基于CNTF基因的多态性治疗精神病和精神分裂症的方法

摘要

本发明涉及应用CNTF基因103G＞A多态性之间的关联来确定患精神病患者的抗精神病药物治疗策略。

说明书

发明背景

发明领域

本发明属于药学、医学和药用化学领域并提供了治疗包括精神分裂症和相关疾病的精神病的方法。特别是，本发明涉及基因组分析的用途，用于测定患者对包括伊潘立酮(Iloperidone)的抗精神病药的反应性，以及涉及确定最佳治疗策略的方法。

相关领域描述

睫状神经营养因子(CNTF)最初已知为小鸡睫状神经元的体外存活因子，但最近已显示该因子为不同神经元细胞类型的存活因子。CNTF参与阻止运动神经轴突退化且其为白细胞介素-6细胞因子家族的成员之一。Barbin等应用来自小鸡胚胎睫状神经节的神经元进行的存活试验报告了来自小鸡眼睛的CNTF具有神经营养活性。参见，Barbin，G等，J.Neurochem.43：1468-1478，1984。在此研究中也显示CNTF对交感神经元和感觉神经元具有作用。

CNTF基因也为治疗肌萎缩性脊髓侧索硬化(ALS)和其他类似的相关紊乱带来希望。在纯合pmn/pmn小鼠中，小鼠发病，其后肢产生渐进性运动神经病，在出生后第三周末该疾病的症状变得明显。所有小鼠在出生后六到七周内死于呼吸麻痹。Sendtner等用CNTF治疗小鼠，甚至在已出现退行性改变时仍成功提高了运动功能并减少了神经退化的形态学症状。参见Sendtner等，Nature 358：502-504，1992。

当通过同源重组去除CNTF基因在小鼠中的表达时，渐进性萎缩和运动神经元的消失依然发生并伴有肌力的轻度降低，由此获得了更好的理解，参见Masu等，Nature 365：27-32，1993。该研究者认为，这些结果证明通过形态学标准确定了该基因表达对于脊髓运动神经元的发育并非必需，但对于在出生后期维持运动神经元的功能则是必需的。

Takahashi等报道了类似的发现，即在CNTF敲除小鼠中缺乏相应的效应。他们发现约2.5％的日本人群为CNTF基因失活的突变纯合子，参见Takahashi等，Nature Genet 7：79-84，1994。缺乏CNTF的人群似乎并未受到负面影响且并未显示出任何相关的神经性缺陷。

CNTF受体亚单位具有与瘦素(leptin，LEP)受体类似的序列。研究表明CNTF和LEP细胞因子均具有向下丘脑饱腹中枢发出信号的能力。将CNTF和LEP全身施与ob/ob小鼠后导致在弓状核中迅速诱导产生tis-11初级反应基因，由此得出以上这些结果。当缺乏功能性瘦素的ob/ob小鼠用CNTF治疗时，与瘦素缺乏相关的肥胖、摄食过多和高胰岛素血症得以缓解。与瘦素相反，CNTF也在缺乏功能性瘦素受体的db/db小鼠以及食物诱导肥胖的小鼠中减轻肥胖相关的表型，前述小鼠具有一部分抗瘦素的作用。

CNTF蛋白储存在成熟的神经胶质细胞内，可能等待通过损伤所激发的某种机制进行释放。该蛋白质可能对发育而言并非必需，且实际上可能会对损伤或某些其他形式的应激中作出反应。CNTF的特征在于其为用于睫状神经结和脊髓中运动神经元的营养因子。

CNTF基因的多态性

已鉴定了CNTF基因的多态性。CNTF基因位于11q12.2，且多态性为GenBank序列X55890(版本1(Version1))(参见PubMed：9285965)中的103 G＞A。受体剪接位点的突变导致mRNA的不正确剪接，由此终止了CNTF蛋白的表达。核苷酸改变为受体剪接位点-6位的G到A转换，这导致从39位氨基酸出现移码，并在下游24位氨基酸处产生终止密码子。异常mRNA预期编码长度为62个氨基酸的截短蛋白质(FS63 TER)。

对组织样本的分析以及对将CNTF微基因转染到培养细胞的分析证明，突变的等位基因仅表达突变的mRNA种类。纯合突变基因并不翻译成蛋白质，这一点由以下发现显示：即识别正常和突变CNTF的抗体完全缺乏对来自纯合突变受试者的外周神经组织的CNTF免疫反应性。参见，Takahashi等，Nature Genet.7：79-84，1994。

精神病

精神病对于患者、患者家庭以及整个社会都会产生巨大的情感和经济负担。精神病，如精神分裂症和相关疾病(例如精神分裂症情感障碍)，并包括具有精神病症状(例如双相情感性精神病)的情感障碍(心境障碍)精神病是复杂和不同种类的疾病，病因不明，危害较大比例的全球所有人口。

精神分裂症的特征是同时具有″正向症状″(幻觉、错觉和概念混乱)和″负向症状″(冷漠、社会退缩、情感性幻想和言语缺乏)。神经递质多巴胺的异常活性是精神分裂症的特点。多巴胺能活性在中脑皮质系统中降低(导致产生负向症状)并在中脑边缘系统中提高(导致产生正向症状或精神病症状)。也涉及几种其它神经递质，包括5-羟色胺、谷氨酸和γ-氨基丁酸(GABA)。

一种或其他形式的抗精神病药一直是治疗精神病的基础。这些药物有时与调节情绪的药物如锂或抗抑郁药联合应用。应用传统的阻断中枢多巴胺受体的抗精神病药进行精神分裂症的治疗已有多年。抗精神病药对治疗精神分裂症的正向症状是有效的，但对负向症状的效果很小或根本没有。这些药物拮抗多巴胺受体的能力与其抗精神病的功效相关。抗精神病药包括吩噻嗪，所述吩噻嗪包含脂族的(如氯丙嗪)、哌啶(如硫利哒嗪)和哌嗪(如氟奋乃静)；丙基苯基酮(如氟哌啶醇)；噻吨(如三氟噻吨)；氧代吲哚(如吗啉酮)；二苯并噁氮杂(如洛沙平)和二苯基哌啶(如匹莫齐特)。

不幸的是，对抗抗精神病药物的负向症状占到由精神分裂症所引起的社会和职业能力丧失的大多数。此外，抗精神病药物导致锥体束外症状，包括僵化、震颤、运动迟缓和智力迟钝(思维迟慢)，以及迟缓性运动障碍和肌张力异常。对于药物治疗精神病，参见精神药理学教科书(Textbook ofPsychopharmacology)，Schatzberg AF和Nemeroff CB编辑，美国精神病学出版社(American Psychiatric Press)，Wash.D.C.1995。

通过引入一种新型、非典型的抗精神病药已在精神病的治疗中取得进展。这些非典型抗精神病药的副作用远优于传统药剂的副作用。非典型抗精神病药是不同类别的抗精神病药，其具有不同受体结合机制且可有效对抗精神分裂症的症状。非典型抗精神病药本质特征是其引起的急性锥体束外症状特别是肌张力异常较少，所述锥体束外症状与作为比较的典型抗精神病药如氟哌啶醇的治疗关联。氯氮平为原型的非典型抗精神病药，与典型的抗精神病药在以下特征中有所区别：(1)在治疗对典型抗精神病药无反应的精神分裂症患者的总体精神病理学中具有更大的功效；(2)在治疗精神分裂症的负向症状中具有更大的功效；(3)与治疗相关的血清促乳素浓度提高的频率和量更小(Beasley等，Neuropsychopharmacology，14(2)，111-123，(1996))。

非典型抗精神病药除结合D2多巴胺受体外也结合中枢5-羟色胺2(5-HT2)受体。与抗精神病药不同，它们可改善负向及正向症状。它们引起最小的锥体束外症状并很少导致产生迟缓性运动障碍、静坐不能或急性肌张力障碍反应。批准用于治疗精神分裂症的首类非典型抗精神病药物为氯氮平。氯氮平对于治疗精神分裂症是有效的，对传统抗精神病治疗无反应的受试者而言更是如此。

多年来用抗精神病药治疗精神病已经取得稳步的进步。但是，目前除了试错试验并无其他方法来确定哪位患者将对抗精神病药物治疗作出反应以及特定的患者需要多大的剂量水平以产生治疗性反应而不带来严重的副作用。由于所有的抗精神病药，甚至是较新的非典型药物，都具有明显的副作用，包括锥体束外症状如僵硬、震颤、运动迟缓(运动减慢)和智力迟钝(思维减慢)以及运动障碍和肌张力障碍，该″试错试验″期对患者而言可能是耗时、令人不悦甚至是危险的，并增加了不顺从的可能性。这些副作用和毒性作用是剂量依赖的。因此非常需要研发这样的方法，即用于确定患者是否会对抗精神病药剂作出反应以及确定哪一剂量范围对特定的患者有效且副作用降至最低。

发明概述

本发明通过提供用于治疗罹患或疑患精神病的方法对此类需要作出回答，所述精神病包括但不限于具有精神病症状的精神分裂症和情绪障碍，所述方法包括确定存在于个体中的CNTF基因的两个拷贝在多态性位点103G＞A处核苷酸对的同一性(CNTF基因位于11q12.2，多态性为GenBank序列X55890(版本1)中的103G＞A)。该核苷酸变化导致产生一个新的受体剪接位点、一段改变的mRNA和因此生成的一种异常蛋白质(FS63TER)，参见PubMed ID号9285965。治疗方案的确定基于以下的认识，即如果两个核苷酸对均为G或如果两个核苷酸对均为A则个体将会对下述抗精神病药物治疗作出反应，所述药物包括但不限于伊潘立酮。如果一个核苷酸对为A且另一个核苷酸均为G则个体将会对下述抗精神病药物治疗作出较小的反应，所述药物包括但不限于伊潘立酮，并可能需要较大的剂量或需要辅助治疗来联合或替代抗精神病药。基于此信息，可对个体施用有效剂量的适宜抗精神病药，旨在将副作用降至最低并将治疗反应及患者的顺从性提高到最大。

因此在一个方面，本发明提供了为需要此治疗的精神病患者进行治疗的方法，该方法包括确定存在于个体中的CNTF基因的两个拷贝在Genbank序列参考号X55890(版本1)中的多态性位点103G＞A处的核苷酸对的同一性，其中如果两核苷酸对均为G或均为A则个体用伊潘立酮治疗，以及其中如果一个核苷酸对为A且一个为G则个体应用备选的治疗或应用伊潘立酮联合以备选的治疗进行治疗。

在另一方面中，本发明提供了对需要此治疗的患者进行精神病治疗的方法，该方法包括测试该患者体液或组织中CNTF蛋白的存在，其中如果发现CNTF蛋白以正常水平或检测不到的水平存在，表明基因型分别为GG或AA，则应用伊潘立酮治疗患者，如果发现CNTF蛋白以中间水平存在则应用备选治疗或应用伊潘立酮联合以备选治疗对患者进行治疗。

在进一步的方面中，本发明提供了对需要此治疗的精神病患者进行治疗的方法，该方法包括检测GenBank序列参考号X55890(版本1)中多态性位点103G＞A处的与CNTF基因G变体对应的mRNA表达水平，检测GenBank序列参考号X55890(版本1)中多态性位点103G＞A处的与CNTF基因A变体对应的mRNA表达水平，比较在以上(a)和(b)中检测到的mRNA水平，如果(a)的数值为(b)的两倍或更多，或如果(b)的数值为(a)的两倍或更多，则应用伊潘立酮(抗精神病药物)对患者进行治疗，且如果(a)和(b)的数值相当，则应用备选的治疗或应用伊潘立酮联合以备选的治疗对患者进行治疗。

在另一实施方案中，本发明提供了选择受试者纳入临床抗精神病药物研究的方法，该方法包括测定存在于个体中的CNTF基因的两个拷贝在GenBank序列参考号X55890(版本1)中多态性位点103G＞A处核苷酸对的同一性，如果两核苷酸对均为G或两核苷酸对均为A则将个体纳入到研究中，且如果一个核苷酸对为A且另一个为G则将个体排除在研究之外。

本发明的另一方面是用于确定精神病患者治疗策略的试剂盒，所述试剂盒包含能够识别并结合CNTF基因的多肽表达产物的抗体，包含适于容纳该抗体和容纳来自所述个体的体液样本的容器，如果体液中存在CNTF多肽则抗体可与其接触，包含检测该抗体与CNTF多肽结合的工具，以及包含应用试剂盒的说明书。

本发明进一步的方面是用于确定精神病患者治疗策略的试剂盒，所述试剂盒包含能够识别并结合CNTF基因mRNA表达产物的多核苷酸，包含适于容纳该核苷酸和容纳来自所述个体的体液样本的容器，如果体液中存在CNTF mRNA则抗体可与其接触，包含检测该多核苷酸与CNTFmRNA结合的工具，以及包含应用试剂盒的说明书。

在另一方面中，本发明提供了用于确定精神病患者的治疗策略的试剂盒，所述试剂盒能够识别并结合CNTF基因中某部分DNA序列的多核苷酸，包含适于容纳该多核苷酸和容纳来自所述个体的体液样本的容器，如果体液中存在CNTF DNA序列则多核苷酸可与其接触，包含检测该多核苷酸与CNTF DNA序列结合的工具，以及包含应用试剂盒的说明书。

在进一步的方面中，本发明提供了用于确定患有精神病的个体对伊潘立酮治疗的反应性的方法，该方法包括测定存在于个体中的CNTF基因的两个拷贝在CNTF基因区域下述多态性位点处核苷酸对的同一性，所述多态性位点与GenBank序列参考号X55890(版本1)中CNTF 103G＞A处的多态性位点为连锁不平衡；且如果CNTF基因区域中多态性位点与103G＞A处的多态性位点连锁不平衡的核苷酸对表明在CNTF多态性位点103G＞A处两核苷酸对均为GC或两核苷酸对均为AT，则将个人指派到良好反应组，且如果该核苷酸对在CNTF 103G＞A位点处显示一对为AT且一对为GC则将个体指派到低反应组。

在另一方面中，本发明提供了用于鉴定患者在CNTF多态性位点103G＞A处的多态性模式的试剂盒，该试剂盒包含确定在CNTF多态性位点103G＞A处的遗传多态性模式的工具。

在另一实施方案中，本发明涉及在前述段落中描述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含DNA样本收集工具。

本发明的另一实施方案为前述段落中描述的试剂盒，其中用于确定CNTF多态性位点103G＞A处的遗传多态性模式的工具包含至少一种CNTF基因分型用寡核苷酸。

本发明的进一步实施方案为根据前述段落的试剂盒，其中用于确定CNTF多态性位点103G＞A处的遗传多态性模式的工具包含两种CNTF基因分型用寡核苷酸。

在另一实施方案中，本发明涉及如在前述段落中描述的试剂盒，其中用于确定CNTF多态性位点103G＞A处的遗传多态性模式的工具包含至少一种CNTF基因分型引物组合物，所述引物组合物包含至少一种CNTF基因分型用寡核苷酸。

本发明进一步的实施方案为如在前述段落中描述的试剂盒，其中CNTF基因分型引物组合物包含至少两套等位基因特异的引物对。

本发明进一步的实施方案提供了根据前述段落的试剂盒，其中两种CNTF基因分型用寡核苷酸包装在单独的容器内。

本发明的进一步的实施方案为一方法，其中根据前述实施方案的试剂盒用于确定存在于个体中的CNTF基因的两个拷贝在GenBank序列参考号X55890(版本1)中多态性位点103G＞A处的核苷酸对的同一性和/或用于确定存在于个体中的CNTF基因的两个拷贝在与GenBank序列参考号X55890(版本1)中CNTF103G＞A处的多态性位点连锁不平衡的位于CNTF基因区域中的多态性位点的核苷酸对的同一性。

本发明的另一方面为用于鉴定CNTF基因mRNA表达的试剂盒，该试剂盒包含用于确定CNTF基因的mRNA产物的工具。

本发明进一步的实施方案为前述段落中描述的试剂盒，其中用于确定CNTF基因mRNA产物的工具包含能够结合CNTF基因mRNA表达产物的多核苷酸。

在另一实施方案中，本发明提供了用于鉴定根据前述段落的CNTF基因mRNA表达的试剂盒，其中用于确定CNTF基因mRNA产物的工具包含至少一种这样的多核苷酸，所述多核苷酸对CNTF基因在多态性位点103G＞A处的变体之一是特异的。

在进一步的实施方案中，本发明提供了用于鉴定CNTF基因mRNA表达的试剂盒，其中多核苷酸对于CNTF基因在多态性位点103G＞A处的G变体mRNA的表达是特异的。

本发明的另一实施方案提供了用于鉴定CNTF基因mRNA表达的试剂盒，其中多核苷酸对于CNTF基因在多态性位点103G＞A处的A变体mRNA的表达是特异的。

在另一实施方案中，本发明提供了根据前述段落的试剂盒，其中多核苷酸特异于编码62个氨基酸的截短蛋白质的异常mRNA。

在进一步的实施方案中，本发明提供了用于鉴定如前述权利要求中描述的CNTF基因的mRNA表达，其中多核苷酸在严格杂交条件下结合CNTF基因G或A变体的mRNA表达产物。

本发明的另一实施方案为用于鉴定在前述权利要求中描述的CNTF基因mRNA表达的试剂盒，其中用于确定CNTF基因mRNA产物的工具包含至少两种多核苷酸，其中一种多核苷酸特异于CNTF基因在多态性位点103G＞A处的G变体的mRNA表达，且另一多核苷酸特异于CNTF基因在多态性位点103G＞A处的A变体的mRNA表达。

在本发明进一步的实施方案中，提供了前述段落中描述的试剂盒，其中两种多核苷酸包装在单独的容器内。

本发明的另一实施方案为一方法，其中本发明前述的鉴定CNTF基因mRNA表达的实施方案用于(a)检测与GenBank序列参考号X55890(版本1)中多态性位点103G＞A处的CNTF基因G变体对应的mRNA表达水平，和/或(b)检测GenBank序列参考号X55890(版本1)中多态性位点103G＞A处的CNTF基因A变体对应的mRNA表达水平。

在另一方面中，本发明提供了用于鉴定患者的CNTF蛋白水平的试剂盒，包含用于检测CNTF基因的多肽表达产物的方法。

本发明进一步的实施方案为前述段落中描述的试剂盒，其中工具包含识别CNTF多肽的抗体。

在另一实施方案中，本发明提供了根据前述段落的试剂盒，其中抗体结合的K_D范围位于10e^-6到10e^-13之间，优选地位于10e^-8到10e^-12之间。

本发明的另一实施方案为一种方法，其中用于鉴定患者GNTF蛋白水平的前述试剂盒之一用于测试患者体液或组织中是否存在CNTF蛋白。

在另一实施方案中，本发明提供了根据前述权利要求的试剂盒，进一步包含收集体液或组织样本的工具。

本发明进一步的实施方案提供了对需要此治疗的患者进行精神病治疗的方法，提供了选择受试者加入抗精神病药物治疗的临床研究的方法，或提供了用于确定患精神病个体对伊潘立酮治疗的反应性的方法，其中该方法离体(ex vivo)进行。

附图简述

图1显示如在实施例1中讨论的GG TOTPANSS和非-GGTOTPANSS中平均百分比变化。

优选实施方案的描述

因此，在第一个方面中，本发明提供了用于确定患精神病个体对抗精神病药物治疗的反应性的方法，所述药物包括但不限于伊潘立酮。这些方法包括确定CNTF基因的基因型或单倍型以及基于CNTF基因中一种或多种多态性变体的存在与否进行反应性测定。CNTF基因位于11q12.2且多态性为GenBank序列X55890(版本1)中的103G＞A。该核苷酸变异导致产生新的受体剪接位点、改变的mRNA以及由此产生的异常蛋白质，参见Pub Med ID号9285965。

这些多态性的检测可用于确定或预测个体对特定抗精神病药剂的反应性。此外，可直接检测多态性或与通过检测不同于较常见CNTF类型的多态性变体基因的特征性mRNA而检测多态性。

此外，体液或组织中CNTF基因的多肽(蛋白质)表达产物的检测可用于确定是否存在多态性，且多肽表达产物的相关水平可用于确定多态性是否以纯合或杂合状态存在，且因此确定患者对抗精神病药的反应性。

因此，本发明的一个实施方案为通过鉴定CNTF基因蛋白质表达产物的存在而确定患者是否存在多态性的方法。已有研究显示，A变体的mRNA并不翻译为多肽表达产物。因此，如果发现患者体液或组织样本中存在正常数量的CNTF蛋白，则推测该患者具有较常见的纯合G变体并将对抗精神病药剂作出反应。如果CNTF蛋白表达水平为不能检测到的水平，则推测该患者具有纯合A多态性并预期也将成为对抗抗精神病药剂作出反应者。但是，如果发现体液或组织样本中存在中间水平的CNTF蛋白，则推测该患者具有在多态性位点处一个等位基因含G一个含A的杂合多态性。在此情形下，将预期患者对包括伊潘立酮的抗精神病药为非反应者，且将不指示单独应用如伊潘立酮进行抗精神病治疗。

当谈及在体液或身体组织中测定的CNTF基因的多肽表达产物水平时，如此处所应用的术语″正常水平″意指测量水平位于以下的CNTF基因多肽表达产物平均水平的一个标准差之内，所述平均水平至少测定已知在人CNTF基因(在具有GenBank登录号X55890(版本1)的序列中)103G＞A多态性位点处的两个基因座具有G变体的10个个体，且通过相同的试验技术在同样的体液或组织类型中进行测定。

当谈及在体液或身体组织中测定的CNTF基因的多肽表达产物水平时，如此处所应用的术语″中间水平″意指测量水平高于以下的CNTF基因多肽表达产物平均水平的一个标准差，所述平均水平至少测定已知在人CNTF基因(在具有GenBank登录号X55890(版本1)的序列中)103G＞A多态性位点处的两个基因座具有G变体的10个个体，且通过相同的试验技术在同样的体液或组织类型中进行测定。

在另一实施方案中，本发明提供了用于测定患者对抗精神病药剂的反应性以及研发对患精神病患者治疗策略的方法。这些方法包括测定与以下两种变体对应的mRNA的数量和比率，所述变体为在103位点为G的CNTF基因较常见的变体以及在G处为A的较不常见多态性变体。在此实施方案中，在患者体液或身体组织样本中测定两种mRNA的比率。如果所有的mRNA均来自G变体，则患者将会对包括伊潘立酮的抗精神病药剂治疗作出反应。如果所有的mRNA均来自A变体，则患者也将会对如伊潘立酮的抗精神病药剂治疗作出反应。但是，如果发现存在两种类型的mRNA，则患者的多态性为杂合型且预期患者包括伊潘立酮的抗精神病药物治疗的反应性较差，并应当考虑备选的治疗策略。

本领域内的技术人员将容易地认识到，除了此处公开的特定多态性，与该多态性连锁不平衡的任何多态性均可用作替代标记物，以表明与其连锁不平衡的单核苷酸多态性(SNP)对相同药物或治疗的反应性。因此，与本说明书中公开的SNP连锁不平衡的任何SNP均可应用且意在包括于本发明的方法之内。

SNP的鉴定和特征

多种不同的技术可用于鉴定和表征SNP，包括单链构象多态性分析、通过变性高效液相层析(DHPLC)的异型双链分析、直接DNA测序和计算方法，参见Shi MM，Clin Chem 2001，47：164-172。由于在公共数据库中存在大量的序列信息，因此可应用计算工具通过单独比对提交的特定基因序列(cDNA或基因组序列)在硅片中(in silico)鉴定SNP。对实验获得和通过硅片方法获得的SNP的比较显示，55％的由SNPFinder(http：//lpgws.nci.nih.gov：82/perl/snp/snp_cgi.pl)发现的侯选SNP也已经通过实验发现，参见Cox等Hum Mutal 2001，17：141-150。然而，它们在硅片方法中发现仅27％的SNP为真正的SNP。

最常见的SNP分型方法目前包括杂交、引物延伸和切割方法。这些方法中的每一种方法必须与适宜的检测系统相连。检测技术包括荧光偏振(参见Chan X等Genome Res 1999，9：492-499)、焦磷酸释放的发光计检测(焦磷酸测序)、(参见Ahmadiian A等Anal Biochem 2000，280：103-10)、基于荧光共振能量转移(FRET)的切割试验、DHPLC和质谱(参见ShiMM，Clinchem 2001，47：164-172和美国专利号6,300,076B1)。检测和表征SNP的其它方法为美国专利号6,297,018B1和6,300,063B1中公开的方法。以上参考的内容在此全部引入作为参考。

在一特别优选的实施方案中，可通过称作INVADER^TM技术(可从Third Wave Technologies Inc.Madison，Wis.获得)实现多态性检测。在此试验中，当与互补DNA模板结合时，一特异的上游″侵入者(invader)″寡核苷酸和部分重叠的下游探针一起形成特异的结构。该结构被切割酶识别并在特异位点进行切割，且此切割导致释放出探针寡核苷酸的5′突出端(flap)。然后该片段被用作反应混合物中合成的二级靶标和二级荧光标记信号探针的″侵入者″寡核苷酸。这导致通过切割酶特异切割二级信号探针。当此二级探针切除时产生荧光信号，所述二级探针标记有能够进行荧光共振能量转移的染料分子。切割酶严格识别由重叠DNA序列或突出端形成的结构，且因此可用于检测位于下游DNA链中紧邻切割位点上游的单碱基对错配。参见Ryan D等，Molecular Diagnosis，卷4，第2期，1999：135-144和Lyamichev V等，Nature Biotechnology，17卷，1999：292-296，同时参见美国专利5,846,717和6,001,567(所述在此全部引入作为参考)。

在一些实施方案中，组合物含有两种或更多种不同标记的基因分型寡核苷酸，以用于同时探测两个或更多个多态性位点的核苷酸同一性。也考虑引物组合物可包含两套或更多套的等位基因特异引物对，以允许同时靶向和扩增含多态性位点的两个或更多个区域。

也可将本发明的CNTF基因分型用寡核苷酸固定到或合成到固体表面，所述固体表面如微芯片、珠子或载玻片(参见如WO98/20020和WO98/20019)。此类固定的基因分型寡核苷酸也可用于多种多态性检测试验，包括但不限于探针杂交和聚合酶延伸试验。本发明固定的CNTF基因分型用寡核苷酸也可包含寡核苷酸的有序阵列，所述阵列意在同一时间快速筛选DNA样本多个基因的多态性。

本发明等位基因特异的寡核苷酸引物具有这样的3’末端核苷酸或优选地为3’倒数第二的核苷酸，所述核苷酸仅与特定SNP的一个核苷酸互补，由此仅在存在含该核苷酸的等位基因时用作聚合酶介导的延伸引物。与编码或非编码链杂交的等位基因特异的寡核苷酸(ASO)引物也为本发明所考虑。可应用本领域内技术人员已知的技术设计用于检测CNTF基因多态性的ASO引物。

本发明其它的基因分型寡核苷酸与这样的靶区域杂交，所述靶区域位于此处鉴定的新多态性位点之一的下游一个至几个核苷酸处。该寡核苷酸可用于聚合酶介导的引物延伸方法以检测此处描述的新多态性之一，因此该基因分型寡核苷酸在此称作″引物延伸寡核苷酸″。在一优选实施方案中，引物延伸寡核苷酸的3′末端为与位于多态性位点紧邻的核苷酸互补的脱氧核苷酸。

在另一实施方案中，本发明提供了包含至少两种包装于单独容器内的基因分型寡核苷酸的试剂盒。试剂盒也可包含其它组份，如包装于单独容器内的杂交缓冲液(其中寡核苷酸用作探针)。备选地，当应用寡核苷酸扩增靶区域时，试剂盒可包含包装于单独容器内的聚合酶和反应缓冲液，所述缓冲液经过优化以用于由聚合酶介导的引物延伸，如PCR。

以上描述的寡核苷酸组合物和试剂盒可用于对个体进行CNTF基因的基因分型和/或单倍型分型的方法。如此处所应用，术语″CNTF基因型″和″CNTF单倍型″分别意指含在此处描述的一个或多个新多态性位点处存在的核苷酸对或核苷酸的基因型或单倍型，且可任选地包括在CNTF基因一个或多个其它多态性位点处存在的核苷酸对或核苷酸。其它多态性位点可为目前已知的多态性位点或随后发现的位点。

基因分型方法的一个实施方案包括，从个体中分离存在于个体中的包含两拷贝CNTF基因或其片段的核酸混合物，以及测定一个或多个多态性位点处两拷贝核苷酸对的同一性以赋予个体CNTF基因型。本领域内的技术人员将容易地理解，个体中一个基因的两个″拷贝″可为相同的等位基因或可为不同的等位基因。在一特别优选的实施方案中，基因分型方法包括测定每一多态性位点处核苷酸对的同一性。

通常，从取自个体的生物样本中分离核酸混合物或蛋白质，所述生物样本如血液样本或组织样本。适宜的组织样本包括全血、精液、唾液、泪液、尿液、排泄物、汗液、口腔粘膜涂片、皮肤，以及特异器官组织如肌肉或神经组织的活组织检查切片和毛发。核酸混合物可由基因组DNA、mRNA或cDNA组成，且在后两种情况下，生物样本必须从表达CNTF基因的器官中获得。此外，技术人员将会理解，mRNA或cDNA制备物将不用于检测位于内含子或5′和3′非转录区内的多态性。如果分离出CNTF基因片段，该片段必须包含用于基因分型的一个或多个多态性位点。

单倍型分型方法的一个实施方案包括，从个体中分离存在于个体中的包含两拷贝CNTF基因或其片段中一个拷贝的核酸分子，以及测定一个或多个多态性位点处该拷贝的核苷酸对的同一性以赋予个体CNTF基因型。可应用能够将CNTF基因或片段的两拷贝分开的任何方法分离核酸，所述方法包括但不限于以上描述的用于制备CNTF同源基因的方法之一，具有靶向体内克隆的方法为优选。

本领域内的技术人员将易于理解，任何单独的克隆将仅提供存在于个体中的CNTF基因两拷贝中一个拷贝的单倍型信息。如果也需要个体另一拷贝的单倍型信息，需要检测其它的CNTF克隆。通常，至少应检测5个克隆以使对个体CNTF基因的两个拷贝均进行单倍型分型的概率大于90％。在一个特别优选的实施方案中，鉴定了每一多态性位点处的核苷酸。

在一优选实施方案中，通过鉴定存在于个体中CNTF基因的每一拷贝在一个或多个多态性位点处核苷酸的相位序列(phased sequence)进行CNTF单倍型对的确定。在一特别优选的实施方案中，单倍型分型方法包括鉴定CNTF基因每一拷贝中每一多态性位点处核苷酸的相位序列。当对基因的两个拷贝均进行单倍型分型时，优选地应用置于单独容器内基因的每一拷贝进行鉴定。但是，也可预想，如果两拷贝标记以不同的标签，或其区分或鉴定的方式不同，则在一些情况下也可能在同一容器内进行所述方法。例如，如果基因的第一和第二拷贝分别标记以不同的第一和第二荧光染料，而用于测试一个或多个多态性位点的等位基因特异寡核苷酸标记以第三种不同的荧光染料，然后检测第一和第三染料的组合将会鉴定出第一基因拷贝中的多态性，而检测第二和第三染料的组合将鉴定出第二基因拷贝中的多态性。

在基因分型和单倍型分型方法中，多态性位点处核苷酸(或核苷酸对)的同一性可通过下述方法进行测定，所述方法直接从CNTF基因或其片段的一个或两个拷贝中扩增含多态性位点的靶区域，并通过常规方法测定扩增区域的序列。本领域内的技术人员将易于理解，从具有纯合位点的个体中多态性位点处仅检测出一种核苷酸，而如果个体的该位点为杂合的则将检测出两种不同的核苷酸。可直接鉴定多态性，称作阳性类型鉴定，或通过推论进行鉴定，称作阴性类型鉴定。例如，当已知SNP在参照人群中为鸟嘌呤或胞嘧啶时，该位点为纯合的所有个体将阳性确定出为鸟嘌呤或胞嘧啶的位点，如果个体在该位点为杂合，则确定出为鸟嘌呤和胞嘧啶。备选地，可阴性确定位点不是鸟嘌呤(且因此为胞嘧啶/胞嘧啶)或不是胞嘧啶(且因此为鸟嘌呤/鸟嘌呤)。

此外，存在于此处描述的任何新多态性位点处等位基因的同一性可进行间接确定，所述确定通过对与目的多态性位点连锁不平衡的此处未公开的多态性位点进行基因分型而实现。如果一个位点的特定变体的存在提高了第二个位点的另一变体的可预测性则说两位点为连锁不平衡(参见，Stevens，JC 1999，Mol Diag，4：309-317)。与目前公开的多态性位点连锁不平衡的多态性位点可位于该基因区域内或其他此处未检测的基因组区域内。与此处描述的新多态性位点连锁不平衡的多态性位点的基因分型可通过但不限于这样的方法进行，所述方法为以上提及的用于检测多态性位点处等位基因同一性的任何方法。

可应用任何的寡核苷酸指导的扩增方法扩增一个或多个靶区域，所述方法包括但不限于聚合酶链反应(PCR)(美国专利号4,965,188)、连接酶链反应(LCR)(Barany等，Proc Natal Acad Sci USA 88：189-193，1991；WO90/01069)和寡核苷酸连接试验(OLA)(Landegren等，Science 241：1077-1080，1988)。在此类方法中用作引物或探针的寡核苷酸应与包含多态性位点或与多态性位点邻近的核酸区域特异杂交。通常，寡核苷酸长度在10到35个核苷酸之间，且优选地长度在15到30个核苷酸之间。最优选地，寡核苷酸长度为20到25个核苷酸。寡核苷酸的确切长度将依赖于技术人员常规考虑并实践的多种因素。

其它已知的核酸扩增方法也用于扩增靶区域，所述方法包括基于转录的扩增系统(美国专利号5,130,238；EP329,822；美国专利号5,169,766，、WO89/06700)和等温方法(Walker等，Proc Natl Acd Sci USA 89：392-396，1992)。

也可应用本领域内已知的几种基于杂交的方法之一在扩增之前或之后测试靶区域内的多态性。通常，应用等位基因特异的寡核苷酸实施此类方法。等位基因特异的寡核苷酸可用作不同标记的探针对，探针对中的一个探针对靶序列的一个变体精确匹配且另一个探针对不同的变体精确匹配。在一些实施方案中，应用一套等位基因特异的寡核苷酸或寡核苷酸对可立即检测出不止一个多态性位点。优选地，当杂交到每一待检测的多态性位点时，上述一套寡核苷酸对成员间解链温度的差异在5℃之内，优选地在2℃之内。

等位基因特异的寡核苷酸与靶多核苷酸杂交时，前述二者可均在溶液中，或者寡核苷酸或靶多核苷酸共价或非共价固定在固体支持物上。固定可通过以下方式介导，例如抗体-抗原反应、聚-L-Lys、链亲和素-或亲和素-生物素、盐桥、疏水交互作用、化学键、紫外交联等。等位基因特异的寡核苷酸可直接合成到固体支持物上或在合成后固定到固体支持物上。用于本发明检测方法中的适宜固体支持物包括由硅、玻璃、塑料、纸等制成的基质，所述基质可加工成如孔(如在96孔板中)、玻片、薄片、薄膜、纤维、芯片、圆盘和珠子。固体支持物可经过处理、包被或衍生化以易于等位基因特异的寡核苷酸或靶核酸的固定。

也可通过将含CNTF基因的一个或两个拷贝的核酸样本与核酸阵列或子阵列杂交来确定个体CNTF基因的基因型或单倍型，如在WO95/11995中所描述的。阵列包含一组等位基因特异的寡核苷酸，所述寡核苷酸代表基因型或单倍型中所包括的每一个多态性位点。

也可应用错配检测技术确定多态性特征，所述检测技术包括但不限于应用核酸探针(riboprobe)的RNase保护法(Winter等，Proc Natal Acad SciUSA 82：7575，1985；Meyers等，Science 230：1242，1985)和可识别核苷酸错配的蛋白质，其中所述蛋白质如大肠杆菌mutS蛋白(Modrich P.，AnnRev Genet 25：229-253，1991)。备选地，变体等位基因的鉴定可通过单链构象多态性(SSCP)分析(Orita等，Genomics，5：874-879，1989；Humphries等，遗传疾病的分子诊断，R.Elles编辑，321-340页，1996)或变性梯度胶电泳(DGGE)(Wartell等，Nucl Acids Res 18：2699-2706，1990；Sheffield等，ProcNatal Acad Sci USA 86：232-236，1989)实现。

聚合酶介导的引物延伸法也可用于鉴定多态性。在专利和科学文献中已描述了几种此类方法，包括″Genetic Bit Analysis″法(WO92/15712)和连接酶/聚合酶介导的遗传位分析(美国专利号5,679,524)。相关的方法在WO91/02087、WO90/09455、WO95/17676、美国专利号5,302,509和5,945,283中描述。包含多态性的延伸引物可通过质谱进行检测，如在美国专利号5,605,798中所描述的。另一引物延伸方法为等位基因特异的PCR(Ruafio等，Nucl Acids Res 17：8392，1989；Ruafio等，Nucl Acids Res19，6877-6882，1991；WO93/22456；Turki等，Clin Invest 95：1635-1641，1995)。此外，应用多组等位基因特异引物同时扩增核酸的多个区域可研究多个多态性位点，如Wallace等(WO89/10414)所描述。

在一优选实施方案中，检测每一民族地理学分组的单倍型频率数据以确定其是否与Hardy-Weinberg平衡一致。Hardy-Weinberg平衡(D.L.Hart等，群体基因组定律(Principles of Population Genomics)，SinauerAssociates(Sunderland，MA)，第三版，1997)假定单倍型对H₁/H₂的频率当H₁≠H₂时P_H-W(H₁/H₂)＝2p(H₁)p(H₂)，以及当H₁＝H₂时P_H-W(H₁/H₂)＝p(H₁)p(H₂)。在观测和预期的单倍型频率间存在的统计学上显著性差异可能是由于以下的一个或多个因素，包括在人群组中的近亲繁殖、基因的强选择压力、取样偏差和/或基因分型过程中的错误。如果在民族地理学分组中发现与Hardy-Weinberg平衡具有大的偏差，则可增加该组中个体的数目以了解偏差是否由于取样误差所致。如果较大的样本数仍不能减小观测的和预期的单倍型对频率间的差异，则可考虑应用直接单倍型分型法对个体进行单倍型分型，所述方法如CLASPER System^TM技术(美国专利号5,866,404)或等位基因特异的长距离PCR(Michalotos-Beloin等，Nucl AcidsRes 24：4841-4843，1996)。

在该方法用于预测CNTF单倍型对的一个实施方案中，指定步骤包括进行以下的分析。首先，每一可能的单倍型对与参考人群中的单倍型对进行比较。一般而言，仅参考人群单倍型对之一与可能的单倍型对匹配且该配对指定给个体。偶尔，在参考单倍型对中仅一个单倍型与可能的个体单倍型对一致，且在此情形下个体指定以这样的单倍型对，即其包含此已知单倍型和通过从可能单倍型中减去已知单倍型而得出的新单倍型。在很少的情形下，参考人群中的单倍型均不与可能的单倍型对一致，或另外，多个参考单倍型对与可能的单倍型对一致。在此情形下，个体优选地应用直接的分子单倍型分型法进行单倍型分型，所述方法如CLASPER System^TM技术(美国专利号5,866,404)或等位基因特异的长距离PCR(Michalotos-Beloin等，Nucl AcidsRes 24：4841-4843，1996)。

本发明也提供了用于确定人群中CNTF基因型或CNTF单倍型的频率的方法。该方法包括测定存在于人群每一个体中的CNTF基因的基因型或单倍型对，其中基因型或单倍型包含在CNTF基因的一个或多个多态性位点处检测的核苷酸对或核苷酸，包括但不限于FS63 TER多态性，并计算人群中发现的任何特定基因型或单倍型的频率。人群可为参考人群、家庭人群、同性别人群、人群组、特征人群(例如具有目的特性的一组个体，所述目的特性如医学疾病或对治疗性处理的反应)。

在本发明的另一方面中，在参考人群中发现的CNTF基因型和/或单倍型的频率数据用于以下的方法中，所述方法用于鉴定特性和CNTF基因型或CNTF单倍型之间的关联。特性可为任何可检测的基因型，包括但不限于对疾病的易感性或对治疗的反应。所述方法包括获得参考人群以及显示有特性的人群中目的基因型或单倍型的频率数据。参考人群和特性人群之一或这两种人群的频率数据可通过应用以上描述的方法之一对人群中每一个体进行基因分型或单倍型分型而获得。特性人群的单倍型可直接进行测定，或备选地，通过以上描述的预测基因型到单倍型的方法进行测定。

在另一实施方案中，参考人群和/或特性人群的频率数据通过访问先前测定的频率数据而获得，该数据可为书写或电子形式。例如，频率数据可存在于可由计算机访问的数据库中。一旦获得频率数据，则比较参考人群和特性人群中目的基因型或单倍型的频率。在一优选实施方案中，比较人群中观测到的所有基因型和/或单倍型的频率。如果CNTF基因的特定基因型或单倍型在特征人群中的频率与参考入群相比存在统计学上显著数量的提高，则预测该特征与上述CNTF基因型或单倍型关联。

在一优选的实施方案中通过应用标准方差分析(ANOVA)试验进行统计分析，前述试验具有的Bonferoni校正和/或Bootstrapping方法多次促进基因型表型的相关性并计算显著值。当分析多种多态性时，可进行因子的校正以校正可能是偶然发现的显著相关性。本发明方法中应用的统计学方法，参见，生物学中的统计学方法，第3版，Bailey NTJ，CambridgeUniv.Press(1997)；计算生物学入门，Waterman MS，CRC Press(2000)和生物信息学，Baxevanis AD和Ouellette BFF编辑(2001)JohnWiley&Sons，Inc。

在方法的一优选实施方案中，目的特性为患者对某种治疗性治疗所显示出的临床反应，例如对靶向CNTF的药物的反应或对医学疾病进行治疗性治疗的反应。

在本发明的另一实施方案中，与目的CNTF基因型或单倍型连锁不平衡的可检测基因型或单倍型可用作替代标记物。与CNTF基因型连锁不平衡的基因型可通过下述方法发现，即测定也显示出潜在替代标记基因型的群体与参考人群相比，前者CNTF基因的特定基因型或单倍型的频率是否存在统计学上显著增高的数量，然后预测所述标记基因型与该CNTF基因型或单倍型关联，且然后可用作替代CNTF基因型的替代标记。

如此处所应用，″医学疾病″包括但不限于任何需要治疗的病症或疾病，所述病症或疾病表现为一种或多种身体和/或精神症状，包括先前和最近鉴定的疾病或其它紊乱。

如此处所应用，术语″临床反应″意指任何或全部的以下所述内容：反应、无反应和有害反应(即副作用)的定量检测。

为推断对治疗的临床反应和CNTF基因型或单倍型之间的关联，必需获得接受治疗的群体所显示的临床反应的数据，前述群体在下文中称作″临床群体″。该临床数据可通过分析已实施的临床试验的结果而获得和/或通过设计并实施一个或多个新的临床试验而获得。

如此处所应用，术语″临床试验″是指任何意在收集对特定治疗产生反应的临床数据的研究，且包括但不限于I期、II期和III期临床试验。应用标准方法以确定患者群以及招收受试者。

优选的是，对包括在临床群体中的个体已经进行了存在目的医学病症的分级。分级在下述的情形下尤为重要，即患者表现的症状可由多于一种根本病症引起，且对根本病症的治疗并不相同。此情形的一个实例是经受呼吸困难的患者，所述病症由于哮喘或呼吸道感染引起。如果两组病人均按哮喘进行治疗，则实际上未患哮喘的组将成为不真实的明显无反应小组。这些人群将影响到检测单倍型和治疗结果间的任一相关性。对潜在病人进行此类分级可应用标准身体检查或一种或多种的实验室试验。备选地如果单倍型对和疾病易感性或严重性之间密切相关，对病人进行分级可使用单倍型分型。

目的治疗性治疗施用给试验人群中的每一个体，并应用一种或多种预先确定的标准测定每一个体对治疗的反应。预期在多种情形下，试验人群将显示多种反应，且研究者将选择由不同反应组成的反应组数(例如，低、中、高)。此外，确定试验群体中每一个体CNTF基因的基因型和/或单倍型，所述确定可在治疗前和治疗后进行。

在已获得临床和多态性数据之后，建立个体反应与CNTF基因型或单倍型之间的相关性。可以多种方式产生相关性。在一个方法中，根据其CNTF基因型或单倍型(或单倍型对)将个体分组(也称作多态性组)，并计算每一多态性组成员显示的临床反应的平均数和标准差。

然后分析这些结果以确定观测到的多态性组间临床反应的差异是否具有统计学意义。可应用的统计学分析方法描述在：L.D.Fisher和G.vanBelle，″生物统计学：用于健康科学的方法学″，Wiley-Interscience(New York)1993。该分析也可包括回归计算，以明确在CNTF基因中哪些多态性位点对基因型差异的影响最为显著。用于本发明的一个回归模型在以下PCT申请中描述，题为″获得并应用单倍型数据的方法″，2000年6月26日申请。

发现CNTF单倍型含量和临床反应间相关性的第二个方法应用这样的预测模型，所述模型基于误差最小优化算法。多种可能的优化算法之一为遗传算法(R.Judson，″遗传算法及其在化学中的应用″，计算化学中的综述(Reviews in Computational Chemistry)，第10卷，1-73页，K.B.Lipkowitz和D.B.Boyd编辑(VCH出版社，纽约，1997)。也可应用模拟退火(Press等，″C中的数字方法：科学计算的艺术″，剑桥大学出版社(剑桥)1992，Ch.10)、神经网络(E.Rich和K.Knight，″人工智能″，第二版(McGraw-Hill，纽约，1991，Ch.18)、标准梯度下降方法(Press等，见上文，Ch.10)或其它总体或局部优化方法(参见上文Judson中的讨论)。优选地，相关性的建立应用如下PCT申请所描述的遗传算法，题目为″获得并应用单倍型数据的方法″，2000年6月26日申请。

也可应用ANOVA技术分析相关性以确定临床数据中的变异中有多少可由CNTF基因中多态性位点的不同子集合进行解释。如在题目为″获得并应用单倍型数据的方法″的PCT申请(2000年6月26日申请)中所描述，应用ANOVA检验这样的假说，即反应的差异是否由可测定的一种或多种特性或变量引起或与其相关(Fisher和vanBelle，参见上文，Ch.10)。

通过以上描述的分析，技术人员可容易地建立起这样数学模型，所述模型预测临床反应与CNTF基因型或单倍型含量的关系。优选地，在设计为用于测试模型的一种或多种重复临床试验中对模型进行验证。

鉴定临床反应与CNTF基因的基因型或单倍型(或单倍型对)间的相关性可作为设计诊断方法的基础，以确定那些个体中哪些会对治疗作出反应哪些则不能，或另外，确定哪些将以低水平作出反应且因此可能需要更多的治疗，即需要更大剂量的药物。诊断方法可采用多种形式中的一种：例如直接DNA测试(即对CNTF基因的一个或多个多态性位点进行基因分型或单倍型分型)、血清学试验或体检测量。唯一的要求是诊断检测结果与根本的CNTF基因型或单倍型密切关联，接下来也与临床反应关联。在一优选实施方案中，该诊断方法应用以上描述的预测性单倍型分型方法。

实践本发明的方法中所涉及的任何或全部的分析和数字操作均可由计算机完成。此外，计算机可执行产生在显示器上显示视窗(或显示屏)的程序，且应用该程序用户可通过显示视窗观看并分析涉及CNTF基因及其基因组变异的大量信息，包括染色体定位、基因结构和基因家族、基因表达数据、多态性数据、遗传序列数据和临床数据、群体数据(例如一个或多个群体的民族地理学起源、临床反应、基因型和单倍型数据)。此处描述的CNTF多态性数据可储存为相关数据库(例如Oracle数据库或ASCII单种资料组)的一部分。这些多态性数据可储存在计算机的硬盘中，或者，例如可储存在计算机可应用的CD-ROM或一种或多种其它储存设备中。例如，数据可储存在通过网络与计算机联系的一个或多个数据库中。

在其它实施方案中，本发明提供了对个体CNTF基因进行单倍型分型和/或基因分型的方法、组合物和试剂盒。方法包括对在GenBank登录号X55890(版本1)中核苷酸：103G＞A处存在的核苷酸或核苷酸对进行鉴定。该核苷酸替换导致产生一个新的受体剪接位点以及由此产生的一种异常蛋白质。参见，Pub Med ID#9285965。

组合物包含设计为与含多态性位点或与其邻近的一个或多个靶区域进行特异杂交的寡核苷酸探针和引物。用于确定个体在此处描述的新多态性位点处的基因型或单倍型的方法和组合物在研究多态性对下述疾病病因学的影响是有用的，所述疾病受CNTF蛋白的表达和功能的影响或受该蛋白质缺乏的影响，上述方法和组合物可用于研究靶向CNTF的药物的功效，用于预测对下述疾病的易感性，所述疾病受CNTF蛋白的表达和功能的影响，并用于预测个体对靶向CNTF的药物的反应性。

而在另一实施方案中，本发明提供了用于鉴定基因型、单倍型和特性间相关性的方法。在优选的实施方案中，特性为对疾病的易感性、疾病的严重程度、疾病发展阶段或对药物的反应。此类方法可应用于这样的研发诊断试验和所有药物遗传应用的治疗性治疗中，即应用情形中基因型和治疗结果间存在潜在的关联，所述治疗结果包括功效测定、药物动力学(PK)测定和副作用测定。

本发明也提供了储存和显示已确定的CNTF基因多态性数据的计算机系统。计算机系统包含计算机处理部件、显示器、和含多态性数据的数据库。多态性数据包括鉴定参考人群CNTF基因的多态性、基因型和单倍型。在一优选实施方案中，计算机系统能够产生显示CNTF单倍型的阵列，所述阵列是根据CNTF单倍型的进化关系进行组织的。

在另一方面中，本发明提供了SNP探针，所述探针用于根据其遗传变异的类型对人群进行分类。根据本发明的SNP探针为寡核苷酸，所述寡核苷酸能够在常规等位基因区分试验中区分SNP核酸等位基因间的差别。

如此处所应用，“SNP核酸”为这样的核酸序列，在个体间或个体组间该序列包含一个可变的核苷酸而其他的核苷酸序列完全相同，由此作为等位基因存在。该SNP核酸的长度优选地从约15到约500个核苷酸。SNP核酸可为染色体的一部分或可为染色体一部分的精确拷贝，例如通过PCR或通过克隆扩增出染色体的该部分。SNP核酸下文中简称为“SNPs”。根据本发明的SNP探针为与SNP核酸互补的寡核苷酸。

如此处所应用，术语″互补的″是指寡核苷酸的全长按Watson和Crick规则完全互补。

在某些优选实施方案中，根据本发明此方面的寡核苷酸与SNP核酸的一个等位基因互补，并不与SNP核酸的任何其它等位基因互补。根据本发明此实施方案的寡核苷酸可以多种方式区分SNP核酸的等位基因。例如，在严格的杂交条件下，适宜长度的寡核苷酸将与SNP核酸的一个等位基因杂交，但不与SNP核酸的任何其它等位基因杂交。寡核苷酸可标记以放射性同位素标记或荧光标记。备选地，适宜长度的寡核苷酸可用作PCR的引物，其中3′末端核苷酸与SNP核酸的一个等位基因互补，但不与任何其它的等位基因互补。在此实施方案中，以是否存在PCR扩增产物来确定SNP核酸的单倍型。

因此，在一个实施方案中，本发明提供了包含下述核苷酸序列的分离的多核苷酸，所述核苷酸序列为CNTF基因或其片段参考序列的多态性变体。参考序列包含GenBank登录号号X55890(版本1)且多态性变体包含至少一种多态性，包括但不限于核苷酸：103G＞A。一特别优选的多态性变体为CNTF基因天然存在的同种型(此处也称作″同基因(isogene)″)。

本发明的基因组和cDNA片段包含至少一个此处鉴定的新多态性位点，其长度至少为10个核苷酸且其可覆盖基因的全长。优选地，根据本发明片段的长度在100到3000个核苷酸之间，且更优选地在200到2000个核苷酸之间，且最优选地长度在500到1000个核苷酸之间。

在描述此处鉴定的多态性位点时，为方便起见将基因的有义链设为参考。但是，如由技术人员所了解的，含CNTF基因的核酸分子可与双链分子互补，且因此，谈及有义链特定位点也指互补反义链上的相应位点。因此，可将在任意一条链上的同一多态性位点设为参考，且可设计在含多态性位点的靶区域与任意一条链进行特异杂交的寡核苷酸。因此，本发明也包括与此处描述的CNTF基因组变体的正义链互补的单链多核苷酸。

此处鉴定的多态性对CNTF表达的影响可通过制备含CNTF基因多态性变体的重组细胞和/或生物体进行研究，所述生物体优选地为动物。如此处所应用，″表达″包括但不限于一个或多个以下过程：将基因转录成前体mRNA；前体mRNA进行剪接或其它加工以产生成熟的mRNA；mRNA稳定；将成熟mRNA翻译成CTNF蛋白质(包括密码子使用和tRNA可用性)；以及需要正确表达和发挥功能时对翻译产物进行糖基化和/或其它修饰。

为制备本发明的重组细胞，可通过载体将目的CNTF同基因导入细胞以使同基因仍在染色体外。在此情形下，细胞将从染色体外的部位表达基因。在一优选实施方案中，CNTF同基因以这样的方式导入细胞以使其与存在于细胞内的内源CNTF基因重组。该重组需要发生双重组事件，由此导致产生所需的CNTF基因多态性。用于导入进行重组及维持在染色体外的基因的载体为本领域内已知，且任何适宜的载体或载体构建体均可用于本发明。用于将DNA导入细胞的方法如电穿孔、粒子轰击、磷酸钙共沉淀和病毒转导方法为领域内已知；因此，熟练操作者可根据能力和喜好选择方法。

可将CNTF同基因导入其中的细胞的示例包括但不限于连续培养细胞如COS、NIH/3T3，以及相关组织类型的原代或培养细胞，所述相关组织类型即其表达CNTF等基因。该重组细胞可用于比较不同蛋白质变体的生物活性。

应用本领域内已知的标准方法制备表达变体基因的重组生物体，即转基因动物。优选地，将包含变体基因的构建体在胚胎阶段导入非人动物或动物的先辈，所述胚胎阶段即单细胞期或通常不迟于约八细胞期。本领域内的技术人员可通过多种方法制备携带本发明构建体的转基因动物。一个方法涉及到将构建的逆转录病毒转染入胚胎中，所述构建的逆转录病毒包含一个或多个绝缘子(insulator)元件、一个或多个目的基因以及领域内技术人员已知的其它成分，以提供含有用作转基因的绝缘基因的完整穿梭载体，参见例如美国专利号5,610,053。另一方法涉及将转基因直接注射到胚胎中。第三个方法涉及到应用胚胎干细胞。

可将CNTF同基因导入的动物的示例包括但不限于小鼠、大鼠、其它啮齿动物和非人灵长类动物(参见″将外源基因导入小鼠″以及其中引用的参考文献，该文章在重组DNA，J.D.Watson，M.Gilman，J.Witkowski和M.Zoller编辑；W.H.Freeman and Company，纽约一书中的254-272页)。稳定表达人CNTF同基因并产生人CNTF蛋白的转基因动物可用作研究与异常CNTF表达和/或活性有关的疾病的生物模型，以及用作筛选并试验以减轻这些疾病的症状或影响的多种侯选药物、组合物和治疗方法的生物模型。

技术人员将会理解，用于本发明的多数或全部的化合物能够形成盐，且通常应用药品的盐形式，这通常是由于与游离碱相比前述盐形式更易于结晶和纯化。在所有情况下，以上描述的药物的盐形式预期用于此处的描述，且通常为优选，所有化合物的可药用盐包括在它们的名称中。

用于本发明的多种化合物为胺，且因此与多种无机和有机酸反应以形成可药用酸加成盐。由于本发明化合物的一些游离胺在室温下通常为油，为易于处理和施用优选地将游离胺转换成其可药用酸加成盐，这是由于后者在室温时通常为固体。通常用于形成此类盐的酸为无机酸如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸等，以及有机酸如对甲苯磺酸、甲磺酸、草酸、对溴苯磺酸、碳酸、琥珀酸、柠檬酸、苯甲酸、乙酸等。

此类可药用盐的示例为硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙炔酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、丁炔-1，4-二酸盐、己炔-1，6-二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、苯二甲酸盐、磺酸盐、二甲苯磺酸盐、苯乙酸盐、苯丙酸盐、苯丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、β-羟基丁酸盐、乙醇酸盐、洒石酸盐、甲磺酸盐、丙磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-1-磺酸盐、扁桃酸盐等。优选的可药用盐为与盐酸、草酸或富马酸形成的盐。

施用

用于本发明的药物的剂量在最终的分析中必须由主管病人的医生进行设定，所述设定应用药物知识，结合临床试验中测定的药物特性，以及患者的特征，包括医生所治疗疾病之外的其它疾病。此处将提供剂量的概要以及一些优选剂量，例如；伊潘立酮：每天一次从1到50mg且最优选地每天一次，从12到16mg；奥兰扎平：从约0.25到50mg，一次/天，优选地从1到30mg，一次/天；且最优选地1到25mg，一次/天；氯氮平：每天从约12.5到900mg；优选地每天从约150到450mg；维思通：每天从约0.25到16mg；优选地每天约2-8mg；舍吲哚：每天从约0.0001到1.0mg/kg；喹迪平：从约1.0到40mg/kg，每天一次应用或分次应用；齐拉西酮：每天从约5到500mg；优选地每天从约50到100mg；Haldol：从0.5到40mg，每天一次。

涉及的所有化合物均适于口服且通常经口施用，因此辅药组合物优选地也经口施用。辅药和化合物可以单剂量形式一同施用，或也可分开施用。但是，经口施用不是唯一的途径或甚至不是唯一的优选途径。例如，对于口服药物健忘或性急的患者可能非常需要经皮肤施用。在特殊情况下，药物中的一种可通过一种途径施用如口服，而其它药物则可经皮肤、经皮、静脉内、肌肉内、经鼻或直肠内途径施用。施用途径可有多种变化，所述途径受限于药物的物理特性和对病人及护理者的方便性。

转录状态测定

优选地，转录状态的测定通过与转录本阵列的杂交实现，这将在下面分段描述。用于转录状态测定的其它方法将随后在分段中描述。

转录本阵列概述

在本发明的一个实施方案中，应用″转录本阵列″(此处也称作″微阵列″)。转录本阵列可用于分析细胞中的转录状态。

在一个实施方案中，可通过将存在于细胞中的代表mRNA转录本的经可检测标记的多核苷酸(例如荧光标记的来自细胞总mRNA的cDNA)与微阵列杂交而产生转录本阵列。微阵列为具有结合(例如杂交)位点规则排列的表面，所述位点用于细胞或生物体基因组中多个基因产物结合，所述基因优选地为基因组中大多数的基因或几乎全部的基因。可通过多种方法制备微阵列，其中的一些方法在以下描述。无论以何种方法产生，微阵列具有某些共同的特征：阵列可进行再现，以允许产生特定阵列的多个拷贝并易于互相之间进行比较。优选地，微阵列为通常小于5cm²小型微阵列，且阵列由在结合(例如核酸杂交)条件下稳定的材料制成。微阵列中的一个特定结合位点或由多个结合位点形成的特定组将与细胞中单基因的产物特异结合。尽管每个特异mRNA可存在不止一个物理结合位点(以下称作″位点″)，为了清楚地阐述，以下的讨论中将假设存在单一位点。在一特定实施方案中，应用每一位点包含序列已知的经固定核酸的可寻址阵列。

应当理解，当制备出与细胞的RNA互补的cDNA并在适宜的杂交条件下与微阵列杂交时，微阵列中与任何特定基因对应的位点处的杂交水平将反应出细胞中由该基因转录的mRNA的数量。例如，当与细胞总mRNA互补的经可检测标记(例如用荧光团)的cDNA与微阵列杂交时，阵列上对应于细胞中不进行转录的基因(即能够特异结合基因产物)的位点产生的信号很弱或无信号(例如荧光信号)，而编码大量mRNA的基因产生的信号相当强。

微阵列制备

微阵列为本领域内熟知，且其由这样的表面组成，即与基因产物(例如cDNA、mRNA、cRNA、多肽及其片段)的序列对应的探针可在已知位点处特异杂交或结合到该表面。在一个实施方案中，微阵列为这样的阵列(即矩阵)，其中每一位点代表基因编码产物(例如蛋白质或RNA)的不连续结合位点，且其中存在用于生物体基因组中大多数或几乎全部基因产物的诸多结合位点。在一优选实施方案中，″结合位点″(以下称作″位点″)为特定的相关cDNA可特异与之杂交的核酸或核酸类似物。结合位点的核酸或核酸类似物可为，例如合成的寡聚物、全长cDNA、小于全长的cDNA或基因片段。

尽管在一优选实施方案中微阵列包含用于靶生物体基因组中全部或几乎全部基因的产物的结合位点，但并非必须含如此详尽的位点。通常微阵列具有与基因组中至少约50％的基因对应的结合位点，一般至少约75％，更为常见的是至少约85％，甚至更为常见的是大于约90％，且最为常见的是至少约99％。优选地，微阵列含有与试验和证实目的生物网络模型相关的基因的结合位点。

″基因″定义为一个开放读码框(ORF)，在生物体(例如，如果为单细胞)或多细胞生物体中的某些细胞中从前述ORF中信使RNA可优选地转录出至少50、75、或99个氨基酸。基因组中基因的数目可通过生物体表达的mRNA的数目或通过对基因组中充分表征的部分进行外推而进行评估。如果目的生物体的基因组已经过测序，则可确定ORF的数目且可通过DNA序列分析鉴定出mRNA编码区。例如已对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因组进行了全序列测定且测序报告该生物体含有6275个长度大于99个氨基酸的开放读码框(ORFs)。对这些ORFs的分析表明存在5885个可能确定蛋白质产物的ORFs(Goffeau等，1996，具有6000个基因的生命，Science 274：546-567，所述文献全部引用作为参考)。相反，估计人基因组中含有约100,000个基因。

用于微阵列的核酸的制备

如以上所描述，特定的相关cDNA与之特异杂交的″结合位点″通常为在该结合位点处固定的核酸或核酸类似物。在一个实施方案中，微阵列结合位点为与生物体基因组中每一基因的至少一部分对应的DNA多核苷酸。可通过例如从来自基因组DNA、cDNA(例如通过RT-PCR)或克隆序列的基因片段进行聚合酶链反应(PCR)扩增而获得这些DNA。PCR引物的选择基于基因或cDNA的已知序列，并导致扩增出特征性片段(即片段与微阵列中任何其它片段的连续相同序列不多于10个碱基)。应用计算机程序设计具有所需特异性和最佳扩增特征的引物。参见，例如Oligo plversion 5.0(国家生物科学)。当结合位点与非常长的基因对应时，有时需要扩增接近基因3′末端的片段，以使寡聚-dT制备的cDNA探针与微阵列杂交；小于全长基因的探针可高效结合。通常微阵列中每一基因片段长度在约50bp到约2000bp之间，更通常地在约100bp到约1000bp之间，且通常长度在300bp到约800bp之间。PCR方法为公知且在以下描述，例如，Innis等编辑，1990，PCR法：方法和应用指南，学院出版公司.圣地亚哥，加利福尼亚，前述全部内容在此引入作为参考。显然，计算机控制的机器人系统可用于分离和扩增核酸。

产生用于微阵列的核酸的备选方法为通过合成人工的多核苷酸或寡核苷酸，所述合成如应用N-膦酸盐或氨基磷酸酯(Froehler等，1986，Nucleic Acid Res 14：5399-5407；McBride等，1983，Tetrahedron Lett.24：245-248)进行。合成序列的长度在约15到约500个碱基之间，更通常地在约20到约50个碱基之间。在一些实施方案中，合成的核酸包括非天然碱基如次黄嘌呤核苷。如以上描述，核酸类似物可用作杂交的结合位点。适宜核酸类似物的示例为肽核酸(参见，例如Egholm等，1993，PNA遵循Watson-Crick氢键结合原则与互补寡核苷酸杂交，Nature 365：566-568；也参见美国专利号5,539,083)。

在一备选实施方案中，结合(杂交)位点由基因、cDNA(例如表达的序列标签)的质粒或噬菌体克隆、或其中的插入片段(Nguyen等，1995，通过排成阵列的cDNA克隆进行定量杂交测试在鼠胸腺中的差异基因表达，Genomics 29：207-209)产生。而在另一实施方案中，结合位点的多核苷酸为RNA。

核酸与固体表面的结合

核酸或类似物结合到固体支持物，所述支持物可由玻璃、塑料(例如聚丙烯、尼龙)、聚丙烯酰胺、硝酸纤维素或其它材料制成。用于将核酸结合到表面的一个优选方法是印刷到玻璃平板上，如由以下所概括性描述的，Schena等，1995，应用互补DNA微阵列定量监测基因表达模式，Science 270：467-470。该方法特别用于制备cDNA微阵列。也参见DeRisi等，1996，应用cDNA微阵列分析人类癌症中的基因表达模式，NatureGenetics 14：457-460；Shalon等，1996，用于分析复杂DNA样本的应用双色荧光探针杂交的DNA微阵列系统，Genome Res.6：639-645；和Schena等，1995，平行的人类基因组分析；1000个基因基于微阵列的表达，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：10539-11286。以上提及的所有文献在此全部引入作为参考。

用于制备微阵列的第二个优选方法是制备高密度的寡核苷酸阵列。用于制备含几千个与规定序列互补且位于表面规定位置的寡核苷酸阵列的技术为已知技术，所述技术应用照相平版光刻技术进行原位合成(参见，Fodor等，1991，光导的可空间寻址的平行化学合成，Science 251：767-773；Pease等，1994，用于快速DNA序列分析的光导寡核苷酸阵列，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：5022-5026；Lockhart等，1996，通过与高密度寡核苷酸阵列杂交监测表达，Nature Biotech 14：1675；美国专利号5,578,832；5,556,752；和5,510,270，上述全部内容在此引入作为参考)，或应用典它方法进行规定寡核苷酸的快速合成和沉积(Blanchard等，1996，高密度寡核苷酸阵列，Biosensors&Bioelectronics 11：687-90)。当应用这些方法时，在表面如衍生化的玻璃片上直接合成序列已知的寡核苷酸(例如20-mers)。通常，产生的阵列是基因冗余的，每个RNA对应于几种寡核苷酸分子。可选择寡核苷酸探针检测经其它方式剪接的mRNA。

也可应用制备微阵列的其它方法，例如通过掩膜技术(Maskos和Southern，1992，Nuc.Acids Res.20：1679-1684)。尽管原则上可应用任何类型的阵列，例如尼龙杂交膜上的点印迹(参见Sambrook等，分子克隆—实验手册(第二版.)，1-3卷，冷泉港实验室，冷泉港，N.Y.，1989，前述在此全部引入用于所有目的)，本领域内的技术人员仍会认识到，优选地应用非常小的阵列，这是由于杂交体积会较小。

标记探针的产生

用于制备总RNA和poly(A)+RNA的方法为领域内公知，且在Sambrook等(参见上文)书中有概括性描述。在—个实施方案中，本发明从多种目的细胞类型中提取RNA，所述RNA提取应用硫氰酸胍裂解随后通过CsCl离心完成(Chirgwin等，1979，Biochemistry 18：5294-5299)。通过寡聚-dT纤维素筛选Poly(A)+RNA(参见上文的Sambrook等)。目的细胞包括野生型细胞、暴露于药物的野生型细胞、具有经修饰/干扰的细胞组份的细胞以及暴露于药物的具有经修饰/干扰的细胞组份的细胞。

通过寡聚dT-引物锚定的或随机引物锚定的反转录由mRNA制备标记cDNA，前述两种技术均为领域内公知(参见，例如Klug和Berger，1987，Methods Enzymol.152：316-325)。可在与可检测标记结合的dNTP的存在下进行反转录，所述dNTP最优选地为荧光标记的dNTP。备选地，在标记dNTPs存在下通过双链cDNA的体外转录可将分离的mRNA转换成标记的反义RNA(Lockhart等，1996，通过与高密度寡核苷酸阵列杂交进行表达监控，Nature Biotech.14：1675，前述全部在此引入作为参考)。在备选实施方案中，可在缺乏可检测标记存在下合成cDNA或RNA探针，且可随后进行标记，例如通过掺入生物素标记的dNTPs或rNTP或一些类似方法(例如将生物素的补骨脂素衍生物与RNA进行光交联)进行标记，随后加入标记的链亲和素(例如连接有藻红蛋白的链亲和素)或其等同物。

当应用荧光标记的探针时，已知存在许多适宜的荧光团，包括荧光素、丽丝胺、藻红蛋白、若丹明(Perkin Eimer Cetus)、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、Fluor X(Amersham)以及其它荧光团(例如参见，Kricka，1992，非同位素的DNA探针技术，学院出版社圣地亚哥，加利福尼亚)。应当理解，选择具有完全不同发射光谱的荧光团对以使其易于区分。

在另一实施方案中，应用荧光标记之外的其它标记。例如，可应用放射性标记或具有不同发射光谱的放射性标记对(参见Zhao等，1995，高密度cDNA的过滤分析：用于大规模定量分析基因表达的新方法.Gene 156：207；Pietu等，1996，通过与高密度cDNA阵列的定量杂交揭示出在人肌肉中优选表达的新基因转录本，Genome Res.6：492)。但是，由于放射性颗粒的散射，结果需要结合位点的较大空间间隔，因此放射性同位紊是较不优选的实施方案。

在一个实施方案中，通过应用反转录酶(例如SuperScript.TM.II，LTI Inc.)在42℃孵育下述混合物60分钟而合成标记的cDNA，所述混合物含0.5mM dGTP、dATP、dCTP和0.1mM dTTP，外加荧光脱氧核苷酸(例如0.1mM若丹明110 UTP(Perken Elmer Cetus)或0.1mM Cy3dUTP(Amersham))。

微阵列杂交

选择核酸杂交和洗涤条件以使探针″特异结合″或″特异杂交″到特异阵列位点，即探针杂交、形成双链结合或结合到具有互补核酸序列的序列阵列位点，而不杂交到具有非互补核酸序列的位点。如此处所应用，如果多核苷酸中较短的一个长度小于或等于25个碱基时应用标准碱基配对原则不存在错配，或者，如果多核苷酸中较短的一个大于25个碱基时其错配不超过5％，则可认为前述多核苷酸序列间是互补的。优选地，多核苷酸为完全互补(无错配)。通过进行包括阴性对照的杂交试验可容易地证明特异杂交条件导致产生特异杂交(参见，例如上文的Sharon等以及上文的Chee等)。

最佳杂交条件取决于标记探针和固定的多核苷酸或寡核苷酸的长度(例如，寡聚体或者大于200个碱基的多核苷酸)和类型(例如RNA、DNA、PNA)。用于核酸特异(即严格)杂交条件的常规参数在以下中描述：Sambrook等(见上文)以及Ausubel等，1987，分子生物学最新方法，Greene Publishing and Wiley-Interscience，纽约，在此全部引入作为参考。当应用Schena等的cDNA微阵列时，通常杂交条件为在5XSSC加0.2％SDS中65℃杂交4小时，之后在低严格洗涤缓冲液(1XSSC加0.2％SDS)中于25℃洗涤，之后在高严格洗涤缓冲液(0.1XSSC加0.2％SDS)中于25℃洗涤10分钟(Shena等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：10614)。有用的杂交条件也在以下所述中提供，例如Tijessen，1993，应用核酸探针进行的杂交，Elsevier科学出版社B.V.和Kricka，1992，非同位素的DNA探针技术，学院出版社圣地亚哥，加利福尼亚。

信号检测和数据分析

当应用荧光标记探针时，转录本阵列每一位点处的荧光发射可优选地通过扫描共聚焦激光显微镜进行检测。在一个实施方案中，对应用的两荧光团中每一个应用适宜激发光谱进行单独扫描。备选地，可应用允许样本在所用荧光团的特异波长处发光的激光，且可分析来自荧光团的发射。在一优选实施方案中，应用具有计算机控制的X-Y相(stage)和显微镜物镜的激光荧光扫描器对阵列进行扫描。应用多光谱、混合气体激光获得荧光团的相继激发且发射光通过波长得以分离并应用光电倍增管进行检测。荧光激光扫描设备在以下描述，Schena等，1996，Genome Res.6：639-645以及于此引用的其它参考文献。备选地，由Ferguson等，1996，NatureBiotech.14：1681-1684所描述的光纤束也可用于在大量位点处同时监测mRNA丰度水平。

记录信号且在一优选实施方案中通过计算机分析信号，例如应用12位模拟数字板的计算机。在一个实施方案中，应用制图程序(例如HijaakGraphics Suite)对扫描的图像进行污点去除且应用图像格栅程序分析扫描图像以产生在每一位点处每一波长的杂交平均数的电子表格。

如果需要，可实验确定两荧光染料通路间的″串光″(或交叠)的校正。对于转录本阵列上的任何特定杂交位点，优选计算两荧光团的发射比率。该比率不依赖于相关基因的绝对表达水平，但可用于以下所述的基因，即该基因的表达受到药物施用、基因缺失或任何其它测试事件的显著调节。

优选地，除了鉴定干扰为阳性或阴性之外，确定干扰的强度也是有利的。这可通过领域内技术人员易于明晓的方法进行。

测定转录状态的其它方法

可通过本领域内已知的其它基因表达技术测定细胞的转录状态。

基于TAQMAN^TM的mRNA水平分析

RT-PCR(实时定量PCR)试验应用RNA反转录酶以催化从RNA链到DNA链的合成，所述RNA链包括mRNA链。可特异检测并定量产生的DNA且可应用该方法确定特定种类mRNA的水平。已知进行此试验的一个方法是使用商品TAQMAN(PE Applied Biosystems，Foster City，CA)并利用AMPLI TAQ GOLD^TM DNA聚合酶的5′核酸酶活性来切割在PCR反应期间特异形式的探针。这被称作TAQMAN^TM探针。参见Luthra R等，新型的基于5′核酸外切酶的实时PCR试验用于检测滤泡性淋巴瘤患者的t(14；18)(q32；q21)，Am J Pathol.，153卷，(1998)，63-68页。探针由具有5′-报告染料和3′-淬灭染料的寡核苷酸(通常约20mer)组成。荧光报告染料如FAM(6-羧基荧光素)与寡核苷酸的5′末端共价连接。报告染料由位于3′末端通过连接臂连接的TAMRA(6-羧基-N，N，N′，N′-四甲基若丹明)淬灭。参见Kuimelis RG等，用于实时定量PCR的TaqMan探针的结构类似物，Nucleic Acids Symp Ser.，37卷(1997)，255-256页以及Mullah B等，双染料标记的寡脱氧核糖核苷酸探针的高效合成及其在实时PCR试验中的应用，Nucleic Acids Res.，15卷，(1998)，1026-1031页。在反应中，对探针的切割将报告染料和淬灭染料分开，这导致报告荧光增强。

通过监测报告染料荧光的增强直接检测PCR产物的积聚。参见HeidCA等，实时定量PCR，Genome Res.，6卷，(1996)，986-994页。反应由循环中最初检测到PCR产物扩增的时间点所表征，而不是固定循环数后积聚的PCR产物的数量。起始核酸靶标的拷贝数越高，则越早观测到荧光的显著增强。参见，Gibson UE等，实时定量RT-PCR的一种新方法，Genome Res.，6卷，(1996)，995-1001页。

当探针处于完整时，报告染料与淬灭染料邻近，导致主要由Frster-类型的能量转移引起的报告荧光受到抑制。参见Lakowicz JR等，蛋白质中酪氨酸残基的氧淬灭和荧光去极化，J Biol Chem.，258卷，(1983)，4794-4801页。在PCR反应中，如果存在靶序列，探针在上下游引物位点间特异性退火。仅当该探针与靶标杂交时，AMPLITAQ GOLD^TM DNA聚合酶的5′-3′核酸降解活性使得其在探针的报告染料和淬灭染料之间进行切割。然后探针片段从靶标中置换掉，且链的聚合反应继续。该过程在每一循环中发生且并不干扰产物的指数级积聚。探针的3′末端封闭以阻止探针在PCR过程中延伸。

无活性参照物为包括在TAQMAN^TM缓冲液中的染料，且其并不参与5′核酸酶试验。无活性参照物提供了内部参照物，可据此在数据分析中对报告染料信号进行校正。该校正对于浓度或体积改变时发生的荧光波动是必需的。

校正通过下述完成，即对于特定反应管，将报告染料的发射强度除以无活性参照物的发射强度以获得定义为Rn(经校正的报告者)的比率。

循环阈值或C_t值为首次检测出ΔRn具有统计学意义显著增高的循环。在Rn相对于循环数绘制的图中，当序列检测设备开始检测出与PCR产物指数级扩增相关的信号增加时的循环即为阈循环。

为进行定量检测，在每一实验中包括系列稀释的cRNA(标准品)以构建对于精确且快速地定量mRNA所必需的标准曲线。为评估该技术的可重复性，同一cRNA样本的扩增可进行多次。

用于测定细胞转录状态的其它技术产生用于电泳分析的具有有限复杂性的限制性片段集合，例如结合双限制性酶消化和相位引物(phasingprimer)的方法(参见，如1992年9月24日由Zabeau等申请的欧洲专利0534858A1)，或选择具有与特定mRNA末端最为接近的位点的限制性片段的方法(参见，如Prashar等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：659-663)。

其他方法按统计学方法取样cDNA集合，例如通过对多个cDNA中的每一个均测定足够的碱基(例如20-50个碱基)以鉴定每个cDNA，或对在已知位点产生的与特定mRNA末端相关的短标签(例如9-10个碱基)进行序列测定(参见，如Velculescu，1995，Science 270：484-487)。

其他方面的检测

在本发明的多种实施方案中，也可检测除转录状态外的生物状态方面或混合的方面以获得药物和通路反应，所述生物状态如翻译状态、活性状态。这些实施方案的细节在本部分中描述。

翻译状态检测

基因编码的蛋白质的表达可通过经可检测标记的探针或随后标记的探针进行检测。一般而言，探针为识别表达蛋白质的抗体。

如此处所应用，术语抗体包括但不限于多克隆抗体、人源化或嵌合的抗体以及足以将抗体片段结合到蛋白质的具有生物功能的抗体片段。

为产生由公开的基因之一所编码的蛋白质的抗体，可通过注射多肽或其部分对多种宿主动物进行免疫。此类宿主动物可包括但不限于兔、小鼠和大鼠，此处仅列出少数动物。根据应用的宿主种类，可应用多种佐剂以增强免疫反应，所述佐剂包括但不限于弗氏(完全和不完全)佐剂、无机胶如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇(pluronicpolyols)、多聚阴离子、肽、乳油、钥孔形血蓝素、二硝基酚以及潜在的人类佐剂如卡介苗(BCG；bacille Camette-Guerin)和小棒杆菌(Corynebacterium parvum)。

多克隆抗体为源自动物血清的抗体分子的异种群体，所述动物用抗原如靶基因产物或其具抗原功能的衍生物进行免疫。用于产生多克隆抗体时，可注射编码的蛋白质或其部分并补充如上描述的佐剂免疫宿主动物，所述宿主动物同样如上描述。

单克隆抗体(mAbs)为特定抗原的同种抗体群体，可通过培养的连续细胞系以提供抗体分子产生的任何技术获得前述单克隆抗体。这些技术包括但不限于杂交瘤技术，Kohler和Milstein，Nature，256：495-497(1975)以及美国专利号4,376,110；人B细胞杂交瘤技术，Kosbor等，今日免疫学，4：72(1983)；Cole等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80：2026-2030(1983)以及EBV杂交瘤技术，Cole等，单克隆抗体和癌症治疗，Alan R.Liss，Inc.，77-96页(1985)。此类抗体可为任何种类的免疫球蛋白，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD及其亚类。本发明产生mAb的杂交瘤细胞可于体外或体内培养。体内培养可产生高滴度的mAb使得该方法成为当前优选的生产方法。

此外，也可应用为产生″嵌合抗体″而发展的技术，Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci USA，81：6851-6855(1984)；Neuberger等，Nature，312：604-608(1984)；Takeda等，Nature，314：452-454(1985)，所述嵌合抗体通过将具有适宜抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与具有适宜生物学活性的人抗体分子的基因进行剪接而得以产生。嵌合抗体为这样的分子，其中不同的部分来自不同物种的动物，例如可变或高变区来自鼠mAb且恒定区来自人免疫球蛋白。

备选地，可修改描述的用于产生单链抗体的技术，美国专利号4,946,778；Bird，Science，242：423-426(1988)；Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：5879-5883(1988)；和Ward等，Nature，334：544-546(1989)，以产生差异表达基因的单链抗体。通过氨基酸桥连接重链和轻链片段的Fv区形成单链抗体，上述操作导致产生单链多肽。

更优选地，可修改用于产生″人源化抗体″的技术以产生蛋白质、其片段或衍生物的抗体。此类技术在美国专利号5,932,448、5,693,762、5,693,761、5,585,089、5,530,101、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,789,650、5,661,016和5,770,429中公开。

可通过已知的技术产生识别特异抗原表位的抗体片段。例如，此类片段包括但不限于可通过抗体分子的胃蛋白酶消化而产生F(ab′)₂片段以及可通过还原F(ab′)₂片段片段的二硫桥而产生的Fab片段。备选地，可构建Fab表达文库，Huse等，Science，246：1275-1281(1989)，以允许快速且容易地鉴定具有所需特异性的单克隆Fab片段。

然后以利用以上描述抗体的免疫试验方法测定样本中已知蛋白质的表达程度。此类免疫试验方法包括但不限于斑点印迹、western印迹、竞争和非竞争性蛋白质结合试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫组织化学、荧光激活的细胞分类(FACS)以及在科学和专利文献中常规应用和广泛描述的其他方法，且许多上述方法可商业获得。

由于其易于检测，夹心ELISA为特别优选的方法，该方法存在多种改变，前述所述方法全部意在包括于本发明之内。例如，在一典型的正向试验中，将未标记的抗体固定在固体基质上，将待测样本与结合的分子接触且孵育适宜的时间后，前述接触的时间足以允许形成抗体-抗原二元复合体。此时，加入标记有能够诱导可检测信号的报告分子即二级抗体并进行孵育，前述孵育的持续时间足以形成抗体-抗原-标记抗体的三元复合体。洗去任何未反应的材料，且通过观测信号确定抗原的存在，或通过与含已知数量抗原的对照样本进行比较对抗原进行定量。正向试验的变更包括同时试验，所述同时试验中样本和抗体均同时加到结合抗体，或为反向试验，所述反向试验中标记抗体和待测样本首先结合、孵育并加到结合未标记的表面结合抗体上。这些技术为领域内技术人员公知，且显然会存在小的变更。如此处所应用，″夹心试验″意在包括基于两位点技术(two-sitetechnique)的所有变更。对于本发明的免疫试验，唯一的限制因素是标记抗体必须是特异于目的基因所表达蛋白质的抗体。

在此类型的试验中最常应用的报告分子为酶、含荧光团或放射性核素的分子。在酶免疫试验的情况下，酶与二级抗体共轭连接，所述连接通常应用戊二醛或高碘酸。但容易认识到，存在多种不同的技术人员公知的连接技术。经常应用的酶包括辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶等。选择的用于特异酶的底物在相应酶进行水解时通常产生可检测的颜色变化。例如，对硝基苯基磷酸酯适用于碱性磷酸酶共轭物；对于过氧化物酶共轭物，通常应用1，2-苯二胺或甲苯胺。也可能应用荧光底物，所述底物产生荧光产物而不是以上描述的发色物质。然后向三元复合体中加入含适宜底物的溶液。底物与连接有二级抗体的酶反应，产生定性的可进一步定量的视觉信号，以对存在于血清样本中的蛋白质的量作出评估，前述定量通常应用分光光度法进行。

备选地，可将荧光化合物如荧光素和若丹明化学偶联到抗体而不改变其结合能力。当被特定波长的光照射而激活时，荧光素标记的抗体吸收光能，诱导分子处于激发状态，随后发射出具有特征波长的光。发射以可用光学显微镜进行光检测的特征性颜色显现。免疫荧光和EIA技术均为领域内的成熟技术且为本发明特别优选的方法。但是，也可应用其他报告分子如放射性同位素、化学发光分子或生物发光分子。技术人员将容易地知道如何改变方法以适应所需的用途。

也可根据几种其它方法进行翻译状态的检测。例如，可通过构建下述的微阵列进行蛋白质的全基因组监测(即″蛋白质组″，Goffeau等，参见上文)，所述微阵列中的结合位点包含经固定的与细胞基因组编码的多种蛋白质种类特异的抗体，抗体优选地为单克隆抗体。优选地，存在相当大部分编码蛋白质的抗体，或至少存在与测试或证实目的生物学网络模型相关的那些蛋白质的抗体。用于制备单克隆抗体的方法为公知(参见，例如Harlow和Lane，1988，抗体：实验室手册，冷泉港，纽约，前述内容全部引入用于各种场合)。在一优选实施方案中，由根据细胞基因组序列设计的合成肽片段产生单克隆抗体。应用此抗体阵列，将来自细胞的蛋白质接触阵列，且应用领域内已知的试验测试二者的结合。

备选地，可通过双向凝胶电泳系统分离蛋白质。双向凝胶电泳为领域内公知且通常包括沿第一维方向的等电聚焦随后沿第二维方向的SDS-PAGE电泳。参见，例如Hames等，1990，蛋白质的凝胶电泳：实践指南，IRL出版社，纽约；Shevchenko等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：1440-1445；Sagliocco等，1996，Yeast 12：1519-1533；Lander，1996，Science 274：536-539。可通过多种技术分析产生的电泳图谱，所述技术包括质谱技术、应用多克隆抗体和单克隆抗体的western印迹和免疫印迹分析以及内部和N-末端的微序列分析。应用这些技术可能鉴定出在特定生理条件下产生的蛋白质中相当大的部分，所述特定条件包括暴露于药物的细胞(例如酵母)或例如通过特异基因删除或过表达而被修饰的细胞。

基于生物状态其他方面的实施方案

尽管监测除mRNA丰度外的其他细胞成分当前存在某些在检查mRNA中没有遇到的技术困难，领域内的技术人员将会明晓，应用本发明的方法可检测与细胞功能的特征有关的蛋白质的活性，本发明的实施方案可基于此类测定。活性检测可通过适合所表征的特定活性的任何功能上、生物化学或物理方法。当活性涉及化学转化时，可将细胞蛋白质与天然底物接触，并测定转化速率。当活性涉及多元单位的结合时，例如涉及激活的DNA结合复合体与DNA的结合时，可检测结合蛋白质的量或该结合引起的结果，例如被转录mRNA的量。另，当仅已知功能活性时，例如在细胞周期调控中，可观察功能的性能。无论是已知还是经过检测，蛋白质活性变化形成由本发明前述方法进行分析的反应数据。

在备选和非限定实施方案中，反应数据可由细胞生物学状态的混合方面形成。反应数据可构建自例如特定mRNA丰度的改变、特定蛋白质丰度的改变以及特定蛋白质活性的改变。

作为标记的核酸和蛋白质的检测

在一特定实施方案中，可应用本领域内已知的方法以原位或体内方式检测生物样本中与标记对应的mRNA水平。术语″生物样本″意在包括组织、细胞、生物液体及其分离物，前述分离物分离自受试者以及存在于受试者体内的组织、细胞和体液。多种表达检测方法应用分离的RNA。对于体外方法，并不意在排除mRNA分离的任何RNA分离技术均可用于从细胞中纯化RNA(参见，例如Ausubel等编辑，分子生物学最新方法，John Wiley&Sons，纽约(1987-1999)。此外，应用本领域内技术人员公知的技术可容易地处理大量的组织样本，所述技术如Chomczynski的一步RNA分离方法，美国专利号4,843,155(1989)。

分离的mRNA可用于杂交或扩增试验，所述试验包括但不限于Southern或Northern分析、聚合酶链式反应分析和探针阵列。用于检测mRNA水平的一个优选诊断方法包括将分离的mRNA与核酸分子(探针)接触，所述核酸分子可与待检测基因编码的mRNA杂交。核酸探针可例如为全长cDNA或其一部分，例如寡核苷酸的长度至少为7、15、30、50、100、250或500个核苷酸且其足以在严格条件下与编码本发明标记的mRNA或基因组DNA特异杂交。在本发明诊断试验中应用的其他适宜探针于此描述。mRNA与探针的杂交表明所研究的标记被表达。

在一种形式中，将mRNA固定到固体表面并与探针接触，例如将分离的mRNA在琼脂糖凝胶上跑胶并将mRNA从凝胶转移到膜上，所述膜如硝酸纤维素。在一备选形式中，将探针固定到固体表面并将mRNA与探针接触，例如在Affymetrix基因芯片阵列中的探针。技术人员可容易地修改已知的mRNA检测方法以用于检测本发明标记所编码的mRNA的水平。

用于确定样本中与本发明标记对应的mRNA水平的备选方法涉及核酸扩增方法，例如通过RT-PCR(实验性实施方法在Mullis，美国专利号4,683,202(1987)中列出；连接酶链反应，Barany，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：189-193(1991)；自动维持序列扩增，Guatelli等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：1874-1878(1990)；转录扩增系统，Kwoh等，Proc.Natl.Ac.Sci.USA，86：1173-1177(1989)；Q-β复制酶，Lizardi等，Bio/Technology，6：1197(1988)；滚环复制，Lizardi等，美国专利号5,854,033(1988)；或任何其他的核酸扩增方法，随后应用领域内技术人员公知的技术检测扩增分子。这些检测方案特别适用于检测以非常低的量存在的核酸分子。如此处所应用，扩增引物定义为可与基因的5’或3′区(分别为正链和负链，或为相反情况)退火的核酸分子对且在退火区域间含有一个短的区域。通常，扩增引物长度约为10到30个核苷酸且位于长度约50到200个核苷酸的区域的两侧。在适宜的条件下且应用适宜的试剂时，该引物允许扩增包含所述引物所限定核苷酸序列的核酸分子。

对于原位方法，在检测前并不需要从细胞中分离mRNA。在此方法中，应用已知的组织学方法制备/处理细胞或组织样本。然后将样本固定到通常为载玻片的支持物上，然后与探针接触，所述探针可与编码标记的mRNA杂交。

基于标记的绝对表达水平而进行检测的备选方案，可基于标记的经校正表达水平进行检测。通过校正标记的绝对表达水平而对表达水平进行校正，所述校正为将标记基因的表达与非标记基因的表达进行比较，其中提及的非标记基因如组成型表达的看家基因。用于校正的适宜基因包括看家基因如肌动蛋白基因或上皮细胞特异的基因。该校正允许将一个样本(例如患者样本)的表达水平与另一样本的表达水平进行比较，或在不同来源的样本间进行比较。

备选地，表达水平可以相对表达水平提供。在测定待测样本的表达水平前，测定10或更多个正常样本相对于患病生物样本的标记的表达水平，优选地测定50或更多个样本，以测定标记的相对表达水平。确定在大量样本中测定的每一基因的平均表达水平且将其用作标记的基线表达水平。然后将受试样本所测定的表达水平(绝对表达水平)除以由该标记获得的平均表达值。所得数值提供了相对表达水平。

优选地，用于基线测定的样本来自不具有多态性的患者。细胞来源的选择由相对表达水平的用途决定。应用存在于正常组织中的表达作为平均表达分值有助于确认测试的标记是否特异(相对于正常细胞)。此外，当积累更多的数据后，可对平对表达值进行修正，以提供基于积累数据的改进的相对表达值。

多肽的检测

在本发明的另一实施方案中，检测了与标记对应的多肽。用于检测本发明多肽的优选试剂为能够结合与本发明标记对应的多肽的抗体，前述抗体优选地带有可检测的标记。抗体可为多克隆抗体，或更优选地为单克隆抗体。可应用完整抗体或其片段(例如Fab或F(ab′)₂)。术语″标记的″当其用于探针或抗体时，意在包括探针或抗体的直接标记，所述直接标记通过将可检测物质偶联(即物理连接)到探针或抗体而实现，以及包括探针或抗体的间接标记，所述间接标记通过与另一直接标记的试剂反应而实现。间接标记的示例包括用荧光标记的二级抗体检测一级抗体，以及用生物素标记DNA探针的末端以使其可应用荧光标记的链亲和素进行检测。

可应用领域内技术人员公知的技术分离来自精神病患者的蛋白质。应用的蛋白质分离方法可为如以下所描述的方法，Harlow和Lane，抗体：实验手册，Harlow和Lane，冷泉港实验出版社，冷泉港，纽约(1988)。

可应用多种形式来确定样本是否含有与特定抗体结合的蛋白质。此类形式的示例包括但不限于酶免疫试验(EIA)、放射免疫试验(RIA)、Western印迹分析和酶联免疫吸附试验(ELISA)。技术人员可容易地改变已知的蛋白质/抗体检测方法以用于确定细胞是否表达本发明的标记。

在一种形式中，可在如Western印迹或免疫荧光技术的方法中应用抗体或抗体片段以检测表达的蛋白质。在此类用途中，通常优选地是将抗体或蛋白质固定到固体支持物上。适宜的固相支持物或载体包括能够结合抗原或抗体的任何支持物。公知的支持物或载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然和经修饰的纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁石。

本领域内的技术人员知晓多种用于结合抗体或抗原的其他适宜载体，且将能够修改此支持物以用于本发明。例如，可将从患者细胞中分离的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并将其固定到固相支持物上，所述支持物如硝酸纤维素。然后可用适宜的缓冲液洗涤支持物，随后用可检测标记的抗体进行处理。然后可用缓冲液再次洗涤固相支持物以移除未结合的抗体。然后可通过方便的方法检测固相支持物上被结合标记的量。

本发明也包含用于检测生物样本(例如任何体液，包括但不限于血清、血浆、淋巴、囊液、尿液、粪便、脑脊液、腹水或血液，以及包括身体组织的活组织样本)中是否存在与本发明标记对应的多肽或核酸的试剂盒。例如，试剂盒可包含能够检测生物样本中的多肽或编码本发明标记对应的多肽的mRNA的标记化合物或试剂(例如结合多肽的抗体或结合编码该多肽的DNA或mRNA的寡核苷酸探针)。试剂盒也可包括用于解释应用试剂盒所获得的结果的说明书。

对于基于抗体的试剂盒，试剂盒可包含，例如；1)与本发明的标记相应的多肽结合的一级抗体(例如结合到固体支持物上)；以及任选地，2)与多肽或一级抗体结合并连接有可检测标记的与一级抗体不同的二级抗体。

对于基于寡核苷酸的试剂盒，试剂盒可包含，例如：1)一寡核苷酸，例如可检测标记的寡核苷酸，所述寡核苷酸与编码本发明的标记相对应的多肽的核酸序列杂交；或2)用于扩增与本发明的标记对应的核酸分子的引物对。试剂盒也可包含，例如缓冲试剂、防腐剂或蛋白质稳定剂。试剂盒可进一步包含检测可检测标记所必需的组份(例如酶或底物)。试剂盒也可包含对照样本或一系列的对照样本，可对所述对照样本进行试验并与测试样本进行比较。试剂盒每一组份可封闭在单独的容器内且所有的多种容器可置于一个包装内，包装内可附有解释应用试剂盒获得的试验结果的说明书。

将抗体导入细胞

可以多种方式进行细胞内蛋白质的表征。例如，可以多种方式将抗体导入细胞，包括如将抗体微注射到细胞内(Morgan等，1988，ImmunologyToday 9：84-86)或将编码所需抗体的杂交瘤细胞mRNA转染细胞(Burke等，1984，Cell 36：847-858)。在进一步的技术中，重组抗体可进行改造并在多种非淋巴细胞类型中表达以结合靶蛋白以及阻断靶蛋白活性(Biocca等，1995，Trends In Cell Biology 5：248-252)。抗体的表达优选地在可调控启动子控制下进行，所述启动子如Tet启动子，或组成型活性启动子(用于产生饱和干扰)。第一个步骤是选择特定的具有对靶蛋白适宜特异性的单克隆抗体(参见以下)。然后可将编码所选择抗体的可变区的序列克隆入多种设计的抗体形式，包括如全抗体、Fab片段、Fv片段、单链Fv片段(通过肽接头连接的VH和VL区)(“ScFv”片段)、双抗体(两个相连的具有不同特异性的ScFv片段)等(Hayden等，1997，CurrentOpinion in Immunology 9：210-212)。多种形式的细胞内表达的抗体可靶向到细胞组份(例如细胞质、细胞核、线粒体等)，前述靶向通过与多种已知的细胞内引导序列融合表达而实现(Bradbury等，1995，AntibodyEngineering(第2卷)(Borrebaeck编辑)295-361页，IRL出版社)。特别是，ScFv形式似乎特别适用于靶向到细胞质。

多种有用的抗体类型

抗体类型包括但不限于多克隆、单克隆、嵌合、单链、Fab片段和Fab表达文库。领域内已知的多种方法可用于产生针对靶蛋白的多克隆抗体。对于产生抗体，可将靶蛋白通过注射免疫多种宿主动物，所述动物包括但不限于兔、小鼠、大鼠等。可应用多种佐剂以提高其免疫反应，前述佐剂的应用取决于宿主种类，且其包括但不限于弗氏(完全和不完全)佐剂，无机胶如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇、多聚阴离子、肽、乳油、二硝基酚，以及潜在的人类佐剂如卡介苗(BCG)和小棒杆菌。

单克隆抗体

对于制备直接针对靶蛋白的单克隆抗体，可应用通过连续培养的细胞系提供产生抗体分子的任何技术。前述技术包括但不限于由Kohler和Milstein最初研发的杂交瘤技术(1975，Nature 256：495-497)、trioma技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等，1983，Immunology Today 4：72)以及EBV杂交瘤技术，用以产生人单克隆抗体(Cole等，1985，单克隆抗体和癌症治疗，Alan R.Liss，Inc.，77-96页)。在本发明一个额外的实施方案中，可应用最新技术(PCT/US90/02545)在无菌动物中产生单克隆抗体。根据本发明，可应用人抗体且人抗体可通过应用人杂交瘤(Cote等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：2026-2030)或通过体外将EBV病毒转化人B细胞(Cole等，1985，单克隆抗体和癌症治疗，Alan R.Liss，Inc.，77-96页)获得。实际上，根据本发明，可应用为产生“嵌合抗体”而发展的技术(Morrison等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855；Neuberger等，1984，Nature 312：604-608；Takeda等，1985，Nature 314：452-454)，前述技术将小鼠抗体分子中特异于靶蛋白的基因与来自具有适宜生物活性的人抗体分子的基因进行剪接；此类抗体位于本发明的范围之内。

此外，当应用单克隆抗体为有利时，可备选地应用噬菌体展示技术(Marks等，1992，J.Biol.Chem.267：16007-16010)从大抗体库中筛选前述抗体。应用此技术，已在fd丝状噬菌体表面表达约10¹²种不同抗体的文库，产生可用于筛选单克隆抗体的″单点(single pot)″体外抗体免疫系统(Griffiths等，1994，EMBO J.13：3245-3260)。可通过领域内已知的技术从该文库中筛选抗体，所述技术包括将噬菌体与固定的靶蛋白接触、筛选并克隆与靶蛋白结合的噬菌体以及将编码抗体可变区的序列亚克隆到表达所需抗体形式的适宜载体。

根据本发明，可对描述的用于产生单链抗体的技术(美国专利号4,946,778)进行修改以产生靶蛋白特异的单链抗体。本发明的另一个实施方案应用Fab表达文库构建技术(Huse等，1989，Science 246：1275-1281)以允许对靶蛋白具有目标特异性的单克隆Fab片段进行快速和方便的鉴定。

可通过领域内已知的技术产生含靶蛋白个体基因型的抗体片段。例如，此类片段包括但不限于：可通过胃蛋白酶消化抗体分子而产生的F(ab′)₂片段；可通过还原F(ab′)₂片段的二硫桥而产生的Fab′片段；可通过木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子而产生的Fab片段；以及Fv片段。

在产生抗体时，目标抗体的筛选可通过领域内已知的技术如ELISA(酶联免疫吸附试验)实现。为筛选靶蛋白特异的抗体，可测试产生的杂交瘤细胞或噬菌体展示文库以获得与靶蛋白结合的抗体。

实施例

实施例1

本发明的一些方面可由这样的实施例证明，所述实施例显示首次发现了CNTF基因多态性和对抗精神病药产生反应之间的相关性。

为鉴定可能与伊潘立酮的治疗反应相关的遗传因素，研究了临床试验中CNTF(睫状神经营养因子)基因(位于11q12.2，多态性为103G＞A，GenBank序列X55890(版本1)，参见PubMed：9285965)的多态性与对抗精神病药伊潘立酮的临床反应之间的相关性。该试验为随机、双盲、设立了安慰剂和维思通对照、多中心的研究，以评估两个非交叠剂量范围的伊潘立酮(12或16mg/d和20或24mg/d)和维思通(6或8mg/d)与安慰剂相比的功效和安全性，所述评估为每天两次(b.i.d)持续42天给精神分裂症患者施用药物，随后每天一次(q.d)以4、8、12、16、或24mg/d剂量持续46周给精神分裂症患者长期施用伊潘立酮。

在II期临床试验中进行侯选基因多态性的药物遗传学分析。确定CNTF(睫状神经营养因子)103G＞A多态性(GenBank序列X55890(版本1))103G＞A(表达改变的蛋白质FS63TER)是否与临床试验中研究的功效的临床参数相关，以及是否与BPRSA、总PANNS、阳性PANNS、阴性PANNS和常规PANNS范围的改变特异相关。

在伊潘立酮12-16mg治疗组中观察到CNTF基因多态性和治疗反应(BPRSA和总PANNS范围)间的显著相关。对于PANNS范围的描述参见Kay SR等1987，Schizophrenia Bulletin 13；2：261-276。该组中CNTF基因为GG类型的个体，反应显著优于非GG类型的个体，且GG类型与安慰剂组间反应的差异显著(p＜0.001)。这些结果显示，在CNTF基因为GG类型的个体中如伊潘立酮的抗精神病药物对于治疗精神病具有更大的功效，所述精神病如精神分裂症。用此方法鉴定出CNTF 103G＞A多态性(GenBank序列X55890(版本1))与BPRSA及总PANNS范围间的显著相关性。

从试验点的患者收集总共207份的单独血液样本。应用PUREGENE^TM DNA分离试剂盒(D-50K)通过Covance(Geneva)提取DNA。CNTF 103G＞A多态性(GenBank序列X55890(版本1))由Takahashi描述，参见，Takahashi等，Nature Genet.7：79-84，1994。

设计用于基因分型的探针组并由Third Wave Technologies，Inc(Madison，WI)合成。根据该生产商的使用说明书应用INVADER^试验对60ng基因组DNA进行基因分型，参见Ryan D等，Molecular Diagnosis，第4卷，No2 1999：135-144和Lyamichev V等，Nature Biotechnology，第17卷，1999：292-296，同时参见美国专利5,846,717和6,001,567(前述专利内容在此全部引入作为参考)。

分析包括治疗中的方差试验分析以核实一些已进行基因分型的多态性是否与临床参数间显著关联。模型由通过基因型分类的临床参数中的百分比改变组成。当进行治疗组与安慰剂组的比较时，应用方差分析和协方差分析建立基因型和临床参数间的相关性。

方差模型分析中的术语包括通过对具有相同基因型的个体进行治疗所分类的临床参数中的百分比改变。协方差模型分析中的术语包括所研究临床参数的基线值和终点值，前述数值由用于具有相同基因型个体的治疗组分类。治疗中的方差分析揭示，用12-16mg剂量的伊潘立酮(A组)治疗的个体，其CNTF上的CNTF 103G＞A多态性与总PANSS和BPRSA显著相关(P＜0.001)。多态性呈现在内显子上并导致一剪接位点发生修饰，前述修饰接下来导致产生截短的mRNA。这些修饰的结果是出现多样化的临床反应。

实施例2

一位新近出现精神病的30步女性到内科医生处就诊。诊断出所患精神病可通过抗精神病药剂进行改善后，她的医生询问了该患者测试是否存在CNTF基因多态性的可能性，并解释了该结果对于应用药物(包括伊潘立酮)的治疗的意义。

经患者同意后，医生进行了测试以确定患者的基因型并确定出患者在103位具有GG形式或AA形式的CNTF基因。医生与患者讨论了抗精神病药物治疗的短期和长期后果。医生也讨论了其他可使用的治疗形式和药物。

基于这些结果，医生建议且经患者同意尝试了如伊潘立酮的药物治疗以帮助控制精神病症状，并期望对相对低的剂量显示出有利的反应且副作用降至最低。

实施例3

一位52岁男性到他的内科医生处就诊，该患者抱怨出现了典型的抗精神病药副作用，如静坐不能和运动障碍。患者进行了伊潘立酮治疗且患者的精神病性症状得到良好的控制，但患者出现了多种由治疗引起的副作用。医生建议进行基因分型并就基因分型结果可允许的治疗方案与患者进行了协商。患者进行了测试并确定具有一种基因型，即GG或AA，该基因型对伊潘立酮的反应最为有利。基于此结果以及所预期的对伊潘立酮的高敏感性，医生能够建议应用显著低剂量伊潘立酮的治疗方案，以降低副作用的可能性。医生能够降低患者的伊潘立酮剂量、降低副作用并提高了患者的顺从性，同时并不存在恶化该患者对自身或他人可能造成威胁的精神病的风险。

术语汇编和定义

提供以下术语汇编和定义以易于理解在此说明书中经常使用的某些术语。

如此处所应用的术语″精神病″应意指可出现或确定已出现精神病症状的任何病理生理疾病，包括但不限于以下所述；(同时参见，精神疾病诊断和统计手册，第4版(DSM-IV)，Francis A编辑，美国精神病学出版社，Wash，DC，1994)

精神分裂症：

精神分裂症，紧张性的，亚慢性型(295.21)，

精神分裂症，紧张性的，慢性型(295.22)，

精神分裂症，紧张性的，具有急性恶化的亚慢性型(295.23)，

精神分裂症，紧张性的，具有急性恶化的慢性型(295.24)，

精神分裂症，紧张性的，症状缓解(295.55)，

精神分裂症，紧张性的，非特定型(295.20)，

精神分裂症，错乱型的，亚慢性的(295.11)，

精神分裂症，错乱型的，慢性的(295.12)，

精神分裂症，错乱型的，具有急性恶化的亚慢性型的(295.13)，

精神分裂症，错乱型的，具有急性恶化的慢性型的(295.14)，

精神分裂症，错乱型的，症状缓解(295.15)，  

精神分裂症，错乱型的，非特定型的(295.10)，

精神分裂症，偏执型的，亚慢性的(295.31)，

精神分裂症，偏执型的，慢性的(295.32)，

精神分裂症，偏执型的，具有急性恶化的亚慢性的(295.33)，

精神分裂症，偏执型的，具有急性恶化的慢性的(295.34)，

精神分裂症，偏执型的，症状缓解(295.35)，

精神分裂症，偏执型的，非特定的(295.30)，

精神分裂症，未分化型的，亚慢性的(295.91)，

精神分裂症，未分化型的，慢性的(295.92)，

精神分裂症，未分化型的，具有急性恶化的亚慢性的(295.93)，

精神分裂症，未分化型的，具有急性恶化的慢性的(295.94)，

精神分裂症，未分化型的，症状缓解(295.95)，

精神分裂症，未分化型的，非特定的(295.90)，

精神分裂症，残留型的，亚慢性的(295.61)，

精神分裂症，残留型的，慢性的(295.62)，

精神分裂症，残留型的，具有急性恶化的亚慢性的(295.63)，

精神分裂症，残留型的，具有急性恶化的慢性的(295.94)，

精神分裂症，残留型的，症状缓解(295.65)，

精神分裂症，残留型的，非特定的(295.60)，

妄想(偏执型的)症(297.10)，

短暂反应性精神病(298.80)，

精神分裂症样的疾病(295.40)，

分裂情感性精神病(295.70)，

诱导性精神病(297.30)，

精神病NOS(非典型精神病)(298.90)，

情感性疾病：

重度抑郁症，具有重度精神病特征的(296.33)

双相情感性精神病I，单一的躁狂发作，具有重度精神病特征的(296.23)

双相情感性精神病I，最近有轻躁狂发作(296.43)

双相情感性精神病I，最近有躁狂发作，具有重度精神病特征的(296.43)

双相情感性精神病I，最近有混合发作，具有重度精神病特征的(296.63)

双相情感性精神病I，最近有抑郁发作，具有重度精神病特征的(296.53)

双相情感性精神病I，最近有非特定发作(296.89)

双相情感性精神病II(296.89)

(躁郁)循环性精神病(301.13)

双相精神病NOS(366)

心境障碍，由于(一般医学疾病)(293.83)

心境障碍NOS(296.90)

行为障碍，孤独攻击类型(312.00)，

行为障碍，未分化型(312.90)，

图雷特病(Tourette′s disorder)(307.23)，

慢性运动性或言语性抽搐(307.22)，

瞬时抽搐(307.21)，

抽搐NOS(307.20)，

使用精神活性物质所致紊乱：

酒精戒断性谵妄(291.00)，

酒精幻觉症(291.30)，

与酒精中毒有关的酒精痴呆(291.20)，

安非它明或类似作用的拟交感中毒(305.70)，

安非它明或类似作用的拟交感谵妄(292.81)，

安非它明或类似作用的拟交感妄想症(292.11)，

大麻妄想症(292.11)，

可卡因中毒(305.60)，

可卡因谵妄(292.81)，

可卡因妄想症(292.11)，

致幻剂幻觉症(305.30)，

致幻剂妄想症(292.11)，

致幻剂心境障碍(292.84)，

致幻剂后致幻剂知觉障碍(292.89)，

苯环利定(PCP)或类似作用的芳环己胺中毒(305.90)，

苯环利定(PCP)或类似作用的芳环己胺谵妄(292.81)，

苯环利定(PCP)或类似作用的芳环己胺妄想症(292.11)，

苯环利定(PCP)或类似作用的芳环己胺心境障碍(292.84)，

苯环利定(PCP)或类似作用的芳环己胺器质性精神病NOS(292.90)，

其他或非特定的精神活性物质的中毒(305.90)，

其他或非特定的精神活性物质的谵妄(292.81)，

其他或非特定的精神活性物质的痴呆(292.82)，

其他或非特定的精神活性物质的妄想症(292.11)，

其他或非特定的精神活性物质的幻觉症(292.12)，

其他或非特定的精神活性物质的心境障碍(292.84)，

其他或非特定的精神活性物质的焦虑症(292.89)，

其他或非特定的精神活性物质的人格障碍(292.89)，

其他或非特定的精神活性物质的器质性精神病NOS(292.90)

谵妄(293.00)，

痴呆(294.10)，

强迫性障碍(300.30)，

间歇性暴露障碍(312.34)，

冲动控制障碍NOS(312.39)

人格障碍：

人格障碍，妄想狂(301.00)，

人格障碍，精神分裂样人格(301.20)，

人格障碍，精神分裂型人格(301.22)，

人格障碍，反社会性人格(301.70)，

人格降碍，边缘性人格(301.83)

如此处应用的术语“抗精神病药”意指用于减少或改善精神病患者精神症状的任何药物，包括但不限于以下化合物：马来酸乙酰奋乃静；氢溴化阿替莫尔；溴泊庭；氮哌酮；马来酸巴替拉平；二苯哌丙林；盐酸苄吲吡啶；溴伏克辛；溴哌利多；溴哌利多癸酸酯；盐酸丁克吗；丁酰拉嗪；马来酸丁酰拉嗪；马来酸卡奋乃静；盐酸卡伏曲林(CarvotrolineHydrochloride)；氯丙嗪；盐酸氯丙嗪；氯普噻吨；桂双哌酮；三甲氧桂酰胺；磷酸克麦兰；氯哌噻吨；氯哌唑酮；甲磺酰氯匹哌生；盐酸氯哌酮；氯噻平；马来酸氯噻吨胺；氯氮平；盐酸环丙奋乃静；氟哌利多；盐酸依他唑酯；乙甲苯琥胺；氟胺氢咔唑；氟甲氮平；氟奋乃静癸酸酯；氟奋乃静庚酸酯；盐酸氟奋乃静；氟螺哌酮；氟司必林；氟苯吡吲醇；盐酸吉伏曲林(Gevotroline Hydrochloride)；氟哌酰胺；氟哌啶醇；氟哌啶醇癸酸酯；伊潘立酮；盐酸咪多林；仑哌隆；琥珀酸马扎哌汀(MazapertineSuccinate)；美索哒嗪；苯磺酸美索哒嗪；甲硫平；苯哌咪酮；苯哌乙吲；盐酸吗茚酮；盐酸纳仓诺；盐酸奈氟齐特(NeflumozideHydrochloride)；奥卡哌酮(Ocaperidone)；奥兰扎平；苯氧哌咪酮；五氟利多；潘迭品；奋乃静；匹莫齐特；盐酸哌诺平；酰胺哌丁苯；乙酰哌丙嗪；棕榈酸哌普嗪；盐酸吡喹酮；乙二磺酸甲哌氯丙嗪；马来酸甲哌氯丙嗪；盐酸丙嗪；喹迪平；瑞莫必利；盐酸瑞莫必利；维思通；盐酸林卡唑；盐酸氯三氟哌丁苯；舍吲哚；噻托哌隆；螺哌隆；硫利哒嗪；盐酸硫利哒嗪；氨砜噻吨；盐酸氨砜噻吨；盐酸硫哌喹酮；盐酸噻斯匹隆；盐酸三氟拉嗪；三氟哌多；氟丙嗪；盐酸氟丙嗪；和盐酸齐拉西酮。

此外如此处应用的术语“抗精神病药”包括所称的“非典型抗精神病”药物，包括但不限于：

奥兰扎平，2-甲基-4-(4-甲基-1-哌嗪基)-10H-噻吩并[2，3b][1，5]苯并二氮杂，为已知的化合物并在美国专利号5,229,382中描述为用于治疗精神分裂症、精神分裂症样紊乱、急性躁狂症、中度焦虑状态和精神病。美国专利号5,229,382在此全部引入作为参考；

氯氮平，8-氯-11-(4-甲基-1-哌嗪基)-5H-二苯并[b，e][1，4]二氮杂，在美国专利号3,539,573中描述，所述专利在此全部引入作为参考。精神分裂症治疗的临床功效在下文中描述(Hanes，等，Psychopharmacol.Bull.，24，62(1988))；

维思通，3-[2-[4-(6-氟-1，2-苯并异噁唑-3-基)哌啶子基]乙基]-2-甲基-6，7，8，9-四氢-4H-吡啶并-[1，2-a]嘧啶-4-酮，以及其在治疗精神病疾患中的用途在U.S.Pat.号4,804,663中描述，所述专利在此全部引用作为参考；

舍吲哚，1-[2-[4-[5-氯-1-(4-氟苯基)-1H-吲哚-3-基]-1-哌啶基]乙基]咪唑烷-2-酮，在美国专利号4,710,500中描述。其在精神分裂症治疗中的应用在美国专利号5,112,838和5,238,945中描述。美国专利号4,710,500、5,112,838、和5,238,945在此全部引用作为参考；

喹迪平，5-[2-(4-二苯并[b，f][1，4]硫氮杂-11-基-1-哌嗪基)乙氧基-]乙醇，以及其在证明治疗精神分裂症的效用试验中所显示的活性在美国专利号4,879,288中描述，所述专利在此全部引入作为参考。喹迪平通常以其(E)-2-丁烯二酸盐(butenedioate)(2∶1)的形式施用；以及；

盐酸齐拉西酮，5-[2-[4-(1，2-苯并异噻唑-3-基)-1-哌嗪基]乙基]-6-氯-1，3--二氢-2H-吲哚-2-酮，通常以一水合盐酸盐形式施用。该化合物在美国专利号4,831,031和5,312,925中描述。其在证明治疗精神分裂症的效用试验中所显示的活性在U.S.Pat.号4,831,031中描述。美国专利号4,831,031和5,312,925在此全部引入作为参考。类似地，当本发明以其最广义进行理解时，第二组份化合物为行使5-羟色胺再摄入抑制剂功能的化合物。

在谈及来自特定等位基因的mRNA或多肽产物的表达水平时(例如CNTF基因(位于11q12.2)的多态性，多态性为103G＞A，GenBank序列X55890，参见PubMed：9285965)此处所应用的″显著水平″意指表达的水平可使本领域内的技术人员相信存在所研究的等位基因。

如此处应用的″抗体″包括多克隆和单克隆抗体、嵌合、单链和人源化抗体，以及Fab片段，包括Fab或其他免疫球蛋白表达文库产物。

″多核苷酸″通常指任何的多聚核糖核苷酸(RNA)或多聚脱氧核糖核苷酸(DNA)，所述核苷酸可为未修饰的或经修饰的RNA或DNA。″多核苷酸″包括但不限于，单链和双链DNA，单链和双链区混合的DNA，单链和双链RNA，以及单链和双链区混合的RNA，包含DNA和RNA的杂合分子，所述杂合分子可为单链或更通常地为双链，或杂合分子为单链和双链区的混合物。此外，″多核苷酸″指含RNA或DNA或同时含RNA和DNA的三链区。术语″多核苷酸″也包括含一个或多个修饰碱基的DNA或RNA，以及包括出于稳定或其他的原因其骨架进行修饰的DNA或RNA。

″修饰的″碱基包括，例如三苯甲基化碱基和稀有碱基如次黄嘌呤。可对DNA和RNA进行多种修饰；因此″多核苷酸″包括如在自然界中通常存在的多核苷酸的经化学、酶或代谢修饰的形式，以及包括病毒和细胞中特征性的DNA和RNA的化学形式。″多核苷酸″也包括相对短的多核苷酸，通常称为寡核苷酸。

″多肽″是指包含通过肽键或经修饰的肽键即肽等排物进行相互连接的两个或多个氨基酸的任何多肽。″多肽″既指通常称为肽、寡肽或寡聚体的短链，也指通常称为蛋白质的较长的链。多肽可包含并非20种基因编码的氨基酸。″多肽″包括的氨基酸序列可经天然过程修饰，例如翻译后加工，或可经领域内公知的化学修饰技术进行修饰。该修饰在基础教科书中充分描述并在专论以及大量的研究文献中更为详细地描述。修饰可发生在多肽的任何部位，包括肽骨架、氨基酸侧链以及氨基或羧基末端。

应当理解在特定多肽的多个位点处可存在相同或不同程度的同一类型的修饰。另，特定的多肽可包含多种类型的修饰。多肽可为遍在蛋白化作用所产生的分支多肽，并也可为带有或不带有分支的环状多肽。环状、分支和分支环状多肽可产生于翻译后的天然过程，也可由合成方法进行制备。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、生物素化、黄素的共价连接、血红素分子的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、形成二硫键、脱甲基、形成共价交联、形成胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧化、糖基化、形成GPI锚、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸化，转运RNA介导的氨基酸加入到蛋白质如精氨酰化和遍在蛋白化作用(例如参见，蛋白质、结构和分子特征，第二版，T.E.Creighton编辑，W.H.Freeman and Company，纽约，1993；Wold，F.，蛋白质的翻译后修饰：进展和展望，1-12，蛋白质的翻译后共价修饰，B.C.Johnson编辑，学术出版社，纽约，1983；Seifter等，“蛋白质修饰和非蛋白质辅因子分析”，Meth Enzymol，182，626-646，1990，和Rattan等，“蛋白质合成：翻译后修饰和老化”，Ann NY Acad Sci，663，48-62，1992)。

多肽序列的“片段”是指这样的多态序列，即其短于参考序列但仍保持与参考多肽基本相同的生物功能或活性。

“变体”是指这样的多核苷酸或多肽，即其不同于参考多核苷酸或多肽，但仍保留参考多核苷酸或多肽的基本特性。典型的多核苷酸变体的核苷酸序列与参考多核苷酸不同。变体核苷酸序列的变化可改变或不改变由参考序列所编码的多肽的氨基酸序列。核苷酸改变可导致参考序列编码的多肽中出现氨基酸替换、添加、缺失、融合和截短，如以下所探论的。典型的多肽变体与参考多肽的氨基酸序列不同。通常，改变是有限的，也因此参考多肽和变体的序列非常类似，并在许多区域完全相同。变体和参考多肽的氨基酸序列差别可为在多种组合中一处或多处替换、插入和缺失。替换或插入的氨基酸残基可由或不由遗传密码所编码。典型的保守替换包括Gly、Ala；Val、Iie，Leu；Asp、Glu；Asn、Gln-lSer，Thr；Lys、Arg；以及Phe和Tyr。多核苷酸或多肽的变体可天然存在，如等位基因，或可为已知并非天然存在的变体。多核苷酸和多肽的非天然存在变体的制备可通过诱变技术或通过直接合成而实现。变体也包括具有一个或多个翻译后修饰的多肽，所述修饰如糖基化、磷酸化、甲基化、ADP核糖基化等。实施方案包括N-末端氨基酸的甲基化、丝氨酸和苏氨酸的磷酸化以及C末端甘氨酸的修饰。

″多态性″-在个体的多态性位点处观测到的序列变化。多态性包括核苷酸替换、插入、缺失和微卫星，且可能但不必导致产生基因表达或蛋白质功能的可检测水平的差异。

″多态性位点(PS)″-在人群中发现的基因座中存在至少两个可替换序列的部位，其中频率最高的序列其频率不超过99％。

″多态性变体″-是指这样的基因、mRNA、cDNA、多肽或肽，即由于存在基因多态性其核苷酸或氨基酸序列与参考序列不同。

″多态性数据″-有关特定基因的一种或多种以下的信息：多态性位点的位置；这些位点处的序列变化；在一个或多个群体中的多态性频率；所测定基因的不同基因型和/或单倍型；在一个或多个群体中的一种或多种此类基因型和/或单倍型的频率；特性和基因的基因型或单倍型之间任何已知的相关性。

″多态性数据库″-以系统或有组织的方式排列的多态性数据的集合且其能够通过电子或其他方式进行单独访问。

″单核苷酸多态性″(SNP)是指在群体内的基因组中单核苷酸位置发生的核苷酸变化。SNP可存在于基因组的基因内或基因间区域。可应用等位基因特异扩增(ASA)测试SNPs。至少需要3条引物用于此过程。应用的通用引物与待测试多态性反向互补。该通用引物可距离多态性碱基50到1500bp之间。其他两条(或更多)引物相互间相同，不同之处仅在于末端的3′碱基摆动以匹配形成多态性的两个(或更多)等位基因中的一个。然后对样本DNA进行两个(或更多)PCR反应，每个反应应用通用引物和一条等位基因特异的引物。

如此处所应用的″剪接变体″是指由这样的RNA分子所产生的cDNA分子，所述RNA分子最初转录自相同的基因组DNA序列但其已经过备选的RNA剪接。当最初的RNA转录进行剪接时发生备选的RNA剪接，通常用于移除内含子，所述剪接导致产生多于一种的mRNA分子，每种分子可编码不同氨基酸序列。术语剪接变体也指由以上的cDNA分子所编码的蛋白质。

″同一性″反映两条或多条多肽的序列间或者是两种或多种多核苷酸的序列间的关系，同一性通过比较这些序列而得以测定。通常，同一性分别是指在进行比较的序列长度内两多核苷酸或两多肽序列的核苷酸对核苷酸或氨基酸对氨基酸的精确一致性。

″同系物″是本领域内应用的同属术语，用以表明与参考序列具有高度序列相关性的多核苷酸或多肽序列。可通过确定两序列间的同一性和/或类似性的程度对该相关性进行定量，如此前所定义的。位于此同属术语内的术语为″直向同系物(ortholog)″和″共生同系物(paralog)″。″直向同系物″是指与另一物种中的多核苷酸或多肽功能等同的多核苷酸或多肽。″共生同系物″是指同一物种中功能类似的多核苷酸或多肽。

″融合蛋白质″是指由两个不相关的融合基因或其片段所编码的蛋白质。融合蛋白质的示例已在美国专利号5,541,087和5,726,044(两专利在此全部引入作为参考)中公开。在Fc-PGPCR-3的例子中，应用免疫球蛋白Fc区作为融合蛋白质的一部分有利于进行Fc-PGPCR-3或PGPCR-3片段的功能性表达，以在用于治疗时提高该融合蛋白质的药物动力学特性并产生二聚体化的Fc-PGPCR-3。Fc-PGPCR-3 DNA构建体从5′到3′方向包含分泌盒(即引发从哺乳动物细胞中运出的信号序列)，编码免疫球蛋白Fc区片段的DNA(作为融合部分)，以及编码Fc-PGPCR-3或其片段的DNA。在一些用途中需要能够通过下述操作来改变内在功能特性(补体结合、Fc受体结合)，所述操作为突变功能性Fc侧而保留其余的融合蛋白质不发生变化或在表达后完全删除Fc部分。

“等位基因”-一种特殊形式的基因座，通过其特定的核苷酸序列将其同其他形式区分开来。

“侯选基因”-推定为疾病、病症的原因或产生治疗反应或者是与前述之一关联的基因。

“基因”-包含用于调节RNA产物生物合成的所有信息的DNA片段，包括启动子、外显子、内含子和其他调控表达的非翻译区。

“基因型”-在个体的一对同源染色体基因座上的一个或多个多态性位点处存在的非定相的5’到3’核苷酸时序列。如此处所应用，基因型包括如下描述的全基因型和/或亚基因型。

“全基因型”-在单一个体的一对同源染色体基因座上的所有已知多态性位点处存在的非定相的5’到3’核苷酸对序列。

″亚基因型″-在单一个体的一对同源染色体基因座上的已知多态性位点的子集处观察到的非定相的5’到3’核苷酸序列。

″基因分型″-用于确定个体基因型的方法。

″单倍型″-在单一个体的单条染色体基因座上的一个或多个多态性位点处存在的5’到3’核苷酸序列。如此处所应用，单倍型包括如下描述的全单倍型和/或亚单倍型。

″全-单倍型″-在单一个体的单条染色体基因座上的所有已知多态性位点处存在的5’到3’核苷酸序列。

″亚单倍型″-在单一个体的单条染色体基因座上的已知多态性位点的子集处观察到的5’到3’核苷酸序列。

″单倍型对″-在单一个体的一个基因座位上存在的两个单倍型。

″单倍型分型″-用于确定单一个体的一个或多个单倍型的方法，包括应用家族谱系、分子技术和/或统计推论。

″单倍型数据″-有关特定基因的一种或多种以下的信息：人群中每一个体的单倍型对的陈列；人群中不同单倍型的陈列；在该群体或其他群体中每一单倍型的频率，以及一个或多个单倍型与特性间的任何已知的相关性。

″同种型″-基因、mRNA、cDNA或由其编码的蛋白质的一种特定形式，通过其特定的序列和/或结构与其他形式区分开来。

″同基因″-在群体中存在的基因的同种型中的一种。同基因包含基因的特定同种型中存在的所有多态性。

″分离的″-当应用于生物分子如RNA、DNA、寡核苷酸或蛋白质时，分离的意指基本不含其他生物分子或其他物质的分子，其中所述其他生物分子如核酸、蛋白质、脂类、糖，其中所述其他材料如细胞残渣和生长培养基。通常，术语″分离的″并不意指此类物质的完全缺乏或意指水、缓冲液或盐的缺乏，除非前述物质的存在量已严重影响了本发明的方法。

″连锁″-描述了基因由于位于同一染色体而具有的一同遗传的倾向；通过基因座间发生重组的百分比进行测定。

″连锁不平衡″-描述这样的一种情形，即人群中遗传标记的一些组合发生频率高于或低于由这些标记可预期的频率。这意味着一组标记发生了平行遗传。这一现象的产生可能源于该区域内的重组减少或源于建立者效应，其中由于标记之一导入群体而没有足够的时间达到平衡。

″基因座″-染色体或DNA分子上与基因、物理或表型特征对应的位置。

″天然存在″-用于命名下述主体的术语，即所应用的主体如天然存在的多核苷酸或多肽，可由自然来源分离且未经过人类的有意修饰。

″核苷酸对″-在个体的两拷贝染色体上多态性位点处存在的核苷酸。

″定相的(phased)″-当用于基因座中两个或多个多态性位点的核苷酸对序列时，定相的意指在单拷贝基因座的那些多态性位点处存在的核苷酸组合为已知组合。

″非定相的(unphased)″-当用于基因座中两个或多个多态性位点的核苷酸对序列时，非定相的意指在单拷贝基因座的那些多态性位点处存在的核苷酸组合为未知组合。

″人群组″-具有如下共同特征的一组个体，所述特征如民族地理学起源、医学疾病、对治疗的反应等。

″参考群体″-预测可代表人群组的一个或多个特征的一组受试者或个体。通常，参考群体代表人群中遗传变异的确定水平至少为85％，优选地至少为90％，更优选地至少为95％且甚至更优选地至少为99％。

″受试者″-欲对其基因型或单倍型或对治疗的反应或疾病状态进行测定的人类个体。

″治疗″-从内部或外部施与受试者的刺激。

引用的参考文献

此处引用的所有参考文献以其全部内容在此引入作为参考并用于所有目的，相当于每一单独出版物或专利或专利申请均特别且单独地指出以其全部内容引入作为参考并用于所有目的。此处参考文献的讨论仅意在总结由其作者作出的声明且并未允许任何参考文献构成现有技术。申请者保留质疑所引用参考文献的精确性和针对性的权利。

此外，此处引用的所有GenBank登录号、Unigene Cluster号和蛋白质登录号均以其全部内容在此引入作为参考并用于所有目的，相当于每一编号均特别且单独地指出以其全部内容引入作为参考并用于所有目的。

本发明并非限于本申请书描述的特定实施方案，所述实施方案意在作为本发明单独方面的单一例证。可对本发明进行多种改变和变更而不偏离其精神和范围，这一点本领域内的那些技术人员将会明晓的。通过前面的描述和伴随的附图，本领域内的那些技术人员将会明晓，除了此处的例举外，功能等同的方法和设备也位于本发明范围之内。此类改变和变更落入后附的权利要求的范围之内。本发明仅由后附的权利要求以及该权利要求所冠以的等同物的全部范围所限定。