一种新型海洋微生物低温碱性金属蛋白酶及其产酶菌株

摘要

本发明涉及一种从东海海域的海泥中培养分离得到的假单胞杆菌属未知种菌株QD80，该菌株保藏在CCTCC，保藏号为CCTCC NO：M204100，以及由该菌株高产的新型海洋微生物低温碱性金属蛋白酶，可广泛应用于各种洗涤剂、饲料、毛织品处理等领域。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物酶领域，特别涉及一种新型海洋微生物低温碱性金属蛋白酶及其高产海洋微生物低温碱性金属蛋白酶的假单胞杆菌属未知种菌株QD80。

背景技术

海洋辽阔，微生物资源十分丰富，但由于海洋独特的环境，包括高盐、高压、低营养、低温等，造就了海洋微生物有别于陆生微生物的许多特异性如不易培养、形态多样且在保藏和移种过程中很容易死亡等，不利于海洋微生物研究和开发的深入，因而迫切需要建立一些简单、方便、易于操作并能在一定程度上更科学、更精确、更快速地找到并能分离得到有用微生物菌株，为海洋微生物资源的开发利用奠定基础。目前，大分子rRNA已成为一个分子指标，广泛地用于各种微生物的遗传和分子差异的研究，加上大量已知微生物的DNA都已被测定并输入国际基因数据库，成为微生物鉴定分类非常有用的参照系统，从而可以通过对未知微生物DNA序列的测定和比较分析，达到以其进行快速、有效的鉴定分类的确定新的菌株的目的。

近年来随着生物技术的发展，寻找具有全新性质的酶已成为国际酶制剂研究的热点。海洋生物由于生长在海洋这一独特的环境中，特别是生活在极端环境下的海洋微生物和微藻，能产生丰富的极端酶。与陆地微生物所产生的酶相比，海洋酶具有更为独特的酶学性质，因此引起了国内外研究人员的极大关注。碱性蛋白酶作为一种改进合成洗涤剂去垢性的必要成分已为世人共识。但在过去的10年中，世界洗涤传统发生了革命性的改变。全球洗衣正向着低温、节水型发展，传统的洗涤剂用酶(主要是碱性蛋白酶)在较低温下所表现出的清洁能力已难以满足消费者的需求，所以需要在低温区域具有明显相对活性优势的酶。目前已知的洗涤剂用商品低温碱性蛋白酶包括：Properase CT(GENENCOR国际公司，美国)、Savinase4.OT(NOVO公司，丹麦)等品牌，氧化稳定性洗涤剂碱性蛋白酶为MaxapemCX(GENENCOR国际公司，美国)。其中：Savinase 4.0T酶在pH 10.1条件下，最适反应温度55℃、20℃时相对活性约为15％。Properase CT酶在pH 10条件下，最适反应温度50-55℃、20℃时相对活性约为42％。MaxapemCX酶在最适条件下于20mM H₂O₂中可稳定60min。可见，在各自推荐的最适条件下，在低温区蛋白酶的相对活性较低，所以这些酶的低温活性区和对氧化剂的稳定性仍然没有令人满意。

发明内容

本发明的目的在于提供在中国东海海域的海泥中培养分离得到的一种高产新型海洋微生物低温碱性金属蛋白酶的假单胞杆菌属未知种菌株QD80。

本发明的另一目的提供由上述假单胞杆菌属未知种菌株QD80高产海洋微生物低温碱性金属蛋白酶。

本发明提供的新型假单胞杆菌属未知种菌株QD80是从东海海域的海泥中培养分离得到高产新型海洋微生物低温碱性金属蛋白酶(简称低温碱性金属蛋白酶)的假单胞杆菌属未知种菌株QD80。该假单胞杆菌属未知种菌株QD80于2004年12月1日保藏于中国武汉典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号为CCTCC NO：M204100。

本发明提供的假单胞杆菌属未知种菌株QD809(简称菌株QD80)形态特征：

形态特征

对菌株(指菌株QD80)进行革兰氏染色，为革兰氏阴性菌。显微镜形态观察发现形态特征呈粗的短杆状；周生鞭毛、好氧；菌落乳白色、凸起、边缘光滑；不透明、不产生色素。

菌株QD80 16SrDNA序列经测定，全长为1443bp。将该16SrDNA序列递交GenBank进行Blast同源序列检索，结果发现，在亲缘关系相近的前500个序列中，前400个均为假单胞杆菌属的菌株，QD80与他们都具有98％以上的同源性。

菌株QD80 16srRNA全序列

GCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGTAGAGAGGTGCTTGCACCT

CTTGAGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATACCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGG

ATAACGTTCGGAAACGGACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGG

GGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTG

AGGTAATGGCTCACCAAGGCTACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTC

ACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATA

TTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTT

CGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCATTAACCTAATACGTTAGTG

TTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGT

AATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGG

TGGTTTGTTAAGTTGAATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAA

AACTGGCAAGCTAGAGTATGGTAGAGGGTAGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGA

AATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTACCTGGACTGAT

ACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTA

GTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGGAACCTTGAGTTCTTAGTGGC

GCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACT

CAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAA

GCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATCCAATGAACTTTCCAGAGATGGA

TTGGTGCCTTCGGGAACATTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGT

CGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCA

GCACGTAATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGT

GGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACA

ATGGTCGGTACAAAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAACC

GATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAG

TAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGC

CCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTCGGGAG

GACGGTTANCACGGTGTGATTCATG

菌株QD80 16SrRNA基因序列在某些位点会以不同的几率发生突变，在种、属等水平上表现出结构和功能的保守性，有“细菌化石”之称，特别是其进化具有良好的时钟性质，是生物进化史的计时器。应用16SrRNA作为分子指标，可以实现快速、微量、准确、简便的对微生物进行分类鉴定。

本发明提供的海洋微生物低温碱性金属蛋白酶，是由假单胞杆菌属未知种菌株QD80高产的海洋微生物低温碱性金属蛋白酶，特性为：

(1)酶的基因：

ATGATCGAATCCGTCGAGCACTTCCTTGCCCGCCTCAAAAAACGCGACCCAGACCAGCCA

GAATTCCACCAGGCGGTGGAAGAAGTCCTGCGCAGCCTGTGGCCTTTTCTCGAAGCCAAT

CCGCACTACCTGACTTCCGGGATTCTCGAACGTATTTGCGAACCTGAGCGGGCAATTGTG

TTTCGCGTGTCATGGGTGGATGACGAAGGCAAAGTGCGGGTTAACCGCGGCTTCCGCATT

CAGATGAACAGCGCCATTGGCCCTTACAAAGGCGGGTTGCGCTTCCACCCGTCGGTGAAT

TTGGGGGTGTTGAAGTTCTTGGCGTTTGAACAAACCTTCAAAAACTCCCTGACCTCGCTG

CCCATGGGCGGCGGTAAGGGTGGCTCGGATTTCAACCCCAAGGGCAAGAGCGACGCGGAA

GTCATGCGTTTCTGCCAGGCCTTCATGAGCGAGCTGTACCGTCATATCGGTTCGGACGTG

GACGTGCCCGCTGGCGATATCGGCGTCGGCGCCCGTGAGATTGGCTTCCTCTTTGGCCAA

TACAAACGCCTGAGCAACCAGTTCACCTCCGTGTTGACCGGCAAAGGCATGAGCTACGGC

GGCAGCCTGATTCGCCCGGAAGCCACCGGGTTTGGCTGCGTGTATTTTGCGCAGGAAATG

CTCAAGCGCAGCGGCCAGCGGATTGATGGCAAGCCGGTTGCGATTTCCGGCTCGGGTAAC

GTGGCGCAGTATGCCGCGCGCAAAGTCATGGACCTGGGCGGCAAAGTCATTTCGCTCTCG

GACTCCGAAGGCACCCTGTATTGCGAAGCCGGTCTGGACGACGCGCAGTGGGAAGCACTG

ATGGAGCTGAAAAACGTCAAGCGCGGACGTATCAGCGAACTGGCGGCGCAATTTGGTCTG

GAGTTTCTGGCGGGCCAGCATCCGTGGCATCTGCCCTGTGACATTGCGCTGCCTTGCGCA

ACACAGAACGAACTGGACGCCGAAGCCGCTCGCACATTGCTGAGCAATGGCTGTGGGTGC

GTGGCCGAAGGCGCCAACATGCCGACCACGCTGGAAGCGGTGGACCTGTTTATCGAGGCG

GGCATTTTGTTCGCACCGGGCAAAGCCTCCAATGCGGGCGGTGTGGCCGTGAGCGGTCTG

GAAATGTCGCAGAACGCCATGCGCTTGCTGTGGACGGCGGGTGAGGTGGACAGCAAGTTG

CACAACATCATGCAATCGATCCACCACGCCTGA。

(2)酶(指低温碱性金属蛋白酶)的分子量、等电点：

SDS-PAGE凝胶电泳测得该酶的表观分子量为49000±1000Dal。HPLC凝胶过滤法测定酶分子量为49320Dal。薄层聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦测定酶的等电点为pH8.5。

(3)酶的底物特异性：

该蛋白酶在35℃以下低温条件下具有低活化能和高活性，所以在低温下能有效的降解蛋白类物质，诸如蛋白污渍(奶、血、草汁)或肽及酪蛋白、血红蛋白、血纤维蛋白、弹性蛋白、肉蛋白、鱼蛋白质等蛋白质。

(4)酶最适反应温度、pH：

采用Folin-酚法测定酶活性，通过预先调整的pH缓冲体系，测定了不同pH对酶活性的影响，结果该酶的有效pH稳定范围约在6-10(不同pH条件下，20℃保温60min后的活性)；最适反应pH为9-10(20℃，反应时间10min)。

通过上述相同的测酶活性方法，测定了不同温度对酶活性的影响，结果该酶的有效温度稳定范围约在20℃以下(不同温度条件下pH9.5保温60min后的活性)；最适反应温度为30℃(pH9.5，反应时间10min).

(5)酶与常规试剂的配伍性：

金属离子对低温碱性金属蛋白酶的影响：

    名称    浓度Mm    相对酶活保留率％    不含金属离子    0    100    Cu²⁺    5    19.42    Ca²⁺    5    86.38    Mg²⁺    5    122    Mn²⁺    5    141    Co²⁺    5    20.09    Fe³⁺    5    2.74    Zn²⁺    5    36.58    K⁺    5    97.86    Na⁺    5    94.5    Ag⁺    5    1.22

配伍化学试剂对酶活性的影响：

    名称    浓度    相对酶活保留率％    不含金属离子    0    100    乙醇    1％(V/V)    100    硼砂    1％(W/V)    120    戊二醛    1％(V/V)    30.9    尿素    1％(W/V)    83    聚氧乙烯(20)失水山梨    醇单油酸酯(吐温80)    0.1％(W/V)    110    聚氧乙烯(20)失水山梨    醇单油酸酯(吐温40)    0.1％(W/V)    77.32    KH₂PO₄    1％(W/V)    77.9    Na₂HPO₄    1％(W/V)    32.9    Na₂SO₃    0.1％(W/V)    75.38    乙二醇苯醚    0.1％(W/V)    90.11    三羟甲基氨基甲烷(Tris)    1mM    134    十二烷基硫酸钠(SDS)    0.1mM    85    直链烷基苯磺酸钠(LAS)    500ppm    83

抑制物质对酶活性的影响

    名称  浓度    相对酶活保留率％    不含抑制物  0    100    PMSF(甲苯磺酰氟)  0.016％(W/V)    100    EDTA  0.04％(W/V)    55.82    Na₂O₆S₄.2H₂O  0.04％(W/V)    77.58    TLCK(胰蛋白酶抑制剂)  0.04％(W/V)    54    TPCK(糜蛋白酶抑制剂)  0.04％(W/V)    100

稳定剂(增稠剂)对酶活性的影响

    名称    浓度(％)    相对酶活保留率(％)    不含增稠剂    0    100    丙三醇    1(w/v)    102.2    乙二醇    1(w/v)    98.7    聚乙二醇    1(w/v)    126.5    聚乙烯醇    1(w/v)    97.7    甘露醇    1(w/v)    107.5    海藻酸钠    1(w/v)    94.0    糊精    1(w/v)    107.2    乳化剂OP    1(w/v)    100.0    明胶    1(w/v)    115.4    橄榄油    1(w/v)    101.1    琼脂    1(w/v)    86.8

(6)酶的稳定性

该低温碱性金属蛋白酶能够满足下列条件之一：

①Folin-酚试剂法测定该低温碱性金属蛋白酶的活性，25℃下在含过氧化氢(H₂O₂)缓冲溶液(50Mm硼砂盐缓冲液、pH10，H₂O₂20mM、Ca²⁺5mM)放置60min后剩余酶活性不低于95％。

②按Folin-酚试剂法测定该低温碱性金属蛋白酶的活性，25℃下在含1％(W/V)过硼酸钠(NaBO₃)缓冲溶液(50mM硼砂盐缓冲液、pH10，Ca²⁺5mM)放置60min后剩余酶活性不低于90％。

③按Folin-酚试剂法测定该低温碱性金属蛋白酶的活性，25℃下在含直链烷基苯磺酸钠(LAS)缓冲溶液(50mM硼砂盐缓冲液、pH10，LAS500ppm、Ca²⁺5mM)放置60min后剩余酶活性不低于65％。

④按Folin-酚试剂法测定该低温碱性金属蛋白酶的活性，25℃下在含亚硫酸钠(Na₂SO₃)缓冲溶液(50mM硼砂盐缓冲液、pH10，Na₂SO₃8mM、Ca²⁺5mM)放置60min后剩余酶活性不低于90％。

⑤按Folin-酚试剂法测定该低温碱性金属蛋白酶的活性，10℃下在含5％(W/V)氯化钠(NaCl)缓冲溶液(50mM硼砂盐缓冲液、pH10，Ca²⁺5mM)放置12小时后剩余酶活性不低于70％。

⑥按Folin-酚试剂法测定该低温碱性金属蛋白酶的活性，25℃下在含2％(V/V)乙醇缓冲溶液(50mM硼砂盐缓冲液、pH10，Ca²⁺5mM)放置121小时后剩余酶活性不低于70％。

(7)酶动力学研究

①酶基本动力学参数：

以不同浓度酪蛋白为底物，在0.05M甘氨酸—氢氧化钠pH9.5缓冲液中，反应体系温度18℃，测定反应的初速度v₀，对[S]作图，结果如下

②温度对酶反应动力学参数的影响

以酪蛋白为底物，在0.05M甘氨酸—氢氧化钠pH9.5缓冲液中，按Folin法测不同温度下反应稳态动力学参数V、K_m的。

结果由Hanes作图法求得动力学参数V、K_m。

T(℃)                  5.0   15.0  20.0   25.0   30.0   35.0   40.0

V(10^-4g·l^-1·s^-1)  1.53  6.21  13.41  16.98  23.37  33.05  27.65

K_m(g·l^-1)           0.19  2.11  5.37   6.29   10.65  14.51  10.48

根据Arrhenius公式：

                           k＝A·e^-Ea/RT

上式可改写为：             logk＝logA-E_a/2.3RT

                           将logK对1/T作图

由图1的直线斜率求得E_a＝33242J/mol。结果如下：

反应                      催化剂              活化能(J/mol)

                          H⁺                 66944

乙酸丁酯水解              OH^-                41840

                          胰脂肪酶            18828

                          H⁺                 83680

酪蛋白水解

                          胰蛋白酶            50208

                          H⁺                 104600

蔗糖水解

                          酵母蔗糖酶          33472

以K_e和K_H表示酶和H⁺催化的反应速度常数，则：

$>>log>ke>=>log>A>->>>E>>a>e>>>>2.3>RT>>>>$

$>>log>>k>H>>=>log>A>->>>E>>a>H>>>>2.3>RT>>>>$

$>>log>>ke>>k>H>>>=>>>>Ea>H>>->>Ea>e>>>>2.3>RT>>>=>>>83680>->33242>>>2.3>\times >8.28>\times >303>>>=>8.7>>$

$>>>ke>>k>H>>>=>5.0>\times >>10>8>>>$

反应的温度系数Q₁₀(Q₁₀表示温度升高10℃，反应速度提高的倍数)。

                  logQ₁₀＝logk_T2/k_T2

                         ＝E_a(1/T₁-1/T₂)/(2.3R)

                         ＝[1/(T₁··T₂)]10×33242/(2.3×8.28)

                         ＝17455[1/(T₁··T₂)]

(3)pH对酶动力学参数的影响

以酪蛋白为底物，在0.05M不同pH值缓冲液(磷酸氢二钠和磷酸二氢钠pH6-7；Tris-盐酸pH8；甘氨酸pH9-11)中，按Folin法测不同pH下反应稳态动力学参数V、K_m的，反应体系控制30℃。

由Hanes作图法求得的不同pH下的动力学参数V、K_m。

pH                        6.0   7.0   8.0    8.5    9.0    9.5    10.0   10.5   11

V_ap(10^-4g·l^-1·s^-1)  3.45  5.83  10.57  12.07  13.16  23.10  23.32  25.85  15.17

K_ap(g·l^-1)             1.31  2.50  3.80   4.48   5.06   10.46  10.53  11.64  7.12

将测得的V取log对pH作图，得到反应的pH曲线见图2。

根据图2所测数据，求得pK_a＝9.3、pK_b＝10.7，低温碱性金属蛋白酶催化酪蛋白反应的最适pH₀＝10.0。

(4)抑制剂对酶反应的作用

以酪蛋白为底物，通过加入不同浓度的EDTA，在0.05M甘氨酸—氢氧化钠pH9.5缓冲液中，测定反应的V、K_m，反应体系温度18℃。结果采用Kinetics软件进行分析，

                  EDTA对酶抑制情况数据分析

        竞争性        8.39        0.51          1.67

        非竞争性      0.80        0.05          0.06

        混合          0.10        0.06          0.09

根据分析结果我们可以看到，EDTA对于该酶的抑制属于可逆抑制中的竞争性抑制，在可逆抑制剂存在条件下，酶反应系统进行的反应可表示为：

在这种抑制中，酶不能同时和底物、抑制剂结合，即不能形成EIS，或者说K′_i或K′_s＝∞，它的动力学方程是：

$>>>v>i>>=>>>V>·>[>S>]>>>[>S>]>+>>K>m>>>(>1>+>[>I>]>/>>K>i>>)>>>>>$

EDTA与酶结合后，K_m增大了(1+[I]/K_i)倍，而酶和底物的亲和力降低了(1+[I]/K_i)倍；[I]愈高，K_i愈小，抑制剂浓度愈高，酶和抑制剂间的结合力愈强，K_m增大，酶和底物亲和力进一步降低，酶反应速度因之相应减缓。抑制程度取决于[I]和[S]、K_s和K_i的相对大小，以(1/v_i-1/v)表示抑制程度时，有：

$>>>1>>v>i>>>->>1>>v>i>>>=>>1>V>>·>>>K>s>>>[>S>]>>>·>>>[>I>]>>>K>i>>>>$

表明底物、抑制剂在浓度以及它们和酶的亲和力上存在着竞争关系，底物具有保护作用。EDTA和该海洋低温碱性蛋白酶的活性部位结合，阻止了酶与底物的进一步结合，从而抑制了酶的活性，由于EDTA是对金属有强螯合作用的特征试剂，可能有金属离子存在于该酶活性中心，该蛋白酶为低温碱性金属蛋白酶。该蛋白酶可广泛应用于洗涤剂、饲料、毛织品处理等领域中。

附图说明

图1为logK～1/T作图

图2为lgV对pH作图(30℃)

具体实施方式

本发明用下列实施例来说明本发明，但本发明并保护范围不限于下列实施例

实施例1：产酶菌株的培养及海洋微生物低温碱性金属蛋白酶的生产

20℃下将本发明假单胞杆菌属未知种菌株QD80在500ml含有3.5％大豆粉、2％麸皮、0.4％ NaH₂PO₄、0.03％ K₂HPO₄、0.2％ Ca(Cl)₂的培养基中震荡培养48小时(用1M氢氧化钠将培养基的pH调节到7.5-7.7)，然后可在培养基中产生并分泌所述的低温碱性金属蛋白酶。4℃下以1000G离心此培养物，获得含有本发明酶的上清液。上清液中的酶的活性大约为700u/ml(用上述Folin-酚试剂法测定)。

         实施例2：海洋微生物低温碱性金属蛋白酶的纯化

将在实施例1.中获得的培养物的上清液再用30-65％饱和度的(NH₄)₂SO₄分级沉淀，离心收取沉淀。将沉淀溶解在蒸馏水中，并透析24小时。将透析液过二乙氨乙基一琼脂糖(DEAE-Sepharose)  FF阴离子交换层析柱，用0-1M NaCl·磷酸缓冲液(20mM，pH7.0)梯度洗脱，收集活性组分再经CM-Sepharose FF凝胶层析柱，用0-1M NaCl·磷酸缓冲液(10mM，pH5.0)梯度洗脱，收集活性组分。然后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE鉴定，经考马斯亮兰染色为单一条带，激光灰度扫描结果，样品纯度大于95％。