作为局部杀微生物药和避孕药的苏拉明及其衍生物

摘要

本发明涉及通过向实际或潜在感染部位局部施用苏拉明或其衍生物抑制性传播疾病的方法，以及通过阴道内局部施用苏拉明或其衍生物防止怀孕的方法。也提供了含有抗微生物剂和/或精子功能抑制剂的苏拉明组合物，并且可以有利地用于本发明的方法中。也提供了一种同时抑制性传播疾病和防止怀孕的方法。进一步公开了用该局部用药苏拉明组合物浸渍或包被的装置，可以用来施用此处所述的组合物。

说明书

相关申请的交叉引用

本发明要求2002年3月26日提交的美国临时申请系列号60/367,273的权益，在此全文引用作为参考。

关于联邦资助的研究或发展的声明

本发明部分由避孕剂研究与发展(CONRAD)计划资助(基金号HRN-A-00-98-00020-00)，该计划是美国国际发展局(USAID)与东弗吉尼亚医学院(EVMS)的一项合作协议。政府对本发明有一定的权利。

发明背景

本发明主要涉及局部制剂中的苏拉明及其衍生物，及其作为杀微生物避孕药预防性传播疾病(STD)和怀孕的用途。本发明发现，苏拉明及其衍生物显示对抗STD病原体的强活性，并且显示抗精子活性，单独或与其它精子功能抑制剂(包括杀精子剂)和/或其它微生物剂(包括抗病毒剂)联合使用，它们构成有效的阴道避孕杀微生物药。

STD的越来越普及是一个影响发达国家和欠发达国家的严重的公共卫生问题。在欠发达国家中，获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的流行对人类的生命造成破坏性损害。贫穷、人口过多和文化习俗使避孕套无法普及，受其限制，这些国家的人免疫缺陷病毒(HIV)感染的人口显著增多，有时达到生育年龄人口的三分之一。因此迫切需要发展可有效对抗性传播病原体(特别是HIV)和怀孕的安全、预防性、女性控制的药物。

壬苯醇醚-9(N-9)是一种非离子型表面活性剂，是当前美国市场上唯一获得FDA批准的杀精子药。其它表面活性剂，如苯扎氯铵，在加拿大和欧洲可以作为杀精子制剂的一部分。由于它们对脂类的作用，这些表面活性剂在体外显示抗-HIV活性，破坏病毒包膜，灭活病毒。可惜，对于N-9已经清楚地证实，这些表面活性剂单独在体内似乎不引起明显的保护作用。使用N-9的几次临床试验显示HIV感染的发病率没有减少(Rowe，Lancet.，349：1074 1997；Hira等人，Int J.STD AIDS.，8(4)243-50 1997；Martin等人，Sex.Transm.Dis.，24(5)：279-283，1997；Roddy等人，N.Engl.J.Med.，339(8)：504-10 1998；Van Damme等人，Lancet.，360(9338)：971-72002)。实际上已经证实，N-9实际上增加了生殖器炎症(Stafford等人，J.Acquir Immune DeficSyndr.Hum.Retrovirol.17(4)：327-31 1998)、泌尿道感染(Fihn等人，Am.J.Epidemiol.，144(5)：512-20 1996)、外阴阴道念珠菌病(Geiger和Foxman，Epidemiology.7(2)：182-7 1996)和生殖器溃疡(Feldblum，Genitourin Med.72(6)：451-2 1996)的危险。最近的一项研究(Fichorova等人，J.Infect.Dis.184(4)：418-28 2001)显示N-9对阴道上皮有细胞毒性，并且诱发促炎细胞因子的释放，后者又补充作为HIV靶标的免疫细胞，从而有利于组织侵入。

由于这些原因，仍然需要研制一种局部制剂，该制剂对粘膜和粘膜微生物区系无害，有效对抗HIV和其它STD病原体，如单纯疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒(CMV)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoeae)(NG)和沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)(CT)，同时提供避孕保护。

发明概述

现发现包含苏拉明或其衍生物的组合物可有效作为避孕药，并有效抑制性传播疾病的传播。因此，本发明提供了抑制性传播疾病传播的方法和避孕方法。在此也提供包含苏拉明或其衍生物的组合物，以及用这些组合物包被或浸渍的装置。

本发明的第一方面提供抑制性传播疾病传播的方法。在本发明的一种形式中，该方法包括局部(优选阴道)施用苏拉明或其衍生物。在本发明的某些形式中，苏拉明可以在一种组合物中与一种或多种抗微生物剂共施用。

本发明的第二方面提供避孕方法。在一个实施方案中，该方法包括向阴道施用可有效抑制精卵受精、从而防止怀孕的量的苏拉明或其衍生物。在某些实施方案中，苏拉明可以与一种或多种抗微生物剂和/或精子功能抑制剂共施用。

本发明的第三方面提供可以有利地用于抑制性传播疾病传播并抑制精卵受精的局部用药组合物。在一个实施方案中，该组合物包含药物可接受的载体和可有效抑制性传播疾病传播并抑制精卵受精的量的表面活性剂和苏拉明或其衍生物。

本发明的第四方面提供向阴道或子宫施用苏拉明的装置。在一个实施方案中，该装置包括适合插入阴道内的一种固体支持物。该支持物有利地用含有表面活性剂和苏拉明或其衍生物的组合物包被或浸渍。

本发明的第五方面提供同时抑制性传播感染和抑制精卵受精的方法。在本发明的一种形式中，该方法包括向雌性哺乳动物阴道内、向子宫颈或向子宫施用一种组合物，该组合物含有可有效抑制性传播感染和精卵受精的量的苏拉明。性传播感染可由微生物引起，如淋病奈瑟氏球菌、沙眼衣原体、苍白密螺旋体(Treponema pallidum)、杜氏嗜血菌(Haemophilus ducreyi)、肉芽肿鞘杆菌(Calymmatobacteriumgranulomatis)、生殖道支原体(Mycoplasma genitalium)、解脲尿支原体(Ureaplasma urealyticum)、HIV-1、HIV-2、HTLV-1、1型单纯疱疹病毒、2型单纯疱疹病毒、EB病毒、巨细胞病毒、人疱疹病毒6、水痘-带状疱疹病毒、人乳头瘤病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、阴道毛滴虫(Trichomona vaginalis)和白假丝酵母(Candida albicans)。

附图简述

图1显示苏拉明8，8′-(羰基二(亚氨基-3，1-亚苯基羰基亚氨基(4-甲基-3，1-亚苯基)羰基亚氨基))二-1，3，5-萘三磺酸的六钠盐。

图2是显示随苏拉明和壬苯醇醚-9的指定浓度变化的精子活动性和存活力，更详细的描述见实施例1。

图3的棒图显示苏拉明对人精子透明带结合和仓鼠卵穿透的影响，更详细描述见实施例1。HZA，半透明带(hemizona)试验；HEPT，仓鼠卵穿透试验。

图4是显示随苏拉明浓度变化的精子透明质酸酶活性，更详细的描述见实施例1。

图5显示随预先确定的苏拉明浓度变化的指定细胞中剩余的感染性，更详细的描述见实施例2。VBI-BaL，使用嗜单核细胞的HIV-1 BaL株的病毒进入抑制试验；CTC，细胞-细胞传播试验；VBI-IIIB，使用嗜淋巴细胞的HIV-1 EB株的病毒进入抑制试验；API，活性药物成分(苏拉明药物成分)。

图6显示在存在或不存在粘蛋白的情况下，苏拉明对HIV-1上皮细胞传播的抑制，更详细的描述见实施例2。

图7显示苏拉明的抗疱疹活性和细胞毒性，更详细的描述见实施例2。

图8的棒图显示随苏拉明浓度变化的对巨细胞病毒与成纤维细胞结合的抑制，更详细的描述见实施例2。

图9显示用不同浓度的苏拉明处理后，沙眼衣原体的滴度，更详细的描述见实施例2。

图10的棒图显示通过淋病奈瑟氏球菌(MSIIA)增殖(生长)试验测定，随苏拉明指定浓度变化的淋病奈瑟氏球菌的生长，更详细的描述见实施例2。

图11的棒图显示随苏拉明指定浓度变化的阴道细胞存活力，更详细的描述见实施例3。

图12的棒图显示随苏拉明和壬苯醇醚9(N-9)浓度变化的来自人阴道细胞上清液的指定白介素的浓度。人阴道(VK-2)细胞在存在或不存在指定组合物的情况下培养6小时，更详细的描述见实施例3。

图13显示苏拉明对乳杆菌生长的影响，更详细的描述见实施例3。r²(相关性系数)＝0.996。TD，倍增时间。

优选实施方案描述

现发现，局部制剂中的苏拉明及其衍生物具有抑制STG感染传播和减少精卵受精(即精子使卵子受精)概率的组合效能。申请人发现，局部施用苏拉明及其衍生物可有效抑制STD的传播并防止怀孕。

本发明的第一方面提供了抑制性传播疾病传播的方法。在本发明的一种形式中，该方法包括局部施用或以其它方式施用苏拉明或其衍生物，一般是向感染部位局部施用。

苏拉明是一种多磺酸化萘基脲，其化学名称为8，8′-(羰基二(亚氨基-3，1-亚苯基羰基亚氨基(4-甲基-3，1-亚苯基)羰基亚氨基))二-1，3，5-萘三磺酸。图1显示了苏拉明六钠盐的结构。苏拉明可以在市场上购买到，也以下列化学名和商品名为人所知：Antrypol、Bayer 205、Fourneau309、Germanin、Moranyl、Naganol、Naganin、苏拉明(Suramin)、Naphuride钠。以前已证实，苏拉明抑制多种生长因子的体内活性和自身免疫病及过敏性疾病(美国专利号5,158,940)，具有强逆转录酶(RT)抑制活性(Jentsch等人，J.Gen.Virol.，68：2183-2192 1987)和抗增殖活性(Nakajima等人，J.Biol.Chem.，266(15)：9661-61991)。

如此处所用的“苏拉明”包括苏拉明及其药物可接受的盐，它们可有效抑制STD感染、抑制精卵受精。药物可接受的盐包括，例如：碱金属、碱土金属、其它无毒金属、铵和取代的铵盐，例如但不限于：钠、钾、锂、钙、镁、铝、锌、铵、三甲基铵、三乙基铵、四丁基铵、吡啶鎓和取代的吡啶鎓盐。优选地，使用一种苏拉明六钠盐。

苏拉明的“衍生物”(类似物)在本领域公知，包括如Jentsch等人，J.Gen.Virol.，68：2183-2192(1987)和美国专利号5,173,509和6,121,320所述，这些文献均在此全文引用作为参考。其它已知的苏拉明衍生物如美国专利号6,121,320所述，后者描述了苏拉明的NF110、NF032、NF201、NF023和NF103衍生物，以及如Firsching-Hauck等人，Anticancer Drugs 11(2)：69-77(2000)和Gagliardi等人，CancerChemother.Pharmacol.41(2)：117-24(1998)所述。这些衍生物能够用本领域技术人员公知的方法合成，包括如Nickel P等人，Arzneim.-Forsch.36，1153-1157(1986)所述的方法。

现意外地发现，苏拉明或其衍生物与此处描述的其它活性药物组合产生协同作用。因此，在本发明的另一个实施方案中，此处所述的抑制性传播疾病传播的方法包括局部使用含有苏拉明和一种或多种活性剂的组合物。如此处所定义的，活性剂包括抗微生物剂或显示抗STD病原体活性的其它药物。活性剂也可以是一种精子功能抑制剂，它能够抑制精子的功能，以其他方式抑制精子使卵子受精，和/或以其他方式防止怀孕，例如通过杀死和/或功能灭活精子或通过对精子活性的其它作用。活性剂可能至少有双重功能，如作为精子功能抑制剂以及作为抗微生物剂。

抗微生物剂可以具有对抗藻类、细菌、真菌、寄生虫(蠕虫、原生动物)、病毒和亚病毒体的活性，因此，抗微生物剂可以是一种抗细菌剂、抗真菌剂、抗病毒剂、抗寄生虫剂和抗原生动物剂。抗微生物剂优选地具有对抗传染病，如性传播疾病的活性。能够引起这些疾病的微生物(和这些微生物所致疾病)的例子包括：淋病奈瑟氏球菌(淋病)；沙眼衣原体(衣原体，性病淋巴肉芽肿)；苍白密螺旋体(梅毒)；杜氏嗜血菌(软下疳)；肉芽肿鞘杆菌(腹股沟肉芽肿)，生殖道支原体、解脲尿支原体(支原体)；人免疫缺陷病毒HIV-1和HIV-2(HIV，AIDS)；HTLV-1(1型嗜T淋巴细胞病毒)；1型和2型单纯疱疹病毒(HSV-1和HSV-2)；EB病毒；巨细胞病毒；人疱疹病毒6；水痘-带状疱疹病毒；人乳头瘤病毒(生殖器疣)；甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒(病毒性肝炎)；阴道毛滴虫(Trichomona vaginalis)(毛滴虫病)；和酵母，如白假丝酵母(外阴阴道念珠菌病)。抗微生物剂也可能具有对抗其它疾病的活性，这些疾病通过体液接触传播，也可通过性接触传播，通过施用根据本发明的化合物能够预防。因此，短语“性传播疾病(STDs)”在此解释为包括能够在性接触过程中传播的任何疾病，无论生殖器是或不是产生病理变化的部位。

适宜的抗病毒剂包括，例如：病毒灭活剂，如此处所述的非离子型、阴离子型和阳离子型表面活性剂，和C31G(氧化胺和烷基甜菜碱)、聚双胍、二十二烷醇、酰基肉碱类似物、辛基甘油，和抗微生物肽，如爪蟾抗菌肽、短杆菌肽、protegrins和retrocyclins。温和的表面活性剂有利地可以在此处所述的组合物中用作抗病毒剂。在一个实施方案中，用于抑制STD感染的苏拉明组合物包含一种抗病毒表面活性剂，它不是通过与苏拉明相同的机制抑制致STD的微生物。更优选地，抗病毒表面活性剂是脱水山梨糖醇单月桂酸酯。可以在此处所述组合物中使用的其它抗病毒剂包括核苷酸或核苷类似物，如tenofovir、阿昔洛韦、金刚烷胺、双脱氧肌苷、膦甲酸、更昔洛韦、利巴韦林、阿糖腺苷、扎西他宾和齐多夫定。可以使用的其它抗病毒剂包括非核苷逆转录酶抑制剂，如UC-781(thiocarboxanilide)、吡啶酮、TIBO、奈韦拉平、地拉夫定、calanolide A、capravirine和efavirenz。在这些逆转录酶抑制剂中，显示口服生物利用度较差的药物及其类似物特别适于与苏拉明组合阴道施用，以预防HIV的性传播。可以与苏拉明组合使用的其它抗病毒剂包括HIV进入阻断剂类的药物，如cyanovirin-N、环糊精类、角叉藻聚糖类、硫酸化或磺酸化聚合物、苦杏仁酸缩合聚合物、单克隆抗体、趋化因子受体拮抗剂，如TAK-779、SCH-C/D和AMD-3100，和融合抑制剂，如T-20和1249。

合适的抗细菌剂包括抗生素，如氨基糖甙类、头孢菌素，包括第一代、第二代、第三代头孢菌素，大环内酯类，包括红霉素、青霉素，包括天然青霉素、青霉素酶抗性青霉素、氨基青霉素、广谱青霉素；磺胺类，四环素类，氟喹诺酮类，甲硝唑，和泌尿道抗菌剂。

合适的抗真菌剂包括：两性霉素B、制霉菌素、灰黄霉素、氟胞嘧啶、氟康唑、碘化钾、intraconazole、clortrimazole、咪康唑、酮康唑和托萘酯。

合适的抗原生动物剂包括：抗疟剂，如氯喹、伯氨喹、乙胺嘧啶、奎宁、fansidar和甲氟喹；杀阿米巴剂，如dioloxanide、吐根碱、双碘喹啉、甲硝唑、巴龙霉素和奎吖因；喷他脒羟乙磺酸盐、阿托喹酮和依氟鸟氨酸。

根据此处所述方法制备的本发明的苏拉明组合物，一般通过向感染部位局部输送该组合物施用或使用。感染部位可以是已经存在感染的部位(实际感染部位)或可能发生感染的部位(未感染个体的潜在感染部位)。因此，通过接触目的部位的或目的部位周围的皮肤或粘膜，这些组合物可以局部输送到外阴，包括阴道腔、阴茎和肛门直肠和口腔。粘膜或皮肤表面还可包括肛周和肛门内侧。例如，为了抑制STD感染，可以通过接触任何潜在的或实际的感染部位，包括阴道、肛门直肠或口腔，施用本发明的苏拉明组合物，以在亲密举动中防止STD感染。当向阴道腔施用时，组合物也可以施用到子宫的任一部分，包括子宫内和子宫颈上，包括子宫颈内和表面的粘膜和/或内侧。而且，当配制为润滑剂时，组合物可以施加到外生殖器和内部粘膜表面，以减少润滑不足导致的微创伤，也可以防止活STD病原体通过受到损伤的、病变的或健康的皮肤或粘膜传播。

一个剂量的药物组合物优选地由一个或多个药物剂量单位组成。选择的剂量可以对哺乳动物例如人施用，使用任何已知的给药方法，包括此处所述的方法，例如，作为栓剂和凝胶向阴道、直肠或子宫施用。例如，通过在装置(包括海绵、子宫帽、卫生栓、避孕隔膜或子宫内装置)上作为润滑剂使用，或者通过作为栓剂、灌洗器、卵形体(ovule)、凝胶或其它可控输送装置使用该组合物，苏拉明组合物可以阴道内施用。尽管将组合物置于避孕套上能够使一些组合物转移到粘膜表面，并为这些表面提供一定程度的保护，但是这种施用的主要好处包括对避孕套使用者的保护。通过子宫内输送装置，如本领域技术人员公知的子宫内装置(IUDs)，苏拉明组合物可以被施加到子宫的任一部分。本领域公知的涂药器，如当前商业上用来输送杀精子凝胶或抗酵母化合物的涂药器，也可以用来阴道内施用组合物。

一般施用可抑制或以其它方式预防STD感染有效量的苏拉明组合物。该量是指，当对需要的哺乳动物施用时，足以实现抑制STD感染传播的苏拉明的量。换句话说，该剂量可有效预防进入部位的STD感染，或者预防致STD微生物的复制。对于抑制STD感染的传播，苏拉明的有效量可能随多种因素而变化，例如将要通过阻断其进入或停止它在感染部位复制而抑制的致STD微生物。例如，适当配制本发明的苏拉明组合物，以抑制人免疫缺陷病毒(HIV)(包括但不限于HIV-1和HIV-2)、单纯疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒(CMV)、淋病奈瑟氏球菌(NG)和沙眼衣原体(CT)。优选地，苏拉明的有效量是有效抑制本领域公知的和此处描述的任何可能的致STD微生物传播的量。尽管这些量也可能变化，但是苏拉明的用量一般为约0.1％(每1克制剂1mg苏拉明)到约30％(300mg/g)，优选地约1％(10mg/g)到约5％(50mg/g)；或者以一种方式使用，其中输送系统释放足够的苏拉明来保持此重量体积百分浓度。当存在于含抗微生物剂的组合物中时，所用组合物中苏拉明的量也将随使用的具体抗微生物剂而不同，并且可由本领域技术人员容易地确定。组合物中抗微生物剂的量例如随有关疾病的性质和组合物中苏拉明的量而不同，也可以由本领域技术人员容易地确定。可以对STD个体或将与STD个体有性接触的个体施用这些量。

本发明的方法中提到的“抑制”是指，相对于未处理的个体，发生指定活动的发生率或普及率至少降低。这些术语可能包括哺乳动物的预防性处理，或相对于未处理的哺乳动物，疾病发病率降低。传播STD感染的“抑制”是指，相对于未处理的个体，在亲密接触之前或之后立即处理个体，导致STD感染的传播减少。在这种情况下，不受任何具体作用机制的限制，在感染部位中和导致STD感染的微生物，或防止微生物在感染部位复制，可导致传播STD的抑制。这种STD感染的抑制是在彼此充分接触足以发生STD感染的至少两个人之间。例如，可以在有性接触的两个人之间或母亲与孩子之间(垂直传播)抑制STD感染。

根据本发明的方法可以抑制多种STD感染。例如，苏拉明和此处所述的组合物，可以用来对抗藻类、细菌、真菌、寄生虫(蠕虫、原生动物)类的微生物。例如，苏拉明组合物可以根据本发明的方法使用，以抑制由多种微生物引起的疾病的传播，这些微生物包括：淋病奈瑟氏球菌(淋病)；沙眼衣原体(衣原体，性病淋巴肉芽肿)；苍白密螺旋体(梅毒)；杜氏嗜血菌(软下疳)；肉芽肿鞘杆菌(腹股沟肉芽肿)、生殖道支原体、解脲尿支原体(支原体)；人免疫缺陷病毒HIV-1和HIV-2(HIV，AIDS)；HTLV-1(1型嗜T淋巴细胞病毒)；1型和2型单纯疱疹病毒(HSV-1和HSV-2)；EB病毒；巨细胞病毒；人疱疹病毒6；水痘-带状疱疹病毒；人乳头瘤病毒(生殖器疣)；甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒(病毒性肝炎)；阴道毛滴虫(Trichomona vaginalis)(毛滴虫病）；和酵母，如白假丝酵母(外阴阴道念珠菌病)。这些微生物引起的疾病在以上括号中给出。

在本发明的其它形式中，STD感染可能由细菌引起。这类细菌的例子包括：淋病奈瑟氏球菌、沙眼衣原体、苍白密螺旋体、杜氏嗜血菌、肉芽肿鞘杆菌、生殖道支原体和解脲尿支原体。在其它实施方案中，STD感染可能由病毒引起，包括HIV-1、HIV-2、HTLV-1、1型单纯疱疹病毒、2型单纯疱疹病毒、EB病毒、巨细胞病毒、人疱疹病毒6、水痘-带状疱疹病毒、人乳头瘤病毒、甲型肝炎病毒和乙型肝炎病毒。在本发明的其它实施方案中，STD感染可能由病毒引起，如HTLV-1、EB病毒、水痘-带状疱疹病毒、人乳头瘤病毒、甲型肝炎病毒和乙型肝炎病毒。在其它实施方案中，STD感染可能由白假丝酵母和阴道毛滴虫(Trichomona vaginalis)引起。

本发明的另一方面提供了避孕或以其它方式防止怀孕的方法。在一种形式中，该方法包括向阴道施用可有效抑制精卵受精以及防止怀孕的量的苏拉明或其衍生物。在本发明的其它实施方案中，苏拉明或其衍生物可以与不同的精子功能抑制剂组合，因为在此发现这种组合在避孕方面发挥协同作用。含有任选地与此处所述活性剂组合的苏拉明及其衍生物的组合物，也设想用于此处所述的方法。

提高苏拉明的避孕特性的精子功能抑制剂可以选自，例如：表面活性剂，包括非离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂和阴离子型表面活性剂；杀精子剂，如壬苯醇醚-9(α-(4-壬基苯基)-ω-羟基九(氧乙烯)；其它精子灭活剂，如硫酸化或磺酸化的聚合物，如磺酸聚苯乙烯、苦杏仁酸缩合聚合物、环糊精；抗微生物肽，如短杆菌肽、爪蟾抗菌肽、indolicidin和蜂毒肽；和酸性缓冲组合物，如BufferGel和AcidForm。非离子型表面活性剂包括，例如：脱水山梨糖醇单月桂酸酯、壬基苯氧基聚乙氧基乙醇、对二异丁基苯氧基聚乙氧基乙醇、聚氧乙烯(10)油基醚和onyx-ol。合适的阴离子型表面活性剂包括但不限于烷基磺酸钠和烷基苯磺酸钠。阳离子型表面活性剂包括，例如，季铵表面活性剂，如十六烷基氯化吡啶鎓和苯扎氯铵。两性离子表面活性剂，如酰基肉碱类似物和C31G，尤其适合它们柔和的皮肤及粘膜刺激特性。

对于抑制精子-卵母细胞受精，或者以其它方式防止怀孕，本发明的苏拉明组合物直接或间接阴道内施用。例如，通过在避孕套或其它装置(包括海绵、子宫帽、卫生栓、避孕隔膜、或子宫内装置)上作为润滑剂，或者通过作为栓剂、灌洗器、ovule、凝胶或其它可控输送装置施用组合物，苏拉明组合物可以阴道内施用。通过子宫内输送装置，如本领域技术人员公知的子宫内装置(IUDs)，苏拉明组合物可以被施加到子宫的任何部分。本领域公知的涂药器，如当前商业上用来输送杀精子凝胶或抗酵母化合物的涂药器，也可以用来施用组合物。

一般施用有效量的苏拉明组合物。在此处描述的避孕方法中，这种有效量是指当对需要的哺乳动物施用时，足以抑制精卵受精和胚胎形成的苏拉明的量。对于其避孕剂性质，苏拉明的有效量是指，通过阻断精子进入卵子，抑制精子-受精能力或通过其它方法，有效降低精卵受精可能性的量。苏拉明的量可以由本领域技术人员容易地确定。例如，苏拉明可以为有效的量存在，优选地，每克组合物约1到约300mg，优选地约5到约100mg/g，或者0.0001-90％，优选地约0.01到约30％，或约0.5％到约10％组合物重量。在本发明的实践中也可以有效地使用较高和较低的量。

而且，精卵受精的“抑制”是指相对于未处理的个体，怀孕，即导致怀孕的精卵受精的发生减少。在这种情况下，苏拉明可能以多种不同方式起作用。例如，通过阻断精子受体与透明带，可以抑制受精。此外，也可以抑制透明质酸酶或受精所需的其它精子-酶相互作用。它也可以凝集精子，妨碍通过女性生殖道正常的上升或转运。无论机制如何，也不受此处所述组合物的作用机理的任何具体理论限制，精卵受精的抑制导致本发明的苏拉明局部药物组合物的有效避孕特性。

在此处所述方法中使用的组合物可包含不会负面影响或以其它方式影响组合物成分(包括抗微生物剂、精子功能抑制剂、苏拉明或苏拉明衍生物)的杀微生物和/或避孕效能的其它药物。例如，药物组合物中可以使用固体、液体或固体与液体混合物的药物可接受的载体、稀释剂、载体(vehicle)或赋形剂。合适的生理学可接受的、基本上惰性的载体包括水、聚乙二醇、矿物油或矿脂(petrolatum)、丙二醇、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、纤维素衍生物、多聚羧酸、连接的聚丙烯酸，如聚羰乙烯；和其它聚合物，如聚(赖氨酸)、聚(谷氨酸)、聚(马来酸)、聚(乳酸)、热聚天冬氨酸酯和脂肪-芳香树脂；甘油、淀粉、乳糖、二水硫酸钙、白陶土、蔗糖、滑石、明胶、果胶、金合欢胶、硬脂酸镁、硬脂酸、糖浆、花生油、橄榄油、盐水溶液等。

在本发明的方法中有用的此处所述的药物组合物还可含有本领域技术人员公知的稀释剂、填料、粘合剂、湿润剂、防腐剂、酸和其它成分。例如，合适的防腐剂在本领域公知，包括，例如：对羟苯甲酸甲酯、对羟苯甲酸丙酯、对羟苯甲酸丁酯、苯甲酸和苄醇。

在本发明的方法中使用的组合物可以以适于局部施用的任何形式使用。例如，本发明的组合物可以是本领域公知的多种形式，包括液体形式或洗液形式，水包油或油包水乳剂，水凝胶组合物，泡沫、薄膜、喷雾剂、软膏、阴道栓剂、栓剂、胶囊、片剂、胶冻剂、乳膏、脂质体形式，或者为了向已经施用或接触的皮肤或表面缓释或控释生物活性物质，包埋于基质中的其它形式。优选地，本发明的组合物是水性组合物。最优选地，这些组合物是水性凝胶组合物。

本发明的另一方面，提供了同时抑制性传播疾病或感染并抑制精卵受精的方法。本发明的苏拉明组合物可有效地同时抑制引起STD的微生物(包括HIV、单纯泡疹病毒、巨细胞病毒、沙眼衣原体和淋病奈瑟氏球菌)的粘膜进入，以及在雌性哺乳动物中抑制精卵受精。在这种情况下，向雌性哺乳动物阴道内施用苏拉明组合物，其用量为足以在雌性哺乳动物中抑制精卵受精并抑制STD或感染的杀微生物避孕剂的量。STD的抑制可以通过如下方式发生，例如：阻止引起STD的微生物进入子宫颈-阴道粘膜，和/或阻止这些微生物在雌性哺乳动物中复制和生长。

现在参考具体实施例说明上述方法、组合物和装置。应当理解，这些实施例旨在说明优选实施方案，并非有意限制本发明的范围。

实施例1

抗精子活性

精子固定(Immobilization)

如Sander FV和Cramer SD.，Hum.Fertil.6：134-153(1941)所述，利用Sander Cramer试验测定对精子固定的影响。该试验可以用来评价避孕组合物的精子固定效能。在室温(即25℃)下，向调节到指定数量(例如每毫升6千万个活动精子)的精液中加入连续稀释的每种待测组合物。终点是所有精子在20秒内固定的最大稀释度。结果表示为最小有效浓度，单位为毫克每毫升。

显示20mg/mL的苏拉明没有明显的精子固定活性。另外，当使用10和5mg/mL苏拉明钠进行实验时，来自标本的所有精子都是活动的。在使用1对数倍浓度(1-10,000μg/mL)或2倍连续稀释度(5-0.07mM)以精子渐进活动性和膜完整性作为终点的更详细的剂量应答研究中，苏拉明钠与溶剂对照未显示显著性差异，即它不诱导精子渐进活动性和存活力的改变(图2)。相反，平行检测的商品杀精子剂壬苯醇醚-9(N-9)显示已知的精子固定作用。在次最佳剂量的时间依赖性研究中，不同于N-9，苏拉明钠显示不改变精子活动性，甚至在长时间温育(例如30分钟)后同样如此。在1mM时，如《WHO人精液和精子-宫颈粘液相互作用实验室检测手册》第4版，WHO组织，Cambridge University Press，pp.30-33，1999所述，通过CASA(计算机辅助精液分析)检测，精子活动参数没有显著改变。甚至在更高浓度时(例如7.5mg/mL)，精子活动特征似乎也没有显著不同于对照(溶剂处理的)精子。

宫颈粘液穿透作用

牛宫颈粘液获自Humagen(Charlottesville，VA)，形式是预包装的扁平毛细管(Penetrak^)，冷冻保存，在实验前融化。利用改进的一端检测(One End Test)(MOET)[(Doncel G.F.，《屏障避孕药》，Wiley-Liss，Mauck C.K.等人编著，pp.147-162(1994)的描述]检测化合物(如此处所述的苏拉明钠)对精子穿透宫颈粘液的影响。含有待测化合物的每种测试组合物均在盐水溶液中稀释，即每升水9克NaCl。打开宫颈粘液的试管。将开口端置于含有溶于盐水的待测化合物的容器中。待测化合物在试管内扩散30分钟。从正常健康供体中获得的精液标本然后用缓冲液稀释为每毫升6千万个活动精子，并与待测化合物样品(即苏拉明钠)混合。然后将含有待测化合物样品的试管重新插入含有混合溶液的容器中，在37℃、5％二氧化碳孵箱中贮存60分钟。然后从孵箱中取出容器和试管，在显微镜下目视分析试管，分析最前面的活动精子沿试管的迁移。结果表示为与对照样品相比的迁移百分数。在对照样品中，试管与不含化合物的盐水温育。

利用同时一端试验(SOET)检测待测化合物的快速阻断作用，特别是通过精子活动性的改变发挥这种作用，该方法在Doncel G.F.，《屏障避孕药》，Wiley-Liss，Mauck C.K.等人编著，pp.147-162(1994)]中描述。SOET类似于MOET，不同之处在于含有待测化合物的溶液与精液标本混合，然后将含有牛宫颈粘液的毛细管的一端插入待测化合物与精液标本的混合物中，在37℃、5％二氧化碳孵箱中贮存60分钟。记录最前面的活动精子的穿入距离，结果表示为与对照样品(即不含化合物的盐水)相比的迁移百分数。在SOET中，如果不被待测化合物阻止，精子能够在接触后立即迁移到试管内。

剂量依赖性研究表明，当在MOET试验中检测50mg/mL(5％)的苏拉明钠时，对精子穿入只有较低的抑制。在25mg/mL或更低时，没有发现显著的精子阻碍。在5％时，硫酸葡聚糖显示比苏拉明钠更强的抑制作用。作为比较，N-9在300μg/mL(0.03％)时完全阻止精子穿入。KY Jelly^(KY)是一种商品阴道润滑剂和苏拉明钠的KY溶液，显示相同程度的抑制(约40％)，与相同浓度的单独的苏拉明钠显著不同(约4％)。在任何浓度时均未观察到显著的精子凝集(表1)。

表1.苏拉明的宫颈粘液阻断活性

    化合物    溶剂    稀释度    MOET    ％CTL    n    苏拉明    0.9％NaCl    50mg/ml    25mg/ml    12.5mg/ml    6.25mg/ml    72.3±7.1    95.9±1.4    94.9±2.2    96.1±0.9    10    10    5    5    硫酸葡聚糖    0.9％NaCl    50mg/ml    25mg/ml    12.5mg/ml    6.25mg/ml    5 6.6±8.9    86.8±4.4    82.4±5.2    93.7±1.7    10    10    5    5    N-9    0.9％NaCl    300μg/ml    30μg/ml    0.7±0.5    48.6±6.9    10    10    苏拉明-KY    dH₂O    25.5mg/ml-25％    64.1±7.6    10    KY    0.9％NaCl    25％    61.6±6.9    10

精子的存活力

如Jeyendran R.S.等人，J.Reprod.Fertil.，70：219-28(1984)所述，通过精子膜完整性评价估计精子的存活力。精子标本等份与苏拉明或N-9待测化合物温育。加入1.5mL Ham′s F10终止反应。离心精子，沉淀重悬浮于200μL培养基中。将100μL精子悬液加入900μL低渗膨胀试验(HOST)介质中30分钟评价精子的存活力。卷曲的精子尾反映完整的精子膜通透性，表明是活精子。每个标本显微镜检查最少200个细胞。

精子膜完整性评价结果在图2中显示。当苏拉明处理的标本(10-0.001mg/mL)与溶剂处理的对照相比较时，精子存活力未见显著性差异。在15分钟共温育后，在剂量和时间依赖的实验中，活动性和存活力都显示非常相似的应答模式，表明苏拉明不是一种杀精子化合物。

人精子-透明带结合

如Burkman L.J.等人，Fertil.Steril.，49：688-697(1988)所述，利用半透明带(hemizona)试验测定精子获能以及与卵子细胞的透明带结合的能力。简言之，在该试验中，活动的正常精子在含有牛血清白蛋白的培养基中分离，触发获能。用游泳(swiming-up)技术分离活动的人精子，在37℃、5％CO₂下，与1mM苏拉明或溶剂对照培养基在覆盖矿物油的100μL培养基小滴中温育15分钟。然后精子与被透明带(卵子细胞的非细胞包被)环绕的死卵子细胞温育。对应于一个卵细胞的对分半透明带各置于检测(苏拉明)和对照(溶剂)小滴中，再温育4小时。充分洗涤精子-半透明带复合物，在倒置显微镜下计数与透明带外表面结合的获能的精子。与一个半透明带结合的苏拉明处理的精子的数量除以与另一半透明带结合的未处理的(对照)精子的数量，计算半透明带指数(HZI)。

图3显示半透明带试验的结果。发现苏拉明是一种强精子-透明带结合抑制剂，在1mM时产生92％的人精子结合抑制(HZI＝0.08±0.01，n＝9)(图3)。在精子-表面水平上阻断透明带受体和/或干扰信号转导可以介导这种抑制。

精子-卵膜结合和穿入

利用仓鼠卵穿入试验(HEPT)，通过评价精子的卵细胞穿入能力，预测人精子的授精能力，如Yanagimachi R.等人，Biol.Reprod.，15：471-6(1976)所述。通过蛋白酶处理溶解仓鼠卵的透明带，随后向不含透明带的卵中添加人精子。在将精-卵复合物置于聚赖氨酸包被的载玻片上，并覆盖以22×22mm盖玻片之后，用标准显微镜(放大60倍)评价精子的结合和穿入。通过计数位于卵细胞质内的精子核，对精子结合并进入卵的能力进行评分。通过比较与卵表面结合的精子数量与被穿入卵的百分比，检测待测化合物的作用。

使用苏拉明钠作为待测化合物的HEPT试验的结果在图3中显示。苏拉明钠显示降低精子与仓鼠的无透明带卵细胞的结合(约75％抑制)，并且在体外完全消除了这些卵的精子穿入/受精(n＝28个卵细胞)。

精子透明质酸酶活性

利用透明质酸水解试验评价苏拉明钠的透明质酸酶抑制特性。透明质酸酶是一种重要的精子酶，与对卵丘的穿入有关。该酶的抑制使精子不能穿过卵的外被(vestments)，从而妨碍了精子-卵母细胞的相互作用，最终阻碍了受精。

通过测定透明质酸水解的程度(即由酶活性形成的N-乙酰葡糖胺反应性物质的浓度)定量测定透明质酸酶活性。制备含有下列成分的反应混合物：待测化合物(不同浓度的苏拉明钠)；0.1M乙酸钠；0.15M氯化钠；pH调节为5.5；乙酸缓冲液中所含的7.2单位绵羊睾丸透明质酸酶(Sigma，Type III；H-2251)；0.3mg/ml透明质酸(Sigma，来自牛玻璃体液；H-7630)。该酶与待测药物(1mg/ml，用于筛选目的)预温育10分钟，之后通过加入透明质酸开始反应。用Aronson和Davidson(J.Biol.Chem.241 437-40，1967)的方法测定酶反应。反应混合物在室温下温育30分钟。通过测量545nm的吸光度，用β-二甲基氨基苯甲醛通过量热法测定反应产物(Reissig等人，J.Biol.Chem.217959-966，1965)。在1mg/ml的筛选浓度时不显示抑制的化合物被认为是无活性的。如果待测药物在筛选浓度时显示抑制，则生成剂量应答曲线，利用曲线拟合软件能够根据该曲线确定IC₅₀值。

图4显示用苏拉明钠检测的透明质酸酶活性测定的结果。苏拉明钠被证明是透明质酸酶的一种不可逆的强抑制剂，显示IC₅₀＝约22μg/mL。1mg/mL诱导100％的抑制(图4)。

顶体反应

如Cummins J.M.等人，J.Androl.，12：98-103(1991)所述，利用顶体反应离子载体攻击试验(ARIC)测定对钙离子载体(一般是A23187)反应的精子的比例，进行顶体反应。更具体而言，该试验用来确定苏拉明钠是否影响离子载体诱导的精子的顶体反应，因而改变精子穿入卵的能力。结果表示为对照(未处理的精子)顶体反应的百分抑制。使用苏拉明钠的ARIC的结果在表2中显示。

表2.苏拉明对人精子顶体反应的影响

  化合物  钙离子载体处理  (5μM A23187)    顶体反应的精子    的百分数    n  苏拉明钠  对照  苏拉明钠  对照    -    -    +    +    5.26±1.93    5.39±1.38    31.4±15.1    29.8±13.0    6    6    6    6

根据表2，苏拉明钠似乎既不刺激自发顶体反应(顶体损失)也不阻断Ca²⁺离子载体诱导的反应，如同关于其它硫酸化和磺酸化化合物(特别是聚合物)所描述的。

兔避孕效能试验

借助人工阴道从雄性新西兰白(NZW)兔中采集精液，合并，并用改进的Tyrode′s白蛋白乳酸丙酮酸(TALP)培养基调节为每毫升5千万个活动精子。通过静脉内注射200IU人绒毛膜促性腺激素(hCG)，诱导雌性排卵。按照离体(体外)混合方案，如Anderson R.A.等人J.Androl.，21：862-875(2000)所述，授精前精子与指定的苏拉明待测化合物在试管中37℃温育15分钟(0.5mL)。如果根据该方案苏拉明组合物显示避孕活性，则检测制剂，该制剂在授精前15-30分钟在阴道内施用(1mL)。在这种情况下，精子-化合物接触在体内在阴道内发生。受精和化合物的施用用一个柔性的12cm长的聚氨酯导管进行。两个方案的主要终点是在受精11天后计数的植入部位的数量和妊娠率。这些部位通过目视观察试管计数。

离体试验

根据表3，按照“离体混合”形式，其中精子在体外与含或不含苏拉明钠的培养基温育，1mM(1.4mg/mL)浓度使妊娠率(PR)抑制86％(1/7)，也使植入部位的数量(IS)从对照组的6.4±0.9减少到检测组的1。0.1mg/mL的浓度不显著降低PR，尽管它使IS从7.7±1.2略降到4.4±0.8。百分之五(5％)的浓度完全防止妊娠(0/7)。结果在表3中显示。

表3.在离体精子混合后，苏拉明钠的避孕效能

  化合物  苏拉明浓度  (mg/mL)  妊娠雌性数/  总数    妊娠率    (％)    植入部位   (平均值±SD)  培养基对照  苏拉明    0    0.1    1.4    50    7/7    5/6    1/7    0/7    100    83    14    0    7.7±1.2    4.4±0.8    1    N.A.

在授精前，合并的兔精子与不同浓度的苏拉明在体外混合15分钟。用hCG诱导雌性排卵，然后与5千万个处理的或未处理的活动精子/mL(0.5mL)在阴道内受精。在授精11天后评价妊娠和植入部位。

体内试验

阴道内施用KY Jelly(KY)中的5％苏拉明钠或羧甲基纤维素(CMC)，随后人工授精，使PR下降75％(2/8)。为了证实可能提高苏拉明效能的一种潜在加成效应，向苏拉明钠/KY制剂中加入一种温和的非离子型表面活性剂脱水山梨糖醇单月桂酸酯，进行预研究。对照、2％脱水山梨糖醇、2％苏拉明钠和2％脱水山梨糖醇+2％苏拉明钠的PR分别为100％、100％、44％和0％(表4)。5％苏拉明与0.1％N-9在KY中组合的另外一个实验也显示协同效应。

表4.阴道内施用后苏拉明钠的避孕效能和表面活性剂的协同效应

   化合物活性物质的浓度(mg/mL)妊娠雌性数/总数    妊娠    率(％)  植入部位(平  均值±SD)   KY Jelly^   KY中的苏拉明   KY中的苏拉明   KY中的脱水山梨糖醇ML   KY中的苏拉明+脱水山梨糖醇ML    0    50    20    20    20+20    7/8    2/8    4/9    4/4    0/4    87.5    25    44    100    0    5.9±0.8    8.5±0.5    5.0±1.1    3.0±1.0    N.A.

在用hcG诱导排卵之前，向雌性阴道内施用对照和检测制剂(1mL)。

15-30分钟后，雌性用未处理的合并的正常兔精子(每毫升5千万个活动精子，0.5mL)授精。

根据表5，当以不同浓度(5％-1.25％)在基于carbopol的阴道润滑剂凝胶Replens^中配制苏拉明时，协同效应是明显的。甚至研究的最低剂量，1.25％，也是100％避孕(PR＝0％)。对照组的PR(单独的Replens^)为100％。

表5.苏拉明制剂的避孕效能-剂量应答

    化合物  苏拉明的  浓度  (mg/mL)  妊娠雌  性数/  总数  妊娠  率  (％)    植入部位    (平均值    ±SD)    Replens^(对照)    Replens^中的5％苏拉明    Replens^中的2.5％苏拉明    Replens^中的1.25％苏拉明    0    50    25    12.5    4/4    0/4    0/4    0/4    100    0    0    0    10.5±1.73    N.A.    N.A.    N.A.

向雌兔阴道内施用0.75mL化合物，15-30分钟后用合并的兔精子授精。植入部位在授精11天后显示。

本发明化合物的抗精子和避孕活性在表6中概括。

表6.苏拉明组合物的抗精子和避孕活性的概括

活性类型  抑制/灭活  试验效能注释抗精子(体外)  活动性  Sander  Cramer活动  性CASA无最高浓度＝25mg/mL时间和剂量依赖性实验计算机辅助活动分析  存活力  HOST无时间和剂量依赖性实验  CM穿入  MOET  SOET极低检测了配制的(5％)和非配制的  ZP结合  HZA高在1mM时92％抑制—可逆  卵膜结合/穿  入  HEPT高结合和穿入分别75％和100％抑制  透明质酸酶  透明质酸水  解高IC₅₀＝22μg/ml-不可逆  顶体反应  ARIC无顶体反应的诱导或抑制避孕(体内)  兔，预处理的  精子  体外混合中在KY jelly^中5％时100％抑制；0.1％(约1mM)时86％抑制  兔，授精  阴道施用中5％时75％抑制；2％时44％  阴道施用  Combo高在2％苏拉明+2％脱水山梨糖醇单月桂酸酯或0.1％N-9时，100％抑制  阴道施用高在1.25％Replens^时，100％抑制

实施例2

抗微生物活性

抗HIV的活性

HIV传染性的抑制：病毒结合抑制试验

VBIAIIIB：MT-2细胞、化合物和病毒(HIV-1 IIIB)在96孔板中混合在一起，在37℃下温育2小时。在温育期结束时，离心96孔板10分钟，用多通道移液器吸出约175μL培养基，替换为175μL新鲜培养基。培养物然后在37℃下温育6天。利用XTT(2，3-二(2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基)-5-[(苯氨基)羰基]-2H-四唑鎓氢氧化物)染料还原试验，通过测定光密度(O.D.)的降低百分数，测定病毒诱导的细胞病变效应的调节。病毒诱导的细胞病变效应和除去培养基引起的机械假象通过显微镜观察证实(Anderson R.A.等人，J.Androl.，21：862-875(2000))。在此提供了该试验的结果。

C-MAGI/Ba-L试验

C-MAGI/Ba-L试验用MAGI-CCR-5细胞进行。该细胞系保存在含有10％FBS、100U/ml青霉素、300sμg/mL谷氨酸盐和如上所述的选择抗生素的DMEM培养基中。在试验前，将细胞以每孔1×10⁴个细胞的浓度置于96孔平底组织培养板中，并在不含抗生素的情况下温育过夜。次日，除去培养基，加入病毒和化合物(100μL病毒(HIV_Ba-L)+100μL化合物)。将培养物温育2小时，以促进病毒附着。温育后，从孔中吸出培养基，替换为不含化合物的新鲜培养基，洗涤两次，最后在新鲜培养基中37℃温育2天。温育后，吸出培养基，通过化学发光法检测β-半乳糖苷酶活性的诱导。使用一种化学发光底物，按照厂商说明书(Tropix)，检测β-半乳糖苷酶活性。利用线性回归确定TC₅₀和IC₅₀，计算治疗指数或抗病毒指数。在此提供了本试验的结果。

基于ME-180的局部杀微生物试验

将ME-180宫颈上皮细胞以每孔5×10³个细胞的密度置于96孔平底微孔板的内部孔中，温育过夜。慢性感染的H9细胞(H9-SK1)用200μg/ml丝裂霉素C(Sigma)在完全培养基中处理1小时，充分洗涤，以每毫升4×10⁵重悬浮。使用的丝裂霉素C的浓度可在48小时处理时间内杀死慢性感染的细胞，病毒对ME-180细胞的细胞-细胞传播有充足的时间，而确保病毒终点定量不包括慢性感染细胞的作用。向含有ME-180细胞的每个孔中加入抗病毒化合物和慢性感染的细胞(2×10⁴个细胞)，温育6小时。共培养后，充分洗涤该单层细胞，加入新鲜培养基。在感染24和48小时后除去培养基，加入新鲜培养基，以去除死亡的淋巴细胞。在感染后的第6天，吸取上清液样品，通过p24ELISA分析病毒含量(Phillips DM等人，1995，J Virol Methods，Mar，52(1-2)：1-13)。下面提供了该试验的结果。

细胞-细胞传播(CTC)试验

HIV-1-感染的SupT1细胞(IIIB株)，由于预先在37℃下暴露于丝裂霉素C(200μg/mL)1小时而被杀死，将其与每种药物和P4-R5(MAGI)细胞温育，37℃2小时。温育后，洗涤细胞，替换为新培养基。在感染48小时后，利用Galacto-Star试验定量测定成功传播及随后的复制事件。感染的细胞表示为模拟感染后感染细胞的百分比。在每个试验中，重复检测三个孔的浓度。此处提供了该试验的结果。

外周血单核细胞(PBMCs)中的临床分离株：PBMC分离和活化(blasting)

通过ficoll hypaque梯度分离从正常肝炎和HIV-1阴性供体中获得外周血单核细胞(PBMCs)。简言之，抗凝化血液用不含Ca⁺⁺和Mg⁺⁺的Dulbecco′s磷酸缓冲液(PBS)1∶1稀释，在50ml离心管中在14mL淋巴细胞分离介质中分层。然后以600×g离心试管30分钟。从形成的界面上轻轻吸出PBMCs层，随后通过低速离心用PBS洗涤2次。计数单核细胞，通过台盼蓝染料排阻法测定存活力，将细胞重悬浮于补充有15％FBS(加热灭活的)、2mM L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和10μg/mL庆大霉素以及20U/mL重组IL-2(R&DSystems，Minneapolis，MN)的RPMI 1640培养基中。IL-2包含于培养基中，用于保持由PHA促有丝分裂刺激启动的细胞分裂。然后保存培养基直到使用，每3天将1/2培养体积更换为新鲜的含有IL-2的培养基。大部分试验都用活化3天的PBMCs开始。此处提供了该试验的结果。

PBMC测定

计数用PHS和IL-2刺激的至少两个供体的人外周血单核细胞，通过台盼蓝染料排阻法测定存活力，并等量混合。利用供体群的库使各个供体之间的变异最小化，这种变异是由于HIV感染在性质和数量上的差异，以及主要淋巴细胞群体对PHA和IL-2的总体应答。细胞以1×10⁶细胞/mL的浓度重悬浮于不含酚红、补充有15％胎牛血清(加热灭活的)、2mM L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、10μg/mL庆大霉素和IL-2(20U/mL，R&D Systems，Minneapolis，MN)的RPMI 1640中。然后将50微升细胞分配到标准形式的96孔圆底微孔板的内部60个孔中。每块板都含有细胞对照孔(只含细胞)、病毒对照孔(细胞加病毒)和实验孔(药物加细胞加病毒)。向微孔板中加入连续稀释的化合物，随后加入适当的预滴定的HIV-1株。平板然后在37℃、5％CO₂下温育6小时，以大约300×g离心10分钟，用多通道移液器吸出175μL上清液，替换为不含化合物的新鲜培养基。每孔的终体积均为200μL。所有样品均一式三份测定，用一块不含病毒的重复板测定化合物的毒性。培养板在37℃、5％CO₂和潮湿环境下温育6天，之后收集上清液分析RT活性，并通过XTT染料还原法分析平行板的细胞存活力。也用显微镜检查孔，记录任何异常。此处提供了该试验的结果。

用于细胞存活力和化合物细胞毒性的XTT染色

通过在含有细胞和化合物、不含病毒的重复微孔板中测定四唑鎓染料XTT(2，3-二(2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基)-5-[(苯氨基)羰基]-2H-四唑鎓氢氧化物)的减少，获得待测物质的TC₅₀值。代谢活性细胞中的XTT被线粒体酶NADPH氧化酶代谢为可溶性甲月替产物。每日制备XTT溶液，为PBS中的1mg/mL贮存液。在PBS中制备15mg/mL的Phenzaine甲基硫酸盐(PMS)溶液，贮存于暗处和-20℃下。在使用前立即用PBS 1∶100稀释PMS，加入40μL/mL XTT溶液，制备XTT/PMS贮存液。向平板的每孔中加入50微升XTT/PMS，平板在37℃下温育4小时。对于每次试验，根据经验确定4小时温育，这处于使用指定数量细胞的MTS染料还原的线性应答范围内。使用粘性平板密封材料代替盖子，将密封的平板反转数次，以混合可溶性甲月替产物，用Molecular Devices SpectraMax Plus 96孔板格式的分光光度计在450nm下读数。此处提供了该试验的结果。

逆转录酶试验

测定无细胞上清液中的逆转录酶活性，它是病毒复制的一个量度。氚标记的胸苷三磷酸(NEN)(TTP)以5 Ci/mL重悬浮于蒸馏水中。制备Poly rA和oligo dT贮存液，保存于-20℃下。每天新鲜制备RT反应缓冲液，其含有125μL 1.0M EGTA、125μL dH₂O、110μL 10％SDS、50μL 1.0M Tris(pH 7.4)、50μL 1.0M DTT和40μL 1.0MMgCl₂。这三种溶液以2份TTP、1份poly rA∶oligo dT和1份反应缓冲液的比例混合在一起。将10微升(10μL)该反应混合物置于圆底微孔板中，加入15μL含病毒的上清液，混合。平板在37℃下温育60分钟。反应后，将反应体积点样到DE8 1纸片上，用5％磷酸钠缓冲液洗涤5次，各5分钟，用蒸馏水洗涤2次各1分钟，用70％乙醇洗涤2次各1分钟，然后干燥。向每份样品中加入Opti-Fluor O，利用Wallac 1450 Microbetaplus液闪计数仪定量掺入的放射性。此处提供了该试验的结果。

与树状细胞结合的HIV对T细胞的感染(DC/T试验)

用NSI/R5 Ba-L株以10^-3的感染复数感染单核细胞衍生的树状细胞(MO-DC)，单独培养，或者以1∶1或1∶10的比例与自体同源的CD4(+)T细胞一起培养。在感染前1小时，向MO-DC中加入连续稀释的苏拉明，在感染过程中保持存在。感染后，充分洗涤细胞，加入与预温育时相同浓度的化合物。培养基和化合物每周更换两次。2周后通过ELISA测定上清液中的HIV Ag，利用线性回归(Vanham G等人，AIDS2000，14：2299-2311)计算EC₅₀值(50％有效浓度)。此处提供了该试验的结果。

结果

以前报告苏拉明在体外保护T细胞对抗由嗜人T淋巴细胞病毒(HTLV-III)引起的感染、复制和细胞病变(Mitsuya H等人Science，Oct；226(4671)：172-4，1984；Balzarini J.等人Int.J.Cancer.，37：451-7，1986)。而且，也在卡波西肉瘤或AIDS相关复征患者中检测，获得部分成功的结果(Broder S.等人，Lancet.，2(5456)：627-30，1985)。然而，苏拉明从未被评价或打算用作预防HIV性传播的阴道内或直肠内方法。全身毒性和较差的治疗指数是不再继续临床试验的主要原因。这些原因，以及苏拉明的长半衰期和高蛋白质结合特性，妨碍了他人认识到可以局部施用苏拉明来预防性传播。

在此发现苏拉明钠具有对抗HIV-1的嗜淋巴细胞和嗜单核细胞株的高活性(在病毒进入试验中，对IIIB的IC₅₀＝7.3μg/mL[72小时温育]和18.5μg/mL[2小时温育]，对Bal为0.34和5.5μg/mL[2小时温育])(图5)。它在不依赖CD4的上皮细胞传播试验(ME-180试验；IC₅₀＝24.5μg/mL)(图6)、依赖CD4的细胞-细胞传播试验(CTC试验；IC₅₀＝93.5μg/mL)(图5)和树状细胞(DC)/T淋巴细胞模型(IC₅₀＝17μg/mL)中也有效(结果在表7中显示)。

表7.HIV从树状细胞向T细胞传播的抑制

  化合物              实现传播的细胞树状细胞(DC)DC+T细胞(1∶1)DC+T细胞(1∶10)  苏拉明  (EC₅₀，μg/mL)56±657.5±517±3

在多种浓度的苏拉明存在下，BaL(R5 HIV-1)感染的DC单独培养，或者以两种比例与自体同源的T淋巴细胞一起培养。

在ME-180试验中加入粘蛋白模拟宫颈阴道分泌物不会显著降低苏拉明的活性(图6)。在KY Jelly^中配制2％的苏拉明，其抗病毒活性保持完整。有趣的是，在Replens^(一种基于carbopol的阴道润滑剂)中配制苏拉明具有显著的协同效应，特别是在苏拉明对抗不含细胞的和细胞结合的HIV-1 IIIB的抗病毒活性方面(表8)。

表8.苏拉明制剂的抗HIV活性

   化合物           无细胞株  细胞结合株IIIB(mg/mL)BaL(mg/mL)IIIB(mg/mL)   苏拉明    18.5    5.5    93.5   KY Jelly^中的2％苏拉明    24.4    3.16    287.5   Replens^中的2％苏拉明    2.1    7.2    9.6   阳性对照    1.6    14.6    12.9

数据代表50％抑制浓度(IC₅₀)。

靶细胞是表达CD4/复合受体的HeLa细胞。温育时间：2小时。

本发明的组合物和方法的预防方面在本发明之前未被完全了解。例如，在本发明之前，已知HIV在接触后不到2小时内感染阴道粘膜(Hu J等人，J Virol 2000 Jul；74(13)：6087-95)，直肠粘膜同样在较短时间内感染。然而，报道的旨在描述苏拉明抗HIV活性的所有试验都使用延长的温育(天)，其中化合物在整个温育期间均存在。尽管这种评价模式适于治疗用途，但是不适于描述预防HIV阴道或直肠传播的方法，其中药物应当在感染窗口期起作用，窗口期从性接触时开始，一旦化合物降到有效浓度以下(例如，由于泄露或稀释)，或者病毒被恢复的酸性阴道pH灭活，即终止。

另外，阴道和直肠粘膜中存在的上皮细胞和树状细胞能够感染或传播活病毒，甚至在初始感染几天后仍然如此。现在发现，苏拉明能够阻断不依赖CD4的上皮细胞和树状细胞感染，没有这两个事件就不可能预防性传播。

为了预防HIV的粘膜传播，包括如此处所述的宫颈-阴道HIV感染，应当获得关于组合物功能和有效性的许多关键实验数据。例如，化合物或组合物应当a)在与病毒接触不到2小时内灭活病毒或抑制HIV进入，因为这是病毒感染阴道粘膜的公认的时间范围；b)有效对抗细胞结合的病毒，这是精液中HIV荷载的重要成分(即阻断细胞-细胞传播)；c)阻断上皮细胞的感染，以及携带CD4的细胞；d)阻断树状细胞(粘膜传播的主要靶标之一)的HIV感染和传播；e)抑制嗜单核细胞HIV-1株(，在性传播中居支配地位)。

现证明，苏拉明具有上述所有特征。而且，在此也证实，苏拉明对阴道上皮或乳杆菌(控制病原微生物生长的产过氧化氢细菌)没有毒性，并且显示对阴道细胞的抗炎症活性(即抑制阴道分泌促炎细胞因子)。后一个发现使苏拉明成为一种可与表面活性剂、病毒灭活剂、抗微生物剂和杀微生物剂组合的理想药物，因为它们的性质-显示促炎活性，这是有利于HIV粘膜传播的一个特征。而且，还没有证实当阴道施用时，苏拉明显示可以忽略的生物利用度。

如果一种化合物没有上述特征，本领域技术人员应当理解，不能推荐该化合物或组合物作为HIV性传播的预防药物。

对抗HSV的活性

苏拉明抗HSV活性的评价是根据Herold等人，J.Virol.，70：3461-3469(1996)所述的方法。该化合物用磷酸缓冲液(PBS)连续稀释(1000μg/ml到1.0μg/ml)，每个稀释度与两个连续稀释的(10^-5和10^-6)HSV(2型333株)的每一个混合。病毒工作滴度分别为约10³和10⁴噬斑形成单位(pfu)每ml。每种混合物的样品(1ml)一式两份接种于25cm²摇瓶底上洗涤并排干的CaSki细胞(一种人宫颈上皮细胞系，获自美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD)汇合单层上。每种培养物中的最初滴度(如不加待测药物的对照培养物所示)以pfu/ml为单位给出。将摇瓶温育2小时，之后除去培养基(含有病毒和待测化合物)，用PBS洗涤细胞。细胞在补充1％血清和0.5％甲基纤维素的培养基199中培养3天，为了防止次级噬斑的形成，培养基中含有抗-HSV抗体。通过相差显微镜用姬姆萨染色细胞，以计数病毒噬斑。对稀释度校正后，根据噬斑数推断病毒滴度。数值对对照滴度5×10⁸pfu/ml校正。数据表示为病毒滴度和在对照细胞培养物(不暴露于待测药物)中计数的噬斑的百分数。在100μg/ml时显示没有活性的待测化合物被认为没有作为抗HSV剂的活性。根据噬斑形成单位(pfu)/ml随化合物浓度改变的图，用曲线拟合软件(TableCurve 2D，版本3.02)估计使病毒滴度减少50％所需的化合物浓度(IC₅₀)。

苏拉明钠对HSV-2也高度有效，在噬斑测定中在100μg/mL时显示病毒感染100％抑制。结果在图7中显示。在检测的最高浓度(1000μg/mL)时没有显著的细胞毒性，苏拉明对HSV-2和HSV-1的IC₅₀分别为1和30μg/mL。

对抗巨细胞病毒的活性

在巨细胞病毒结合试验中，在单独的培养基或含有1-1000μg/mL苏拉明的培养基存在下，氚化的鼠巨细胞病毒(MCMV)与NIH3T3成纤维细胞在固定(0.4％低聚甲醛)的24孔板中温育，37℃2小时(振摇)。然后充分洗涤细胞，用1％SDS和triton X-100裂解。用闪烁计数仪定量裂解物的放射性(cpm)。

苏拉明钠对CMV也有效，在结合试验中显示IC₅₀＝50μg/mL，如图8所见。

对抗沙眼衣原体(CT)的活性

根据Cooper M.D.等人，J.Gen.Microbiol.，136：1109-1115(1990)所述进行衣原体增殖的抑制。在实验前，快速融化(37℃)冻存的沙眼衣原体(血清型E/UW-5/CX)，通过温和的超声处理悬浮。制成1∶10连续稀释的细菌悬液，从10^-1到10^-7。

在存在或不存在检测药物的情况下，对(盖玻片上的)HeLa单层接种100μL不同稀释度的衣原体(原生小体)。检测0.1、1.0、10、100和1000μg/ml的苏拉明化合物。1小时后，洗涤单层，除去游离的衣原体和待测药物，温育48小时。

去除培养基，HeLa单层用甲醇固定，洗涤，用Kallsted衣原体培养确认用荧光素偶联的单克隆抗体处理。标记抗体与细胞的反应在室温(即25℃)下在潮湿容器中(避光)进行30分钟。用水洗涤细胞，向载玻片上滴加一滴封固剂，放上盖玻片。衣原体感染产生的包涵体用荧光显微镜显示为绿色荧光。数据报告为每毫升未稀释的衣原体滴度的包涵体形成单位数量，并在每个实验中根据对照培养物(不含待测药物)调节为2.6×10⁷IFU/ml的对照值。在1000μg/ml时显示无活性的化合物被认为没有作为抗衣原体药物的活性。所有数据经对数转换后，用曲线拟合(TableCurve 2D，版本3.02；Jandel Scientific)软件生成剂量-应答曲线。

苏拉明钠在100μg/mL时使CT增殖抑制75％(IC₅₀＝28μg/mL)(图9)。在2mg/mL时，基本上完全抑制(对照滴度：1×10^-5，苏拉明钠滴度：0.08×10^-5)。

淋病奈瑟氏球菌(GC)

淋球菌生长抑制

淋球菌生长抑制试验通过Anderson R.A.等人，J.Androl.，21：862-875；2000的方法进行。简言之，从局部非并发的淋病病例分离淋病奈瑟氏球菌(通过革兰氏染色、氧化酶反应性和糖酵解证实)。通过在GC培养液中稀释为0.5 McFarland标准(每ml约10⁸集落形成单位)，调节对数期培养物的滴度。用不含添加物的培养液(对照)1∶10稀释，待测药物的每个1∶10连续稀释度为1mg/ml-1.0μg/ml。培养物在37℃下温育4小时。在GC培养液中制备4个1∶10连续稀释度，每个稀释度的一部分接种到GC琼脂板上。将平板温育过夜，在亮视野显微镜下计数获得的淋球菌菌落。每个苏拉明浓度的数据表示为每ml原始对数期细菌悬液的集落形成单位(CFU)的数量。

根据图10(检测1-1000μg/mL苏拉明的试验)，没有明显的剂量-应答。然而，苏拉明钠在1mg/mL时完全抑制GC生长(增殖试验)。

表9概括了本发明的苏拉明组合物的抗微生物活性。

表9.苏拉明组合物的抗微生物活性的概述

  活性类型    抑制/灭活    试验    效能 注释  抗微生物  (体外)    HIV-1    VBIA-IIIb    MAGI-Bal    ME-180    临床分离株    CTC    DC    高    高    高    高    高    高 IC₅₀＝7.3μg/mL IC₅₀＝0.39μg/mL IC₅₀＝24.5μg/mL IC₅₀＝14.6μg/mL IC₅₀＝93.5μg/mL(API)和 9.6μg/mL IC₅₀＝17μg/mL    SIV    逆转录酶    高 IC₅₀＝4μg/mL    HSV-2    噬斑    高 IC₅₀＝1μg/mL(HSV-2)和 30μg/mL(HSV-1)    CMV    结合    中 IC₅₀＝50μg/mL    衣原体(CT)    增殖    高 IC₅₀＝28μg/mL；2mg/mL 时100％抑制    淋球菌(GC)    增殖    中 1mg/mL时100％抑制。 没有剂量应答

可以认为这是第一次报告苏拉明显示抗细菌活性。苏拉明显示对沙眼衣原体和淋病奈瑟氏球菌有抑制活性，这是两种最流行的性传播病原体。根据已知的抗病毒或杀锥虫活性无法预测苏拉明的这种抗细菌活性。

实施例3

局部毒性

阴道细胞毒性

阴道细胞毒性通过3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基溴化四唑鎓(MTT)试验和细胞因子试验测定，这两种方法均如Fichorova R.N.等人，J.Infect.Dis.184(4)：418-28，2001所述。在暴露于化合物之前通过平板接种希望的细胞，MTT试验评价多种化合物对细胞系的细胞毒性。在处理当天，从孔中仔细吸出培养基，替换为含有不同浓度的待测化合物的新鲜培养基。细胞与多种化合物温育6小时，用新鲜培养基洗涤，然后加入MTT，平板在37℃下温育足以使MTT通过与代谢活性细胞反应形成甲月替晶体的一段时间。甲月替晶体在37℃下在含有溶于0.01M HCl的10％SDS的溶液中溶解过夜。用微孔板读数器(Dynex)在540nm和690nm的参考波长下测量每孔的吸光度。

使用商品ELISA试剂盒(R&D Diagnostics，Minneapolis，MN)，按照厂商说明书，测定在化合物-细胞温育6小时后收集的上清液中的白介素水平(参见Fichorova R.N.等人，J.Infect.Dis.184(4)：418-28，2001)。

如上所述，在MTT试验中，以10mg/mL-10μg/mL的浓度与人阴道细胞系(VK2)温育30分钟、6小时和24小时，苏拉明钠没有显示细胞毒性证据(图11)。在使用不同细胞系，如MT-2、HeLa、CaSKi等的抗微生物试验中描述的细胞毒性作用的缺乏支持了这一发现。在与硫酸葡聚糖、硫酸纤维素和N-9的比较研究中，苏拉明钠的细胞毒性最低。

使苏拉明制剂能够作为预防HIV性传播的阴道方法的另一个因素是证实它对阴道环境没有不利的影响。苏拉明被证明对于阴道上皮内侧和乳杆菌(阻止病原细菌生长的有益细菌)是安全的。而且，苏拉明不诱导促炎反应，并且减少表面活性剂引起的炎症。表面活性剂(如壬苯醇醚-9)在临床试验中的失败，不是因为它们的杀病毒活性较差，而是因为它们引起炎症(Van Damme L.等人，Lancet.，360(9338)：971-7，2002；Fichorova R.N.等人，J.Infect.Dis.184(4)：418-28，2001)，显示与抗炎症活性的苏拉明的组合似乎是理想的。

促炎细胞因子

在ELISA试验中，苏拉明钠不诱导培养的阴道细胞释放IL-1β。这与N-9和其它表面活性剂的作用完全不同。如图12部分所见，使用IL-1α、IL-6、IL-8和IL-18获得类似的结果(数据未显示)。没有促炎细胞因子的刺激。此外，苏拉明钠也降低了N-9诱导的阴道细胞释放IL-1和IL-8，因此具有抗炎症活性(图12)。这种活性应当与减少作为HIV感染靶标的白细胞的数量有关。

乳杆菌生长

5mg/mL(检测的最高浓度)苏拉明钠对加氏乳杆菌(Lactobacillusgasseri)的生长没有抑制作用(生长率为对照的107％)(图13)。

下面表10显示了局部毒性活性的概括：

表10：苏拉明组合物的局部毒性活性

  活性类型抑制/灭活试验  效能  注释  局部毒性  (体外)乳杆菌倍增时间  无  检测的最高浓度＝5  mg/mL阴道细胞细胞毒性MTT  无  检测的最高浓度＝10  mg/mL(不同细胞型)促炎细胞因子ELISA  无  IL-1β、IL-1、IL-8、  IL-6、IL-18(降低N-9  诱导的细胞因子释放)

实施例4

药代动力学

主要由于全身副作用，苏拉明作为一种治疗剂已经被放弃，因此对于作为阴道预防性抗STD病原体方法的用途(这种应用)的可行性，证明阴道腔的低生物利用度是关键。

对雌性大鼠(n＝6)每kg施用30mg化合物，在盐水中单次静脉内给药，或阴道内给药，每天两次，共5天，在KY jelly中配制。选择的单剂量是估计的人剂量(250mg)的10倍。在进行该研究期间未观察到临床体征。对于静脉内给药，在开始给药后1小时(第一个时间点)在血浆中测到相对高浓度的苏拉明钠(平均值＝563μg/mL)。长平均半衰期值(68.5hr)和小平均清除值(1.75mL/hr)提示，按照这种给药途径，苏拉明钠似乎被缓慢地清除。计算平均分布体积为147mL/kg。

对于阴道内给药，在最后一次给药3.5小时后在血浆中检测到相对低浓度的化合物(平均值＝17.7μg/mL)。长平均半衰期值(132hr，约5.5天)和小平均清除值(0.006mL/hr)提示，在阴道内给药后，苏拉明钠似乎被缓慢地清除。

根据阴道内施用的总剂量(90mg)计算的生物利用度在0.8％，可以忽略。在静脉内接受化合物溶液的雌性大鼠的所选组织(阴道、肺、肝和肾)中未观察到组织学损伤。

由于口服后的全身吸收极差，苏拉明在过去静脉内施用。而且，由于高蛋白质结合亲和力，以大剂量(克级)施用。大剂量静脉内施用的苏拉明显示副作用，降低了它作为一种全身HIV药物的治疗指数。因此，临床试验没有放大，该化合物没有进一步研究。然而，在作为粘膜(阴道)杀微生物药和避孕药的预期用途中，较差的全身吸收是一个优点，因为这使它的作用限制在施用部位，并且防止了全身副作用的发展。如上所述，所进行的药代动力学研究证实在阴道施用后生物利用度可以忽略(＜1％)。

表11列出了药代动力学分析的小结。

表11.药代动力学分析小结，显示以30mg/kg的剂量静脉内输注和阴道内施用后，雌性大鼠血浆中苏拉明的平均值和多个药代动力学参数

  组  Kel    Cmax    (μg/ml)    AUC(tf)    (μg-hr/ml)    AUC(I)    (μg-hr/ml)  t1/2  (hr)   Vdss   (mL/kg)  CL  (mL/hr)  IV  0.0102    563    13857    17289  68.6    147  1.75  Ivag  0.005    17.7    1174    2275  2275    132  0.006

IV：30mg/kg的单次静脉内剂量

Ivag：30mg/kg的阴道内剂量，每天两次，共5天

AUC(I)：血浆浓度与时间曲线下从时间0到无限远的面积

AUC(tf)：血浆浓度与时间曲线下从时间0到给药后144小时的面积

CL：血浆清除率

Cmax：最高可观察浓度

Kel：清除常数

Tmax：到Cmax的时间

t1/2：末期半衰期

Vdss：稳态时的表观分布体积

本说明书中提到的所有公开文献均在此引入作为参考，如同每个公开文献具体、分别地引入作为参考。

尽管已经参照具体实施方案描述了本发明，但是应当理解，能够做进一步修饰。本申请旨在涵盖总体上遵循本发明原则的本发明的所有变化、用途或改变，包括与本公开内容的如下偏离：其在本发明所属的领域内已知或属常规实践，可适用于如以下权利要求范围所述的必要特征。