressible acidphosphatases with altered subunit coniposition.Microbiol.Res.151，291-300；Martinez et al.(1998)Identification，cloning and characterization of aderepressible Na+-coupled phosphate transporter in Saccharomyces cerevisiae.Mol.Gen.Genet.258，628-638.)。这些化合物都作模式有机磷源之用。一般认为酵母可以利用某些有机磷源。
考虑到在两种情况中PHO系统都有竞争性情况的发生，而这两种化合物都很容易被S.cerevisiae降解，于是对添加第二有机磷酸化合物(pNPP)后IP6的降解速率作了进一步的研究。
图10描述了在以2％葡萄糖为碳源和能量源的CBS培养基中，细胞外对硝基苯磷酸(pNPP，正方形)和IP6(三角形)浓度与啤酒酵母(S.cerevisiae)SKQ2n的生长函数关系。其中CBS培养基可以添加IP6(空心三角形)为唯一磷源，可以添加pNPP(空心正方形)为唯一磷源，也可以添加IP6和pNPP为混合磷源(实心符号)。
在实验中，在同时存在IP6和pNPP而Pi缺乏时，IP6的降解效率与培养基中仅含有IP6时相比完全未发生变化(图10)，然而，在IP6存在时，与仅有pNPP时相比，pNPP降解效率则会降低。绝大多数的pNPP降解都发生在培养基中的IP6被耗尽以后。在培养12小时后，两种培养基中的IP6都被耗尽了，在混合培养基中的pNPP仅有17％被降解，而在纯pNPP培养基中已经有49％被降解。为获得在计量化学上相等的磷酸集团数目，同样的实验也在将pNPP浓度提高6倍于IP6浓度(2.25mM)的条件下进行。虽然pNPP以原来六倍以上的随机几率与酶结合，但实验结果却与原来相似，说明在IP6的比率一定，并有pNPP存在时，没有改变，而同仅有pNPP相比，pNPP的降解效率降低。
面包中的无机磷酸和IP6成分
为了了解酵母PHO系统在面包发酵过程中的情况，对两种小麦面团的Pi和IP6含量进行分析。以发酵时间作为函数，在两种面团都呈现出Pi水平增高和IP6水平下降的趋势(图11)。
图11描述的是肌醇六磷酸(IP6，三角形)和无机磷酸(Pi，正方形)浓度(μmol/g湿面团重)与两种面团发酵时间呈函数关系。实心符号：全麦面粉(100％提取率；作为最终面粉的小麦全麦粒的比率)，空心符号：白面粉(60％来源于小麦)。标准偏差量(error bar)表示两个样品间的最大偏差。
在全麦发酵面包中无机磷酸(Pi)的起始浓度为4μmol/g湿面团重(大约相当于mM)，在发酵60分钟后达到11.8μmol/g；白面团中的起始和最终浓度值分别为1.7μmol/g和5.8μmol/g。IP6在全麦麦团和白面团中的起始浓度分别为9μmol/g和3μmol/g，发酵60分钟后分别降为4.8μmol/g和0.4μmol/g，说明面团中的植酸酶具有活性。
大多数前人的降解IP6的研究都关于“酵母植酸酶”，常常将它区别于磷酸酶，但却没有鉴别它的基因和酶。(Nayini et al.(1984)The phytase of yeast.Lebensm.Wiss.u-Technol.17，24-26；Harland et al.(1989)Effects of phytase from three yeastson phytate reduction in Norwegian whole wheat flour.Cereal Chem.4，357-358；Naifet al.(1991)Phytic acid content reduction in canola meal by various microorganismsin a solid state fermentation process.Acta Biotechnologica.11，211-218)。Lambrechts等人有时试图通过饥饿和加热到50℃的方法来对面包发酵中的酵母植酸酶活性的作用进行研究(Lambrechts et al.(1992)Utilization of phytate by some yeasts.Biotechnol.Lett.14，61-66.；Harland et al.(1989)Effects of phytase from three yeasts onphytate reduction in Norwegian whole wheat flour.Cereal Chem.4，357-358.)。
在最适酵母生长条件下对酵母植酸酶活性进行研究发现，在无机磷酸缺乏的时候，啤酒酵母(S.cerevisiae)可以很好的利用细胞外的IP6磷源。在不影响生长速率时，IP6的快速降解为酵母代谢系统提供磷，以补偿由于合成降解酶所增加的能量消耗。磷酸盐诱导的植酸酶活性抑制证明了这种现象与啤酒酵母中的PHO基因家族相关。
在低浓度的无机磷酸条件下，啤酒酵母(S.cerevisiae)可以诱导合成至少三种磷酸酶并运送到细胞膜外。这说明植酸酶在一特定比率下组合Pho5p(86％)，Pho10p和Pho11p(共14％)的寡聚状态下的活性最高。(Shnyreva et al.(1996)Biochemical properties andexcretion behAVAIor of repressible acid phosphatases with altered subunitconiposition.Microbiol.Res.151，291-300.)。所谓的“酵母植酸酶”可以是寡聚酶中的一种协助组分。
然而，当使用pNPP为底物时，Shnyreva等人证明由单一分泌型磷酸酶构成的同聚物也有显著不同的活性(Shnyreva et al.(1996)Biochemical properties and excretionbehavior of repressible acid phosphatases with altered subunit composition.Microbiol.Res.151，291-300)。当pNPP大量存在时，Pho5p具有最高的专一活性，与表达的Pho10p和Pho11p相比，单独表达的Pho5p活性高出15倍。
PHO5缺失的菌株在IP6降解产生的菌株同样有效能。可以如下解释这个数据：(i)PHO5对植酸酶的活性来说并不重要；(ii)在没有Pho5p的情况下，残余水平的Pho10p和Pho11p足以保持植酸酶活性不变；可以(iii)在缺乏PHO5时，PHO10和PHO11变得不受调控。事实上，在PHO10或PHO11缺乏时，Pho5p的水平会有所增加(Shnyreva et al.(1996)Biochemical properties and excretion behavior of repressible acid phosphatases withaltered subunit composition.Microbiol.Res.151，291-300)；因此，反之也可成立。(iv)可能存在不同而未被鉴定的一种植酸酶。例如啤酒酵母(S. cerevisiae)中的DIA3基因，就编码一种与Pho3、Pho15、Pho10和Pho11相关的蛋白(参见YPD数据库)，Dia3p可能存在于细胞外。
因IP6的特异性降解中的不为人知的不同分泌型磷酸酶的作用，我们构建了只缺失PHO10(YS10)的菌株。利用菌株YS10未受影响的生长与IP6降解率说明，对酵母的植酸酶活性而言，PHO10可以忽略。因此，PHO3，PHO5或PHO10对植酸酶的高活性都不是必需的。然而却在CBS培养基中观察到，三缺失突变体(YM10)中对IP6降解效率的微小但重要的降低，且在YPD培养基中更为明显。这证明了首先，Pho10p是具有植酸酶活性的，因为当PHO10是唯一变量时观察到了变化；其次，只单独含有Pho11p(或者其他未知植酸酶)的菌株在定义的培养基中依然具有明显的植酸酶活性。所有这些缺失突变体的生长速率都没有发生改变，所以它们如果作为生物质专一植酸酶活性表达，净植酸酶活性是可以进行比较的。即使是把缺乏三种分泌型磷酸酶的菌株在IP6中进行培养，磷源永不会缺乏。有意思的是，主要的分泌型磷酸酶(Pho5p)是可舍弃的，而仅编码二者之一的所谓次要分泌型磷酸酶(Pho11p)的菌株可以几乎保持恒定的植酸酶活性。
为了单对Pho5p的植酸酶潜能进行单独研究，构建了两种在抑制性培养基中只表达PHO5的两种菌株。实验数据说明这些菌株中的PHO5自身编码一种具有植酸酶活性的蛋白质，并且参与野生型菌株对IP6的降解。在脱-抑制培养基中培养YM-p5和YS-p5，与未进行转化的亲本菌株相比，植酸酶活性增加(图6)。这并不一定是期待的结果，因为IP6降解率提高导致Pi浓度增加，反之对基因组中植酸酶的编码基因造成抑制。数据说明酵母的植酸酶活性不是由单一基因产品完成。然而，在抑制和脱-抑制培养基中都可以观察到能共同获得对单个基因过量表达菌株和净植酸酶活性的提高。
另外，已知pho80p和pho85p调控成份在培养基中高Pi情况下对pho4p进行磷酸化。磷酸化的pho4p变成了具有亲和力的转运蛋白离开细胞核；而不作为PHO基因包括分泌型磷酸酶基因的转录激活蛋白。如果在pho80p和pho85p中一个或二者都缺失的情况下，他们对pho4p的激酶活性就丧失，pho4p和pho2p依然作为具有活性的分泌型磷酸酶的转录激活蛋白。这就是组成型表达PHO5，PHO10和PHO11的突变体。因为PHO80或PHO85的缺失都导致了强烈的组成型植酸酶活性表达，又一次证明了PHO基因家族的存在。
前人的研究已经证明酵母对面包发酵过程中观察到的植酸酶活性起的作用很小，不足以显著增加对铁和锌的吸收(Harland et al.(1989)Effects of phytase from three yeastson phytate reduction in Norwegian whole wheatflour.Cereal Chem.4，357-358；Turket al.(1992)Phytate degradation during bread making：effect of phytase addition.J.Cereal Science.15，281-294；Turk et al.(1996)Reduction in the levels of phytateduring wholemeal breadmaking；Effect of yeast and wheat phytases. J.Cereal Science.23，257-264.)。在向面团和小麦面卷wheat rolls中添加商业化的土曲霉植酸酶，却使得人类小肠分别增加对IP6和微量元素的吸收水平(Turk et al.(1992)Phytate degradatioraduring bread making：effect of phytase addition.J.Cereal Science.15，281-294；Turk et al.(1996)Reduction in the levels of phytate during wholemeal bread making；Effect of yeast and wheat phytases.J.Cereal Science.23，257-264.)。证明了植酸酶活性是受到无机磷酸抑制的。无机磷酸的浓度在毫摩尔范围内变动时可以发生诱导抑制作用(Yoshida et al.(1989)Function of the PHO regulatory genes for repressibleacidphosphatase synthesis in Saccharomyces cerevisiae.Mol.Gen.Genet.217，40-46.)，(10mM Pi通常为高浓度，0.2mM为低浓度)，(Ogawa et al.(2000)Newcomponents of a system for phosphate accurnulation and polyphosphate metabolism inSaccharornyces cerevisiae revealed by genomic expression analysis. Mol.Biol.Cell.11，4309-4321)。因此，在通常的面包制作情况下，编码Pho5p，Pho10p和Pho11p的PHO基因并不具有较高活性，植酸酶活性并没有完全表达。而且，谷物中的IP6必须广泛得到降解才能改善对铁的吸收(Brune et al.(1992)Human iron absorption from bread：Inhibiting effects of cereal fibre，phytate and inositol phosphates with differentnumbers of phosphate groups. J.Nutr.122，442-449.)即使是低至0.5μmol/g干样品中的IP6和IP5都具有抑制作用的(Sandberg et al.(1999)Inositol phosphates withdifferent number of phosphate groups influence iron absorption in humans. Am.J.Clin.Nutr.70，240-246.)。面团中的IP6含量以每克湿重表示(以干重表示的数值更高)，到发酵的最后阶段会超过对铁的抑制范围。发酵过程中添加商业发酵粉后，IP6的降解几乎全部源于面粉中的植物源植酸酶。这样组成型表达的酵母菌株是值得期待的。
Nayini等人也进一步证明在两者同时施用时，酵母对IP6比对pNPP更加偏好(Nayini et al.(1984)The phytase of yeast.Lebensm.Wiss.u-Technol.17，24-26)。酵母植酸酶和磷酸酶可以从BAKER’S酵母Baker’s yeast cake的粗提物中纯化得到。植酸酶(也是一种磷酸酶，其是植酸的一种底物)和磷酸酶活性的区别在于磷酸酶可以水解α-磷酸甘油，但不能水解IP6。采用11种不同的磷源来检测植酸酶对不同底物的特异活性。苯基磷酸就是一种，它比IP6具有高40倍的降解效率。以上数据说明，在IP6没有耗尽之前，pNPP不会被降解。即使是在pNPP浓度高出6倍时，数据表明IP6也显现出对pNPP水解产生抑制。与之前某种商业面包酵母的数据相似，酵母植酸酶不是一个单一的酶，但它的酶活性与肌醇六磷酸的苯环位置有非常明确的特异性关系(Turk et al.(2000)Inositolhexaphosphate hydrolysisby baker’s yeast.Capacity kinetics，and degradationproducts.J.Agric.Food Chem.48，100-104.)。这种特异性，即所谓的3-植酸酶活性在所有的实验酵母中都存在，而且在一些从鱼类小肠中和人类的病原体中分离得到的啤酒酵母(S. cerevisiae)，以及所有的缺失突变体中也是这样。因此，改造过的菌株可以被用于高效合成低级肌醇磷酸盐的高度专一异构体。
除了以上在酵母菌中的工作，我们还尝试在非酵母菌中查找具有期望性质的新酶的可能。实验的材料主要来源于热带和仙人掌属的菌株，和啤酒酵母(S.cerevisiae)相比，所期待的特性有高温最大极限和/或产生不同异构体。至今，所有检测的群属和菌株都显示植酸酶活性。到目前为止，所有检测种和菌株均表现出植酸酶活力。然而不同酶的生化特性还没有进行检测。
除了啤酒酵母(S.cerevisiae)，其他的能够表达植酸酶的酵母品种也可以用来进行转化以获得植酸酶活性的提高。
尽管通过若干优选实施方案对本发明进行了说明和诠释，在不偏离本发明主旨和范围的情况下，仍可对本发明形式和内容进行各种修改、删除和添加。
序列表
1、PHO5过量表达的引物序列
-正向引物：
5’：CGGAATTCATGTTTAAATCTGTTGTTTATTC
-反向引物：
3’：CGCTCGAGCTATTGTCTCAATAGACTGGC
下划线的序列分别为EcoRI和Aval(产生与用XhoI酶切pYX212质粒相同的粘末端)限制酶的识别位点。其余序列与PHO5基因起点(ATG)和末端互补。
插入PHO5之后的pYX212质粒序列：
GAATTCATGTTTAAATCTGTTGTTTATTCAATTTTAGCCGCTTCTTTGGCC
AATGCAGGTACCATTCCCTTAGGCAAACTAGCCGATGTCGACAAGATTGG
TACCCAAAAAGATATCTTCCCATTTTTGGGTGGTGCCGGACCATACTACT
CTTTCCCTGGCGACTATGGTATTTCTCGTGATTTGCCTGAAGGTTGTGAA
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CTTATATGCGTCTATTTATGTAGGATGAAAGGTAGTCTAGTACCTCCTGTGAT
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AAGCACGCTTATCGCTCCAATTTCCCACAACATTAGTCAACTCCGTTAGGCCC
TTCATTGAAAGAAATGAGGTCATCAAATGTCTTCCAATGTGAGATTTTGGGCC
ATTTTTTATAGCAAAGATTGAATAAGGCGCATTTTTCTTCAAAGCTGCGGCCG
CACTCTCACTAGTACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCC
CTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAAT
AACCGTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCA
ACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTT
GCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTG
CACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAG
TTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTAT
GTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGCTCGCCG
CATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGC
ATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCAT
GAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAG
GAGCTAACCGCTTTTTTGGACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCG
TTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACG
ATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTAC
TTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTT
GCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAA
ATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCA
GATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAA
CTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAA
GCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAA
AACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCA
TGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTA
GAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTG
CTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAA
GAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACC
AAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTG
TAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCC
AGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGG
ATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTT
GGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAA
AGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGC
AGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGG
TATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTG
TGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCT
TTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTT
ATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCG
GTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGG
AAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAA
TGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACG
CAATTAATGTGAGTTACCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATG
CTTCCGGCTCCTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGG
AAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCGAAATACGACTCACTATAGGG
CGAATTGGGTACCGGGCCGGCCGTCGAGCTTGATGGCATCGTGGTGTCACGCT
CGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTT
ACATGATCCCCCATGTTGTGAAAAAAAGCGGTTAGCTCTTCGGTCCTCCGATC
GTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGGAAC
TGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTG
TACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTG
CCCGGCGTCAACACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAGTG
CTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCT
GTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCAT
CTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCC
GCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCC
TTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGATACAT
ATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCC
GAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTAT
AAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCAAGAATTGGGGATCTACGT
ATGGTCATTCTTCTTCAGATTCCCTCATGGAGAAGTGCGGCAGATGTATATGA
CAGAGTCGCCAGTTTCCAAGAGACTTTATTCAGGCACTTCCATGATAGGCAAG
AGAGAAGACCCAGAGATGTTGTTGTCCTAGTTACACATGGTATTTATTCCAGA
GTATTCCTGATGAAATGGTTTAGATGGACATACGAAGAGTTTGAATCGTTTAC
CAATGTTCCTAACGGGAGCGTAATGGTGATGGAACTGGACGAATCCATCAAT
AGATACGTCCTGAGGACCGTGCTACCCAAATGGACTGATTGTGAGGGAGACC
TAACTACATAGTGTTTAAAGATTACGGATATTTAACTTACTTAGAATAATGCC
ATTTTTTTGAGTTATAATAATCCTACGTTAGTGTGAGCGGGATTTAAACTGTG
AGGACCTCAATACATTCAGACACTTCTGACGGTATCACCCTACTTATTCCCTT
CGAGATTATATCTAGGAACCCATCAGGTTGGTGGAAGATTACCCGTTCTAAGA
CTTTTCAGCTTCCTCTATTGATGTTACACTCGGACACCCCTTTTCTGGCATCCA
GTTTTTAATCTTCAGTGGCATGTGAGATTCTCCGAAATTAATTAAAGCAATCA
CACAATTCTCTCGGATACCACCTCGGTTGAAACTGACAGGTGGTTTGTTACGC
ATGCTAATGCAAAGGAGCCTATATACCTTTGGCTCGGCTGCTGTAACAGGGA
ATATAAAGGGCAGCATAATTTAGGAGTTTAGTGAACTTGCAACATTTACTATT
TTCCCTTCTTACGTAAATATTTTTCTTTTTAATTCTAAATCAATCTTTTTCAATT
TTTTGTTTGTATTCTTTTCTTGCTTAAATCTATAACTACAAAAAACACATACAGG
下划线标识为引物序列，
蓝色核酸标识插入的PHO5基因序列。
2、PHO10基因缺失的引物
5’-CGATAGATTCAAGCTCAGTTTCGCCTTGGTTGTAAAGTAGGCAGCTGAAGCTT CGTACGC-3’
5’-GGTCTATTTACTGTTTTAATAAAGTGTCGTTGTAGTGCTTGGGGCAGATGATG TCGAGGCG-3’。
利用这些寡核苷酸作为引物用来构建基因的缺失盒。下划线序列与模板的HIS5基因序列互补，未划线的部分与PHO10基因的侧翼序列互补。PHO10基因的缺失是通过PCR置换方法，用来源于酵母(Saccharomyces pombe)的HIS5基因对应于啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的HIS3作为选择标记，采用质粒pFA6a-HIS3MX6作为模板DNA完成的。
通过同源重组缺失PHO10基因的PCR产物序列。
CGATAGATTCAAGCTCAGTTTCGCCTTGGTTGTAAAGTAGCCAGCCTGGAAGCTTCGT
ACGCTGCAGGTCGACGGATCCCCGGGTTAATTAAGGCGCGCCAGATCTGTTTA
GCTTGCCTCGTCCCCGCCGGGTCACCCGGCCAGCGACATGGAGGCCCAGAAT
ACCCTCCTTGACAGTCTTGACGTGCGCAGCTCAGGGGCATGATGTGACTGTCG
CCCGTACATTTAGCCCATACATCCCCATGTTAATCATTTGCATCCATACATTT
TGATGGCCGCACGGCGCGAAGCAAAAATTACGGCTCCTCGCTGCAGACCTGC
GAGCAGGGAAACGCTCCCCTCACAGACGCGTTGAATTGTCCCCACGCCGCGC
CCCTGTGAGAAATATAAAAGGTTAGGATTTGCCACTGAGGTTCTTCTTTCATA
TACTTCCTTTTAAATCTTGCTAGGATACAGTTCTCACATCACATCCGAACATA
AACAACCATGGGTAGGAGGGCTTTTGTAGAAAGAAATACGAACGAAACGAA
AATCAGCGTTGCCATCGCTTTGGACAAAGCTCCCTTACCTGAAGAGTCGAATT
TTATTGATGAACTTATAACTTCCAAGCATGCAAACCAAAAGGGAGAACAAGT
AATCCAAGTAGACACGGGAATTGGATTCTTGGATCACATGTATCATGCACTGG
CTAAACATGCAGGCTGGAGCTTACGACTTTACTCAAGAGGTGATTTAATCATC
GATGATCATCACACTGCAGAAGATACTGCTATTGCACTTGGTATTGCATTCAA
GCAGGCTATGGGTAACTTTGCCGGCGTTAAAAGATTTGGACATGCTTATTGTC
CACTTGACGAAGCTCTTTCTAGAAGCGTAGTTGACTTGTCGGGACGGCCCTAT
GCTGTTATCGATTTGGGATTAAAGCGTGAAAAGGTTGGGGAATTGTCCTGTGA
AATGATCCCTCACTTACTATATTCCTTTTCGGTAGCAGCTGGAATTACTTTGCA
TGTTACCTGCTTATATGGTAGTAATGACCATCATCGTGCTGAAAGCGCTTTTA
AATCTCTGGCTGTTGCCATGCGCGCGGCTACTAGTCTTACTGGAAGTTCTGAA
GTCCCAAGCACGAAGGGAGTGTTGTAAAGAGTACTGACAATAAAAAGATTCT
TGTTTTCAAGAACTTGTCATTTGTATAGTTTTTTTATATTGTAGTTGTTCTATTT
TAATCAAATGTTAGCGTGATTTATATTTTTTTTCGCCTCGACATCATCTGCCCC
AAGCACTACAACGACACTTTATTAAAACAGTAAATAGACC
下划线部分代表引物(或与引物互补)的序列，
斜体部分代表与PHO10相对应的基因序列(SGD)，
蓝色标识序列用来源于酵母的HIS5基因(S.pombe；对应于啤酒酵母(S.cerevisiae)的HIS3)作为选择标记。
3、PHO4基因过量表达引物
正向引物(JP42)
5’-CGGAATTCATGGGCCGTACAACTTCTGAGG-3’
反向引物(JT42)
5’-CGCTCGAGTCACGTGCTCACGTTCTGCAG-3’
下划线序列补于是pYX212质粒中EcoRI和XhoI的酶切位点，其余部分分别补于PHO4基因(SGD)的起始和结束区域。
包含PHO4插入基因的pYX212质粒序列
GAATTCATGGGCCGTACAACTTCTGAGGGAATACACGGTTTTGTGGACG
ATCTAGAGCCCAAGAGCAGCATTCTTGATAAAGTCGGAGACTTTATCACC
GTAAACACGAAACGGCATGATGGGCGCGAGGACTTCAACGAGCAAAACG
ACGAGCTGAACAGTCAAGAGAACCACAACAGCAGTGAGAATGGGAACGA
GAATGAAAATGAACAAGACAGTCTCGCGTTGGACGACCTAGACCGCGCC
TTTGAGCTGGTGGAAGGTATGGATATGGACTGGATGATGCCCTCGCATG
CGCACCACTCCCCAGCTACAACTGCTACAATCAAGCCGCGGCTATTATAT
TCGCCGCTAATACACACGCAAAGTGCGGTTCCCGTAACCATTTCGCCGAA
CTTGGTCGCTACTGCTACTTCCACCACATCCGCTAACAAAGTCACTAAA
ACAAGAGTAATAGTAGTCCGTATTTGAACAAGCGCAGAGGTAAACCCGG
GCCGGATTCGGCCACTTCGCTGTTCGAATTGCCCGACAGCGTTATCCCAA
CTCCGAAACCGAAACCGAAACCAAAGCAATATCCGAAAGTTATTCTGCCG
TCGAACAGCACAAGACGCGTATCACCGGTCACGGCCAAGACCAGCAGCA
GCGCAGAAGGCGTGGTCGTAGCAAGTGAGTCTCCTGTAATCGCGCCGCA
CGGATCGAGCCATTCGCGGTCGCTGAGTAAGCGACGGTCATCGGGCGCG
CTCGTGGACGATGACAAGCGCGAATCACACAAGCATGCAGAGCAAGCAC
GGCGTAATCGATTAGCGGTCGCGCTGCACGAACTGGCGTCTTTAATCCC
CGCGGAGTGGAAACAGCAAAATGTGTCGGCCGCGCCGTCCAAAGCGACC
ACCGTGGAGGCGGCCTGCCGGTACATCCGTCACCTACAGCAGAACGTGA
GCACGTGACTCGAGCTCAGCTAGCTAACTGAATAAGGAACAATGAACGTTTT
TCCTTTCTCTTGTTCCTAGTATTAATGACTGACCGATACATCCCTTTTTTTTTTT
GTCTTTGTCTAGCTCCAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTCAATTCAC
TGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTT
AATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGC
CCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGC
GACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCA
GCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCC
CTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGC
TCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGGTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTT
GATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCG
CCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGG
AACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCC
GATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGA
ATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTAC
GCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATAGGGTAATAACTGATATAATTAAATT
GAAGCTCTAATTTGTGAGTTTAGTATACATGCATTTACTTATAATACAGTTTTT
TAGTTTTGCTGGCCGCATCTTCTCAAATATGCTTCCCAGCCTGCTTTTCTGTAA
CGTTCACCCTGTACCTTAGCATCCCTTCCCTTTGCAAATAGTCCTCTTCCAACA
ATAATAATGTCAGATCCTGTAGAGACCACATCATCCACGGTTCTATACTGTTG
ACCCAATGCGTCTCCCTTGTCATCTAAACCCACACCGGGTGTCATAATCAACC
AATCGTAACCTTCATCTCTTCCACCCATGTCTCTTTGAGCAATAAAGCCGATA
ACAAAATCTTTGTCGCTCTTCGCAATGTCAACAGTACCCTTAGTATATTCTCCA
GTAGATAGGGAGCCCTTGCATGACAATTCTGCTAACATCAAAAGGCCTCTAG
GTTCCTTTGTTACTTCTTCTGCCGCCTGCTTCAAACCGCTAACAATACCTGGCC
CCAGCACACCGTGTGCATTCGTAATGTCTGCCCATTCTGCTATTCTGTATACAC
CCGCAGAGTACTGCAATTTGACTGTATTACCAATGTCAGCAAATTTTCTGTCT
TCGAAGAGTAAAAAATTGTACTTGGCGGATAATGCCTTTAGCGGCTTAACTGT
GCCCTCCATCGAAAAATCAGTCAATATATCCACATGTGTTTTTAGTAAACAAA
TTTTGGGACCTAATGCTTCAACTAACTCCAGTAATTCCTTGGTGGTACGAACA
TCCAATGAAGCACACAAGTTTGTTTGCTTTTCGTGCATGATATTAATAGCTT
GGCAGCAACAGGACTAGGATGAGTAGCAGCACGTTCCTTATATGTAGCTTTC
GACATGATTTATCTTCGTTTCCTGCAGGTTTTTGTTCTGTGCAGTTGGGTTAAG
AATACTGGGCAATTTCATGTTTCTTCAACACTACATATGCGTATATATACCAA
TCTAAGTCTGTGCTCCTTCCTTCGTTCTTCCTTCTGTTCGGAGATTACCGAATC
AAAAAAATTTCAAAGAAACCGAAATCAAAAAAAAGAATAAAAAAAAAATGA
TGAATTGAATTGAAAAGCTGTGGTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTG
ATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCC
CTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCT
CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAG
ACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAA
TGGTTTCTTAGACGTGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCAATTCCACGGACT
ATAGACTATACTAGTATACTCCGTCTACTGTACGATACACTTCCGCTCAGGTC
CTTGTCCTTTAACGAGGCCTTACCACTCTTTTGTTACTCTATTGATCCAGCTCA
GCAAAGGCAGTGTGATCTAAGATTCTATCTTCGCGATGTAGTAAAACTAGCTA
GACCGAGAAAGAGACTAGAAATGCAAAAGGCACTTCTACAATGGCTGCCATC
ATTATTATCCGATGTGACGCTGCAGCTTCTCAATGATATTCGAATACGCTTTG
AGGAGATACAGCCTAATATCCGACAAACTGTTTTACAGATTTACGATCGTACT
TGTTACCCATCATTGAATTTTGAACATCCGAACCTGGGAGTTTTCCCTGAAAC
AGATAGTATATTTGAACCTGTATAATAATATATAGTCTAGCGCTTTACGGAAG
ACAATGTATGTATTTCGGTTCCTGGAGAAACTATTGCATCTATTGCATAGGTA
ATCTTGCACGTCGCATCCCCGGTTCATTTTCTGCGTTTCCATCTTGCACTTCAA
TAGCATATCTTTGTTAACGAAGCATCTGTGCTTCATTTTGTAGAACAAAAATG
CAACGCGAGAGCGCTAATTTTTCAAACAAAGAATCTGAGCTGCATTTTTACAG
AACAGAAATGCAACGCGAAAGCGCTATTTTACCAACGAAGAATCTGTGCTTC
ATTTTTGTAAAACAAAAATGCAACGCGAGAGCGCTAATTTTTCAAACAAAGA
ATCTGAGCTGCATTTTTACAGAACAGAAATGCAACGCGAGAGCGCTATTTTAC
CAACAAAGAATCTATACTTCTTTTTTGTTCTACAAAAATGCATCCCGAGAGCG
CTATTTTTCTAACAAAGCATCTTAGATTACTTTTTTTCTCCTTTGTGCGCTCTAT
AATGCAGTCTCTTGATAACTTTTTGCACTGTAGGTCCGTTAAGGTTAGAAGAA
GGCTACTTTGGTGTCTATTTTCTCTTCCATAAAAAAAGCCTGACTCCACTTCCC
GCGTTTACTGATTACTAGCGAAGCTGCGGGTGCATTTTTTCAAGATAAAGGCA
TCCCCGATTATATTCTATACCGATGTGGATTGCGCATACTTTGTGAACAGAAA
GTGATAGCGTTGATGATTCTTCATTGGTCAGAAAATTATGAACGGTTTCTTCT
ATTTTGTCTCTATATACTACGTATAGGAAATGTTTACATTTTCGTATTGTTTTC
GATTCACTCTATGAATAGTTCTTACTACAATTTTTTTGTCTAAAGAGTAATACT
AGAGATAAACATAAAAAATGTAGAGGTCGAGTTTAGATGCAAGTTCAAGGAG
CGAAAGGTGGATGGGTAGGTTATATAGGGATATAGCACAGAGATATATAGCA
AAGAGATACTTTTGAGCAATGTTTGTGGAAGCGGTATTCGCAATATTTTAGTA
GCTCGTTACAGTCCGGTGCGTTTTTGGTTTTTTGAAAGTGCGTCTTCAGAGCGC
TTTTGGTTTTCAAAAGCGCTCTGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAAC
TTCGGAATAGGAACTTCAAAGCGTTTCCGAAAACGAGCGCTTCCGAAAATGC
AACGCGAGCTGCGCACATACAGCTCACTGTTCACGTCGCACCTATATCTGCGT
GTTGCCTGTATATATATATACATGAGAAGAACGGCATAGTGCGTGTTTATGCT
TAAATGCGTACTTATATGCGTCTATTTATGTAGGATGAAAGGTAGTCTAGTAC
CTCCTGTGATATTATCCCATTCCATGCGGGGTATCGTATGCTTCCTTCAGCACT
ACCCTTTAGCTGTTCTATATGCTGCCACTCCTCAATTGGATTAGTCTCATCCTT
CAATGCTATCATTTCCTTTGATATTGGATCATATGCATAGTACCGAGAAACTA
GTGCGAAGTAGTGATCAGGTATTGCTGTTATCTGATGAGTATACGTTGTCCTG
GCCACGGCAGAAGCACGCTTATCGCTCCAATTTCCCACAACATTAGTCAACTC
CGTTAGGCCCTTCATTGAAAGAAATGAGGTCATCAAATGTCTTCCAATGTGAG
ATTTTGGGCCATTTTTTATAGCAAAGATTGAATAAGGCGCATTTTTCTTCAAA
GCTGCGGCCGCACTCTCACTAGTACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTG
CGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTC
ATGAGACAATAACCGTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTA
TGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCC
TTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGAT
CAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGA
TCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAA
GTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACT
CGCTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCA
CAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGC
CATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGA
GGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGGACAACATGGGGGATCATGTAACTC
GCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCG
TGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACT
GGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGG
CGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTT
ATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGC
ACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGG
AGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCT
CACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAG
ATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTT
GATAATCTCATGACCAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTC
AGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCG
TAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTG
CCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGC
GCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCA
AGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTG
GCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATA
GTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAG
CCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGC
TATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGT
AAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAA
CGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCG
ATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAAC
GCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTC
CTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCT
GATACCGGTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAG
GAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGA
TTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGA
GCGCAACGCAATTAATGTGAGTTACCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTAC
ACTTTATGCTTCCGGCTCCTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTT
CACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCGAAATACGACTCA
CTATAGGGCGAATTGGGTACCGGGCCGGCCGTCGAGCTTGATGGCATCGTGG
TGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCA
AGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGAAAAAAAGCGGTTAGCTCTTCGGT
CCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTAT
GGCAGGAACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCT
GTGACTGGTGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCG
AGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAACACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAA
CTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGG
ATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTG
ATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAA
GGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATAC
TCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCA
TGAGCGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCG
CGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCAT
GACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCAAGAAT
TGGGGATCTACGTATGGTCATTCTTCTTCAGATTCCCTCATGGAGAAGTGCGG
CAGATGTATATGACAGAGTCGCCAGTTTCCAAGAGACTTTATTCAGGCACTTC
CATGATAGGCAAGAGAGAAGACCCAGAGATGTTGTTGTCCTAGTTACACATG
GTATTTATTC CAGAGTATTCCTGATGAAATGGTTTAGATGGACATACGAAGAG
TTTGAATCGTTTACCAATGTTCCTAACGGGAGCGTAATGGTGATGGAACTGGA
CGAATCCATCAATAGATACGTCCTGAGGACCGTGCTACCCAAATGGACTGATT
GTGAGGGAGACCTAACTACATAGTGTTTAAAGATTACGGATATTTAACTTACT
TAGAATAATGCCATTTTTTTGAGTTATAATAATCCTACGTTAGTGTGAGCGGG
ATTTAAACTGTGAGGACCTCAATACATTCAGACACTTCTGACGGTATCACCCT
ACTTATTCCCTTCGAGATTATATCTAGGAACCCATCAGGTTGGTGGAAGATTA
CCCGTTCTAAGACTTTTCAGCTTCCTCTATTGATGTTACACTCGGACACCCCTT
TTCTGGCATCCAGTTTTTAATCTTCAGTGGCATGTGAGATTCTCCGAAATTAAT
TAAAGCAATCACACAATTCTCTCGGATACCACCTCGGTTGAAACTGACAGGTG
GTTTGTTACGCATGCTAATGCAAAGGAGCCTATATACCTTTGGCTCGGCTGCT
GTAACAGGGAATATAAAGGGCAGCATAATTTAGGAGTTTAGTGAACTTGCAA
CATTTACTATTTTCCCTTCTTACGTAAATATTTTTCTTTTTAATTCTAAATCAAT
CTTTTTCAATTTTTTGTTTGTATTCTTTTCTTGCTTAAATCTATAACTACAAAAA
ACACATACAG
红色标志序列表示PHO4基因序列
下划线部分代表引物序列
4、PHO80基因的缺失
-正向引物：
5’-CAGCGTATATTGGCTTTCCTTTAATCTAATGCCCCAAGCCCACATACGATTTAGGTGACAC-3’
-反向引物：
5’-GGAGTTCTCAAGCTCATCTCGAAGTGTTTTCTGTCGCTTATGAATACGACTCACTATAGGGTG-3’
下划线的部分互补于pAG32质粒中的hph(Goldstein and MCCusker，1999，Yeast 15：1541-1553)，其余是缺失的基因互补于PHO80基因(SGD)。以含有可选标记潮霉素B磷酸转移酶(hph)的pAG32质粒(Goldstein and McCusker，1999)为模板。正向引物(FW)与非编码链互补，起始于pAG32质粒中hph起始(ATG)上游483bp处，PHO80基因的上游315bp处。反向引物(BW)与编码链互补，起始于在pAG32质粒hph中止末端下游311bp处，在啤酒酵母(S.cerevisiae)中结束于PHO80基因下游267bp处。
所得PCR产物用于以同源重组方法对PHO80基因进行缺失
CAGCGTATATTGGCTTTCCTTTAATCTAATGCCCCAAGCCCACATACGATTTA
GGTGACACTATAGAACGCGGCCGCCAGCTGAAGCTTCGTACGCTGCAGGTCG
ACGGATCCCCGGGTTAATTAAGGCGCGCCAGATCTGTTTAGCTTGCCTCGTCC
CCGCCGGGTCACCCGGCCAGCGACATGGAGGCCCAGAATACCCTCCTTGACA
GTCTTGACGTGCGCAGCTCAGGGGCATGATGTGACTGTCGCCCGTACATTTAG
CCCATACATCCCCATGTATAATCATTTGCATCCATACATTTTGATGGCCGCAC
GGCGCGAAGCAAAAATTACGGCTCCTCGCTGCAGACCTGCGAGCAGGGAAAC
GCTCCCCTCACAGACGCGTTGAATTGTCCCCACGCCGCGCCCCTGTAGAGAAA
TATAAAAGGTTAGGATTTGCCACTGAGGTTCTTCTTTCATATACTTCCTTTTAA
AATCTTGCTAGGATACAGTTCTCACATCACATCCGAACATAAACAACCATGGG
TAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAAGTTTCTGATCGAAA
AGTTCGACAGCGTCTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAATC
TCGTGCTTTCAGCTTCGATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCTGCGGGTA
AATAGCTGCGCCGATGGTTTCTACAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACTT
TGCATCGGCCGCGCTCCCGATTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGAATTC
AGCGAGAGCCTGACCTATTGCATCTCCCGCCGTGCACAGGGTGTCACGT
TGCAAGACCTGCCTGAAACCGAACTGCCCGCTGTTCTGCAGCCGGTCGC
GGAGGCCATGGATGCGATCGCTGCGGCCGATCTTAGCCAGACGAGCGGG
TTCGGCCCATTCGGACCGCAAGGAATCGGTCAATACACTACATGGCGTG
ATTTCATATGCGCGATTGCTGATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGTG
ATGGACGACACCGTCAGTGCGTCCGTCGCGCAGGCTCTCGATGAGCTGA
TGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCCGAAGTCCGGCACCTCGTGCACGCGGA
TTTCGGCTCCAACAATGTCCTGACGGACAATGGCCGCATAACAGCGGTC
ATTGACTGGAGCGAGGCGATGTTCGGGGATTCCCAATACGAGGTCGCCA
ACATCTTCTTCTGGAGGCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACGCG
CTACTTCGAGCGGAGGCATCCGGAGCTTGCAGGATCGCCGCGGCTCCGG
GCGTATATGCTCCGCATTGGTCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGA
CGGCAATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGCAATC
GTCCGATCCGGAGCCGGGACTGTCGGGCGTACACAAATCGCCCGCAGAA
GCGCGGCCGTCTGGACCGATGGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAGTGG
AAACCGACGCCCCAGCACTCGTCCGAGGGCAAAGGAATAATCAGTACTGA
CAATAAAAAGATTCTTGTTTTCAAGAACTTGTCATTTGTATAGTTTTTTTATAT
TGTAGTTGTTCTATTTTAATCAAATGTTAGCGTGATTTATATTTTTTTTCGCCTC
GACATCATCTGCCCAGATGCGAAGTTAAGTGCGCAGAAAGTAATATCATGCG
TCAATCGTATGTGAATGCTGGTCGCTATACTGCTGTCGATTCGATACTAACGC
CGCCATCCAGTGTCGAAAACGAGCTCGAATTCATCGATGATATCAGATCCACT
AGTGGCCTATGCGGCCGCGGATCTGCCGGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTCA
TAAGCGACAGAAAACACTTCGAGATGAGCTTGAGAACTCC
蓝色标志序列表示hph基因的ORF，下划线表示部分与PHO80基因互补的引物序列。
机译： 糖酵母酿酒酵母酵母菌株具有增强的植酸酶活性
机译： 糖酵母酿酒酵母酵母菌株具有增强的植酸酶活性
机译： 糖酵母酿酒酵母酵母菌株具有增强的植酸酶活性
