对多个样本进行多基因座基因分型的微阵列方法

摘要

提供了在一次检测中对多个样本在多个基因座进行基因分型的方法。形成代表分立位点的基因组片段的微阵列，并与互补于基因组片段的合成寡核苷酸混合物杂交。通过读取微阵列信号获得基因型信息。本方法可用于鉴定来自多种生物源的样本，并可用于多种用途。

说明书

技术领域

本发明广义地说涉及到基因分型，且更具体地涉及到用于疾病诊断的基因分型。

发明背景

目前人类、动物和植物的许多病理疾病已在遗传水平得以阐明。随着人类基因组图谱宣布完成，可以预期在不久的将来会鉴定出更多人类疾病的遗传基础。因此，来自个体的DNA分析原则上可使得在缺乏明显症状的情况下诊断或鉴定出基于遗传的疾病。这对于许多疾病例如代谢紊乱是有利的，其中早期诊断能防止后期生活中严重的医学并发症。

分析DNA序列的方法(其在遗传学上通常指基因分型)在本领域公知。通常情况下，为判定样本中的DNA是否对应于遗传序列已知的特定疾病，将样本在允许杂交的条件下暴露于与该疾病相关的核酸探针。核酸探针经过标记，这样使得探针可检测是否探针已与DNA样本进行了杂交。在一项技术中，探针以阵列形式排列在芯片上，每一探针位于特定的位置。阵列暴露于标记的DNA样本后，扫描设备可检查阵列中的每一位置，并判定目标分子是否与该位置处的探针相互作用。阵列芯片可由商业渠道提供，例如从Affymetrix(Santa Clara，CA)获得，且在授予Affymetrix的专利中进行了描述(参见如美国专利号6,045,996、5,858,659和5,925,525，以及其中的参考文献)。阵列也已用于DNA测序，如通过杂交方法的序列测定，例如在美国专利号6,025,136、6,018,041、5,525,464和5,202,231中所描述的。

尽管已经存在用于疾病诊断的基因分型方法，但为使这些方法可用于公共健康，它们的费用必须适当。例如，尽管相关的遗传鉴定法已为人所知，但新生儿的筛选目前仍通过质谱的方法进行，这主要是基于费用的考虑。此外，用于公共健康的DNA诊断需要其可应用于多个样本以及可应用于难以使用质谱法的遗传疾病。多样本的需求可通过应用同时作用的多阵列芯片解决。如在美国专利号5,545,531(Rava等)中所描述，可使用包括标准的96孔微滴定板的排列，在所述标准的96孔微滴定板中每个孔的底部均含有一个阵列芯片。为在许多病人样本上进行同一试验，在溶液中的每个病人样本经过标记并导入不同的孔内，其中每个孔具有相同的阵列芯片。这样，在此方法中，每个样本应用一个单独的阵列芯片，由于每个病人的阵列、试剂、样本处理等的固定费用，该方法对于大规模的应用过于昂贵。

美国专利号5,807,522(Brown等)描述的方法应用病人基因组DNA的多个微阵列和代表给定基因的所有已知突变的探针DNA片段来筛选多个病人是否在疾病基因中存在已知突变。微阵列制作在以塑料支持的硝化纤维片上，在单独的阵列之间存在硅橡胶屏障以防止交叉污染。所有微阵列作为一单片材料操作。但Brown等的方法中，对筛选的每一突变等位基因或遗传标记应用单独的微阵列。

这样，需要具有足够精确度的用于诊断的基因分型方法，该方法的费用可以承受并可提供足够的通量用于大规模筛选。理想的情况是，这样的方法使得在一次检测中可对多个病人筛选多种疾病。更通常的情况是，该方法使得在一次检测中可对人类、动物、植物或微生物材料来源的多个样本筛选位于多个基因座处的等位基因。

发明概述

本发明提供了用于在一次检测中对多个样本在多个基因座处进行基因分型的方法。根据本方法，来自多个样本的基因组片段通过聚合酶链反应引物进行扩增，其中每个基因组片段包含一个基因座，即一个目的DNA标志。基因组片段在表面形成微阵列，其中在表面的每一位置处的材料基本上对应于来自单个样本的单个基因组片段。微阵列与合成的寡核苷酸混合物杂交，所述合成的寡核苷酸与微阵列上的基因组片段互补。多个样本的基因型信息通过读取微阵列信号得以同时获得。本方法可用于疾病诊断或从任何植物或动物物种中筛选等位基因，且因此具有广阔的应用范围。

附图简述

本专利文件包含至少一张彩图。在索要并交付所需的费用后，带有彩图的本专利的拷贝将由美国专利和商标局提供。

图1是根据本发明的一个实施方案同时对多个样本进行多基因座基因分型的方法的流程图。

图2是根据本发明的一个实施方案的一小部分微阵列的图解式说明。

图3A和3B显示了根据本发明的一个实施方案，检测出的分别由Cy3和Cy5发射的直接荧光信号，信号来自576个位点(从72个不同的病人样本中制备)的微阵列，如在以下的实施例中所描述的。微阵列信号在100％光电倍增管(PMT)和80％激光设置下由共聚焦扫描器读取。使用了常规的彩虹信号码，其中红色为强度最大，黑色为强度最小。

图4A和4B分别为图3A和3B中数据的放大部分。字母(a-c)和数字(1-28)如下表示了每个不同病人样本的位置：a 10-12，样本1(S/S)；a 13-15，样本2(A/S)；a 16-18，样本3(S/C)；a 19-21，样本4(C/C)；a 22-24，样本5(A/C)；a 25-27，样本6(A/A)；b 1-3，样本7(E/E)；b 4-6，样本8(A/E)；b 7-9，样本9(A/A)；b 10-12，样本10(野生型)；b 13-15，样本11(杂合的)；b 16-18，样本12(纯合的)；b 19-21，样本13(野生型)；b 22-24，样本14(杂合的)；b 25-27，样本15(纯合的)。应用来自阴性对照印刷缓冲液的信号(a28-30)进行背景消减。也显示了阳性杂交对照(b28-30、c1-3、c4-6、c7-9和c10-12)。距离条相当于1.0mm。

图5显示了在图4A中彩虹信号码所代表的信号的定量数值。消减背景后对三次检测进行平均。每一病人样本的基因型在图表的上面和下面给出。

图6A和6B显示了根据本发明的一个实施方案检测出的分别由Cy3和Cy5发射的信号，信号来自通过间接标记法从与图3A和3B为同一组病人样本制备的微阵列，如在以下的实施例中所描述的。信号如图3A和3B中所描述的方法进行检测。

发明详述

基因分型方法同时获得有关多个个体在多个疾病位点的信息。如此处所用，基因分型具体定义为：在给定的基因座处以单核苷酸分辨来区分等位基因。基因座(多个基因座)定义为遗传标志或DNA标志的染色体位置。这样，本发明方法具有所需的提供用于个人的筛选和诊断信息的精确度，所述信息可作为医疗决定的基础。

本方法的总结在图1中进行了图解式的阐明。首先，在步骤10，将基因组DNA样本从生物标本中分离出来。标本可为包括细菌、酵母、植物或动物的任何来源。任何含DNA的生物体均适用于本方法。在人类疾病诊断的应用中，生物样本如从血液、羊膜液、新生儿血液卡、唾液、精液、上皮刮取物和针吸活组织检查中获得。对于某些的生物体，生物标本可能含有RNA而不是DNA。样本应用标准的程序进行分离和纯化。

然后在步骤12用基因特异的引物通过聚合酶链反应(PCR)对样本DNA进行扩增，以产生所说的扩增子。PCR法已广泛应用，并已在本领域中充分描述(参见如美国专利号4,683,202、4,683,195、4,800,159、4,965,188和5,333,675，以及其中的参考文献)。将特异的引物对应用于每个目标基因组片段，即用于每一含已知潜在突变或其它DNA改变的目标基因组片段。因此，本方法可应用于任一用DNA标记鉴定的疾病。这些疾病包括如名为囊性纤维化、酪氨酸血症、槭糖尿病、α-l-抗胰蛋白酶缺乏症、I型丙二酸尿症、遗传性听力丧失、β-地中海贫血、长链3-羟酰基辅酶A脱氢酶缺乏症、中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症的一些疾病。本方法尤其用于如镰形细胞性贫血和半乳糖血症，其中已深入研究的单一基因的单一突变可产生疾病表型。DNA标志可代表任何已知类型的DNA改变，包括突变、单核苷酸多态性、小的缺失等。唯一的要求是目标DNA的改变必须处于用于产生扩增子的引物对内。这保证了从所有标本(包括来自纯合子、杂合子和正常个体的标本)中特定位点产生的复制子以近乎相等的效率进行扩增。

每一生物样本应用多引物对分别进行处理，以产生每一个体的多扩增子，每一扩增子与来自特定个体的特定基因组片段相关，每一基因组片段包含一个目的基因座。每一扩增子的长度，在目前应用的方法中为约60个碱基对，尽管本方法也可应用于复制子的长度在约40-1000个碱基对之间。每一PCR反应的总体积如目前通常采用的为约50μl。预期进一步的优化会将体积减少到5-10μl，其使用用于样本制备所需的PCR扩增和纯化的试剂数量的减少将进一步降低费用。

纯化基因组片段以移去污染物，如核苷酸、酶、引物和其它可干扰微阵列印刷、吸附或杂交的底物。用于PCR扩增子纯化的方法可从一些供应商获得，包括TeleChem(Sunnyvale，CA)和Qiagen(Valencia，CA)。纯化的扩增子悬在缓冲液中，如氯化钠和柠檬酸钠溶液(SSC)，二甲基亚砜溶液(DMSO)，氯化钠、磷酸钠和乙二胺四乙酸盐(SSPE)溶液或其它标准试剂。在步骤14中，将缓冲的扩增子排列在标准的96孔或384孔微板上，每孔分配一种扩增子溶液。尽管产物体积在2-20μl之间足以用于形成微阵列，但用于阵列步骤的纯化产物的体积一般为每孔约3-4μl。

DNA分离和PCR过程易于在96孔或384孔结构中大规模进行，这样在自动化的实验室设备中易于每天处理＞10,000个样本。此通量使得每年可从240,000个病人中扩增10个位点。这样，本方法可用于人群的大范围筛选以及其它高通量应用如用于农业中所需的作物繁育、法庭、军事应用等。

在步骤16中，微板中基因组片段的高密度微阵列在基片上形成，目前微阵列的大小在基片上占约1.0cm²，基片一般为标准的25mm×76mm显微镜用载玻片。标准的点直径为约100μm，点的中心到中心的距离约为140μm，以使每个点在基片上不同且独立的位置处形成。在以下实施例描述的实验中，在1.0cm²印刷面积上点的总数为576，尽管与目前微点样技术的能力相关的样本放大使得可在每cm²上点出超过1000个点，即估计每cm²上有5,184个点，这样使得每个25mm×76mm微阵列玻片上的18mm×72mm微阵列可含约82,944个点。这样本发明的方法允许同时从多个个体中获得基因分型信息，即从至少10个、至少60个或至少5,000个个体中同时获得基因分型信息。原则上，每个公民的微阵列可提供人群中个人的永久基因档案。

在PCR方法的精确度范围内，微阵列上的每个点基本上与来自单一个体的单一扩增子对应。样本目前以140μm的间距重复三次进行印刷。重复三次点样增加了结果的可信度，且作为示例在图2中以图解显示。前面的第26排从左到右含来自个体1的用PCR引物对A处理的扩增子对应的三个点，标记为1A，随后是来自个体1的用PCR引物对B处理的三个点，等等。在图2中，第28排显示来自个体2的用PCR引物对A、B和C处理的扩增子。尽管来自不同扩增子溶液的点的确需要放置在不同的位置上，但是并不需要将不同样本来源的点置于不同的排。也不必拘泥于重复三次点样的样式本身，并可使用单倍、两倍、四倍或其它的点样模式以产生可靠的基因分型信息。

目前已有的用于形成微阵列的技术包括接触和非接触的印刷技术。一个实例为来自Cartesian Technologies(Irvine，CA)的PixSys 5500运动控制系统，其配备有来自TeleChem(Sunnyvale，CA)的Stealth微点样印刷头。接触印刷技术包括应用固体针、裂口针、镊子、微点样针及针和环的机械装置。接触印刷技术可从许多商业供应商处获得，包括BioRobotics(Boston，MA)、Genetix(Christchurch，英国)、Incyte(Palo Alto，CA)、Genetic MicroSystems(Santa Clara，CA)、Affymetrix(Santa Clara，CA)、Synteni(Fremont，CA)、Cartesian Technologies(Irvine，CA)等。非接触印刷技术包含如那些应用压电体、泡沫喷气机、微螺线管阀、注射器泵等的“喷墨”类装置。非接触印刷技术的供应商包括Packard Instruments(Meriden，CT)、Agilent(Palo Alto，CA)、Rosetta(Kirkland，WA)、Cartesian Technologies(Irvine，CA)、Protogene(Palo Alto，CA)和其它。接触印刷装置和非接触印刷装置均可应用在可三维运动的自制或商售的装置上。购自Engineering Services Incorporated(Toronto，Canada)、IntelligentAutomation Systems(Cambridge，MA)、GeneMachines(San Carlos，CA)、Cartesian Technologies(Irvine，CA)、Genetix(Christchurch，UnitedKingdom)和其它公司的运动控制装置也适用于产生根据本发明的微阵列。

本方法PCR反应中应用的引物对一般包含活性基团，如烷基胺基团，该基团允许扩增子特异结合到微阵列的基片上，其中所述基片例如可经化学处理的玻璃基片。例如基片可含有活性醛基，该基团允许连接有氨基的PCR产物通过席夫碱进行末端连接，产生反应产物。连接反应过程通过脱水反应进行。疏水印刷表面(如那些含活性醛基的印刷表面)用于防止样本扩散，并因此使得可形成更小的点和更高的微阵列密度。带有活性醛基的微阵列可通过许多供应商获得，包括TeleChem(Sunnyvale，CA)和CELAssociates(Houston，TX)。但显而易见，也可应用任何其它一些微阵列表面和连接化学品，包括那些含包被有多聚赖氨酸、有机硅烷、环氧硅烷、活性羧基、凝胶垫材料、硝化纤维的涂层或处理的玻璃和其它材料。同样显而易见的是，除了末端连接方案，也可另外应用许多非特异方案，包括用紫外光或热、静电作用、疏水及其它方法作用交联到基片。

在步骤18中，微阵列经处理并与标记的合成寡核苷酸混合物杂交。微阵列应用常规的方法(参见如Schena等，PNAS 93，10614-10619，1996)处理以移去未结合的DNA材料、使未反应的醛基失活并使印刷的PCR片段在微阵列杂交前变性。通常，杂交反应在含盐和去污剂的水溶液中进行，且反应温度比合成寡核苷酸的解链温度(Tm)约低10℃。杂交混合物由合成的与存在于微阵列扩增子中的等位基因互补的寡核苷酸组成。即混合物中的每种合成寡核苷酸与通过PCR引物对选择的一个基因座对应。根据本方法，实际上可制备出无限多的不同杂交混合物，以检测来自任何含核酸生物体的目的扩增子的等位基因。同样明显的是，该过程是可大规模化的，这样含几十、几百或可能几千的不同寡核苷酸的混合物可用于同时检测多种不同的目的等位基因并因此检测许多不同的疾病。唯一需要的是：野生型和改变的等位基因的序列信息及与每一PCR引物对互补的边界基因序列是可获得的。合成的寡核苷酸可由许多供应商提供，包括EOSBiotechnology(South San Francisco，CA)和Operon Technologies(Alameda，CA)。

混合物中的寡核苷酸长度一般约10-30个核苷酸，以优化在扩增子内区别单核苷酸变化的能力。例如寡核苷酸的长度可为15个核苷酸(15-mers)，其中目的等位基因位于与15mer相关的中间位置(位置8)。混合物中的合成寡核苷酸经过标记，且标记可位于例如每一寡核苷酸的5′末端，尽管5′或3′末端标记或两端均标记在描述的方法中均预期可起作用。直接和间接的方法均在本领域公知。在直接标记中应用的常见荧光标签包括称为Cy3和Cy5的染料，二者分别在约550nm和650nm处发出荧光。寡核苷酸混合物可含在多个波长处发出荧光的多种荧光标签。可用任何数量的不同类型荧光标签替换Cy3和Cy5标签以允许检测一种或多种不同的颜色。多色法预期是有用的，例如它允许野生型等位基因在一种颜色以最大效率检测，且突变等位基因在另一种颜色以最大效率检测。其它类型的标记物可包含许多商售染料和染料衍生物，如那些名为Alexa、荧光素、罗丹明、FAM、TAMRA、Joe、ROX、德克萨斯红、BODIPY、FITC、Oregon Green、丽丝胺等的染料。许多此类染料和衍生物可从供应商获得，如Molecular Probes(Eugene，OR)、Amersham Pharmacia(Bucks，英国)和Glen Research(Sterling，VT)。

间接标记的方法包括如用生物素或二硝基酚进行标记，二者为自身并不发出荧光的有机分子，但可与抗体结合物反应，所述抗体结合物含与抗体结合的荧光基团。因此标记、半抗原或抗原表位如生物素和二硝基酚允许通过所谓的间接方法进行荧光检测，因为在每个点的荧光由抗体结合物提供，所述抗体结合物与微阵列通过非荧光标记相互作用。某些抗体结合物含酶类，如辣根过氧化物酶，该酶催化短寿Tyramide自由基与吸附在微阵列表面的蛋白质的酪氨酸部分结合。通过将Tyramide与多种荧光部分连接，采用涉及生物素和二硝基酚标记、抗体-辣根过氧化物酶结合物和Tyramide-Cy3和Tyramide-Cy5衍生物的间接方法来检测杂交产物是可能的。但本领域的任何技术人员理解任何数量的直接和间接标记方案可用于检测，包括荧光法和非荧光法。一个备选的荧光法应用由Genisphere(Oakland，NJ)所描述的树枝状分子(Dendrimer)技术。一个备选的非荧光法应用珠子和微粒，如Genicon(San Diego，CA)描述的共振光散射(RLS)微粒。

与标记的合成寡核苷酸混合物杂交之后，在步骤20微阵列用已知的方法进行扫描或读取，以检测基因型信息。检测例如可应用带有激光激发和光电倍增管的共聚焦扫描设备进行(如由GSI Lumonics(Bellerica，MA)提供的ScanArray 3000)。另外，许多不同类型的共聚焦和非共聚焦荧光检测系统可用于实施该方法，例如那些由Axon Instruments(Foster City，CA)、Genetic MicroSystems(Santa Clara，CA)、Molecular Dynamics(Sunnyvale，CA)和Virtek(Woburn，MA)提供的检测系统。其它的检测系统包括应用气体、二级管和固态激光以及那些应用许多其它类型发光源(如氙和卤素灯泡)的扫描系统。除光电倍增管外，检测器还可包括应用带有充电设备(CCD)和互补金属氧化硅(CMOS)芯片的照相机。

不论是直接标记的或间接标记的寡核苷酸用于杂交，从特定的微阵列点检测出的信号强度是与在该特定点处混合物内的寡核苷酸与基因组片段杂交的程度直接成比例的。寡核苷酸混合物可包含与野生型或突变等位基因互补的核苷酸，因此野生型或突变基因组片段得以检测，这取决于杂交混合物制备的方式。来自相同的微阵列点的信号，例如来自图2中标记为1A的三个点的信号，经过平均以提高精确度，并因此提供小的变异系数(CVs)。

许多方法可用于获取并评估基因型信息。如以上所描述，绝对荧光信号可用于判定特定扩增子的等位基因组成。另外，也可应用带有两种或多种颜色的寡核苷酸混合物，其中特定的颜色代表特定的等位基因，例如野生型为绿色荧光且突变等位基因为红色荧光。许多其它的方案如荧光染色也可与直接标记联合应用以评定每个点的DNA含量。来自MolecularProbes(Eugene，OR)的SYBR Green染料允许在异硫氰酸荧光素(FITC)染料的波长范围内检测染色的DNA。

本发明的特性和优点将通过以下的(但不限于)实施例进一步阐明，所述实施例从新生儿血液样本筛选镰形细胞性贫血和半乳糖血症的各种等位基因。

实施例

分离来自72个不同新生儿的血液样本，并用下表1中命名的基因特异的引物ARDC100-109进行扩增。这5对引物对含有来自Glen Research(Sterling，VT)的与C6氨基修饰对应的活性氨基，该基团允许扩增子特异连接到微阵列的基片。以下表1中每一寡核苷酸序列的“N”位置代表C6氨基修饰。这些引物对包含5种不连续的基因组片段，与共3个人类基因对应：β-珠蛋白、CFTR和GALT。人类与β-珠蛋白、CFTR和GALT基因相关的疾病分别是镰形细胞性贫血、囊性纤维化和半乳糖血症。基因组片段包含存在于3个基因中的5个疾病位点，且每个扩增子的大概长度是60个碱基对。每个PCR反应的总体积为50μl。

扩增基因组片段然后纯化以移去污染物。根据厂商的说明书应用TeleChem(Sunnyvale，CA)的384孔PCR纯化试剂盒。纯化产物重悬在10μl无菌蒸馏水中，且10μl中的2μl与2μl的2X微点样溶液混合(该溶液由TeleChem(Sunnyvale，CA)提供)，以提供总共4μl的样本用于印刷。在样本平板上的每一PCR扩增子的浓度为100μg/μl。72个样本的扩增子每种取4μl放置在384孔板的临近孔内，外加总共24个只含印刷缓冲液或合成寡核苷酸的对照样本。实验中24个对照样本提供阳性和阴性的杂交对照。共96个样本(72个新生儿扩增子和24个对照)置于384孔微板，以使前4排的所有孔内(A1-24到D1-24)都含有4μl的样本。应用来自ComingCostar(Corning，NY)的聚丙烯384孔微板，尽管作为备选来自其它供应商(如Whatman Polyfiltronics(Rockland，MA))的平板也可应用。尽管有多种不同类型的微板足以满足装载样本的需求，但与含如聚苯乙烯的微板材料相比，疏水材料产生凸起的样本微滴，倾向于具有轻度提高的载样和印刷效率。

表1.用于扩增基因组片段的PCR引物

引物编号描述序列ARDC-100镰形细胞C等位基因5′5′NAAACAGACACCATGGTGCAC 3′ARDC-101镰形细胞C等位基因3′5′NCCCACAGGGCAGTAACGGCA 3′ARDC-102镰形细胞E等位基因5′5′NGCAAGGTGAACGTGGATGAA 3′ARDC-103镰形细胞E等位基因3′5′NGTAACCTTGATACCAACCTG3′ARDC-104囊性纤维变性ΔF508等位基因5′5′NCTGGCACCATTAAAGAAAAT 3′ARDC-105囊性纤维变性ΔF508等位基因3′5′NTTCTGTATCTATATTCATCA 3′ARDC-106GALT Q188R 5′5′NTGGGCTGTTCTAACCCCCAC 3′ARDC-107GALT Q188R 3′5′NAACCCACTGGAGCCCCTGAC 3′ARDC-108GALT N314D 5′5′NCCACAGGATCAGAGGCTGGG 3′ARDC-109GALT N314D 3′5′NGGTAGTAATGAGCGTGCAGC 3′

应用PixSys5500运动控制系统(来自Cartesian Technologies(Irvine，CA)，配备有来自TeleChem(Sunnyvale，CA)的Stealth微点样技术)，将72个新生儿样本加上24个对照样本的微阵列组成一个微阵列。Stealth印刷头含总共4个印刷针，以2×2形状排列，中心到中心的距离为4.5mm。4个针用于同时装载和印刷一次从384孔微板中取出的4个样本。共24个印刷循环(96个样本除以4个针)用来印刷72个新生儿样本和24个对照。总共的印刷时间为约48分钟。

全部的96个样本印刷3次(共288个点)，点的大小为100μm、间距为140μm，这样每4个针头产生含72个分别的微阵列点(共288个点除以4)的微阵列子格。然后全部的96个样本再次印刷3次，与第一微阵列距离2mm，以提供用于所有96个样本(288个额外点)的双套阵列。每个最终的微阵列含总共576个微阵列点(288加上288)，总面积为约1.0cm²。根据厂商的使用说明书，共有30个微阵列印刷在30 SuperAldehyde微阵列基片(来自TeleChem(Sunnyvale，CA))上，以允许用于大量不同的杂交混合物和进行优化。尽管在该实施例中印刷了30个微阵列基片，应当指出一些商售印刷系统(包括来自ESI(Toronto，Canada)的技术)，允许在一轮中印刷高达120个基片。单一的微阵列足以用单一的杂交混合物生成基因型信息，且多个微阵列允许用不同的杂交混合物对一组特定样本进行分析。

杂交步骤后，微阵列在微阵列设备的台板上室温干燥过夜，然后进行处理，在微阵列杂交之前移去未结合的DNA材料、使未反应的醛基失活以及使印刷的PCR片段变性。处理步骤如下：室温条件下在0.2％SDS中浸泡两次，每次2分钟，剧烈振摇，室温下在蒸馏水中浸泡两次，每次2分钟，剧烈振摇，将基片在蒸馏水中于100℃处理2分钟使DNA变性，使基片室温风干5分钟，在硼氢化钠溶液中(制备时将1.2g NaBH₄溶解在330ml磷酸盐缓冲液(PBS))处理基片5分钟，加入120ml 100％乙醇以减少泡沫生成，室温将基片在0.2％SDS中漂洗3次，每次1分钟，室温将基片在蒸馏水中漂洗1分钟，将玻片浸没在100℃蒸馏水中5秒钟，将玻片风干并避光室温储存。应当指出，由于硼氢化钠是高活性的还原剂，应在每次应用前新鲜配制以保证表面的未反应醛基以高效率进行还原。

应用合成的寡核苷酸制备杂交混合物，所述寡核苷酸由生产商EOSBiotechnology(South San Francisco，CA)提供。每一合成的寡核苷酸与存在于特定扩增子的等位基因互补。用于新生儿样本的等位基因与目的疾病位点对应。为说明直接的检测，应用含Cy3或Cy5标记的15-mers混合物(在表2中表示为混合物1)。表2混合物1中的Cy3和Cy5标记分别用在各自核苷酸序列中的数字″3″和″5″表示。为说明间接的检测，应用含生物素或二硝基酚标记的15-mers混合物(在表2中表示为混合物2)。

表2混合物2中的生物素和二硝基酚标记分别通过在各自核苷酸序列中的字母“B”和“D”表示。表2中列出的所有寡核苷酸的合成规模是10nmoles，且每种寡核苷酸在使用前悬于蒸馏水中，浓度为100μM。混合物1通过在50μl的缓冲液中使10种寡核苷酸(表2，ARDC110-119)中的每一种含2μM浓度得以制备，缓冲液为5X SSC(0.75M氯化钠、0.075M柠檬酸钠)和0.2％SDS(十二烷基硫酸钠)。除了混合物2中的10条寡核苷酸为ARDC125-129和ARDC135-139(表2)外，混合物2用与混合物1同样的方式制备。

应用10μl的混合物1或混合物2进行每个微阵列的杂交反应。10μl的混合物应用到微阵列，覆有大小为18mm×18mm×0.2mm的盖玻片。根据制造商TeleChem(Sunnyvale，CA)的建议，杂交反应在杂交盒内42℃作用5.5小时。5.5小时的杂交之后，按以下方法洗涤微阵列以移去未杂交的材料：25℃下在2X SSC(0.3M氯化钠，0.030M柠檬酸钠)和0.2％SDS(十二烷基硫酸钠)中洗涤两次，每次5分钟，且在25℃下在2X SSC(0.3M氯化钠，0.030M柠檬酸钠)中洗涤1分钟。

表2.合成的寡核苷酸混合物

  混合物 寡核苷酸编号 寡核苷酸序列*  1 ARDC-110 ARDC-111 ARDC-112 ARDC-113 ARDC-114 ARDC-115 ARDC-116 ARDC-117 ARDC-118 ARDC-119 3GACTCCTG(A/T)GGAGAA 5GACTCCTA(A/T)GGAGAA 5TGGTGGTGAGGCCCT 3TGGTGGTAAGGCCCT 3ATCATCTTTGGTGTT 5TATCATCGGTGTTTC 5CACTGCCAGGTAAGG 3CACTGCCGGGTAAGG 3CAACTGGAACCATTG 5CAACTGGGACCATTG 2 ARDC-125 ARDC-126 ARDC-127 ARDC-128 ARDC-129 ARDC-135 ARDC-136 ARDC-137 ARDC-138 ARDC-139 BGACTCCTG(A/T)GGAGAA BTGGTGGTAAGGCCCT BATCATCTTTGGTGTT BCACTGCCGGGTAAGG BCAACTGGAACCATTG DGACTCCTA(A/T)GGAGAA DTGGTGGTGAGGCCCT DTATCATCGGTGTTTC DCACTGCCAGGTAAGG DCAACTGGGACCATTG

*所有显示的序列从左到右为5′-3′。3代表Cy3；5代表Cy5；B代表生物素；D代表二硝基酚。

杂交和洗涤步骤之后，检测微阵列用以获得基因型信息。对于涉及混合物1的直接标记实验，通过在冲洗步骤后立即扫描微阵列的荧光发射进行检测步骤。检测应用来自GSI Lumonics(Bellerica，MA)的ScanArray3000共聚焦扫描装置，该装置设置为100％用于光电倍增管(PMT)且80％用于激光设置。扫描器的双色能力用于在Cy3和Cy5两种途径检测荧光微阵列信号，与混合物1寡核苷酸的杂交对应。结果在图3A和3B显示，其中图3A对应于来自Cy3的荧光检测，且图3B对应于来自Cy5的荧光检测。数据以常规的的彩虹信号码表示，红色为强度最高且黑色为强度最低；距离条相当于1.0mm。图4A显示的是图3A中部分微阵列的放大图。微阵列信号以三联形式出现，是因为每个扩增的新生儿病人样本或对照样本在相邻的微阵列部位印刷了三次。微阵列中样本的位置用沿y轴(垂直方向)的字母和沿x轴(水平方向)的数字表示。应用来自GSI Lumonics(Bellerica，MA)的ScanArray软件进行荧光微阵列信号的定量。与微阵列信号对应的数值在图5中进行标绘。数据揭示出在所有的受检测样本中，从镰形细胞和半乳糖血症位点易于区分野生型、杂合子和纯合子。所有样本三个数值的变异系数(CVs)均＜10％。

来自三个个体的三个样本的基因组片段，其β-珠蛋白位点232不同，分别放置在微阵列的位置b1-3；b4-6和b7-9。三个个体分别命名为基因型E/E、A/E和A/A。E/E新生儿由于突变等位基因是β-珠蛋白序列232位的从G到A的单核苷酸突变，因此为纯合子，A/E新生儿在232位存在一个突变等位基因和一个正常等位基因，因此为杂合子，且A/A新生儿在232位存在两个正常等位基因(即两个等位基因均在β-珠蛋白的232位含有一个G残基)。杂交混合物中相应的合成寡核苷酸(ARDC113，表2)与E/E新生儿的两个等位基因均完全互补，与A/E新生儿的一个等位基因完全互补且与A/E新生儿的另一等位基因存在一个核苷酸的不匹配，并与A/A新生儿的两个等位基因均含有一个不匹配核苷酸。与预期相符，微阵列信号在b1-3位增强；b4-6和b7-9位显示为减弱的信号强度，与新生儿样本在微阵列每一位置的基因型一致。其余样本的结果为类似的结果且在图5中以表格显示。

在第二个实验中，应用混合物2寡核苷酸阐明间接标记法。除了染色应用MICROMAX染色试剂盒(根据制造商NEN Life Sciences(Boston，MA)的指导)外，微阵列的杂交和洗涤均与用混合物1的直接标记实验完全一致。染色试剂盒应用的抗体结合物分别识别生物素和二硝基酚表位，并应用辣根过氧化物酶(HRP)催化tyramide Cy3和tyramide Cy5沉积到微阵列表面。与直接标记法一样，用GSI Lumonics(Bellerica，MA)的ScanArray 3000进行Cy3和Cy5波道的检测。与直接标记途径的结果类似，通过间接标记进行的方法显示了微阵列信号，可从中获取精确的基因型信息，如在6A、6B和4B中所阐述的。

从前述中可明显看出，本方法所提供的基因分型的新方法比目前的方法有显著的改良。该方法首次使得可在一次检测中对多个病人和多个位点进行基因分型。本方法的关键特征是每个微阵列点代表来自单一病人的单一遗传片段或位点，因此使得扩增序列和杂交混合物的合成寡核苷酸之间具有高度的特异性。在单一微阵列步骤中检测成千上万个病人的多种疾病的能力提供了可立即应用的用于新生儿筛选的方法，例如，该方法代表了显著的省时和低费用。该方法使得新生儿筛选的费用低于10美元($10 U.S.)/每个疾病位点，并因此可立即适用于大范围的商业应用。早期筛选先天性遗传疾病的能力将对人类健康产生直接的和有益的影响。

尽管本发明已就特定的实施例进行了描述，该描述仅是本发明应用中的一个实施例，且不应将此作为限制。所公开实施例特征的各种修改和组合均在本发明的范围之内，如以下权利要求所定义的。