人骨髓基质细胞来源的线粒体转运蛋白分子及其编码序列和用途

摘要

本发明涉及了一种人骨髓基质细胞来源的新型线粒体转运蛋白分子(Bonemarrow stromal cell－derived mitochondria carrier protein，HuBMSC－MCP)。本发明提供编码此蛋白分子的多核苷酸和经重组技术产生这种蛋白分子的方法。本发明还公开了编码这种新型线粒体转运蛋白分子的多核苷酸的用途。本发明还证实了HuBMSC－MCP可增强树突状细胞内吞作用。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体地说，本发明涉及新的编码人线粒体转运蛋白分子HuBMSC-MCP(human bone marrow stromal cell-derived mitochondriacarrier protein)多肽的多核苷酸，以及此多核苷酸编码的多肽。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的用途和制备。具体地说，本发明的多肽是一种新的线粒体转运蛋白分子。

背景技术

骨髓基质细胞作为造血微环境的主要成分，对造血系统的分化和维持至关重要。除了与造血干细胞的直接作用，它们还可以通过分泌大量的细胞因子调控造血干细胞的分化。在一定程度上，某些白血病的发生与骨髓微环境的异常有关。骨髓基质细胞除了参与对造血的调控，目前还发现具有多种生物学功能，诸如，通过分泌趋化因子，生长因子，细胞因子调控免疫系统的发育和自稳；骨髓基质细胞作为间叶细胞，保留了多分化潜能，能够被诱导分化为成骨细胞，脂肪细胞，肌肉细胞，神经元细胞以及髓鞘细胞等；并且在一定的外界因素诱导下分化为抗原提呈细胞，刺激T细胞活化。因此研究骨髓基质细胞来源相关分子的生物学功能有助于探讨白血病的发病机制、细胞分化、组织形成、免疫调控以及损伤修复，是当前免疫学研究的热点。

线粒体内膜上镶嵌着许多与其代谢物质转运有关的功能相关，结构相似的蛋白质，被统称为线粒体转运蛋白超家族(mitochondrial carrier protein)。此超家族分子的结构特点为(1)均含有三个重复区域，每个区域包含100个左右的氨基酸；(2)每个区域包含一个序列基序(PX(D/E)Xh(K/R)X(R/K)X_{20->)(D/E)GX4)a(K/R)GRG，其中h代表疏水性氨基酸，a代表芳香族氨基酸；(3)疏水性分析显示每一区域含有两个跨膜螺旋，其间有一亲水区相连；(4)分子量在28-32kDa之间。该超家族已知的成员包括：ADP/ATP转运蛋白、解偶联蛋白、磷酸盐转运蛋白、酮戊二酸/苹果酸转运蛋白、柠檬酸转运蛋白、二羧酸转运蛋白、肉毒碱转运蛋白、鸟苷酸转运蛋白及一些未知功能的蛋白，如从酿酒酵母中提取的MRS3及MRS4蛋白，Grave病蛋白等。}

特异性免疫反应是由抗原提呈细胞捕获抗原，经加工、处理后将抗原信息传递给T、B淋巴细胞后诱发产生的，因此，抗原的加工处理和提呈是机体免疫反应的首要环节，直接关系到免疫激活或免疫耐受的诱导。

树突状细胞(dendritic cell，DC)是目前已知的机体内功能最强的专职性抗原提呈细胞，其主要通过两种途径捕获抗原：构成型巨吞饮和甘露糖受体介导的内吞。有效的内吞是DC发挥功能的关键环节。

因此，发现新的线粒体转运蛋白分子对于认识机体免疫细胞的作用机制等具有重要价值。线粒体转运蛋白分子在肿瘤的发生、生长过程中发挥重要调控作用，并可能在抗肿瘤、抗炎症反应、抗感染以及免疫功能调节等多个领域的免疫诊断和免疫治疗方面具有重要的开发和应用价值。因此，本领域迫切需要开发新的人骨髓基质细胞来源的线粒体转运蛋白分子。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的人骨髓基质细胞来源的线粒体转运蛋白以及其片段、类似物和衍生物。

本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。

本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途。

在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的HuBMSC-MCP多肽，该多肽是人骨髓基质细胞来源的，它包含：具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。

较佳地，该多肽选自下组：(a)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有增强树突状细胞内吞作用的功能的由(a)衍生的多肽。更佳地，所述多肽具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

在本发明的第二方面，提供编码分离的这些多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少80％相同性：(a)编码上述人HuBMSC-MCP的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种：(a)具有SEQ ID NO：1中192-1154位的序列；(b)具有SEQ ID NO：1中1-1433位的序列。

在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。

在本发明的第四方面，提供了制备人HuBMSC-MCP蛋白的方法，该方法包含：

(a)在表达条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出人HuBMSC-MCP蛋白。

在本发明的第五方面，提供了与上述的人HuBMSC-MCP多肽特异性结合的抗体。还提供了可用于检测的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中连续的15-1433个核苷酸。

在本发明的第六方面，提供了模拟、促进、拮抗人HuBMSC-MCP多肽活性的化合物，以及抑制人HuBMSC-MCP多肽的表达的化合物。还提供了筛选和/或制备这些化合物的方法。较佳地，该化合物是人HuBMSC-MCP多肽的编码序列或其片段的反义序列。

在本发明的第七方面，提供了检测样品中是否存在HuBMSC-MCP蛋白的方法，它包括：将样品与HuBMSC-MCP蛋白的特异性抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在HuBMSC-MCP蛋白。

在本发明的第八方面，提供了一种检测与人HuBMSC-MCP多肽异常表达相关的疾病或疾病易感性的方法，该方法包括：检测细胞样品中编码所述HuBMSC-MCP多肽表达量。

在本发明的第九方面，提供了本发明多肽和编码序列的用途。例如本发明多肽可被用于筛选促进人HuBMSC-MCP多肽活性的激动剂，或者筛选抑制人HuBMSC-MCP多肽活性的拮抗剂、或者被用于肽指纹图谱鉴定。本发明的人HuBMSC-MCP蛋白的编码序列或其片段，可被作为引物用于PCR扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列。

在本发明的第十方面，提供了一种组合物，它含有安全有效量的本发明的人HuBMSC-MCP多肽或其激动剂、拮抗剂以及药学上可接受的载体。这些组合物可用于促进树突状细胞的内吞作用，在治疗肿瘤、炎症、神经系统和心血管病等病症方面有应用前景。

本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1是本发明的人HuBMSC-MCP的cDNA序列。

图2是本发明的人HuBMSC-MCP的全长氨基酸序列。

图3是本发明的人HuBMSC-MCP与其他线粒体转运蛋白的氨基酸序列同源性比较图。上方序列是人HuBMSC-MCP，下方序列是其他线粒体转运蛋白。相同的氨基酸在多个个序列之间用黑体标出，相似的氨基酸用灰体标出。

图4是本发明的人HuBMSC-MCP RT-PCR表达分析，提示HuBMSC-MCP表达于某些肿瘤细胞。

图5是本发明的人HuBMSC-MCP的细胞内定位，提示HuBMSC-MCP分布在人线粒体内。

图6显示本发明的人HuBMSC-MCP过表达后，显著增强DC的内吞活性。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次分离了骨髓基质细胞来源的新型线粒体转运蛋白分子(Bone marrow stromal cell-derived mitochondria carrier protein，HuBMSC-MCP)。RT-PCR分析表明HuBMSC-MCP在某些肿瘤细胞中有表达，这表明HuBMSC-MCP维持着某些肿瘤细胞的分化。

此外，本发明的人线粒体转运蛋白分子HuBMSC-MCP与已知家族成员有极高的同源性，具有线粒体转运蛋白超家族成员的全部结构特征。这暗示HuBMSC-MCP与其他家族成员一样转运一种与线粒体氧化磷酸化相关的底物，为细胞的生命活动提供能量。共聚焦显微镜观察显示HuBMSC-MCP与线粒体共定位于人乳腺癌细胞系-MCF-7的伪足中。而伪足的形成是肿瘤细胞穿越血管内皮细胞下基底膜形成转移的显著特征，因此，本发明的人线粒体转运蛋白分子HuBMSC-MCP可能与肿瘤细胞的侵袭转移有关，为肿瘤细胞伪足的形成及移动提供能量。同时，本发明的人线粒体转运蛋白分子HuBMSC-MCP可显著增强DC的内吞作用。

因此，HuBMSC-MCP蛋白或其相关的拮抗剂、激动剂等可为治疗肿瘤等疾病提供新的免疫诊断和靶向治疗途径，因而具有巨大的应用前景。

在本发明中，术语“HuBMSC-MCP蛋白”、“HuBMSC-MCP多肽”或“线粒体转运蛋白分子HuBMSC-MCP”可互换使用，都指具有人线粒体转运蛋白分子HuBMSC-MCP氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的蛋白或多肽。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的HuBMSC-MCP蛋白或多肽”是指HuBMSC-MCP多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化HuBMSC-MCP蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括人HuBMSC-MCP蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然人HuBMSC-MCP蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“人HuBMSC-MCP多肽”指具有人HuBMSC-MCP蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与人HuBMSC-MCP蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或多个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或多个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人HuBMSC-MCP蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人HuBMSC-MCP DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人HuBMSC-MCP多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人HuBMSC-MCP多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了人HuBMSC-MCP多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人HuBMSC-MCP多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供人HuBMSC-MCP蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人HuBMSC-MCP多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“人HuBMSC-MCP蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

                      表1

最初的残基代表性的取代 优选的取代Ala(A)Val；Leu；Ile ValArg(R)Lys；Gln；Asn LysAsn(N)Gln；His；Lys；Arg GlnAsp(D)Glu GluCys(C)Ser SerGln(Q)Asn AsnGlu(E)Asp AspGly(G)Pro；Ala AlaHis(H)Asn；Gln；Lys；Arg ArgIle(I)Leu；Val；Met；Ala；Phe LeuLeu(L)Ile；Val；Met；Ala；Phe IleLys(K)Arg；Gln；Asn ArgMet(M)Leu；Phe；Ile LeuPhe(F)Leu；Val；Ile；Ala；Tyr LeuPro(P)Ala AlaSer(S)Thr ThrThr(T)Ser SerTrp(W)Tyr；Phe TyrTyr(Y)Trp；Phe；Thr；Ser PheVal(V)Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO：2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％ SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％ Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码HuBMSC-MCP蛋白的多聚核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的人HuBMSC-MCP核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science1985；230：1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或HuBMSC-MCP蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的HuBMSC-MCP多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码人HuBMSC-MCP多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，人HuBMSC-MCP多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg，et al.Gene，1987，56：125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans，J BioChem.263：3521，1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含人HuBMSC-MCP编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，aLaboratory Manual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体P_L启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

重组的人HuBMSC-MCP蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)：直接做为药物治疗HuBMSC-MCP蛋白功能低下或丧失所致的疾病，和用于筛选促进或对抗HuBMSC-MCP蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组人HuBMSC-MCP蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激人HuBMSC-MCP蛋白功能的多肽分子。

另一方面，本发明还包括对人HuBMSC-MCP DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人HuBMSC-MCP基因产物或片段。较佳地，指那些能与人HuBMSC-MCP基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人HuBMSC-MCP蛋白的分子，也包括那些并不影响人HuBMSC-MCP蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人HuBMSC-MCP基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人HuBMSC-MCP基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人HuBMSC-MCP蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T CellHybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断人HuBMSC-MCP蛋白功能的抗体以及不影响人HuBMSC-MCP蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人HuBMSC-MCP基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人HuBMSC-MCP基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

抗人HuBMSC-MCP蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人HuBMSC-MCP蛋白。此外，与人HuBMSC-MCP蛋白结合的单克隆抗体也可用放射性同位素标记，注入体内可跟踪其位置和分布。

本发明中的抗体可用于治疗或预防与人HuBMSC-MCP蛋白相关的疾病。给予适当剂量的抗体可以刺激或阻断人HuBMSC-MCP蛋白的产生或活性。

抗体也可用于设计成针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如人HuBMSC-MCP蛋白高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，红豆碱等)共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如SPDP，攻击抗体的氨基，通过二硫键的交换，将毒素结合于抗体上。

多克隆抗体的生产可用人HuBMSC-MCP蛋白或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。

利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与HuBMSC-MCP蛋白发生相互作用的物质，如配体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。

本发明蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂或受体等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。

本发明的多肽或其激动剂和拮抗剂可直接用于疾病治疗，例如用于肿瘤方面的治疗。在使用时，还可同时使用其他治疗剂。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明HuBMSC-MCP多肽或其激动剂、拮抗剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的HuBMSC-MCP蛋白或其拮抗剂、激动剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

人HuBMSC-MCP蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于HuBMSC-MCP蛋白的无表达或异常/无活性的HuBMSC-MCP蛋白的表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常。重组的基因治疗载体(如病毒载体)可设计成表达变异的HuBMSC-MCP蛋白，以抑制内源性的HuBMSC-MCP蛋白活性。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将HuBMSC-MCP基因转移至细胞内。构建携带HuBMSC-MCP基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook，et al.)。另外重组人HuBMSC-MCP基因可包装到脂质体中，然后再转移至细胞内。

抑制人HuBMSC-MCPmRNA的寡聚核苷酸(包括反义RNA和DNA)以及核酶也在本发明的范围之内。核酶是一种能特异性分解特定RNA的酶样RNA分子，其作用机制是核酶分子与互补的靶RNA特异性杂交后进行核酸内切作用。反义的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技术获得，如固相磷酸酰胺化学合成法合成寡核苷酸的技术已广泛应用。反义RNA分子可通过编码该RNA的DNA序列在体外或体内转录获得。这种DNA序列已整合到载体的RNA聚合酶启动子的下游。为了增加核酸分子的稳定性，可用多种方法对其进行修饰，如增加两侧的序列长度，核糖核苷之间的连接应用磷酸硫酯键或肽键而非磷酸二酯键。

多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括：将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。

能与人HuBMSC-MCP蛋白结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。筛选时，必须对人HuBMSC-MCP蛋白分子进行标记。

本发明还涉及定量和定位检测人HuBMSC-MCP蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的人HuBMSC-MCP蛋白水平，可以用作解释人HuBMSC-MCP蛋白在各种疾病中的重要性和用于诊断HuBMSC-MCP蛋白起作用的疾病。

一种检测检测样品中是否存在HuBMSC-MCP蛋白的方法是利用HuBMSC-MCP蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与HuBMSC-MCP蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在HuBMSC-MCP蛋白。

HuBMSC-MCP蛋白的多聚核苷酸可用于HuBMSC-MCP蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，HuBMSC-MCP蛋白的多聚核苷酸可用于检测HuBMSC-MCP蛋白的表达与否或在疾病状态下HuBMSC-MCP蛋白的异常表达。如HuBMSC-MCPDNA序列可用于对活检标本的杂交以判断HuBMSC-MCP蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用HuBMSC-MCP蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测HuBMSC-MCP蛋白的转录产物。

检测HuBMSC-MCP基因的突变也可用于诊断HuBMSC-MCP蛋白相关的疾病。HuBMSC-MCP蛋白突变的形式包括与正常野生型HuBMSC-MCP DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。

本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的。简而言之，根据本发明HuBMSC-MCP蛋白的cDNA制备PCR引物(优选15-35bp)，可以将序列定位于染色体上。然后，将这些引物用于PCR筛选含各条人染色体的体细胞杂合细胞。只有那些含有相应于引物的人基因的杂合细胞会产生扩增的片段。

一旦序列被定位到准确的染色体位置，此序列在染色体上的物理位置就可以与基因图数据相关联。这些数据可见于例如，V.Mckusick，Mendelian Inheritance inMan(可通过与Johns Hopkins University Welch Medical Library联机获得)。然后可通过连锁分析，确定基因与业已定位到染色体区域上的疾病之间的关系。

在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。本发明的多核苷酸是从人骨髓基质细胞cDNA文库中分离出的。其序列如SEQ ID NO：1所示，它包含的多核苷酸序列全长为1433个碱基，其开放读框位于192-1154位，编码全长为321个氨基酸的人HuBMSC-MCP蛋白(SEQ ID NO：2)。该HuBMSC-MCP蛋白属于线粒体转运蛋白家族分子，与ADP/ATP转运蛋白、解偶联蛋白、磷酸盐转运蛋白、酮戊二酸/苹果酸转运蛋白等氨基酸序列具有一定同源性，在线粒体转运蛋白结构域内一致性可高达25％以上，相似性则可达50％。RT-PCR分析表明HuBMSC-MCP在多种肿瘤细胞系中表达。因此，HuBMSC-MCP蛋白或其相关的拮抗剂、激动剂等可为治疗肿瘤、炎症、神经系统和心血管病等疾病提供新的免疫诊断和靶向治疗途径，因而具有巨大的应用前景。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：人HuBMSC-MCP cDNA的克隆

用Trizol试剂(Life Technologies公司)提取人骨髓基质细胞总RNA。然后，从总RNA中分离poly(A)mRNA。将poly(A)mRNA经逆转录形成cDNA后，用SuperScriptII克隆试剂盒(购自Gibco)将cDNA片段定向插入到载体的多克隆位点上，转化DH5α细菌形成cDNA质粒文库。用双脱氧法测定随机挑选克隆的5’末端的序列。将测定的cDNA序列与已有的公共DNA序列数据库进行比较，结果发现有一个cDNA克隆的DNA序列为新的全长cDNA。通过合成一系列引物对新克隆所含的DNA序列进行双向测定。计算机分析表明，克隆所含的全长cDNA是一个新的cDNA序列(如SEQ ID NO：1和图1所示)，编码一个新的蛋白质(如SEQ IDNO：2和图2所示)。此蛋白质被命名为人骨髓基质细胞来源线粒体转运蛋白分子HuBMSC-MCP，其编码基因命名为人骨髓基质细胞来源线粒体转运蛋白分子HuBMSC-MCP基因。

序列SEQ ID NO：1全长为1433bp，包括191bp的5’端非编码区和276bp的3’端非编码区，编码含321个氨基酸的多肽。理论上计算未糖基化的成熟分子的分子量约为35.4kD。

BLAST分析表明其与已知基因不同，与人线粒体转运蛋白的氨基酸序列具有一定同源性，一致性达28％，相似性达50％(图3)，属于线粒体转运蛋白(mitochondrial carrier protein)家族分子。

实施例2：用RT-PCR方法进行人HuBMSC-MCP的细胞表达分析

用Trizol试剂提取处于对数生长期人结肠癌细胞系LoVo、前列腺癌细胞系PC-3、宫颈癌细胞系HeLa、卵巢癌细胞系CaoV3、乳腺癌细胞系MCF-7等细胞的细胞总RNA。取5μg细胞总RNA与1μg Oligo-dT_12-18混合，进行反转录。反转录体系为20μl，反应结束后加80μl ddH₂O进行稀释。PCR扩增HuBMSC-MCP所用的引物如下：有义引物5’-GAG ACC AAC ATC CGT GAC-3’(SEQ ID NO：3)，反义引物5’CCTCGTCCTT ATGACTTC-3’(SEQ ID NO：4)，同时以β-肌动蛋白作为阳性对照。PCR反应体积为50μl，其中含反转录模板10μl、0.5mM引物、0.2mM dNTP和1U rTaq DNA聚合酶(Takara)，扩增参数为95℃ 15秒、57℃ 30秒、72℃ 30秒，28个循环后PCR产物行1.5％琼脂糖凝胶电泳初步确认。DNA序列分析结果表明该PCR产物的DNA序列与SEQ ID NO：1所示的386-971完全相同。

结果显示，HuBMSC-MCP mRNA在MCF-7乳腺癌细胞系、HeLa宫颈癌细胞系等多数肿瘤细胞中有表达，在LoVo细胞系中未见表达(图4)。

实施例3：人HuBMSC-MCP重组表达

在该实施例中，Trizol试剂(Life Technologies公司)提取人骨髓基质细胞总RNA作为模板，经过反转录后，用序列如下的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得人HuBMSC-MCP DNA作为插入片段。

PCR反应中使用的5’端寡核苷酸引物序列为：

5’-GCG GTA CCG ACT GAG TAC GGT CTT CTA A-3’(SEQ ID NO：5)

该引物含有KpnI限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是人HuBMSC-MCP的部分编码序列；

3’端引物序列为：

5’-CGG GAT CCC ATG GCG ACG GGC GGC CAG C-3’(SEQ ID NO：6)

该引物含有BamHI限制性内切酶的酶切位点、翻译终止子和人HuBMSC-MCP的部分编码序列。

将获得的PCR产物纯化后经KpnI和BamHI酶切再与质粒pRsetB(Invitrogen公司)按常规方法重组并转化至感受态大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆鉴定后纯化并测序(ABI公司的377型测序仪，BigDye Terminator试剂盒，PE公司)。将正确序列的人HuBMSC-MCPcDNA的质粒转化大肠杆菌BL21。阳性克隆用KpnI和BamHI酶切鉴定，产物行1.0％琼脂糖凝胶电泳分析。经测序证实，已插入了所设计的HuBMSC-MCP编码序列。

挑表达HuBMSC-MCP的阳性BL21克隆接种于100mlLB培养基中，37℃300rpm振荡培养12-15hr，1∶10稀释于预热的LB培养基继续振荡培养1.5hr，加1M IPTG至1mM后37℃诱导2-6hr，5,000g 4℃离心10min去上清，置冰上用50ml 1×PBS(0.14M NaCl，2.7mM KCl，10.1mM Na₂HPO₄，1.8mM KH₂PO₄，pH7.3)重悬，超声(B.Braun Labsonic U)破碎后再加入20％Triton X-100至1％轻摇30min，然后12,000g 4℃离心10min，上清用0.8μm滤膜过滤后，过2mlHis-Sepharose层析柱，1×PBS充分洗涤后，加入500ul洗脱缓冲液室温静置30分钟后收集洗脱液，重复洗脱2-3次，得到人HuBMSC-MCP蛋白。分子量与预测值相符。

实施例4：抗人HuBMSC-MCP抗体的产生

将实施例3中获得的重组蛋白人HuBMSC-MCP用来免疫动物以产生抗体，具体方法如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原，对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀人HuBMSC-MCP基因翻译产物的能力加以评估。结果发现，抗体可特异性地与本发明蛋白发生结合。

实施例5：HuBMSC-MCP真核融合表达载体的构建

在该实施例中，Trizol试剂(Life Technologies公司)提取人骨髓基质细胞总RNA作为模板，经过反转录后，用序列如下的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得人HuBMSC-MCP DNA作为插入片段。PCR反应参数为95℃ 15秒，58℃30秒，72℃ 45秒，20循环后72℃延伸10分钟，

全长HuBMSC-MCP上游引物为5’-GCG GTA CCG ACT GAG TAC GGT CTT CTA A-3’(SEQ ID NO：5)，下游引物为5’-CGG GAT CCC ATG GCG ACG GGC GGC CAG C-3’(SEQ ID NO：6)，产物编码全长HuBMSC-MCP蛋白。

PCR产物纯化后经KpnI和BamHI酶切，并与pEGFP-N1载体(Clontech公司)按常规方法重组并转化至感受态细菌DH5α。挑取白色克隆进行鉴定、纯化并测序。经测序证实，已插入了所设计的HuBMSC-MCP编码序列。

实施例6：HuBMSC-MCP蛋白细胞内定位的免疫荧光分析

以实施例5中所构建的HuBMSC-MCP全长融合表达载体质粒DNA利用LipofectAMINE试剂(Invitrogen)进行真核细胞293T的基因转染。瞬时转染细胞于转染后48小时以胰酶消化，铺于无菌盖玻片上，在共聚焦显微镜下进行观察。细胞器共定位检测，待细胞贴壁后，先分别用线粒体、内质网和高尔基器、溶酶体特异性染料进行染色，浓度为1μM，37℃，15分钟。用PBS洗后，共聚焦显微镜下进行观察。

结果显示：HuBMSC-MCP转染细胞的荧光信号均散在分布在胞浆内；细胞器共定位实验结果提示，HuBMSC-MCP分布于线粒体内(图5)。

实施例7：人HuBMSC-MCP显著增强DC的内吞活性

收集体外培养5天的树突状细胞，用无血清的RPMI1640洗两遍，并调细胞浓度至1×10⁷cells/ml。取300μl细胞悬液与20μg体外转录的HuBMSC-MCP mRNA混合，加入0.2-cm的电击杯中，用BTX ECM-830电穿孔仪，505V，99μs，2个电脉冲，中间间隔10sec。电穿孔后24h，取5×10⁵DC与0.1mg/ml FITC-dextran分别在4℃或37℃共孵育60min。冰PBS洗后，流式细胞仪分析。

结果显示，人HuBMSC-MCP转染DC后，显著增强DC的内吞活性(图6的A和B分别为对照和转染后的DC)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                           序列表

<110>第二军医大学免疫学研究所

<120>人骨髓基质细胞来源的线粒体转运蛋白分子及其编码序列和用途

<130>037861

<160>6

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1433

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(192)..(1154)

<223>

<400>1

ggcgccggcg gccacgccgc ggaaggcgcg ggccgagcag agccgggcgt tggagcccgc   60

gcgcgcatgg aggcgttgcc ggcagccctc tgagggcagc ggggagacaa gacccggcga  120

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             1               5                   10

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                50                  55                  60

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            65                  70                  75

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        80                  85                  90

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    95                  100                 105

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110                 115                 120                 125

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                130                 135                 140

aca aat tcc tta atg aat cct ata tgg atg gtt aaa acc cga atg cag    662

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Ala Phe Tyr Arg Gly Leu Phe Ala Gln Leu Ile Arg Gln Ile Pro Asn

                290                 295                 300

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<210>2

<211>321

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>2

Met Ala Thr Gly Gly Gln Gln Lys Glu Asn Thr Leu Leu His Leu Phe

1               5                   10                  15

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            20                  25                  30

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        35                  40                  45

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                85                  90                  95

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            100                 105                 110

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        115                 120                 125

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    130                 135                 140

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145                 150                 155                 160

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                165                 170                 175

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            180                 185                 190

Ser Tyr Ala Gly Ile Ser Glu Thr Ile Ile Cys Phe Ala Ile Tyr Glu

        195                 200                 205

Ser Leu Lys Lys Tyr Leu Lys Glu Ala Pro Leu Ala Ser Ser Ala Asn

    210                 215                 220

Gly Thr Glu Lys Asn Ser Thr Ser Phe Phe Gly Leu Met Ala Ala Ala

225                 230                 235                 240

Ala Leu Ser Lys Gly Cys Ala Ser Cys Ile Ala Tyr Pro His Glu Val

                245                 250                 255

Ile Arg Thr Arg Leu Arg Glu Glu Gly Thr Lys Tyr Lys Ser Phe Val

            260                 265                 270

Gln Thr Ala Arg Leu Val Phe Arg Glu Glu Gly Tyr Leu Ala Phe Tyr

        275                 280                 285

Arg Gly Leu Phe Ala Gln Leu Ile Arg Gln Ile Pro Asn Thr Ala Ile

    290                 295                 300

Val Leu Ser Thr Tyr Glu Leu Ile Val Tyr Leu Leu Glu Asp Arg Thr

305                 310                 315                 320

Gln

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(18)

<223>引物

<400>3

gagaccaaca tccgtgac                                                   18

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(18)

<223>引物

<400>4

cctcgtcctt atgacttc                                                   18

<210>5

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(28)

<223>引物

<400>5

gcggtaccga ctgagtacgg tcttctaa                                        28

<210>6

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(28)

<223>引物

<400>6

cgggatccca tggcgacggg cggccagc                                        28