显示提高轴突生长活性和神经营养作用的含有荒漠肉苁蓉Y.C.MA提取物的组合物

摘要

本发明涉及一种用于预防和治疗神经退化性大脑疾病的组合物，含有具有神经生长因子(NGF)类似活性的荒漠肉苁蓉Y.C提取物。得自荒漠肉苁蓉的提取物通过促进轴突生长和作为一种NGF，具有有效的神经元细胞保护活性，因此，其可以作为用于治疗和预防神经退化性大脑疾病的治疗或保健食品。

说明书

                       发明背景

技术领域

本发明涉及具有神经生长因子(NGF)类似活性的荒漠肉苁蓉(Cistanche deserticola)Y.C.提取物以及含有能预防和治疗退化性大脑疾病的该提取物的组合物。

背景技术

20世纪，在随着生命科学和医学的快速发展人类平均寿命逐渐延长之时，老年人口比例增长等新的社会问题引人关注，特别地，老年性神经疾病如脑卒中、阿尔茨海默氏病(AD)、帕金森病(PD)等增加，这些疾病是致死性神经系统功能紊乱。

神经系统中神经元细胞的生长、分化和死亡分别是整体发育、组织特异性功能建立和动态平衡维持的重要调控处理。

神经元细胞死亡分为两类，凋亡和坏死：神经元细胞坏死是由损伤引起，损伤由细胞内离子浓度的迅速失衡、胞质和线粒体溶胀(expansion)以及胞质溶解后的核膜细胞溶解导致。神经元细胞坏死是指由突发的物理或化学损伤如局部缺血贫血、体温下降、脑卒中等引起的急性细胞死亡(Tomei等；美国国家科学院汇编，90，853-857，1993)。它不受蛋白抑制剂的影响，在神经系统中发生的代表性例子是由于离子谷氨酸报道活化受损引起。凋亡称作程序性细胞死亡，发生在特征性形态学变化之后，包括膜变化如细胞收缩、膜空泡化和细胞骨架断裂，和核变化如染色质凝聚等(KerrJ.F.，病理学杂志，107(3)，217-219，1972；Arends M.J和Morris R.G，美国病理学杂志，136(30)，593-608，1990)，使细胞形成被膜环绕的小结构凋亡小体，同时失去线粒体的功能。形成的凋亡小体通过相邻细胞或巨噬细胞的吞噬作用被完全除去，不会由胞质成分的分泌导致炎症反应。

多细胞有机体中的所有行为如细胞生长、分化和迁移等是由存在于细胞外的调控因子控制。神经元细胞也需要这种调控因子，包括在CNS(中枢神经系统)和PNS(外周神经系统)中从目标细胞释放的影响神经元细胞生长、分化和存活的所有蛋白。有5种相关因子：NGF(神经生长因子)、BDNF(脑源性神经营养因子)、NT-3(神经营养素-3)、NT-4和NT-5，这些因子之间在繁殖起源、分化和表达表现相互区别，但是其靶向位点与构成氨基酸序列的排列在物种间相似。神经营养因子抑制神经系统中的凋亡。缺乏神经营养因子时发生的凋亡是一种依赖于大多数新蛋白合成和细胞死亡相关基因的细胞死亡。已经十分清楚确定，神经营养因子抑制神经元细胞在神经系统发育中的预定死亡。

具有那些功能的上述神经营养因子(NFs)之一，NGF已经早在20世纪50年代由Levi-Montalcini从蛇的毒液和小鼠肉瘤中提取分离得到，并且已经报道，在上述NF提取物中培养，成倍地促进chic交感神经节神经元轴突生长(Levi-Montalcini R.，Birth DefectsOrig.Artic.Ser.，19(4)，3-22，1983)。

迄今，上述NGF已经被报道促进神经元分化，但是，近来新发现其抑制神经元的退化性死亡，防止神经元大量减少。NGFs的受体存在于传入传感器神经节、大脑和交感神经调控器官中。已经报道，NGFs在交感神经调控器官如心脏中体内生物合成，由神经元末梢吸收，从轴突反向转移到神经元细胞，NGFs促进蛋白质合成(MahalikT.J.，Investig.Dermatol.Symp.Proc.，8月；2(1)，14-18，1997)。

许多报道关于NGF在CNS中防止神经元细胞损伤的保护性功能：例如，海马穹窿的胆碱能轴索显微外科术防止来自下丘脑前脑边缘的胆碱能神经元细胞的胆碱能增加，这使得胆碱能神经元细胞缓慢地退化，并且如果在轴索显微外科术后加入NGF，则胆碱能神经元细胞的退化完全被抑制。如果加入高浓度BDNF，可以从胆碱能轴索显微外科术中得到与NGF相似效果(Hefti F.J.，神经科学，8月；6(8)，2155-2162，1986)。考虑到NGF和外周神经的相关性，尚未完全确定NGF在成熟动物中的作用，但是已经报道，如果注射抗NGF的抗体，发生交感神经节被破坏(breakdown)并且也降低去甲肾上腺素合成酶的活性，如酪氨酸羟化酶和多巴胺β-羟化酶(Levi-Montalcini等，Bull.Soc.Sci.Med.Grand Duche Luxemb.，115(2)，69-74，1978)。

据报道NGF可能在神经元受损后的神经元再生过程中起重要作用，如果将NGF注射到细胞外，存活的NGF敏感细胞的数量增加，神经元对相应器官的调控程度增强，而发育变化削弱(Zettler C.等；大脑研究，538(2)，251-262，1991)。这些结果表明在器官中的NGF调控程度与交感神经元的调控密切相关。

已经报道，大约50％正在发育的神经元在神经系统的正常发育过程中通过凋亡和目标细胞分泌的NF被除去，这决定了神经元的存活(BarresB.A等；发育，118(1)，283-95，1993)。

NFs如NGFs是神经元细胞以正常状态存活、生长和分化必需的。但是，由于这些NGFs分子量大，不能透过BBB(血脑屏障)。因此对于退化性大脑疾病不具有令人满意的治疗作用。应当进一步诱导NGF的合成并且目前特别需要开发与NGF具有相似作用的替代物。

荒漠肉苁蓉Y.C.MA属于列当科(Orobanchaceae)，分布在碱性土壤、干河床和沙地中。它作为滋补剂的中药材，并被报道含有一些酶、脂肪脂质、微量生物碱和结晶中性物质(ChungB.S.和ShinM.K.；HyangyakDaesacheon，Youngrimsa.，888-889，1998)。

有一些报道说明从荒漠肉苁蓉Y.C.MA中分离到了肉苁蓉苷(cistanoside)、肉苁蓉苷F、管花肉苁蓉苷(tubuloside)A、管花肉苁蓉苷B、2’-乙酰基麦角甾苷、海胆苷、3’-α-鼠李吡喃糖苷、异麦角甾苷、麦角甾苷、syringalide A(Wang YM等，药学学报，35(11)，839-842，2000)组分。

然而，在上面所引用的任何一篇文献中都没有报道或披露关于荒漠肉苁蓉Y.C.MA对大脑疾病的治疗作用，上述文献公开的内容在此引入作为参考。

通过一些生化试验研究荒漠肉苁蓉Y.C.MA对神经元的生长和分化的作用，确定粗提取物和非极性溶剂的可溶提取物在抑制退化性大脑疾病的主要原因神经元细胞凋亡中以及在促进NGF诱导中是否起重要作用，本发明人已经深入地进行了一些分子生物学试验并通过细胞系培养进行微观观察，确定粗提取物和非极性溶剂的可溶提取物抑制神经元凋亡、促进NGFs生成并具有神经元细胞保护活性，最终完成了本发明。

从下文提供的本发明的详细公开可知，本发明的这些及其他目的将是显然的。

发明概述

本发明提供一种药物组合物，含有有效量的作为通过保护神经元细胞来治疗和预防退化性大脑疾病的活性成分的荒漠肉苁蓉Y.C.MA粗提取物。

本发明还提供上述提取物在制备通过保护神经元细胞在哺乳动物或人类中治疗和预防退化性大脑疾病的药物组合物的用途。

本发明还提供含有通过保护神经元细胞来预防或缓解退化性大脑疾病的上述提取物的保健食品或食品添加剂。

发明公开

因此，本发明目的在于提供一种含有作为通过保护神经元细胞来治疗和预防退化性大脑疾病的活性成分的荒漠肉苁蓉Y.C.MA的粗提取物、极性溶剂或非极性溶剂可溶提取物的药物组合物。

上述粗提取物包括通过用水，低级醇如甲醇、乙醇，优选甲醇等，或者它们的混合物提取植物原料而制备的提取物。

上述极性溶剂可溶提取物可以通过用极性溶剂提取上述粗提取物来制备，极性溶剂如水，低级醇如甲醇、乙醇，优选丁醇等，或者它们的混合物。

上述非极性溶剂可溶提取物可以通过用非极性溶剂提取上述粗提取物来制备，非极性溶剂如己烷、乙酸乙酯或二氯甲烷、优选乙酸乙酯。

本发明目的在于提供荒漠肉苁蓉Y.C.MA的粗提取物、极性溶剂可溶或非极性溶剂可溶提取物在制备用于通过在人类或哺乳动物中保护神经元细胞治疗和预防退化性大脑疾病的治疗剂的用途。

本发明目的在于提供一种通过在哺乳动物保护神经元细胞治疗或预防退化性大脑疾病的方法，包括给所述哺乳动物应用有效量的荒漠肉苁蓉Y.C.MA的粗提取物、极性溶剂可溶或非极性溶剂可溶提取物及其药学上可接受的载体。

本发明的另一个目的在于提供一种用于通过保护神经元细胞来预防和改善退化性大脑疾病的含有上述提取物以及营养学上可接受的添加剂的保健食品或食品添加剂。

上述退化性大脑疾病包括脑卒中、阿尔茨海默氏病(AD)、帕金森病(PD)、老年性痴呆等。

上述粗提取物可以从任何肉苁蓉属植物如荒漠肉苁蓉、盐生肉苁蓉(C.salsa)、迷肉苁蓉(C.ambigua)中提取。

本发明的药物组合物含有基于组合物总重量的约0.01-50％重量的上述提取物。

本发明的保健食品含有基于组合物总重量的约0.01-80％、优选1-50％重量的上述提取物。

上述保健食品可以被加入到保健食品、保健饮料等中，可以以粉末、颗粒、片剂、咀嚼片、胶囊、饮料等形式使用。

一种分离自荒漠肉苁蓉Y.C.MA的发明提取物可以按照如下优选实施方式制备。

下文详细描述本发明。

一种荒漠肉苁蓉Y.C.MA的发明提取物可以详细地按照如下方法制备，

如下制备荒漠肉苁蓉Y.C.MA的发明粗提取物：干燥、剪切、碾碎荒漠肉苁蓉Y.C.MA，与5-25倍的、优选约10倍体积的蒸馏水，低级醇如甲醇、乙醇、丁醇等或者它们的混合物，优选甲醇相混合；连续地采用通过热水、凉水提取，回流提取或者超声波提取1-5次，优选2-3次的提取方法，用温度范围为20-100℃，优选60-100℃的热水处理该溶液1-24h；过滤残留物获得上清液，在温度范围20-100℃，优选50-70℃下用旋转式蒸发器浓缩，然后通过真空冷冻干燥、热风干燥或喷雾干燥来获得干燥的荒漠肉苁蓉Y.C.MA粗提取物粉末，这种粉末可溶解于水、低级醇或者它们的混合物。

另外，可通过如下方法制备本发明的极性溶剂可溶和非极性溶剂可溶提取物；将通过上述方法制备的粗提取物悬浮在水中，然后与1-100倍、优选1-5倍体积的非极性溶剂如乙酸乙酯、氯仿、己烷等相混合；收集非极性溶剂可溶层获得本发明的非极性溶剂可溶提取物，收集残留的极性溶剂可溶层来获得本发明的极性溶剂可溶提取物，其在水、低级醇或它们的混合物是可溶的。还可以修改上述方法或者通过本领域熟知的传统方法如在文献中公开的方法(HarboneJ.B.植物化学方法：现代植物分析方法指南，第3版，6-7，1998)经过其他步骤来过滤或分离更有效的馏分或化合物。

通过一些生化试验研究荒漠肉苁蓉Y.C.MA对神经元生长和分化的作用，以及通过细胞系培养进行微观观察确定粗提取物和非极性可溶提取物在抑制退化性大脑疾病的主要原因神经元细胞凋亡中以及在促进NGF诱导中是否起重要作用，因而确定粗提取物、极性溶剂可溶和非极性溶剂可溶提取物抑制神经元凋亡、促进NFs生成并具有神经元细胞保护活性。

按照本发明的另一方面，提供一种含有通过保护神经元细胞来治疗和预防退化性大脑疾病的由上述方法制备的荒漠肉苁蓉Y.C.MA的粗提取物、极性溶剂可溶或非极性溶剂可溶提取物作为活性成分的药物组合物。

本发明的另一方面提供一种包括给包括人的哺乳动物的退化性大脑应用含有由上述方法制备的所述提取物的药物组合物的治疗方法和预防方法。

通过保护神经元细胞来治疗和预防退化性大脑疾病的发明组合物可以含有基于组合物总重量的0.01-50％重量的上述提取物。

该发明组合物还可以含有依照本领域熟知应用方法的常规载体、佐剂或稀释剂。按照使用和应用方法，优选地所述载体用作适合的物质，但不限于此。适合的稀释剂列于雷明顿药学科学的书面文本(written text)中(Mack出版公司，Easton PA)。

在下文中，下列配制方法和赋形剂仅用于说明，无论如何不是限定发明。

本发明的组合物可以以一种药物组合物被提供，其含有药学上可接受的载体、佐剂或稀释剂，如乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藻糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、藻酸盐、白明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟甲基苯甲酸酯、羟丙基苯甲酸酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。配方中还可以包括填充物、抗凝剂、润滑剂、润湿剂、调味剂、乳化剂、防腐剂等。可以配制本发明的组合物，使之在通过本领域熟知的任何方法应用于患者之后，快速、持续或延迟地释放活性成分。

例如本发明的组合物可以溶解在油、丙二醇或其他常用于制备注射剂的溶剂中。合适的载体包括但不限于生理盐水、聚乙二醇、乙醇、植物油、异丙豆蔻酸盐等。用于体表应用时，本发明的提取物可以配制成药膏和面霜形式。

含有该组合物的药物配方可以被制备成任何形式，例如口服药剂形式(粉末、片剂、胶囊、软胶囊、药水、糖浆、药丸、粉末、香粉(sachet)、颗粒)，或者体表制剂(面霜、药膏、洗液、凝胶、膜片、膏、喷雾溶液、气雾剂等)，或注射剂(溶液、悬浮液、乳液)。

药物制剂形式的本发明的组合物可以以其药学上可接受盐的形式被使用，也可以单独或者以合适的联合方式以及与其他药学活性化合物结合使用。

发明提取物或组合物的合适剂量根据对象病理状态和体重、严重性、药物形式、应用途径和时期而变化，可以由本领域技术人员选定。但是，为了获得期望效果，通常推荐发明提取物或组合物的应用量范围在10g/kg，优选1-3g/kg体重/天。每天一次或分成多次地应用该剂量。至于组合物，应当含有基于该组合物总重量的0.01-50％重量、优选0.5-40％重量的发明提取物。

本发明的药物组合物可以通过各种途径应用于对象动物如哺乳动物(大鼠、小鼠、家畜或人)。可以考虑所有的使用方式，如可以通过口、直肠应用或通过静脉、肌肉、皮下、皮内、膜内、硬膜外或者脑室内(intracerebroventricular)注射。

此外，本发明提供用于通过保护神经元细胞预防和改善退化性大脑疾病的保健食品饮料组合物，加入0.01-80％重量的上述提取物、0.001-5％重量的氨基酸、0.001-2％重量的维生素、0.001-20％重量的糖、0.001-10％重量的有机酸、适当重量的甜味剂和调味剂。

上述荒漠肉苁蓉Y.C.MA提取物可以被加到用于通过保护神经元细胞来预防和改善退化性大脑疾病的食品和饮料中。

为了开发保健食品，含有上述本发明提取物的可添加食品的例子为各种食品、饮料、口香糖、维生素复合物、改善健康的食品等，可以作为粉末、颗粒、片剂、咀嚼片、胶囊或饮料等使用。

此外，本发明的提取物将可以通过加入到婴幼儿食品中，如改进的奶粉、改进的生长期奶粉、改进的生长期食品，用于预防和改善过敏性疾病或者非过敏性炎症疾病。

上述组合物可以被加入到食品、添加剂或饮料中，其中上述提取物在食品或饮料中的含量一般在保健食品组合物中为食品总重量的约0.1-80w/w％，优选1-50w/w％，和在100ml保健饮料组合物中比例为1-30g，优选3-10g。

只要本发明的保健饮料组合物含有确定比例的上述提取物作为主要成分，对其他液体成分没有特别限制，其中其他成分可以是各种除臭剂或天然碳水化合物等如常规饮料。前述天然碳水化合物是单糖如葡萄糖、果糖等；二糖如麦芽糖、蔗糖等；普通糖如糊精、环式糊精等；和糖醇如木糖醇和赤藻糖醇等。作为除了前述之外的其它除臭剂，天然除臭剂如taumatin、stevia提取物如levaudioside A、甘草皂甙等，以及合成的除臭剂如糖精、冬氨酰苯丙氨酸甲酯等都是适用的。上述天然碳水化合物的含量一般范围在100ml该饮料组合物中占约1-20g，优选5-12g。

除了前述成分之外的其他成分为各种营养物、维生素、矿物质或电解质、合成调味剂、当为奶油巧克力等时的着色剂和改良剂、果胶酸及其盐、褐藻酸及其盐、有机酸、保护胶体的粘合剂、pH调控剂、稳定剂、防腐剂、甘油、乙醇、用在碳酸饮料等中的碳化剂。除了前述的其他成分可以是用以制备天然果汁的果汁、果汁饮料和蔬菜饮料，其中该成分可以单独或者结合使用。这些成分的比例不是非常重要，但是一般范围在每100w/w％该组合物中为约0-20％ w/w％。其中含有前述提取物的可添加食品的例子是各种食品、饮料、口香糖、维生素复合物、健康改善的食品等。

发明组合物还可以含有一种或一种以上有机酸，如柠檬酸、富马酸、己二酸、乳酸、苹果酸；磷酸盐，如磷酸盐、磷酸钠、磷酸钾、酸性焦磷酸盐、多磷酸盐；天然抗氧化剂，如多酚、儿茶酚、α-生育酚、迷迭香提取物、维生素C、绿茶提取物、甘草根提取物、脱乙酰壳多糖、丹宁酸、植酸等。

上述荒漠肉苁蓉Y.C.MA的提取物是20-90％高度浓缩的液体、粉末或颗粒形式。

类似地，上述荒漠肉苁蓉Y.C.MA的提取物还可以含有乳糖、酪蛋白、右旋糖、葡萄糖、蔗糖和山梨醇中的一种或一种以上。

因而本发明的发明提取物没有毒性和副作用；可以被安全地使用。

在不背离发明的精神和范围时可以对本发明的组合物、用途和制备进行各种修改和变化，这对本领域技术人员来说是显然的。

附图描述

从后面详细描述结合相应的附图，将更加清楚理解本发明的上述和其他的目的、特点和优点，其中：

附图1表示在放大倍数为×200显微镜中的发明提取物或NGF处理的PC12细胞系轴突生长的照片；

附图2表示用发明提取物或NGF处理的轴突生长的效果；

附图3表示在放大倍数为×200显微镜中的用不同浓度NGF处理的轴突生长；

附图4描述NGF对轴突生长的作用；

附图5表示通过LDH和MTT分析所观察到的用10μg/ml乙酸乙酯可溶提取物处理的细胞的细胞发育力；

附图6显示用10μg/ml乙酸乙酯可溶提取物处理的细胞的DNA断裂。

附图7a是50ng/ml的NGF处理的细胞的图片；附图7b是50ng/ml的NGF处理和去除的细胞的图片；附图7c是10μg/ml乙酸乙酯可溶性提取物处理和去除的细胞的图片；附图7d是无血清和10μg/ml乙酸乙酯可溶提取物处理的细胞的图片；

附图8a描述通过电泳观察NGF基因表达；附图8b描述表示表达水平的图形；

附图9表示免疫细胞化学分析PC12细胞中的NGF报道表达；

附图10表示当应用给东莨菪碱诱导的失忆小鼠时，本发明的乙酸乙酯提取物对被动识别的作用。

优选实施方式

在不背离发明的精神和范围时，对本发明的组合物、用途和制备进行各种修改和变化对本领域技术人员来说是显然的。

通过以下实施例具体解释本发明，然而，可以理解本发明不以任何方式局限于这些实施例。

实施例

下面的参考实施例、实施例和试验实施例在于进一步说明本发明，而不是限制发明的保护范围。

实施例1.制备荒漠肉苁蓉的粗提取物

将购自汉城的Kyung-dong市场的1kg干燥荒漠肉苁蓉剪切成小碎片，与1.5L 85％的甲醇(水∶甲醇＝15∶85)混合，该混合物在室温下静置1天。

混合物经过超声波(Branson公司，美国)提取1h两次，用滤纸过滤提取物来去除残余物。

收集滤液并用旋转蒸发器(N-1000，Eyela公司，日本)在55-65℃、低压下进行浓缩，用冷冻干燥机(Speed Spec 3000，Bio-Rad公司，美国)干燥得到455g干燥的粗提取物。干燥粉末溶解在蒸馏水中(100mg/ml)。

实施例2.制备极性溶剂和非极性溶剂可溶提取物

通过如下方法分馏在实施例1中制备的干燥提取物。

2-1.制备乙酸乙酯可溶馏分

将300ml蒸馏水加到455g在实施例1中得到的粗提取物中。往分液漏斗中加入3000ml氯仿，猛烈摇晃以分成乙酸乙酯可溶层和水溶层。

将上述的水溶层与等量乙酸乙酯相混合，然后分成乙酸乙酯可溶层和水溶层。重复该分馏处理4-5次。

上述乙酸乙酯可溶层通过旋转蒸发器浓缩，用冷冻干燥机干燥来获得8.2g乙酸乙酯可溶提取物。

2-2.制备丁醇/水可溶馏分

通过与丁醇混合来分馏水溶层，最终获得11.83g丁醇可溶提取物和26g水溶性提取物，作为后面试验的样本。

参考实施例1.制备样本

将在实施例1和2中制备的粗提取物和乙酸乙酯可溶提取物分别以1.0mg/ml的浓度悬浮在PBS(pH7.2)中，各个悬浮液用0.2μm微膜滤器(Millipore有限公司)过滤除菌。如果样本没有完全溶解，将样本以＞0.1％的终浓度悬浮在DMSO(Sigma有限公司)中，并如上所述方式过滤灭菌。

参考实施例2.细胞培养

在37℃、5％CO₂和95％空气的湿润培养箱中，3×10⁴个PC12细胞生长在直径100mm培养皿(TPP有限公司，瑞士)的DMEM中(Gibco BRL有限公司，美国)，其中添加了2.0g/l碳酸氢钠(NaHCO₃)、5％马血清、10％的使用前在55℃下灭活30min的胎牛血清和1％青霉素-链霉素(1000U/ml)。

使用的培养基每周用10ml新鲜DMSO更换4次，细胞每周亚培养(subcultured)3-4次。

参考实施例3.处理样本

用500μl胰岛素-EDTA(Gibco BRL有限公司，美国)处理10mm培养皿中的细胞(1×10⁷细胞/孔)来使细胞与培养皿分离，往其中加入10ml新鲜培养液来中和胰岛素-EDTA溶液，得到细胞悬浮液。

将稀释在磷酸缓冲液盐中的0.4％台盼蓝加到20μl细胞悬浮液中进行细胞计数，通过细胞计数器计算活细胞的数量。

用PBS缓冲液稀释细胞粘附酶，50μg/ml的多聚赖氨酸(Sigma化学公司，路易斯大街，密苏里州，美国)，以2ml等分到6孔细胞培养板中，在37℃下温育1h，用PBS(pH7.2)洗涤。干燥6孔板并用于后面的试验。

将通过上述方法制备的细胞(1×10⁵细胞/孔)植到6孔板上并培养24h。用实施例1的荒漠肉苁蓉粗提取物(10μg/ml)或NGF(50ng/ml)处理细胞，并在37℃、5％CO₂和95％空气的湿润培养箱中培养6天，每两天更换培养液一次。

试验实施例1.荒漠肉苁蓉的粗提取物的生理活性

为了评估荒漠肉苁蓉粗提取物的生理活性，用10μg/ml实施例1和2的发明提取物处理PC12细胞(韩国细胞系库(Korea Cell LineBank)，汉城国立医学院癌症研究学会(the Cancer Research Instituteof the Seoul National University College of Medicine))。

用各种浓度的NGF处理细胞以确定最有效的NGF浓度，从而用选定的NGF作为对照来验证轴突的生长。

2天之后轴突开始形成，在第6天发生轴突生长分化成神经丝。而且实施例2中制备的乙酸乙酯可溶提取物对轴突生长的作用最大(附图1a，附图1b，附图1c，附图1d和附图2)。

试验实施例2.荒漠肉苁蓉馏分对轴突生长的作用

用10μg/ml各种提取物处理PC12细胞24h。在培养24h后，将培养液换成含有50ng/ml NGF、1％FBS和2％HS的新鲜培养液。每天等间隔地用反相显微镜(型号CK-25，奥林巴斯公司，美国)观察神经细胞体的轴突并拍照。在照片上测量轴突长度。

当未见到轴突时，轴突伸展记作0，当轴突长度等于1个细胞体部直径时，记作1，当轴突长度比细胞体部直径长两倍时，记作2，当轴突长度超过细胞体部直径3倍时，记作3(附图1a，附图1b，附图1c，附图1d和附图2)。在对照组中，用50ng/ml NGF进行处理。所有数据都表示为平均数±标准方差。通过t-检验确定统计学显著性的评价(**p＜0.01，附图2和表2)。

发明荒漠肉苁蓉提取物对轴突生长具有最佳作用(*p＜0.01)。

表2

样本轴突比例(％对照)对照100％NGF133±0.21％荒漠肉苁蓉粗提取物132±0.27％

试验实施例3.荒漠肉苁蓉提取物的LDH释放检测

研究发明提取物的LDH(乳酸脱氢酶)抑制作用来确定由其导致的凋亡程度。

为了确定在无NGF条件下释放到溶液中的LDH，用实施例2的乙酸乙酯可溶提取物处理PC12细胞。

作为试验组，还用10μg/ml实施例2的乙酸乙酯可溶提取物处理PC12细胞6天，用新鲜培养液额外培养24h，将30μl培养液转移到96孔板中。

为了进行LDH释放分析(Kim等，神经科学研究杂志，53，426-432，1998)，96孔板中的溶液和30μl的1mg/ml NADH(溶解在0.75mM丙酮酸钠中)在37℃下培养30min，接着加入着色剂，混合物在37℃下再培养20min。往反应混合液中加入0.4N氢氧化钠来结束反应后，在405nm下测定上述溶液的UV吸收值。

如附图5所示，由于凋亡，去除乙酸乙酯可溶提取物组的LDH水平下降。

试验实施例4.MMT检测

通过3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5联苯四唑溴化物(MTT)分析方法确定荒漠肉苁蓉提取物的凋亡作用。

在无NGF条件下将PC12细胞(2×10⁴细胞/孔)植入96孔板中，培养24h后用10μg/ml荒漠肉苁蓉的乙酸乙酯可溶提取物再处理细胞48h。两天后弃去培养液，将150μl MTT溶液(以0.05mg/ml悬浮在溶液中，Sigma公司)加入到细胞中并在37℃下反应。4h后除去MTT并往各个孔中滴加150μl DMSO来溶解结晶)。在570nm下通过微板读出器(microplate reader)(ELISA读出器，Molecular devices公司，美国)测定UV吸收值来计算细胞活性。

如附图5所示，结果说明在荒漠肉苁蓉提取物处理组中细胞发育力下降，凋亡显著增加。

试验实施例5.荒漠肉苁蓉提取物的凋亡检测

为了检测当去除发明乙酸乙酯可溶提取物时是否发生凋亡，进行DNA断裂检测。

PC12细胞(2.5-5×10⁶细胞/孔)在直径100mm培养皿的DMEM培养液中生长24h，吸走培养液并用PBS洗涤细胞。往其中加入含有样本的新鲜培养液并在37℃、5％CO₂和95％空气的湿润培养箱中培养6天。每两天培养液用含有发明提取物的新鲜DMEM培养液更换一次。

通过加入0.25％胰岛素-EDTA来收获细胞，以1000rpm速度离心5min去除其上清液。用1.5ml eppendorf管将细胞沉淀物悬浮在溶解溶液中(5mmol/l Tris-HCl(pH7.4)，5mmol/l EDTA，0.5％TritonX-100)，15min后以1200rpm离心该混合物20min。将生成的上清液转移到新管中，用1.0μl RNA酶混合并在37℃下培养1h。培养后，往其中加入1μl蛋白酶和SDS(终浓度为1％)，反应混合物在50℃下再培养2h。混合物经过苯酚-氯仿提取。将与上述混合物等量的苯酚-氯仿溶剂混合液加入管中，摇晃15秒并以1200rpm离心10min。新管中的上清液与1/10体积的3M醋酸钠和2体积无水乙醇混合，在室温下温育30min，接着在4℃温度下以1200rpm离心10min。在那时，弃去上清液，充分干燥沉淀并将悬浮在20μl TAE缓冲液中。

为了研究以上纯化的DNA片段，用琼脂糖(GibcoBRL公司，美国)凝胶和1×TAE缓冲液进行电泳。

等分与染色溶液混合的10μl纯化DNA，加载到琼脂糖凝胶中，在100伏下电泳40min。用Gel-DOC(型号Gel DOC 2000，Bio-Rad，美国)测定DNA断裂。

在附图6a的结果中，泳道1是50ng/μl NGF处理组，泳道2是10μg/ml荒漠肉苁蓉粗提取物处理组，泳道3是10μg/ml荒漠肉苁蓉乙酸乙酯可溶提取物处理组，泳道4是无FBS组。在用发明粗提取物和乙酸乙酯可溶提取物处理后去除的细胞中检测到DNA断裂，这意味着细胞发生凋亡。

附图6b表示在去除血清导致凋亡后，从发明提取物处理的细胞中分离的断裂DNA。泳道1是50ng/μl NGF处理组，泳道2是10μg/ml粗提取物处理组，泳道3是10μg/ml乙酸乙酯可溶提取物处理组，泳道4是FBS处理组。当粗提取物和乙酸乙酯可溶提取物用于处理细胞时，不发生DNA断裂。

在去除血清后用发明提取物进行处理，细胞DNA不会断裂，因而确定发明提取物抑制细胞的凋亡。

试验实施例6.采用荧光测定荒漠肉苁蓉对细胞凋亡的作用

在本试验中进行FACS分析，测定荒漠肉苁蓉对细胞凋亡的作用。

PC12细胞在全培养液中生长24h。24h后，将培养液更换成去除血清的含有2％马血清和1％FBS的培养液，并且往其中加入NGF或者实施例2制备的乙酸乙酯可溶提取物。再经过24h培养。以200×g离心细胞悬液5min，弃去上清液。细胞沉淀悬浮在100μl联膜蛋白V-FITC溶液中，在室温下避光温育5min，联膜蛋白V-FITC溶解在含有10mMHEPES(pH7.4)、150mM氯化钠、5mM氯化钾、1mM氯化镁和1.8mM氯化钙的缓冲液中。此时将100μl HEPES缓冲液滴加到FACS微型试管中，往其中加入20μl碘化丙锭(PI，100μl溶解于HEPES缓冲液中)。

PI是一种荧光染料，如果发生凋亡，它可结合到细胞的DNA上，测定各个细胞的被结合的DNA量。

最后，进行FACS分析来量化凋亡诱导的程度。

如果存在许多活细胞，代表活细胞的点位于图形的左下角。代表凋亡细胞的点位于图形的右下角。代表死亡细胞的点位于图形的右上角。当发生凋亡时，点移到生成的图形的左下角。

当从培养液中去除乙酸乙酯可溶提取物时，代表细胞的点逐渐移到图形的右下角，意味着凋亡发生。

当去除乙酸乙酯可溶提取物或NGF后4h，细胞开始程序性死亡，12h后凋亡细胞的数量最多(附图7a、附图7b、附图7c、附图7d)。

试验实施例7.NGF的基因表达

7-1.用RT-PCT方法分析基因表达

用Trizol B试剂(GibcoBRL公司)提取细胞总RNA。用细胞刮棒收集通过加入1ml Trizol B所溶解的细胞。将细胞悬液转移到1.5ml的微型试管中，用带有21G针头的注射器吹打数次。在4℃下以12,000rpm离心细胞溶解产物10min。将上清液与氯仿混合，猛烈摇晃混合物，接着在室温下温育15min。在4℃下再次以12,000rpm离心混合物15min。将含有RNA的上清液转移到新的微型试管中，并通过反复颠倒与100％异丙醇混合。样本在室温下温育，并在4℃下以12,000rpm离心15min。去除上清液得到RNA沉淀，用1.0ml 75％乙醇洗涤，并在4℃下以12,000rpm离心15min。在室温下完全干燥沉淀后，将沉淀再悬浮在DEPC(焦碳酸二乙酯)处理的水中，用分光光度计(Bio-Rad，美国)在260nm和240nm下测定UV吸收值。

通过反转录合成互补DNA(cDNA)和用Taq聚合酶(Takara公司，日本)进行聚合酶联反应。

在65℃下热处理1μg上述制备的RNA 15min来分离RNA链。将反应试剂(4μl的5×反应缓冲液、1μl的10mM dNTP混合液、1μl的20μM寡(dT)₁₅引物、0.2μl的M-MLV反转录酶(200U/μl)、2μl的0.1M二硫苏糖醇、加DEPC处理的水到20μl)加到RNA样本中，在37℃下温育60min，接着在72℃下再温育15min来合成互补DNA。

进行聚合酶联反应，将1μl的上述制备的cDNA与反应液(2μl的10×反应缓冲液、2μl的2.5mM dNTP混合液、0.2μl的Taq聚合酶(5U/μl)、1μl的10μM有义引物、1μl的10μM反义引物、加DEPC处理的水到25μl)混合，按以下在表3中描述的条件用热循环仪(Perkin Elmer公司)进行30个循环。

表3

  步骤  温度  时间  循环  预变性  95℃  3min  1  变性  95℃  30sec  30  退火  62℃  30sec  延伸  72℃  1min  终延伸  72℃  7min  1

将10μl的RT-PCR产物加到1.5％琼脂糖(Gibco BRL公司，美国)凝胶中并在1×TAE缓冲液中用100伏对其进行电泳分析30min。琼脂糖凝胶在溴化乙啶中染色20min，在蒸馏水中脱色10min。在UV光箱中观察凝胶的DNA条带，然后用Gel-DOC(Bio-Rad公司)给凝胶拍照(附图8a)，表示电泳的检测结果。

用250bp的GAPDH作为比较各组NGF基因表达的标准，这些组为未处理组、50ng/mlNGF处理组、10μg/ml粗提取物处理组和10μg/ml乙酸乙酯可溶提取物处理组。

如附图8a和8b所示，可以确定该发明提取物提高NGF受体的表达。

7-2.用免疫细胞化学方法分析基因表达

在这个试验中，采用免疫细胞化学方法来证实发明提取物对作为NGF受体的p75受体表达的作用。

PC12细胞在玻璃盖玻片上(22mm×22mm)的全培养液中生长。24h后，培养的细胞分别用10μg/ml乙酸乙酯可溶提取物或10ng/ml NGF处理。再过48h，室温下细胞用溶解在磷酸缓冲液(pH7.4)中的多聚甲醛固定30min，然后用PBS洗涤。将含有2％BSA和0.1％Triton X-100的溶液滴加到细胞上，盖玻片在冰上放置30min避免非特异性反应并提高细胞膜的通透性。细胞用PBS和1％BSA混合液漂洗10min3次，往其中加入第一抗体抗-p75(1∶2000稀释，Chemicon International公司)并温育1h。

接着，细胞用PBS和1％BSA混合液漂洗10min3次，并往其中加入德克萨斯红缀合第二抗体抗小鼠IgG(1∶5000稀释，WithLab公司)再温育1h。

用荧光显微镜观察受体表达结果。

与对照组相比，在NGF处理组和发明乙酸乙酯可溶提取物处理组中，p75受体的表达增加(附图9a、附图9b、附图9c)。

已经确定，发明提取物使NGF合成增加，导致受体表达增多，因此可以断定发明提取物引起PC12细胞生长和分化。而且，可以预料乙酸乙酯可溶提物与受体直接作用刺激NGF基因的表达。

试验实施例8.被动屏蔽(passive avoidance)测试

进行被动屏蔽测试时，在东莨菪碱诱导失忆之前，将乙酸乙酯可溶提取物应用于小鼠。

用具有梭箱的自动化系统来评价提取物对与神经元细胞生长相关的学习和记忆的作用。

屏蔽梭箱(40×20×20cm，Gemini公司，美国)分成大小相同的两个小室，并且箱底为间距0.5cm的3mm厚的格网。亮室装有照明装置。最初将重25-30g的雄性小鼠放在亮室中。

给小鼠腹膜注射东莨菪碱。30min后，进行习得训练(acquisitiontraining)，当喜好黑暗的小鼠走出亮室进入暗室时，通过网格底板给小鼠施加足部电刺激(1mA/10g体重)。

习得训练后24h，对小鼠进行相同试验来测定停留在亮室中的等待时间。该数据作为表示对先前电刺激训练的记忆的指标。进入暗室的等待时间确定(measure)为180sec。如果小鼠在截止时间(cut off time)(180sec)内没有进入暗室，那么将数值180sec作为其等待时间。

如附图10所示，东莨菪碱诱导失忆小鼠的等待时间最短。乙酸乙酯可溶提取物处理的小鼠的等待时间增加。

这些结果表明发明提取物通过增加NGF表达；提高记忆和识别能力并提高被动识别功能。

证明了发明的荒漠肉苁蓉提取物可以用作为有效的防失忆的药物。

试验实施例9.毒性试验

方法(1)

用实施例1的提取物对ICE小鼠(平均体重25±5g)和Sprague-Dawley大鼠(235±10g，Jung-ang实验动物有限公司)进行急性毒性试验。给四个由10小鼠或大鼠组成的小组分别口服腹膜应用250mg/kg、1000mg/kg和5000mg/kg试验样本或溶剂(0.2ml，i.p.)并观察两周。

方法(2)

用实施例1的提取物对ICE小鼠和Sprague-Dawley大鼠进行急性毒性试验。给四个由10小鼠或大鼠组成的小组分别腹膜应用250mg/kg、1000mg/kg和5000mg/kg试验样本或溶剂(0.2ml，i.p.)并观察24h。

结果

在任何小组间以及性别间都没有与处理相关的对死亡、临床指征、体重变化和和总体观察(gross findings)的影响。这些结果表明在本发明中制备的提取物是有效和安全的。

下文将描述药剂的配制方法和种类，但是本发明不仅限于此。代表性的制备实施例描述如下。

粉剂制备

实施例2-1的干燥粉末                 50mg

乳糖                                100mg

滑石粉                              10mg

通过混合上述成分并填装到密封包装中来制备粉剂。

片剂制备

实施例2-1的干燥粉末                 50mg

玉米淀粉                            100mg

乳糖                                100mg

硬脂酸镁                            2mg

通过混合上述成分并制片来制备片剂。

胶囊制备

实施例2-1的干燥粉末                  50mg

玉米淀粉                             100mg

乳糖                                 100mg

硬脂酸镁                             2mg

通过常规制备明胶方法混合上述成分并填装到明胶胶囊中来制备片剂。

注射剂制备

实施例2-1的干燥粉末                  50mg

注射用蒸馏水                         最佳量

pH调节剂                             最佳量

通过常规制备注射剂的方法溶解活性成分，调节pH为约7.5，然后将所有成分装入2ml安瓿(ample)并灭菌来制备注射剂。

液体制备

实施例1的干燥粉末                    0.1-80g

糖                                   5-10g

柠檬酸                               0.05-0.3％

焦糖                                 0.005-0.02％

维生素C                              0.1-1％

蒸馏水                               79-94％

CO₂气体                             0.5-0.82％

通过常规制备液体的方法溶解活性成分，分装所有成分并灭菌来制备液体。

保健食品制备

实施例1的提取物                      1000mg

维生素混合物                         最佳量

维生素A醋酸盐                        70μg

维生素E                              1.0mg

维生素B₁                            0.13mg

维生素B₂                            0.15mg

维生素B6                             0.5mg

维生素B12                    0.2μg

维生素C                      10mg

生物素                       10μg

氨基尼克酸                   1.7mg

叶酸                         50μg

泛酸钙                       0.5mg

矿物质混合物                 最佳量

硫酸亚铁                     1.75mg

氧化锌                       0.82mg

碳酸镁                       25.3mg

磷酸二氢钾                   15mg

磷酸二钙                     55mg

柠檬酸钾                     90mg

碳酸钙                       100mg

氯化镁                       24.8mg

上述维生素和矿物质混合物可以多种方式变化。这些变化不被视为偏离了本发明的精神和范围。

保健饮料的制备

实施例1的提取物              1000mg

柠檬酸                       1000mg

寡糖                         100g

杏子浓缩物                   2g

牛磺酸                       1g

蒸馏水                       900ml

通过常规的保健饮料制备方法，溶解活性成分，混合，在85℃下搅拌1h，过滤，然后将所有成分装入1000ml安瓿并灭菌来制备保健饮料。

如此描述本发明，显然可以以多种方式变化本发明。这些变化不应视为偏离了本发明的精神和范围，并且所有对本领域技术人员来说是显然的这类修改被确定是包含在下列权利要求的范围内。

工业实用性

如本发明所述，分离自荒漠肉苁蓉的提取物通过促进轴突生长和作为一种神经生长因子具有有效的神经元细胞保护活性，因此，它可以用作治疗和预防神经退化性大脑疾病的治疗或保健食品。