壳聚糖－海藻酸钙凝胶微球软组织增强材料及制法和应用

摘要

一种壳聚糖—海藻酸钙凝胶微球软组织增强材料，由海藻酸钙凝胶微球包覆壳聚糖膜，并与海藻酸钠混合形成凝胶，其中海藻酸钙凝胶微球的粒径为1－2000μm。其制备是先将海藻酸钠溶液制备成海藻酸钙凝胶微球；将海藻酸钙胶微球与壳聚糖溶液成膜，制得壳聚糖—海藻酸钙凝胶微球；将壳聚糖—海藻酸钙凝胶微球与海藻酸钠溶液混合，制得壳聚糖—海藻酸钙凝胶微球软组织增强材料。本发明的软组织增强材料主要针对压力性尿失禁、胃食道反流症、单侧声带麻痹等由于局部软组织结构松弛所造成的疾病的微创伤治疗，同时也可用于隆胸、面部整形等美容医学领域。本发明可以采取皮下注射、皮内注射方法植入，还可以根据要求采用其他植入方法。

说明书

技术领域

本发明涉及一种局部注射植入软组织增强材料，具体地说涉及一种壳聚糖-海藻酸钙凝胶微球软组织增强材料。

本发明还涉及上述材料的制备方法。

本发明还涉及上述材料的应用。

背景技术

目前针对压力性尿失禁、胃食道反流症和单侧声带麻痹等由于局部软组织结构松弛所造成的疾病治疗多采用手术悬吊和局部植入增强材料等手段进行治疗[文献1：Ghoniem GM，Elgamasy AN，Elsergany R，et al.Grades of intrinsic spincteric deficiency(ISD)associated with female stressurinary incontinence.Int Urogynecol J，2002：13(2)：99-105.]。其中，局部注射植入软组织增强材料属于微创伤治疗方法。这种治疗方法的原理是：将某些药物和化学制剂注入结构松弛的软组织局部，改善局部松弛程度，提高局部耐受压力的能力，从而使该组织恢复其正常功能或外观。此治疗方法也广泛用于隆胸、面部整形等美容医学领域。此治疗方法，由于临床手术操作简单，患者痛苦少，且治疗效果显著，所以临床应用较多。此治疗方法的技术关键在于植入材料的研制，要求植入材料符合无抗原性(non-antigenic)、无迁移性(non-migrating)、无再吸收性(non-resorbable)和易移植性(easily implantable)等要求[文献2：Bent AE，Tutrone RT，McLennan MT，et al.Treatment of intrinsic sphincter deficiency usingautologous ear chondrocytes as a bulking agent.Neurourol Urodyn，2001；20(2)：157-165.]。目前用于这方面实验研究和临床治疗的植入材料[文献3：Van Kerrebroeck P，Ter Meulen F，Farrelly E，et al.Treatment of stress urinaryincontinence：recent developments in the role of urethral injection.Urol Res，2003；30(6)：356-362.]有1)聚四氟乙烯微球，文献报道其在体内易于迁移，且会在局部产生肉芽肿；2)自体脂肪，虽然生物相容性好，但体内再吸收迅速、效果不佳；3)戊二醛交联牛胶原蛋白，易产生过敏反应，且微量戊二醛残留对人体有害；4)硅树脂球、陶瓷微球等，由于植入方式和成本等原因，应用也受到限制。

发明内容

本发明的目的在于提供一种易于注射的、对人体安全的、成本较低的壳聚糖-海藻酸钙凝胶微球软组织增强材料。

本发明的另一目的在于提供一种制备上述材料的方法。

为实现上述目的，本发明提供的软组织增强材料是由壳聚糖-海藻酸钙凝胶微球和海藻酸钠溶液混合组成，形成混合物作为局部注射植入软组织增强材料，即由海藻酸钙凝胶微球包覆一层壳聚糖膜，与海藻酸钠溶液混合形成凝胶状态，其中海藻酸钙凝胶微球的粒径为1-2000μm，海藻酸钙凝胶微球与壳聚糖溶液以体积比为1∶1-1∶10成膜，壳聚糖-海藻酸钙凝胶微球与海藻酸钠溶液的体积比为10∶1-10∶30。

本发明的制备方法及参数如下：

本发明采用的原材料是广泛用于生物医学研究和应用领域的、具有良好的生物相容性的多糖类生物材料海藻酸钠和壳聚糖。

本发明以重量体积比为0.1～4.0％的海藻酸钠溶液，在0.01～1.0mol/LCaCl₂溶液为凝胶浴或以碳酸钙、乳酸钙、草酸钙颗粒为分散相的条件下，制备海藻酸钙凝胶微球(CAM)，海藻酸钙凝胶微球的粒径在1～2000μm之间。然后将制备好的海藻酸钙凝胶微球与0.1～4.0％(w/v)壳聚糖溶液按体积比1∶1-1∶10成膜，制得壳聚糖-海藻酸钙凝胶微球。

将壳聚糖-海藻酸钙凝胶微球与0.1～4.0％(w/v)的海藻酸钠溶液混合，壳聚糖-海藻酸钙凝胶微球与海藻酸钠的混合比例为10∶1～10∶30(体积比)，从而制备得到壳聚糖-海藻酸钙凝胶微球软组织增强材料。以上操作均在无菌条件下进行。

需要说明的是，关于制备海藻酸钙凝胶微球的方法是一公知技术，比如采用静电液滴法、气动液滴法、乳化/内部凝胶化、膜乳化/内部凝胶化等方法均可以制备出本发明所述的海藻酸钙凝胶微球。为简明起见，本发明对这些公知技术不作详细描述。有关这些公知技术的详细报道可参阅：

静电液滴法[参阅文献：Hommel M，Sun A M，Goosen M F A.Dropletsgeneration.Canadian patent No.1241598，1988]；

气动液滴法[参阅文献：Miyawaki O.，Nakamura K.，Yano T..Agric.Biol.Chem.1980，44：2865-2870]；

乳化/内部凝胶化[参阅文献：Poncelet D，Lencki R，Beaulieu C et al.Production of alginate beads by emulsification/internal gelation.I.Methodology.Appl.Microbiol.Biotechnol.，1992，38：39～45；]、[Poncelet D，Poncelet De Smet B，Beaulieu C et al.Production of alginate beads byemulsification/internal gelation.II.Physicochemistry.Appl.Microbiol.Biotechnol.，1995，43：644～650；]、[刘群，马小军，刘袖洞，一种乳化/内部凝胶化制备海藻酸钙凝胶珠的方法，中国专利，申请号01109449.4，公开号1374338]；

壳聚糖-海藻酸钙凝胶微球与海藻酸钠溶液可以是混合或分散等两种不同方法：

1.制备好的壳聚糖-海藻酸钙凝胶微球通过吸管等器具吸入海藻酸钠溶液中，通过搅拌使其混合均匀，并形成凝胶状态；

2.将海藻酸钠溶液在搅拌状态下均匀分散于壳聚糖-海藻酸钙凝胶微球中，并形成凝胶状态。

本发明提供的壳聚糖-海藻酸钙凝胶微球局部注射植入软组织增强材料主要针对压力性尿失禁、胃食道反流症、单侧声带麻痹等由于局部软组织结构松弛所造成的疾病的微创伤治疗，同时也可广泛用于隆胸、面部整形等美容医学领域。

本发明具有如下效果：

1.制备的壳聚糖-海藻酸钙凝胶微球软组织增强材料植入后，能够稳定固定在局部组织中或周围；

2.壳聚糖-海藻酸钙凝胶微球软组织增强材料植入后，能够在局部形成隆起实体，并保持一定形状，具有较高强度，体积保持率在72％以上；

3.壳聚糖-海藻酸钙凝胶微球软组织增强材料植入后，只在局部组织(隆起实体)周围形成较薄的纤维包裹层，未产生较明显的炎症反应，组织学检查正常；

4.壳聚糖-海藻酸钙凝胶微球软组织增强材料植入后，实验动物局部淋巴结组织学检查证明壳聚糖-海藻酸钙凝胶微球无迁移；

5.壳聚糖-海藻酸钙凝胶微球软组织增强材料植入后，机体能够保持正常生命活动，不产生毒副作用；

6.壳聚糖-海藻酸钙凝胶微球软组织增强材料植入后，解剖回收壳聚糖-海藻酸钙凝胶微球，壳聚糖-海藻酸钙凝胶微球仍能够保持较高球形度、基本无变形，并保持一定强度。

与本发明比较，背景技术的特征和效果如下：

1.单纯海藻酸钙凝胶注射；

2.将采用不同凝胶工艺、加入同源纤维原细胞和使用通过RGD序列肽修饰的海藻酸钠制备的注射剂注射效果进行了对比；

3.具体凝胶工艺有注射前海藻酸钙凝胶化和注射后海藻酸钙凝胶化；

4.动物实验表明，各组八周后皮下注射隆起实体的平均体积保持率在19％到88％不等，其中未加入同源纤维原细胞的实验组中最高平均体积保持率为58％；

5.组织学检查表明在隆起实体周围形成了薄层纤维包裹。

附图说明

图1：游标卡尺测量小鼠皮下注射动物模型隆起实体参数。

具体实施方式

海藻酸钙凝胶微球的制备技术为共知技术，实施例中均采用静电液滴法制备海藻酸钙凝胶微球为例说明。

实施例1

壳聚糖-海藻酸钙凝胶微球软组织增强材料制备：无菌条件下，2.0％(w/v)海藻酸钠溶液在1.0mol/L CaCl₂溶液为凝胶浴的条件下通过静电液滴法制备得到粒径主要在400～600μm的海藻酸钙凝胶微球，并将海藻酸钙凝胶微球与0.7％(w/v)壳聚糖溶液以1∶7体积比成膜，然后与0.5％(w/v)的海藻酸钠溶液以10∶20体积比混合，得到壳聚糖-海藻酸钙凝胶微球软组织增强材料。

实施例2

壳聚糖-海藻酸钙凝胶微球软组织增强材料制备：无菌条件下，0.5％(w/v)海藻酸钠溶液在0.01mol/L CaCl₂溶液为凝胶浴的条件下通过静电液滴法制备得到粒径主要在250-800μm的海藻酸钙凝胶微球，并将海藻酸钙凝胶微球与0.2％(w/v)壳聚糖溶液以1∶1体积比成膜，然后与2.0％(w/v)的海藻酸钠溶液以10∶10体积比混合，得到壳聚糖-海藻酸钙凝胶微球软组织增强材料。

实施例3

壳聚糖-海藻酸钙凝胶微球软组织增强材料制备：无菌条件下，1.5％(w/v)海藻酸钠溶液在0.1mol/L CaCl₂溶液为凝胶浴的条件下通过静电液滴法制备得到粒径主要在100-600μm的海藻酸钙凝胶微球，并将海藻酸钙凝胶微球与1.0％(w/v)壳聚糖溶液以1∶5体积比成膜，然后与1.0％(w/v)的海藻酸钠溶液以10∶15体积比混合，得到壳聚糖-海藻酸钙凝胶微球软组织增强材料。

实施例4

壳聚糖-海藻酸钙凝胶微球软组织增强材料制备：无菌条件下，2.0％(w/v)海藻酸钠溶液在1.0mol/L CaCl₂溶液为凝胶浴的条件下通过静电液滴法制备得到粒径主要在500-1000μm的海藻酸钙凝胶微球，并将海藻酸钙凝胶微球与0.4％(w/v)壳聚糖溶液以1∶10体积比成膜，然后与0.1％(w/v)的海藻酸钠溶液以10∶5体积比混合，得到壳聚糖-海藻酸钙凝胶微球软组织增强材料。

应用例

壳聚糖-海藻酸钙凝胶微球软组织增强材料小鼠皮下注射植入动物实验。

受体：昆明小鼠，雌雄兼用，30只，18～22g，购自大连医科大学动物实验中心，普通饲料喂养，随意饮食，室温(22～25)℃。

将小鼠分为两组，每组15只。第一组用微量注射器在小鼠背部皮下注射0.8ml壳聚糖-海藻酸钙凝胶微球软组织增强材料，产生隆起实体(半椭球体，见附图1)，于注射后当天、1、2、3、...、8周测量隆起实体参数(隆起实体长度a、隆起实体宽度b、隆起实体高度c)，计算隆起实体体积(2πabc/3)和隆起实体体积保持率(定义为该次隆起实体测量体积与第-次隆起实体测量体积之比的百分比)。于注射后2、4、8周处死部分小鼠，回收壳聚糖-海藻酸钙凝胶微球，并作组织切片，进行HE染色等组织学检查。第二组作为对照组，用微量注射器在小鼠背部皮下注射0.8ml 0.9％(w/v)NaCl溶液(生理盐水)，形成隆起实体，观察并测量隆起实体体积变化。

动物实验结果表明，总体上隆起实体体积保持率在80％之内，8周后回收的壳聚糖-海藻酸钙凝胶微球仍然完整，并保持较好的球形度。动物的生理活动状态及体重正常。组织学检查表明，注入局部组织周围只形成较薄的纤维包裹层，并未产生较明显的炎症反应。实验动物局部淋巴结组织学检查表明壳聚糖-海藻酸钙凝胶微球无迁移；对照组小鼠隆起实体1天内全部消失。

动物实验证明壳聚糖-海藻酸钙凝胶微球局部注射植入材料具有较高的强度，在植入组织部位能够很好的固定，且生物相容性良好，符合作为局部注射植入软组织增强材料的基本要求。

比较例：根据文献1报道，使用海藻酸钙凝胶注射，并采用不同凝胶工艺及加入同源纤维原细胞和使用通过RGD序列肽修饰的海藻酸钠进行对比，8周动物实验结果表明，各组八周后皮下注射隆起实体的平均体积保持率在19％到88％不等，其中未加入同源纤维原细胞的实验组中最高平均体积保持率为58％。而且，加入同原纤维原细胞虽然一定程度上提高了隆起实体的体积保持率，但是同时也带来了不易存储、临床应用推广困难和使用成本大幅度提高等问题。加入RGD不但会大幅度提高成本，而且该研究结果也表明，其加入并未提高注射后形成隆起实体的平均体积保持率。