利用肌动蛋白结合肽促进毛发生长的方法和组合物

摘要

本发明公开了适用于增加人和其它动物毛发生长的方法和组合物。公开的实施方案包括含有肌动蛋白结合肽的组合物。在若干实施方案中，肌动蛋白结合肽含有胸腺素β4的片段。在另一些实施方案中，公开的内容提供了含有胸腺素β4和/或其他肌动蛋白结合肽的片段的组合物，这些组合物适合处理脱毛症和其他与脱发相关的症状。在进一步的实施方案中，公开的内容提供了含有胸腺素β4中能结合肌动蛋白的大约6或7个氨基酸序列的组合物。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2002年1月25日提交的美国临时申请No60/351386的优先权，该临时申请在此以其全文引作参考。

发明领域

本公开内容提供了适合促进人和其它动物的毛发生长的方法和组合物。更具体而言，公开的内容涉及用于治疗毛发脱落的方法和组合物。在一个实施例中，公开的内容涉及外源转移胸腺素β4的肌动蛋白结合部分以促进毛发生长。在其他实施例中，公开的内容涉及利用合成的或蛋白水解生成的肽片段来促进毛发生长，这些生成的片段含有胸腺素β4的肌动蛋白结合基元。在进一步的实施例中，用一种或多种含有胸腺素β4的第17-23位的七个氨基酸残基(本发明称作T-3)或第17-22位的六个氨基酸残基的肽进行治疗，从而促进受试者的毛发生长。

发明背景

毛发脱落受到许多男人和女人的关注。在许多个体中，毛发脱落(即毛发脱落症)会使人尴尬，和/或产生一些生理问题，如令人沮丧。尽管毛发脱落症在男性中(如男性秃头或雄性脱发)要比女性(如女性秃头)更普遍，然而却都能引起男性和女性的显著关注。事实上，为了解决这个问题，人们花费了数以百万计的金钱和无数的时间在这项研究上。

成熟的毛囊是一种复杂的微小器官，它的生长周期受到严密调控。在出生后的发育过程中，毛囊要经历一个连续的过程：产生有活性的毛干(生长期)，凋亡驱动的衰退(退行期)，以及静止期(休止期)。Paus等人，“毛囊生物学(The biology of hair follicles)”，NEJM341：491-497(1999)。在生长期，活跃的毛发生长包括近端滤泡上皮细胞的增殖，紧接着是延长的毛囊浸入皮下组织，毛囊底部上皮的分化，以及形成毛母质细胞，所述毛母质细胞增殖并产生一个新的毛干。当毛母质细胞的增殖能力耗尽时，毛发生长的衰退期(退行期)就会接着出现，通过退行期，毛囊更低的部分进行程序性细胞死亡和退化。Costsarelis等人，“毛发囊泡：关注死亡(The hair follicle：dying forattention)”Am.J.Pathol，151：1505-1509(1997)。在这个点上，毛囊便进入剩余的一个时期——休止期。然后，毛发生长周期便开始重复。

头皮毛囊生长周期是相互独立的。平均而言，在100000根头发中，无论哪个时间点，大约90％处于生长期(即在生长)，而剩余的10％却处在休止期(即休息)。Whiting，“毛发的紊乱”，在Dale和Federman(编辑)的“美国医学(Scientific American Medicine)”(来自Web MD ScientificAmerican Medicine)，纽约(1999)，2页：XIII：1-7。生长期平均持续大约三年，在1-7年之间，而休止期平均持续大约3个月，在休止期后，休止的头发脱落，长出新的头发。头发生长的平均速率大约是0.35mm/天(即约1英寸/2-3个月)。在生长期，真皮乳突周围的细胞每隔12小时左右分裂一次，产生的细胞排成列，长得更长，并且开始角质化。在生长期和休止期的过渡期(即退行期或衰退期)，不再发生有丝分裂，而且毛球远离乳突，向表面生长。在休止期，毛发被充分角质化，并准备长出。经过3-4个月后，在毛发的发生圈开始另一轮有丝分裂，并且形成另一个发囊。

头发平均每天脱落100根被认为是正常的，洗头发的时候脱落的数目更多。在诊断头发紊乱的过程中，确定这种脱落是否异常以及脱落的头发是否是从根上断开或长出是很重要的。头发正常情况下是从根上长出的。然而，损伤或头发过于脆弱都会导致头发断裂。在对病人进行检查的过程中，拉扯头发测验能显示出脱落的异常。在这种测验中，将10-20根成组的头发夹在食指和拇指之间，稳健地一拉。如果其中有20％多的头发拔出可能表示出异常的脱落，通常有休止期头发。休止期头发(“畸形头发”)很容易辨认，它们的毛球是畸形和发白的，并且没有根鞘。在正常情况下，生长期头发是很难分开的，而且发黑，发根是锯齿状，具完整的根鞘(Whiting，Web MD ScientificMedicine，2页：XIII：1-7(1999))。

在人类中观察到了不同形式的秃头症。尽管在人类中也能观察到扩散性脱发，休止期脱发(telogen effluvium)，生长期脱发(anageneffluvium)(即anagen arrest)，斑秃，创伤性脱发，拔毛症，瘢痕性脱发以及其他类型的脱发，但最普通的还是雄性遗传性脱发。此外，和癌症治疗相关的脱发也十分常见，引起了很大一部分患者的极大关注。事实上，用不同药物(例如α阻断物，血管收缩素转化酶抑制剂，抗凝血因子，抗痉挛药物，抗甲状腺药物，β阻断物，钙离子通道阻断物，降低胆固醇药物，H₂受体阻断物，非甾体抗炎药，维他命A酸，维他命A，三环抗郁剂等)进行治疗会导致相当大部分的患者脱发。

根据严重性，脱发的治疗和处理范围从持续观察到药物和手术治疗，再到使用假发。美国食品和药品管理局已经批准在男性和女性中可以局部使用2％的米诺地尔。利用这种药物，可以使大约1/3的男性和女性雄性遗传性脱发患者长出肉眼可见的头发，大约1/3的患者长出细发，而大约1/3的患者则可能长不出头发。然而，这种药物看起来有相对有效的预防性治疗作用，因为它能阻碍大约80％的患者脱发。Whiting，Web MD Scientific American Medicine，2页：XIII：1-7(1999)。局部施用5％的米诺地尔可以使45％的男性雄性遗传性脱发患者长出肉眼可见的头发，时间比施用2％的米诺地尔的作用时间更短。米诺地尔给药的副作用包括头皮发炎以及面部毛发增加。此外，至少花费1年的时间来评估这种药物是否有效。如果这种药物有效，那这种药物治疗会持续多长时间就不确定了。

其他发现有用的化合物包括口服非那雄胺(1mg/天)。如果对18-41岁的男性患者持续使用两年，剂量是1mg/天，那66％的患者都会长出可见的毛发，而且也能抑制83％的患者进一步脱发。Whiting，Web MDScientific American Medicine，2页：XIII：1-7(1999)。然而，对停经后妇女给药1年，剂量是1mg/天，发现无效。非那雄胺的副作用包括没有性欲，缺乏力气，以及精子有轻微下降。因为这种药可能会导致男性胎儿严重畸形，因此应禁忌对停经前妇女施用这种药。

其他用于治疗女性雄性遗传性脱发患者的药物包括口服避孕药(如炔雌醇-双醋炔诺醇，去氧孕烯-乙炔雌二醇，炔雌醇-norgesterimate)，这些药物能减少毛发脱落，而且有时候还能轻微增加毛发生长。Whiting，Web MD Scientific American Medicine，2页：XIII：1-7(1999)。口服螺内脂和地塞米松对女性患者的治疗也是有用的。

对于其他类型的脱发，有不同的方法，包括：蒽林，补骨脂素加上紫外线A照射，类固醇，局部免疫疗法，免疫抑制剂，和长期的抗菌药物治疗等。然而，这些治疗方案中的一些会有一定的风险，而且伴随着副作用，其中一些副作用是很严重的。

对于那些对这些组合物没有反应，而且在头皮的后面和两侧均有头发的患者，微量或少量毛发移植法是一种选择。在其他情况下，假发是一种主要的选择。事实上，尽管在寻求成功治疗和抑制脱发的过程中，投入了大量的财力，但是以前已知的治疗方法都有严重的缺陷。因此，寻求促进毛发生长的组合物和方法还是有必要的。

只要存在多效性干细胞，毛囊稳定更新的能力就能得到保证，多效性干细胞通过分裂，能产生两类子细胞。一些子细胞仍然保持多效性表型，而另一些则成为快速分裂的过渡扩增(TA)细胞，这种细胞在每次新的周期开始前，能提供一些分化的子细胞用于较低毛囊的再生和毛干的形成。Janes等人，“表皮干细胞(Epidermal stem cells)”，J.Pathol.197：479-494(2002)。最近，毛囊的膨胀部被鉴定为干细胞的“巢(niche)”，它紧靠坚毛肌插入的地方。参看Lyle等人，“人毛囊膨胀细胞在生化上是独特的并且具有上皮干细胞表型(Human follicle bulgecells are biochemically distinct and posses an epithelial stem cellphenotype)”，J.Invest.Dermatol.Symp.Proc.4：296-301(1999)；Taylor等人，“毛囊干细胞参与形成毛囊和表皮(Involvement of follicular stemcells in forming not only the follicle but also the epidermis)”，Cell102：453-461(2000)；Oshima等人，“发囊从成人多效性干细胞中形态发生和更新(Morphogenesis and renewal of hair follicles from adultmultipotent stem cells)”，Cell 104：233-245(2001)。在生长期开始时，位于膨胀部的多效性干细胞或它们的TA子细胞迁移到毛囊的基底部，成为母质细胞，并且产生新的毛干。有意思的是，发源于膨胀部的细胞既可以向下迁移，重新迁入毛母质，也可以向上迁移，补充上皮，因此，它能有助于伤口治愈。

胸腺素β4是一种普遍存在的4.9kDa的多肽，它最初是从牛胸腺中分离出来的，是一些类型细胞迁移和分化的潜在介质。参看Low等人，“牛胸腺素的完整氨基酸序列：能在胸腺细胞群中诱导出末端脱氧核苷酰转移酶活性的胸腺激素(Complete amino acid sequence ofbovine thymosin：a thymic hormone that induces terminaldeoxynucleotidyl transferase activity in thymocyte populations)”，Proc.Natl.Acad.Sci.78：1162-1166(1981)；Grant等人，“胸腺素β4的新角色：matrigel诱导的基因参与了内皮细胞分化和血管新生(A novel rolefor thymosin beta 4：a Matrigel-induced gene involved in endothelial celldifferentiation and angiogenesis)”，J.Cell.Science 108：3685-3694(1995)；Malinda等人，“胸腺素β4刺激人脐静脉内皮细胞的定向迁移(Thymosinβ4 stimulates directional migration of human umbilical veinendothelial cells)”，FASEB J.11：474-481(1997)；Malinda等人，“胸腺素β4加速伤口愈合(Thymosinβ4 accelerates wound healing)”，J.Invest.Dermatol.113：364-368(1999)；Sosne等人，“胸腺素β4能促进角膜伤口愈合以及碱性受伤后体内降低炎症(Thymosin beta 4 promotes cornealwound healing and decreases inflammation in vivo following alkaliinjury)”，Ex.Eye.Res.74：293-299(2002)。胸腺素β4可以用一个基因来确定，后来显示出促进血管生成，而用来鉴定它的基因在早期内皮细胞管形成过程中能被正调节4-6倍。胸腺素β4出现在伤口流出的液体中，当局部给药或全身性给药时，它能促进血管生成和伤口愈合。参看Frohm等人，“人伤口和水泡中液体的生化和抗菌分析(Biochemical and antibacterial analysis of human wound and blisterfluid)”Eur.J.Biochem，237：86-92(1996)；Malinda等人，J.Invest.Dermatol.113：364-368(1999)。它也是一种潜在的抗炎药。Sosne等人，Ex.Eye.Res.74：293-299(2002)；Frohm等人，Eur.J.Biochem，237：86-92(1996)；Young等人，“在糖皮质激素存在的情况下，胸腺素β4亚砜是一种由单核细胞产生的抗炎药(Thymosin beta 4 sulfoxide is an anti-inflammatory agent generated by monocytes in the presence ofglucocoticoids)”，Nat.Med.5：1424-1427(1999)。此外，胸腺素β4在转移瘤中的水平是递增的，并且当转染到低的转移性细胞中时，它会引起恶性肿瘤。Clark等人，“转移的基因组分析揭示出RhoC发挥了关键的作用(Genomic analysis of metastasis reveals an essential role forRhoC)”，Nature 406：532-535(2000)；Kobayashi等人，“胸腺素β4调节恶性小鼠纤维肉瘤细胞的运动和转移(Thymosin-beta 4 regulatesmotility and metastasis of malignant mouse fibrosarcoma cells)”，Am.J.Pathol.160：869-882(2002)。一个相关的家族成员，胸腺素β15，在某些肿瘤细胞的转移中也很重要。Bao等人，“胸腺素β15：转移性前列腺癌症中正调控的一种新型肿瘤细胞运动的调节蛋白”，Nat.Med.2：1322-1328(1996)；Bao等人，“胸腺素β15在具不同转移潜力的肿瘤细胞系中的表达(Thymosin beta 15 expression in tumor cell lines withvarying metastatic potential)”，Clin.Exp.Metastasis 16：227-233(1998)。胸腺素β4的转移活性和它的血管生成活性，促进迁移活性以及抑制免疫监视的能力相关。最近，发现胸腺素β4是一种有效的抗菌药。Tung等人，“来自人血小板的抗菌肽(Antimicrobial peptides from humanplatelets)”，Infect.Immun.70：6524-6533(2002)。

胸腺素β4典型的作用方式是：加速内皮细胞和角质细胞的迁移，并且增加胞外基质降解酶的产量。

公开内容概述

本公开内容证实了在不同的体外和体内试验模型中，胸腺素β4在毛发生长中的作用。胸腺素β4能促进年老的和裸体的小鼠模型，以及正常大鼠的毛发生长。并不是想拘囿于任何具体的理论，在小鼠皮肤中，起源于膨胀部的特定亚类的毛囊角质细胞，在毛发生长周期的不同阶段，能以高度协同的方式表达胸腺素β4。对于毛发生长周期不同阶段的干细胞和他们的子代TA细胞而言，这些角质细胞在时间和空间上的分布和Taylor等人在Cell 102：453-461(2000)中介绍的类型一致。当克隆发生的角质细胞从大鼠触须囊的膨胀室中分离出来时，它进一步被表征成干细胞的直接后代，并且当它在体外培养时，能表达高水平的胸腺素β4。发现胸腺素β4能促进毛发克隆发生的角质细胞的迁移，以及胞外基质降解酶MMP-2的分泌。综合考虑的话，这些结果表明除了已知的促进血管生成和伤口愈合的特点外，胸腺素β4是毛发生长中自然出现的调节蛋白。

本申请公开的是一些方法，通过给受试者施用治疗有效量的肽，可以促进人和其他动物的毛发生长，其中施用的肽含有胸腺素β4的肌动蛋白结合部分(“Tβ4”)，这一部分序列是胸腺素β4序列中能结合肌动蛋白(如T-3或第17-22位残基)或其它任何肌动蛋白结合多肽的部分。在某些实验中，Tβ4以水凝胶混合物的形式进行局部给药。在一个没有限制的实施例中，T-3是以治疗有效量给药的。

本公开内容进一步提供了一种最小的胸腺素β4序列片段，它和毛发生长相关，例如“T-3”片段(第17-23位残基)或更短的肌动蛋白结合序列(第17-22位残基)。这些片段，或含有这些序列的肽，用来促进人和其它动物毛发的生长。在一些实施方案中，含有一种或多种这些序列的肽局部施用到将要处理的区域。在另外的实施方案中，该肽和附加的成分共同施用，附加的成分包括，但不限于抗菌药，抗寄生虫病药，皮肤和/或头发调理香波，肥皂，润肤剂以及其它合适的成分。在另外的实施方案中，T-3与载体和/或胶共同施用。在另一些实施方案中，T-3与水凝胶共同施用。

在进一步的实施方案中，本公开内容提供了肌动蛋白结合区，这些结合区用于促进毛发生长。这些序列的变体或同源序列(如，保守和/或非保守性氨基酸替换)也可以考虑用于促进毛发生长。此外，这些肽包括全长的Tβ4序列，在肌动蛋白结合序列(残基17-22)之外有一个或多个保守替换。肌动蛋白结合多肽部分的聚体(例如Tβ4，T-3或含有Tβ4的第17-22位氨基酸序列的肽的二聚体和三聚体)也有促进毛发生长的活性，和任何键合了一个肌动蛋白结合部分的融合分子一样。因此，本公开内容中有用的肌动蛋白结合部分可以许多方式表达，包括大肽的一部分，融合分子的一部分，或以聚体或其组合的形式。

此外，在另一个实施方案中，将胸腺素β4外源添加到分离的克隆发生的毛囊干细胞中会导致迁移增加，以及增加细胞基质金属结合蛋白酶(MMP)活性(并且，具体而言，增加MMP-2水平)。在这个及相关实施方案中，毛囊干细胞被激活，能促进分化但不能促进扩增。在某些实施方案中，干细胞中对毛发生长重要的许多活性被增强了，包括迁移，蛋白酶产生和分化。

研究表明，sonic hedgehog可以促进毛囊进入生长期。Sato等人，“通过sonic hedgehog的局部瞬时表达，可以诱导出生后小鼠毛发的生长(Induction of the hair growth phase in postnatal mice by localizedtransient exprssion of Sonic hedgehog)”，J.Clin.Invest.104：855-864(1999)。Shh信号传导截断和影响Wnt信号传导，而Wnt信号传导参与了毛发生长。Tβ4出现在克隆发生的角质细胞核中，有可能调节信号传导。尽管不拘囿于任何理论，但在某些实施方案中，胸腺素β4的肌动蛋白结合部分能激活sonic hedgehog的表达，从而促进毛囊进入生长期。

血管内皮生长因子(VEGF)类似于胸腺素β4的肌动蛋白结合区，参与血管生成。由VEGF或胸腺素β4诱导的毛囊在尺寸上更大。参看Yano等人，“VEGF介导的血管生成对毛发生长和毛囊大小的控制(Control of hair growth and follicle size by VEGF-mediatedangiogenesis)”，J.Clin.Invest.107：409-417(2001)。因此，在某些实施方案中，胸腺素β4序列，T-3或其他肌动蛋白结合肽的肌动蛋白结合区通过促进血管生成，能促进毛发生长，和/或增加毛囊大小。本申请公开的肽也能和其他促进毛发生长的组合物(可以是口服或局部施用)，如米诺地尔或finisteride组合使用(同时给药或先后给药)。尽管不拘囿于任何理论，但在某些实施方案中，胸腺素β4的肌动蛋白结合部分能激活VEGF的表达，从而促进毛囊进入生长期。

附图简述

图1A-1D是大鼠皮肤组织学切片的显微照片的数字图像，显示的是7天后，伤口逐渐闭合，以及用胸腺素β4处理皮肤后，伤口边缘的其他毛囊。

图2A-2D是显微照片的数字图像，显示的是处理后7天，胸腺素β4的水凝胶刺激大鼠皮肤新的毛发生长。

图3A-3D是显微照片的数字图像，显示的是处理后30天，胸腺素β4的水凝胶刺激大鼠皮肤新的毛发生长。使用了苏木精与伊红(H&E)染色法。

图4A和4B是显微照片的数字图像，显示的是用胸腺素β4局部处理无胸腺裸小鼠30天后，生长活跃的毛囊数目增加。相对水凝胶的对照，也观察到了毛囊数目增加。

图5A-5D是显微照片的数字图像，显示的是用0.05％胸腺素β4的水凝胶处理年老的小鼠7天后，它的毛囊发育增强。

图6A和6B是皮肤样品显微照片的数字图像，显示的是胸腺素β4的七氨基酸片段(SEQ ID NO：1的第17-23位氨基酸，即Leu Lys Lys ThrGlu Thr Gln，它在本发明被称作T-3)，施用在水介质中能刺激年老小鼠的毛囊发育增强。

图7A-7F是显微照片的数字图像，显示的是对照和胸腺素β4处理的动物中皮肤组织外貌。图7A-7C是对照介质处理的皮肤。图7D，7E是胸腺素β4处理的皮肤。图7A，7D都表示的是处理7天后的大鼠皮肤。图7B，7E表示的是处理7天后年老小鼠的皮肤。图7C，7F表示的是处理35天后裸小鼠的皮肤。

图8A-8C是显微照片的数字图像，显示的是脱毛诱导毛发生长周期后的正常小鼠皮肤的组织外貌以及胸腺素β4表达细胞的免疫定位。(S＝皮脂腺；M＝毛母质；AP＝竖毛肌；箭头指的是膨胀区的位置和胸腺素β4阳性染色细胞。)

图9A-9C是显微照片的数字图像，显示的是不同角蛋白和胸腺素β4在克隆发生的干细胞中的分离、培养和表达，克隆发生的干细胞来自大鼠触须。图9A是显微照片，表示的是膨胀区的位置，其中插图/放大的照片表示的是抗角蛋白15抗体的免疫染色(角蛋白15是毛囊干细胞的分子标准。已知角蛋白5和14也能在干细胞中表达)。图9B所示的是6天后干细胞的培养。注意观察到了两群克隆发生的干细胞。图9C是干细胞和胸腺素β4抗体的免疫染色。图9D是克隆发生的干细胞和不同的角蛋白抗体的Western杂交图，它表示的是角蛋白在分离的干细胞中的表达形式。注意角蛋白10没有表达，它是终端分化的早期标记，而角蛋白K5，K14和K15的出现是膨胀部衍生的干细胞的特征。

图10A和10B是杂交图和图表，表示的是外源胸腺素β4能使克隆发生的大鼠触须干细胞的角蛋白15mRNA的表达下降。对同一样品进行Northern杂交和定量分析也表示出来了。细胞从血清中耗尽16小时，然后在含或不含不同浓度胸腺素β4的情况下培养6小时。这种处理后，用RIPA缓冲液裂解处理的细胞，裂解液和抗K15抗体进行免疫杂交(图10A，上图)。用抗GAPDH抗体作为探针重新检测同一块膜(图10A，下图)，然后用密度检测术使结果标准化(图10B)。干细胞标记K15表达的下降说明胸腺素β4通过加速毛囊干细胞分化而促进毛发生长。

图11A-11C是杂交图和图表，表示的是外源胸腺素β4能增加克隆发生干细胞中MMP-2的水平，但对MMP-9无效。酶法(zymographic)分析和定量分析也表示出来了。带点的柱子代表的是细胞裂解液，而实心柱子代表的是条件培养基。

序列表

氨基酸序列如附图所示，它使用的是氨基酸的标准三字代码，如37C.F.R.1.822所定义的那样。在附图中，Tβ4的序列名是SEQ ID NO：1：Ser Asp Lys Pro Asp Met Ala Glu Ile Glu Lys Phe Asp Lys Ser Lys LeuLys Lys Thr Glu Thr Gln Glu Lys Asn Pro Leu Pro Ser Lys Glu Thr Ile GluGln Glu Lys Gln Ala Gly Glu Ser。

若干实施方案的详述

缩写和术语

下面提供的术语和方法的解释是为了更好地介绍本公开内容，指导本领域普通技术人员实施本公开内容。如这里和随附权利要求书中使用的那样，单数形式“一个”，“一种”或“该”包括复数形式，除非上下文有明确说明。例如，“一种蛋白”包括多种这样的蛋白，而“这种抗体”包括一种或多种抗体，及其本领域技术人员熟知的等同物等等。

除非有别的解释，本公开内容使用的全部科技术语和本公开内容所在领域一名普通技术人员所理解的意思一样。

缩写：℃(摄氏度)；H₂O(水)；aa或AA(氨基酸)；bp(碱基对)；kb(千碱基对)；kD或kDa(千道尔顿)；gm(克)；μg(微克)；mg(毫克)；ng(纳克)；μl或μL(微升)；ml或mL(毫升)；mm(毫米)；nm(纳米)；μm(微米)；M(摩尔)；mM(毫摩尔)；μM(微摩尔)；U(单位)；MW(分子量)；sec(秒)；min(s)(分钟)；hr(s)(小时)；BSA(牛血清白蛋白)；PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)；PBS(磷酸缓冲液[150mM NaCl，10mM磷酸钠缓冲液，pH 7.2])；PCR(聚合酶链式反应)；RT(室温)；SDS(十二烷基硫酸钠)；w/v(重量/体积)；v/v(体积/体积)；H&E(苏木精与伊红染色法)；HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙烷磺酸)；HUVEC(人脐静脉内皮细胞)；Sigma(Sigma化学药品公司，St.Louis MO)；AmericanHistolabs(American Histolabs，Gaithersburg，MD)；和Hawkeye Jensen，Inc.(Hawkeye-Jensen，Inc.Reading，PA)。

肌动蛋白结合肽：一种能结合肌动蛋白并且促进毛发生长的肽，包括但不限于含有T-3氨基酸序列的肽，含有Tβ4中第17-22位氨基酸残基序列的肽，含有氨基酸序列Leu Lys Lys Thr Asn Thr的肽，含有氨基酸序列Leu Lys Lys Thr Asn Thr Glu的肽，以及含有任何前述序列的肽，其中至多只有2个保守氨基酸被取代。通过实施例10所介绍的技术，本领域的普通技术人员能轻易地鉴定出其他相关肌动蛋白结合肽，这些肽可以用在本公开内容中。例如，肌动蛋白结合肽可以定义为这样的肽，它的血管芽生活性可以通过添加外源肌动蛋白而被抑制。在一些实施方案中，有用的肌动蛋白结合肽和G-肌动蛋白形成复合物，解离常数大于0.3μM，或更普遍的是大于0.5μM，或在0.5-2.5μM之间。

脱发症：从毛发应该正常生长的地方脱发(即光秃或毛发稀少)。它的意思包括任何起因的脱发。在优选的实施方案中，该术语指的是头发的脱落，尽管它的意思并不如此有限。事实上，这个术语包括的是全部或部分毛发脱落，或者在身体毛发正常生长的任何部位毛囊数或生长期毛囊数的下降。

化学合成：这是一种人工方法，通过这种方法，人们能制造蛋白或肽。合成的蛋白或肽就是通过这种人工方法合成的。

包含：该术语意思是“包括”。例如，“包含A或B”意思是指包括A，B或A和B都包括，除非另有明确说明。

增强：提高某物的质量，数量或力量。在一个实施方案中，如果受试者的毛发脱落受到阻碍，停止或逆转了(即毛囊数目上升了，或生长期毛囊数目上升了)，那这种处理就能增强或促进受试者(如患有脱发或其他和脱发相关症状的人)毛发生长。促进毛发生长也包括减少在根上或因为扯断/脆弱而引起的脱发，例如，可以通过拉扯头发测验进行检测。可以采用本领域已知的或本申请公开的任何方法检测任何的增强，例如对处理的区域或受试者与对照进行定量和定性比较。

片段：Tβ4，T-3或任何其他肽的“片段”包括任何氨基酸残基序列，它们短于全长氨基酸序列。因此，Tβ4的片段包括SEQ ID NO：1序列中最多42个氨基酸氨基序列。同样，T-3片段含有最多6个氨基酸残基，这6个氨基酸残基包含于本申请定义的T-3序列中。

毛发：是一种特化的角质结构，它衍生自表皮上皮细胞凹陷或者说是从表皮上皮细胞凹陷中前突出来的，这种凹陷可以在动物中，包括哺乳动物中观察到。因此，这个术语的意思也包括不同的非人动物的皮毛(如软毛)。

同源的：描述的是相关的蛋白。在一些优选的实施方案中，该术语被用来代表本申请公开的不同的肌动蛋白结合肽，以及其他具有相似序列，结构，功能和/或其他特征的蛋白/肽。参看定义“序列同一性/相似性”中的讨论。

水凝胶：任何水凝胶都含有不同的聚体。在医学领域中，许多独占的水凝胶剂型都是已知的。在某些实施方案中，使用了交联聚体凝胶的水凝胶片。不同来源的水凝胶也被考虑用于本发明方法和组合物中，包括但不限于商业上购买到的水凝胶，包括那些适用在伤口上水凝胶，如TEGAGEL(3M)，VIGILON(Bard)，CLEARSITE(Conmed)，AQUASORB(DeRoyal)，FLEXDERM(Bertek[Dow Hickam])，NU-GEL(Johnson&Johnson)，CURAGEL(Kendall)，DERMA-GEL(Medline Industries)，FLEXIGEL(Smith&Nephew)，SMARTHYDROGEL^TM(MedLogic Global，United Kingdom)，和0.2％的聚丙烯酸(Hawkeye-Jensen，Reading PA)。

局部的：“局部化的”和“局部的”指的是有限的面积。因此，和“全身”的处理相反，在全身性处理中，整个身体都参与了(通常通过血管系统和/或淋巴系统)，“局部处理”涉及的是特定的有限的面积。因此，在本申请的一些实施方案中，利用本公开内容的方法和组合物对分散的区域进行局部的处理。

可药用载体：任何已知用于本领域中传递药物，药品等给受试者的介质。因此，可药用载体可能特别适合在局部施用传递，包括但不限于水凝胶，乳膏剂，洗剂，洗发剂，润滑剂，85％乙醇/15％乙二醇，软膏，喷雾剂，油，调味品，糊状物，滴剂，药膏，脂质体等。

多肽：或仅仅是肽，指的是聚体，其中单体是通过酰胺键连接在一起的氨基酸残基。当氨基酸是α氨基酸时，L-光学异构体或D-光学异构体都可以使用，而L-光学异构体是优选的。本申请中使用的“多肽”或“蛋白”意思包括任何氨基酸序列，也包括修饰的氨基酸序列如糖蛋白。术语“多肽”和“肽”特定的意思是涵盖天然发生的蛋白，以及通过重组或合成产生的蛋白。因此，Tβ4，含有Tβ4第17-22位氨基酸残基序列的肽T-3，或含有这些序列中任何一条的聚体都可以通过重组方法合成，其宿主包括细菌或酵母细胞。

术语“多肽的功能性片段”指的是保持多肽活性的所有多肽片段，如Tβ4。例如，生物功能片段在大小上有变化，它可以小到能够结合抗体分子的表位这么小，大到和参与细胞中特征诱导或表型变化编程的多肽一样大，而表型变化包括细胞增殖或分化。“表位”是多肽中能结合免疫球蛋白的区域，免疫球蛋白是由于和抗原接触发生应答反应而产生的。

术语“可溶的”指的是一种多肽形式，这种多肽没有插入细胞膜。本申请公开的多肽是可溶性多肽。

本申请中使用的术语“基本纯化的多肽”指的是基本上没有其它蛋白，脂质，碳水化合物或其他在天然条件下与其相连的物质的多肽。在一个实施方案中，多肽至少有50％，如至少80％不含其它蛋白，脂质，碳水化合物或其他在天然条件下与该多肽相连的物质。在另外一个实施方案中，多肽至少有90％不含其它蛋白，脂质，碳水化合物或其他在天然条件下与该多肽相连的物质。仍然在另外一个实施方案中，多肽有至少95％不含其它蛋白，脂质，碳水化合物或其他在天然条件下与该多肽相连的物质。

保守替换是用另一个在大小、疏水性等方面相似的氨基酸取代一个氨基酸。保守替换的例子如下表所示。

原始残基                            保守性取代

Ala                                 Ser，Gly

Arg                                 Lys

Asn                                 Gln，His

Asp                                 Glu

Cys                                 Ser

Gln                                 Asn，Glu

Glu                                 Asp

His                                 Asn，Gln

Ile                                 Leu，Val

Leu                                 Ile，Val，Arg

Lys                                 Arg，Gln，Glu

Met                                 Leu，Ile，Val

Phe                                 Met，Leu，Tyr

Ser                            Thr

Thr                            Ser

Trp                            Tyr

Tyr                            Trp，Phe

Val                            Ile，Leu

cDNA序列的变异会导致氨基酸的改变，不管保守与否，因此，为了保持编码蛋白的功能和免疫同一性，理想的情况是将这种变异降到最小。因此，在若干非限制性的实施例中，一个变异的多肽包括最多2个，最多5个，最多10个，最多20个，或最多40个保守性取代。该蛋白的免疫同一性可以通过确定该蛋白是否能被抗体识别而得以评估；能被这种抗体识别的变体是免疫保守的。任何cDNA序列变体优选的是导入不超过20个，更优选的是导入不超过10个氨基酸取代到编码多肽中。例如，变异的氨基酸序列和天然的氨基酸序列有80％，90％或甚至于95％或98％的同一性。

促进：用本文解释“增强”的同样方法来解释这个术语。

样品和标本：在本说明书和权利要求书中，这些术语以其最广的意思使用。这些术语包括从人和其它动物中获得的所有类型的样品，包括但不限于体液，如尿液，血液，排泄物，脑脊液，精液和唾液，以及实体组织和毛发。然而，这些例子并不解释成限制适用于本公开内容中的样品类型。

序列同一性/相似性：两个或多个核酸序列，或两个或多个氨基酸序列之间的同一性/相似性用序列之间的同一性/相似性来表示。序列同一性根据同一性的百分率来检测；百分率越高，序列就越有同一性。序列相似性根据相似性的百分率来检测(相似性要考虑保守的氨基酸取代)；百分率越高，序列就越有相似性。

序列对比的方法是本领域众所周知的。不同的程序和排列算法在下列文献中介绍了：Smith & Waterman，Adv，Appl.Math，2：482(1981)；Needleman & Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)；Pearson & Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.85：2444(1988)；Higgins & Sharp，Gene，73：237-44(1988)；Higgins & Sharp，CABIOS 5：151-3(1989)；Corper等人，Nuc.Acids.Res.16：10881-90(1988)；Huang等人，Computer Appls.Inthe Biosciences 8：155-165(1992)；和Pearson等人，Meth.Mol.Bio.24：307-31(1994)。Altschul等人在J.Mol.Biol.215：403-10(1990)中对序列排列方法和同源性计算提出了详细地考量。

可以通过若干渠道，包括国家生物信息中心(NCBI，国家医学图书馆，38A楼，房间8N805，Bethesda，MD20894)和互联网获得NCBI基本局部比对检索工具(BLAST)(Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-10(1990))，它可以和序列分析程序blastp，blastn，blastx，tblastn和tblastx一块使用。其他信息可以从NCBI网址中找到。

为了比较多于约30个氨基酸的氨基酸序列，利用参数设置成默认值的BLOSUM62矩阵，对两段序列进行Blast对比，(存在空隙值记为11，每个残基空隙值记为1)。当比对短肽时(小于约30个氨基酸)，采用参数设置成默认值的PAM30矩阵(开放空隙罚9分，延伸空隙罚1分)，对两段序列功能进行Blast比对。当用这种方法评估时，和参比序列相似性更高的蛋白表示出上升的同一性，如至少70％，如75％，80％，85％，90％，95％或者甚至于99％的同一性。当部分序列进行序列同一性比较时，在10-20个氨基酸的短窗口中，同源物通常具有至少75％的序列同一性，例如根据它们和参比序列的同一性，序列同一性至少是85％，90％，95％或98％。在这么短的窗口中确定序列同一性的方法在NCBI的网址中介绍了。

蛋白同源物的典型的特征是占有至少70％，如至少75％，80％，85％，90％，95％或甚至于98％的序列同一性，利用NCBI Basic Blast2.0，用氨基酸序列计算全长比对，用如nr或swissprot的数据库进行有空隙的blastp。用DUST(Hancock和Armstrong，Comput.Appl.Biosci.10：67-70(1994))过滤通过blastn程序搜索到的查询。其他程序使用SEQ。

本领域的技术人员将会意识到提供的这些序列同一性范围只是用作指南，不在所提供的范围之内，也可获得很有意义的同源物。上述肽的同源物以及编码这种同源物的核酸序列在本申请中提供了。

尽管如此，没有表示高度同一性的核酸序列也能编码相同或相似(保守)的氨基酸序列，因为遗传密码具简并性。利用简并性可以对核酸序列加以改变，从而得到多个核酸分子，但它们编码基本一样的蛋白。这种同源肽，通过这种方法确定的序列同一性例如至少有75％，80％，90％，95％，98％或99％。例如，当部分序列对序列同一性加以比较时，同源物在10-20个氨基酸的短窗口中，例如至少有75％，85％，90％，95％，98％或99％的序列同一性。在这么短的窗口中确定序列同一性的方法在NCBI网址中可以找到。本领域的任何一个技术人员都会意识到提供的这些序列同一性范围只是用作指南，不在所提供的范围之内，也可能获得很有意义的同源物或其他变体。

受试者：活的多细胞脊椎动物，它包括人和兽类受试者，例如哺乳动物，啮齿类动物和鸟类。

治疗有效量：足以达到想要的生物效应的数量，例如，能有效促进毛发生长的数量。在特定的实施例中，治疗有效量指的是能有效促进比如对其给药的受试者或者其他任何含有毛囊的有生命或非生命的样品毛发生长的Tβ4，T-3或其他肌动蛋白结合肽的浓度。

在一个疗程中，治疗有效量可以一次剂量给药，也可以若干剂量给药。

本申请公开的方法在医学和兽医领域的应用相同。因此，一个总的术语“正在处理的受试者”应该被理解可以包括所有的动物(如人，猿，狗，猫，马和母牛)，它们需要增加期望的生物效应，如促进毛发生长，增加克隆发生干细胞的迁移，增加干细胞迁移或增强基质金属蛋白酶活性。

治疗有效的同源物：以某个“治疗有效量”促进受试者毛发生长的同源序列。

胸腺素β4：一种43个氨基酸的小蛋白(Ser Asp Lys Pro Asp Met AlaGlu Ile Glu Lys Phe Asp Lys Ser Lys Leu Lys Lys Thr Glu Thr Gln Glu LysAsn Pro Leu Pro Ser Lys Glu Thr Ile Glu Gln Glu Lys Gln Ala Gly GluSer，SEQ ID NO：1)。这个术语的意思包括天然的，重组的和合成的胸腺素β4。本申请也称作Tβ4或Tβ4。

T-3：7个氨基酸序列Leu Lys Lys Thr Glu Thr Gln，对应于全长Tβ4(即SEQ ID NO：1)的第17-23位氨基酸。这个术语的意思包括天然的，重组的和合成的T-3。

局部应用：在皮肤，粘膜，内脏，毛发等表面应用。换句话说，不是通过摄取或注射。

局部活性剂：一种物质或组合物，它在应用部位能引起药物反应或生物效应。

变体：“变体”指的是同源肽。

胸腺素β4的“变体”指的是和编码胸腺素β4的序列相似的氨基酸序列，它在一个或多个氨基酸上发生了改变(即和SEQ ID NO：1中提出的序列相比较而言)。因此，“变体”和Tβ4有不到100％的序列同一性。变体有“保守的”改变，其中取代的氨基酸具有相似的结构或化学性质(如用异亮氨酸取代亮氨酸)。更罕见的事，变体有“非保守的”变化(例如，用色氨酸取代甘氨酸)。相似的一些小的变异也包括氨基酸缺失或插入，或两者都有。利用本领域众所周知的以及上述“序列同一性/相似性”中所讨论的计算机程序，可以发现指南，这种指南用于确定哪个氨基酸残基被取代、插入或缺失，而不会破坏它的生物或免疫活性。

同样，T-3的变体是和胸腺素β4第17-23位氨基酸片段相似的序列，但在一个或多个氨基酸上发生了改变。和胸腺素β4的变体一样，这种变化可以是保守的，也可以是非保守的。

采用同样的方式，本申请介绍的任何氨基酸序列或片段都有“变体”。

描述

本公开内容涉及适合促进人和其它动物的毛发生长的方法和组合物。具体而言，本公开内容提供含有肌动蛋白结合肽的组合物。在一些实施方案中，肌动蛋白结合肽含有胸腺素β4的片段。在一些优选的实施方案中，本公开内容提供的组合物含有一个或多个胸腺素β4片段和/或别的适合治疗秃发症和其他与脱发相关的症状的肌动蛋白结合肽。在一些特别优选的实施方案中，本公开内容提供的组合物含有胸腺素β4中能结合肌动蛋白的6或7个氨基酸序列。

胸腺素β4是一种43个氨基酸的小蛋白(Ser Asp Lys Pro Asp MetAla Glu Ile Glu Lys Phe Asp Lys Ser Lys Leu Lys Lys Thr Glu Thr Gln GluLys Asn Pro Leu Pro Ser Lys Glu Thr Ile Glu Gln Glu Lys Gln Ala Gly GluSer，SEQ ID NO：1)(Low和Goldstein，J.Biol.Chem.，257：1000(1982))。在不同的组织和细胞类型中，它的浓度从1×10^-5到5.6×10^-1。胸腺素β4是胸腺素组分5(TF5)的一个小的组分(典型的大约是1％)，其中胸腺素组分5是从不同动物胸腺(例如，牛，猪，鼠，公山羊，大鼠，小鸡和人)中制备的多肽的部分纯化混合物。可以利用本领域已知的任何适合的方法来制备TF5。已知TF5由至少40-50个不同的多肽组成，这些多肽可以在等电聚焦的聚丙烯酰胺凝胶(pH3.5-9.5)中观察到，它基本上不含脂质，碳水化合物和内毒素。参看Hooper等人，Ann.NY.Acad.Sci.249：125(1975)。TF5在胸腺缺乏或免疫缺陷的动物，具原发性免疫缺乏的人，和免疫抑制的癌症患者中能有效地重建免疫功能。

胸腺素β4能和G-肌动蛋白相互作用，而且是细胞中主要的肌动蛋白隐蔽蛋白(sequestering protein)。胸腺素β4对体外内皮细胞和角质细胞迁移以及体内血管生成有活性。胸腺素β4也能极大加速正常动物或受损愈合模型(即胆固醇处理的大鼠，糖尿病的小鼠，以及年老的小鼠)大鼠皮肤的全层伤口修复。在用胸腺素β4局部或全身给药的动物中，伤口的深度和宽度会显著降低。此外，胶原沉积上升，可能是因为早期伤口的血供应增加。胸腺素β4的浓度在血小板中的浓度是最高的，这些血小板位于第一种进入伤口并释放颗粒内含物的细胞中，颗粒中含有修复因子和负责募集其他细胞到伤口部位来的分子。然而，为了使用本公开内容中的方法和组合物，没必要知道机制。

胸腺素β4在伤口液体中也有。它和其他修复因子如生长因子不同在于：(1)促进内皮细胞和胶质细胞迁移，(2)不会和基质结合，分子量非常低(使得它能通过组织扩散相对远的距离)，而且(3)不会促进细胞生长。

外源添加胸腺素β4或其肌动蛋白结合片段到分离的克隆发生的毛囊干细胞，会导致迁移增加，和基质金属蛋白酶(MMP)活性的增强(和具体而言，是增强MMP-2水平)。因此，毛囊干细胞被激活，促进分化但不是增殖。通过本申请公开的方法，干细胞中许多对毛发生长重要的活性被增强了，包括迁移，蛋白酶产生和分化。

sonic hedgehog已显示可以促进毛囊进入生长期。Sato等人，“通过sonic hedgehog的局部瞬时表达，可以诱导出生后小鼠的毛发生长期(Induction of the hair growth phase in postnatal mice by localizedtransient expression of Sonic hedgehog)”，J.Clin.Invest.104：855-864(1999)。Shh信号传导截断和影响Wnt信号传导(signaling)，Wnt信号传导参与了毛发生长。Tβ4出现在克隆发生的角质细胞核中，有可能调节信号传导。尽管不拘囿于任何理论，但在某些实施方案中，胸腺素β4激活sonic hedgehog的表达，从而促进毛囊进入生长期。

血管内皮生长因子(VEGF)类似于胸腺素β4，参与血管生成。由VEGF或胸腺素β4诱导的毛囊在尺寸上更大。参看Yano等人，“VEGF介导的血管生成对毛发生长和毛囊大小的控制(Control of hair growthand follicle size by VEGF-mediated angiogenesis)”，J.Clin.Invest.107：409-417(2001)。因此，在某些实施方案中，胸腺素β4的片段，T-3或其他肌动蛋白结合肽通过促进血管生成能促进毛发生长和/或增加毛囊大小。尽管不拘囿于任何理论，但在某些实施方案中，Tβ4能激活VEGF的表达，从而促进血管生成和毛发生长。

最近，另一个在毛囊中表达的血管生成分子肝细胞生长因子也被发现能促进毛发生长。Grant等人，“分散因子在体内能诱导血管形成(Scatter factor induces blood vessel formation in vivo)”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：1937-1941(1993)；Lee等人，“在毛囊中表达的肝细胞生长因子(HGF)激活剂在体外参与依赖HGF的毛囊延长(Hepatocyte growthfactor(HGF)activator expressed in hair follicles is involved in in vitroHGF-dependent hair follicle elongation)”J.Dermatol.Sci.25：156-163(2001)；Lindner等人，“肝细胞生长因子/分散因子以及met受体信号传导参与毛囊形态形成和循环(Involvement of hepatocyte growthfactor/scatter factor and met receptor signaling in hair folliclemorphogenesis and cycling)”，FASEB，J.，14：319-332(2000)。肝细胞生长因子也能正调节胸腺素β4的表达。Oh等人，“人脐静脉血管内皮细胞中，肝细胞生长因子正调节胸腺素β4(Hepatocyte growth factorupregulates thymosin beta4 in human umbilical vein endothelial cells)”，Biochem.Biophys.Res.Commun.296：401-405(2002)。因此，如果利用肝细胞生长因子促进毛发生长是通过增加胸腺素β4和/或与它协同而发挥作用的话，那事实上可能模仿或复制了本申请公开的方法。

此外，也利用类固醇来治疗某些类型的脱发。Shapiro等人，“毛发重新生长的治疗剂(Hair regrowth.Therapeutic agents)”，Dermatol.Clin 16：341-356(1998)。胸腺素β4是一种抗炎分子，在类固醇处理的单核细胞中鉴定出了这类分子。Young等人，Nat.Med.5：1424-1427(1999)。因此，用类固醇处理也可能涉及胸腺素β4在毛发生长上的作用。

所有这些数据支持的结论和结果表明：胸腺素β4的肌动蛋白结合区是天然出现的伤口修复因子和angiogen，即毛发生长的促进剂和调节剂。

如实施例中进一步详细介绍的那样，在本方法和组合物的开发过程中，在雌性大鼠中进行了伤口愈合试验。在这些试验中，在伤口上涂了一些含胸腺素β4的水凝胶制剂(0.2％聚丙烯酸)。对照动物只是涂了水凝胶。当受伤后第7天观察伤口时，发现伤口部位周围的毛发生长显著增加。看起来毛发生长得比该动物其它剃刮区域的毛发要长和浓密。7天后，动物被杀死，制备涂了水凝胶的区域的组织切片，用本领域已知的方法(苏木紫与伊红染色以及Masson氏三色染色)染色。如图1所示，在用胸腺素β4处理的愈合伤口边缘，观察到毛囊数增加。

此外，实施例2介绍的试验是为了直接测试胸腺素β4对正常(即没受伤)雌性大鼠皮肤局部给药的效果。在试验最后，杀死动物，组织切片泡在10％缓冲的福尔马林中，用标准的组织染色方法进行染色。如图2和图3所示，胸腺素β4在处理后的第7和第30天能刺激新的毛发生长。皮肤所有别的方面在处理后第30天看起来没受影响，只在表皮上有一点小变化，或在真皮厚度上有点变化。

在实施例3中详细介绍的进一步试验中，测试了无胸腺的雌性裸小鼠，以确定胸腺素β4是否能促进小鼠后背毛发生长。毛发生长可以用肉眼观察。在处理过的皮肤上，没有观察到毛发生长增强或别的差异，和用不含胸腺素β4的对照(即水凝胶)处理的皮肤完全一样。

此外，检测了胸腺素β4对26个月龄的年老雌性BALB/c小鼠的效果。清晰地观察到了新的毛囊发育，如图5所示。在对这些年老小鼠的进一步试验中，测试了胸腺素β4的合成片段刺激毛发生长的能力，该片段含有7个氨基酸序列T-3。该结果表明该片段能促进毛囊的发育，超过单独用水观察到的毛囊发育。因此，胸腺素β4的片段，包括含有这个片段的多肽，也被考虑用于毛发再生组合物中。

公开的方法能促进年老小鼠和裸小鼠的毛发生长。总之，毛发看起来很粗糙，根据处理过的皮肤上大毛囊的相对数目，这在组织水平上很明显。当检查胸腺素β4在新激活的毛囊中的分布时，发现它在膨胀部表达，而随着毛囊生长活跃，它在细胞亚群中开始表达，这些细胞亚群从膨胀部迁移到球形部，毛发开始在球形部活跃生长。分离的克隆发生的毛囊干细胞能产生胸腺素β4。当胸腺素β4被外源加入这些细胞时，可以观察到迁移加快以及MMP-2水平上升。这些数据表明胸腺素β4通过激活毛囊肝细胞而促进毛囊生长。此外，公开的方法和组合物能增强干细胞中对毛发生长重要的许多活性，包括迁移，蛋白酶产生和分化。

因为T-3的7个氨基酸序列包括了一个肌动蛋白结合区，因此其他含有肌动蛋白结合区的肽也可用来促进毛发生长。这个序列的同源物以及胸腺素β4序列SEQ ID NO：1的片段(例如在肌动蛋白结合区有保守或非保守性氨基酸取代，或专门在肌动蛋白结合区之外)也可以考虑用来促进毛发生长。任何能保持电荷或疏水性的氨基酸保守取代，如赖氨酸取代精氨酸，苏氨酸取代丝氨酸，或亮氨酸取代精氨酸都将保持肌动蛋白结合区或含有肌动蛋白结合区的片段的活性。例如，其他含有T-3序列或SEQ ID NO：1第17-22位残基的肌动蛋白结合蛋白包括，但不限于不同的β胸腺素或其片段(如Tβ₄^Ala，Tβ₄^Xen，Tβ₉，Tβ₉^Met，Tβ₁₀，Tβ₁₁，Tβ₁₂，Tβ₁₂^鲈鱼，Tβ^海胆，Tβ₁₃(前面介绍的所有这些都含有T-3序列，Leu Lys Lys Thr Glu Thr Gln)，以及Tβ^扇贝和Tβ₁₄(含有序列Leu Lys Lys Thr Asn Thr Glu))都可以用于本申请内容。别的例子是一些含有T-3(第17-23位残基)或SEQ ID NO：1第17-22位残基的肽，其每条序列都有1-2个保守取代。相似的肌动蛋白结合肽的例子可以在Tβ^斑马鱼(含有序列Leu Arg Lys Thr Glu Thr Gln)和Tβ₁₅(含有序列Leu Lys Lys Thr Asn Thr)中找到。因此，事实上，任何已知的β胸腺素或其片段含有可用于本申请的肌动蛋白结合基元。参看Huff等人，“β胸腺素，具多种功能的小酸性肽(β-Thymosins，small acidicpeptides with multiple functions)”，Intl.J.Biochem.& Cell Bio.33：205-220(2001)(定义的β胸腺素缩写，及提供的序列，一些序列在表2中也复制了)。对这些不同序列的比较也提供了关于氨基酸取代的指南，这种取代可以在Tβ4肌动蛋白结合区中进行，同时保持它的治疗活性。例如，在第1，3和4位的残基看起来是高度保守的，因此，不太可能被取代。

此外，本领域已知的促进小肽活性的方法可以和能促进毛发生长的公开序列组合使用。这些方法可以提高这种肽在受试者中的半寿期，或增加它用于其他原因的活性。例如，可以使用本领域已知的不同的融合分子。不同分子量的聚乙二醇(“PEGs”)，尤其是那些分子量介于3000-9000gm/mol的聚乙二醇，其能转变成氨基聚乙二醇(“APEG”)，可以和短肽偶联，导致活性增加，这和Kawasaki等人在“[Arg-Gly-Asp]-[氨基聚乙二醇]杂合分子的制备及其对实验性癌症转移的抑制效果(Preparation of[Arg-Gly-Asp]-[Amino-poly(ethyleneglycol) hybrids and their inhibitory effect on experimental metastasis])”，Chem.Pharm.Bull.3373-3375(1991)中介绍的一样。如Hojo等人在“抗转移的层粘连蛋白相关肽的壳聚糖杂合分子的制备(Preparation of achitosan hybrid of an antimetastatic laminin-related peptide)”，Pharm.Pharmacol.Commun.5：277-280(1999)中所介绍的那样，可以将壳聚糖连接到肽上，从而使其活性增强。同样的处理对牛血清白蛋白，葡萄球菌蛋白A(参看Maeda等人，J.Biochem.115：182-189(1994))，纤维粘连蛋白和任何正常的血清蛋白也是真实的。因此，将本申请公开的肌动蛋白结合基元融合到别的分子上同样会导致受试者体内毛发生长活性增强。

其他用来增加小肽活性的方法也能增加本申请公开的用于促进毛发生长的序列的活性。肽序列线性或分支的聚体单独或和融合分子共同作用能增加活性。本领域已知多种不同方法通过形成聚体可以增强活性。参看Kawasaki等人，Biochem.and Biophys.Res.Comm.174：1159-1162(1991)；Nomizu等人，Cancer Res.53：3459-3461(1993)；Saiki等人，Br.J.Cancer.59：194-197(1989)；Murata等人，Int.J.Biol.Macromol.11：97-99(1989)；Saiki等人，Cancer Res.49：3815-3822(1989)。因此，通过制备包含这些序列的聚体或共聚体和任选将这些聚体与另一分子融合，本申请中公开的氨基酸序列的活性可以增强。这样的结构包括：(T-3)n，(T-3)n-APEG，(T-3)₂，(Tβ4)n，(T-3)m-(Tβ4)n，(Leu Lys Lys Thr Asn Thr)n，[(Leu Lys Lys Thr Asn Thr)-(Leu LysLys Thr Asn Thr Gln)]n，(Leu Lys Lys Thr Asn Thr Gln Glu)n，(Leu LysLys Thr Asn Thr Glu)n，(T-3)-Cys-Cys-(T-3)，Cys-(T-3)n-Cys[通过二硫键环化]，[Ac-(T-3)]₈Lys₄Lys₂LysGly-OH等，在这些结构中，n代表的数字大于1，如整数(例如2)或分数(例如2.5)。在某些特定的实施例中，聚体是线性的，具有重复基元Leu Lys Lys Thr Asn Thr或Leu Lys LysThr Asn Thr Gln，而且在一些实施例中，n大于2而小于100，例如2-50或2-10。重复基元可包括在多肽中，该多肽中除了重复基元外，还包括氨基酸序列。

因为本申请公开的内容分离和提供了不同肽的活性区，而不仅仅是全长的，天然存在的蛋白如Tβ4，根据公开的方法可以获得某种好处，在这些方法中，使用了更短的肽。这种好处包括有助于更简单和更经济地合成活性肽，这些肽比天然的全长蛋白要短。另一个好处是肽越短，活性越高，因为同样摩尔的重量，活性相似，而在某些情况下，短肽在作用部位有更好的穿透力或生物药效率。本方法甚至能使天然蛋白的活性增强，例如，通过使用含有一个以上活性位点的肽。

为了证明并进一步例证本公开内容的某些实施方案和许多方面，提供了下列实施例，这些实施例不可理解成对其范围的限制。

实施例1

大鼠毛发生长的证明

本实施例是为了证明胸腺素β4对大鼠毛发生长的促进。在对雌性大鼠进行伤口愈合研究过程中，开发了一种含有胸腺素β4的水凝胶制剂。具体而言，在0.2％水凝胶(聚丙烯酸，Hawkeye-Jensen公司)中制备0.05％胸腺素β4的制剂。使用棉棒作为涂药器，将这种制剂涂在伤口上。对照动物只涂水凝胶。

在实验开始前，将测试的大鼠刮剃一次，以在它们背上去掉尽可能多的毛发，使得试剂和对照介质能穿透。在8周龄的Sprague Dawley大鼠背上开了6个全层8mm切口大小的伤口，每3个大鼠一个数据点。在受伤的当天和受伤后48小时，用棉棒将浓度大致为25μg/50μl胸腺素β4的水凝胶涂在伤口上。涂药的确切体积依靠估计，但药要涂成一薄层。水凝胶很难正好涂在伤口上，因此相邻的组织和水凝胶接触。当肉眼检查伤口时，清楚地观察到伤口周围的毛发生长加速。和动物其他刮剃区域周围毛发相比，观察到伤口周围的毛发生长得又长又密。7天后，杀死动物，涂药区域的组织切片用10％的福尔马林缓冲液固定，并用本领域众所周知的染色方法染色(苏木紫与伊红染色和Masson氏三色染色，Histoserv，Gaithersburg，MD)。如图1所示，组织学数据表明，相对用对照水凝胶处理的动物和未处理的动物而言，在用胸腺素β4处理的动物中，毛囊数目增加。

实施例2

胸腺素β4对正常大鼠的作用

这个实施例证明的是胸腺素β4局部给药时，对正常(未受伤)的雌性大鼠的作用。在这些实验中，利用了8周龄的雌性Sprague Dawley大鼠。每周3次(周一，周三和周五)，将浓度为0.5mg/ml胸腺素β4的水凝胶涂在动物刮剃过的背上。在30天内对动物的毛发进行观察。在处理开始后7天杀死其中一些动物，而另一些动物在处理开始后30天杀死。利用本领域众所周知的方法制备组织切片，如实施例1介绍的那样。一个在皮肤病学方面受过训练的观察者以事先未知的方式(blind)将组织切片全部观察和比较一遍。

如图2所示，发现胸腺素β4在第7天能促进新的毛发生长。此外，如图3所示，在涂药后30天，胸腺素β4也能刺激新的毛发生长。皮肤所有别的方面在处理后30天看起来不受影响，在表皮上或在真皮厚度上几乎没有变化。胶原沉积没有观察到上升，而血管数目看起来也没有变化，尽管观察到炎性细胞数目增加了。

实施例3

胸腺素β4对雌性小鼠皮肤的作用

该实施例证明的是胸腺素β4对无胸腺的雌性裸小鼠皮肤的作用。无胸腺的雌性裸小鼠在皮肤上看不到毛发，但却有一些毛囊，用它们来测试看看胸腺素β4是否能促进毛发生长。用胸腺素β4处理35天，每周3次(浓度和前面的实施例中一样)，用肉眼可以观察到毛发生长，并且通过组织学方法观察到新的毛囊数目增加。

在26个月龄的年老雌性BALB/c小鼠中也证明了胸腺素β4的作用。这些小鼠被认为很老了，因为它们已经超出了正常小鼠的寿命。这些小鼠表示出许多老年症状，包括白内障，关节炎，伤口愈合困难，以及毛发稀薄。将这些小鼠刮剃，并用胸腺素β4在刮剃的当时和48小时后按上述的方法处理。在第7天，收集皮肤，并用组织学方法检查，方法和实施例1介绍的一样。没有观察到明显的新的毛囊发育，如图5所示。

为了证明胸腺素β4的T-3部分是否具有和全长Tβ4同样的活性，用同样的方式将T-3肽涂在年老的小鼠上，其中T-3含有7个氨基酸大小的肌动蛋白结合区，位于Tβ4的第17-23位氨基酸上。使用全自动肽合成仪合成T-3片段，这在本领域众所周知。

合成的T-3肽的水溶液/混合物的浓度是5μg/50μl。结果(参看图6)表明与单独利用水的对照处理中所观察到的相比，该片段增加了毛囊发育。因此，含有这些氨基酸的胸腺素β4片段可被用来生产毛发再生组合物。

实施例4

利用年老的小鼠，裸小鼠和大鼠模型研究毛发生长

为了进一步证明胸腺素β4对毛发生长的作用，0.05％的肽和水凝胶载体组合使用，每隔一天对刮剃的大鼠，刮剃的年老小鼠(24-26个月龄)，以及裸小鼠进行局部涂药。

一个研究中使用的是刮剃的大鼠，在这些大鼠中，胸腺素β4在刮剃区域的一侧局部涂药，而另一侧涂的是对照载体。处理7天后，观察到在用胸腺素β4处理过的大鼠中，生长期的毛囊数目增加了(参看图7A)。生长期毛囊的数目大致是用空白载体单独处理的对照大鼠中的2倍(参看图7D)。和未处理的区域相比，毛发看起来更长更密，毛囊直径也更大。在30天内，随着连续每周3次的处理，生长期毛发的数目持续生长。然而，在停止处理的14天内，活性的毛囊数目下降到对照水平。

处理7天后，年老的小鼠(22-26周龄)毛囊数目生长表示出相似的增长(参看图7B，7E)。在第7天和第35天(参看图7E，7F)，在处理区域，裸小鼠显示毛发生长增加。这些数据表明当对大鼠和鼠模型进行胸腺素β4局部施用时，其会促进毛发生长。

实施例5

迁移试验

用8μm孔的涂有50μg/ml的大鼠尾巴I型胶原(BD Bioscience，Bedford，MA)的聚碳酸酯PVPF膜(Poretics，Livermore，CA)在48孔的Boyden室中进行克隆发生的角质细胞迁移研究，其中I型胶原稀释在角质细胞-SFM中，SFM中含有72mM的HEPES缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA)。包被的膜在使用前干燥2小时。用胰蛋白酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)收获培养的克隆发生的角质细胞，并重悬在结合介质中，结合介质中含有下列成分：角质细胞-SFM，1％的牛血清白蛋白因子(Sigma，St.Louis，MO)，以及25mM的HEPES缓冲液。底室用结合介质填满，结合介质中含有1或100ng3×合成的Tβ4(FDA)。成纤维细胞条件培养基用作阳性对照。将角质细胞加入上室，浓度是每个孔30000个细胞，用5％CO2在37℃温育4.5小时。然后固定膜，并且用Diff-Quik(VWR)进行染色。随机计算每个孔的三个区域的细胞数，并将计算得的细胞数平均，便能对成功通过膜上小孔迁移的细胞数进行定量。在Nikon Optiphot-2显微镜下以10×镜头计数细胞。实验重复两次。

克隆发生的角质细胞在体外向胸腺素β4迁移

Tβ4在前面已经被显示能促进内皮细胞迁移。Malinda等人(1997)。在Boyden室实验中，培养的克隆发生的角质细胞在4.5小时后对Tβ4有反应。在Tβ4存在情况下，细胞的迁移比只有结合介质存在情况下细胞的迁移增加了将近2倍(p0.0006)(参看表1)。这个肽对细胞迁移的作用在1ng/ml的情况下是最大，而Tβ4浓度较高，迁移表现下降。

表1：在存在Tβ4的情况下，克隆发生的角质细胞的迁移上升。

  细胞/视野    阴性对照    Tβ4(1ng)    Tβ4(100ng)  成纤维细胞  条件培养基    平均    69±7.12    113.3±5.5    79.3±6.6  164.3±11.4    P值    0.0006    0.200  0.0001

每个值的SEM计算在表1。

实施例6

毛发生长过程中胸腺素β4活性的证明

按Paus等人在“休止期皮肤含有毛发生长的抑制剂(Telogen skincontains an inhibitor of hair growth)”，Br.J.Dermatol.122：777-784(1990)中介绍的方法，用脱毛来诱导休止毛囊的毛发生长周期。简而言之，用毛发去除器蜡带试剂盒(Hair Remover Wax Strip Kit)(Del Laboratories，Farmingdale，NY)为休止期的8周龄的雌性C57/BL6小鼠后背皮肤去毛，导致生长期毛囊同步发育。在去毛后第0天(没去毛的皮肤-休止期)，第4天(早生长期)，和第9天(晚生长期)收集皮肤组织样品，每个时间点收集5只小鼠。用4％的多聚甲醛固定样品，并将样品包埋在石蜡中。

用毛囊细胞亚群表达胸腺素β4

在C57/BL6小鼠脱毛诱导的同步的成熟毛发生长周期中，内源胸腺素β4在毛囊中表达的空间和时间模型已经被证明。这样就把观察到的给药胸腺素β4的作用效果和内源性胸腺素β4在毛发生长中的功能联系起来了。在去毛后1天，在休止期毛囊中观察到了低水平的胸腺素β4(图8)。在这些毛囊中，胸腺素β4表达限定在少量的位于膨胀区的细胞中，在上毛囊或下毛囊中都没检测到胸腺素β4。皮脂腺在所有阶段都被染色了，可能是因为它对抗胸腺素β4抗体的非特异性吸收。

毛囊向早生长期转变(去毛后4天)伴随着膨胀区中胸腺素β4表达细胞数目的增加(图8)。此外，在毛囊下部，即膨胀部和球形部之间检测到了一些胸腺素β4阳性染色细胞。在晚生长期(去毛后8天)，位于下毛囊(包括基质和外根鞘)的为数众多的细胞都表达胸腺素β4。这些数据表明胸腺素β4表达细胞在时间和空间上的分布与毛囊干细胞的位置类型相似(参看Taylor等人，Cell 102：453-461(2000)，和Oshima等人，Cell 104：233-245(2001))。随着毛发开始生长，在膨胀部外面靠近球形部的地方，观察到了胸腺素β4阳性细胞，它们是从膨胀部迁移到这的。

实施例7

从大鼠触须中分离克隆发生的角质细胞(毛囊干细胞)

根据Kobayashi等人在“大鼠触须膨胀部中角质细胞克隆形成细胞的隔离(Segregation of keratinocyte colony-forming cells in the bulgeregion ofthe rat vibrissa)”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：7391-7395(1993)中介绍的方法，作了一些修改，从大鼠触须囊中分离克隆发生的角质细胞。简而言之，用CO₂窒息的方法杀死Fisher 344大鼠。将含有触须垫的上嘴唇割下来，并将其内表面显露出来。在双目显微镜下解剖触须囊，拔去毛垫的毛囊，然后把它放在无菌的培养基中。将含有毛囊膨胀部的片段割下来，并在胶原酶/离散酶(dispase)溶液(1mg/ml；Roche Molecular Biochemicals，Quebec，Canada)中37℃培养30分钟。从胶原蛋白囊中分离表皮核，并且在0.05％的胰蛋白酶溶液中进一步培养(30分钟，37℃)，以利于表皮细胞的解离。分离的细胞培养在角质细胞-SFM培养基中，其补充有EGF，牛垂体提取物(Invitrogen，Carlsbad，CA)和10％的FCS(Hyclone，Logan，UT)。

培养的大鼠触须克隆发生的角质细胞表达胸腺素β4

来自膨胀区的大鼠触须毛囊角质细胞能表达胸腺素β4。以前，已经确定位于膨胀区的毛囊干细胞具有体外高度增殖能力的角质细胞。尽管根据特定的标记，毛囊干细胞并没有被完全表征，但它们能优先表达细胞角质蛋白15(K15)。从大鼠触须膨胀区分离的克隆发生的角质细胞(图9A，9B)显示该分离的细胞是高度克隆发生的(图9C)。这些细胞表达干细胞标记K15，但不能表达细胞角质蛋白10(K10)，K10是一个已知的末端角质细胞分化的早期标记(图9A，9D)。此外，当在体外培养时，这些细胞能以平均26μm/小时的速度移动。这些特征支持了这样的结论，即通过这些方法获得细胞群体代表的是毛囊干细胞的直系后代。这些细胞在体外培养3-4天后能表达胸腺素β4(图9C)。

有意思的是，用外源的胸腺素β4处理这些克隆发生角质细胞时，能引起K15水平出现剂量依赖的下降(图10)，这表明胸腺素β4对早期干细胞分化是重要的(即向TA表型转变)。没有发现胸腺素β4对干细胞增殖有作用。这些数据将从大鼠触须中分离出来的细胞定义为能产生胸腺素β4的克隆发生的角质细胞。

实施例8

克隆发生的角质细胞在胸腺素β4存在下能提高MMP-2的水平

以前认为胞外基质降解是正常appendageal发育过程中必要的步骤。在这个实施例中证明了胸腺素β4对基质金属蛋白酶(MMPs)的作用。

用外源胸腺素β4处理克隆发生的膨胀部衍生的干细胞，会导致细胞衍生的MMP-2分泌水平以剂量依赖方式上升，却观察不到对MMP-9水平的显著作用(图11)。这些数据表明胸腺素β4能激活MMP-2的活性，MMP-2对于干细胞从膨胀部逃逸和便利它们迁移到球形部都是重要的。

实施例9

促进人毛发生长

本领域的技术人员很容易地意识到上述的处理方法能轻易地用来处理人的秃发症。任何可药用载体，尤其是那些适合局部给药的载体，可以用作肽给药时的载体，该肽含有有效治疗量的Tβ4，T-3，含有肌动蛋白结合序列的Tβ4片段，以及任何其他肌动蛋白结合肽或他们的混合物。这种肽也可以以纯的形式给药，不带载体。如果使用了载体，该肽可以任何有效量存在，但通常是以混合物的形式给药，混合物中含有0001-50％的肽或肽的混合物。更优选地，可药用载体含有0.01-5％的肽或肽的混合物。这种处理包括对局部受秃发影响的区域局部给药一个或多个剂量。在某些实施方案中，每天，每隔一天，每周、两周或每月一次或多次多剂量给药。局部给药剂量的形式可以是洗剂，凝胶，喷雾或任何其他方便的形式。

实施例10

肌动蛋白结合基元的确定

使用天然产生的胸腺素β4，蛋白水解的片段，以及合成的肽，发现胸腺素β4中的6或7个氨基酸大小的肌动蛋白结合基元对于血管生成活性是关键的，该活性又能促进毛发生长。采用人脐静脉血管内皮细胞的迁移试验和利用鸡主动脉弓的血管芽生试验表明胸腺素β4和肽的肌动蛋白结合基元在约50nM时表现出几乎完全一样的活性，而缺乏肌动蛋白结合基元任何一部分的肽是没有活性的。胸腺素β4的粘连和出芽活性随着添加5-50nM的可溶性肌动蛋白而被抑制。这就证明了胸腺素β4的肌动蛋白结合基元对其血管生成活性是关键位点。这些数据进一步表明细胞表面的肌动蛋白可以充当胸腺素β4的受体。

本申请公开的方法被用来确定若干肽中的肌动蛋白结合基元，而且这些方法也能轻易地用来确定其他促进毛发生长肽中的肌动蛋白结合基元。

肽和片段：合成的胸腺素β4由Bethesda，MD的RegeneRx公司提供。下列胸腺素β4的肽片段是用常规方法合成的：Tβ₄^1-15(即SEQ IDNO：1的前15个氨基酸残基)，Tβ₄^10-28(即SEQ ID NO：1的第10-28位的氨基酸残基)，Tβ₄^20-43(即SEQ ID NO：1的第20-43位的氨基酸残基)，Tβ₁₅^13-23(即SEQ ID NO：1的第13-23位的氨基酸残基)，Tβ₄^17-23(即SEQID NO：1的第17-23位的氨基酸残基，也叫T-3)，Tβ₄^19-26(即SEQ ID NO：1的第19-26位的氨基酸残基)，Tβ₄^13-19(即SEQ ID NO：1的第13-19位的氨基酸残基)。天然产生的β胸腺素，胸腺素β4-亚砜，以及蛋白水解片段(即表2第1组中的7种肽)可以用Huff等人以前在Anal.Chim.Acta352：239-248(1997)和Eur.J.Biochem.230：650-657(1995)中介绍的方法来制备。所有的肽都溶解在磷酸缓冲液(PBS)中，并按等分贮存在-70℃。

细胞：HUVECs在2-5节中被分离和使用。Grant等人，J.Cell.Sci.108：3685-3694(1995)。细胞在RPMI 1640(Invitrogen，Carlsbad，CA)中培养，其补充有20％的小牛血清(Hyclone Laboratories，Logan，UT)，200μg/ml的内皮细胞生长补体(ECGS)(Collaborative BiomedicalProducts，Bedford，MA)，0.8U/ml肝素钠(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)，青霉素/链霉素(Invitrogen，Carlsbad，CA)，10μg/ml庆大霉素(Invitrogen，Carlsbad，CA)，和1％的两性霉素B(Invitrogen，Carlsbad，CA)。

细胞粘附：为了确定哪种离子对HUVEC的粘连是必需的，将0.1M碳酸缓冲液中的层粘连蛋白(laminin)-1肽(50μl中有25ng)和两种测试浓度的Tβ₄(50μl中有100和500ng)结合到U形底的96孔滴定板的底部，4℃过夜。用磷酸缓冲液冲洗孔两遍，并用150μl3％BSA的PBS(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)在室温下阻断30分钟。再次冲洗孔，然后将50000 HUVEs的50μl无血清培养基加入每个孔中，无血清培养基中含有指示的盐(1mMCa²⁺，0.5mMMg²⁺和0.5mMMn²⁺)，这些盐或者单独存在，或者组合存在于培养基中。用于本研究的HUVECs在使用前血清缺乏2小时。滴定板在37℃培养45分钟。通过两次PBS冲洗，将没有粘附的细胞轻轻地去掉。剩下的细胞用0.2％结晶紫的20％甲醇染色，多余的染色液用水冲洗，在37℃干燥过夜，用10％SDS裂解10分钟，并在600nm处测定滴定板的OD值。(Molecular Devices的精准微孔板阅读器)。每一个条件测试三次，而每个试验重复三次。

Boyden-室实验：用Salcedo等人以前在J.Imnunol.166：7571-7578(2001)中介绍的方法，在48孔的微趋化室(Neuro Probe公司，CabinJohn，MD)里进行HUVEC迁移试验。简而言之，将50μg/ml大鼠尾巴胶原蛋白(BD Biosciences，Bedford，MA)的RPMI 1640涂在8μm孔的不含PVP的聚碳酸酯膜上，4℃过夜，其中RPMI 1640含25mMHEPES(Invirtogen，Carlsbad，CA)。膜在使用前至少干燥1小时。HUVECs被血清缺乏2小时，用Versene(Invirtogen，Carlsbad，CA)收获，并重悬在结合介质中，结合介质包括具有1％BSA和25mM HEPES的RPMI1640。室的下孔用稀释在结合介质中的1，10，100和1000ng/ml胸腺素β4或其肽片段上样。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(200ng/ml)用作阳性对照。将细胞加到室的上部，浓度是每个孔50000个细胞。小室在37℃温育4小时。使用Diff-Quik(VWR，Bridgeport，NJ)对过滤器进行固定和染色。利用CK-2 Olympus显微镜，在10×放大率下对通过膜孔成功迁移的细胞进行手工定量。每种条件实验三次，每个实验重复两遍。

小鸡主动脉弓实验：从13天大的鸡胚中取出主动脉弓，并将它放在RPMI 1640中。去掉周围的结缔组织后，得到主动脉弓的横断面(1mm)。小心翼翼地将得到的弓环用20-30μl Matrigel(CollaborativeBiomedical Products)附着到48孔滴定板的底部，每个孔一个环。把环如此放置，以使得各个环的内腔可以被看见。在环的顶部加入更多的Matrigel，这样可以把环密封在它们的位置上。往每个孔中加入100μl的人内皮细胞-SFM基础生长培养基(Invitrogen)，该培养基中含有1％的青霉素链霉素。将胸腺素β4、肽片段和外源性肌动蛋白(SigmaChemical Co.)以无血清培养基的形式加入孔中，最终使得每个孔的体积达到400μl。ECGS(200μg/ml)被用作阳性对照。滴定板在37℃培养24小时。用Diff-Quik溶液将环固定和染色。观察者用Olympus显微镜，在10×放大率下，以盲(blind)估计法对出芽进行计数。每一个测试的条件使用六个孔，而每次试验重复三遍。

肌动蛋白介导的HUVEC细胞粘连到胸腺素β4上

锰对细胞粘连到胸腺素β4上是必要的，而且在随后的粘连实验中都用到了它。

因为胸腺素β4含有肌动蛋白结合区，因此在细胞粘连实验中加入了肌动蛋白。这表明可溶性肌动蛋白能阻断胸腺素β4的粘连。作为对照，可溶性肌动蛋白对层粘连蛋白-1介导的粘连没有作用。这些数据表明肌动蛋白能阻断胸腺素β4介导的粘连，同时也表明胸腺素β4上的肌动蛋白结合位点对于细胞粘连到胸腺素β4上是重要的。这些数据也表明肌动蛋白可以作为胸腺素β4的细胞表面受体。

在胸腺素β4存在下，肌动蛋白能阻断主动脉环的血管芽生

利用一个小鸡胚主动脉环模型，发现胸腺素β4能促进芽生。肌动蛋白在这个模型系统中表现出了血管生成活性。在促进芽生过程中，胸腺素β4和肌动蛋白都没有与ECGS阳性对照一样有活性。添加外源肌动蛋白能显著地抑制胸腺素β4介导的芽生。外源肌动蛋白对胸腺素β4介导的血管生成的作用是特异的，因为它不能抑制ECGS介导的血管芽生。当肌动蛋白和ECGS一块加入时，可以观察到芽生的增长。这些数据表明胸腺素β4离体能促进血管生成，而外源肌动蛋白能阻断这种活性。因此，有理由相信胸腺素β4是通过结合内皮细胞表面上的肌动蛋白而发挥作用的。

胸腺素β4中的肌动蛋白结合区具有血管生成活性的确定

不同胸腺素β4的合成肽和蛋白水解片段用来确定Tβ4对内皮细胞迁移和血管芽生的活性位点，根据本申请公开的方法，这些过程至少部分负责促进毛发生长。无论是合成的，还是天然产生的胸腺素β4在两个实验中都有活性(表2和数据没有显示)。胸腺素β4-亚砜也是有活性的。含有肌动蛋白结合序列的C端或全长的合成肽和蛋白水解片段(Tβ4^1-26，Tβ4^13-23，Tβ4^7-43，Tβ4^13-43，Tβ4^10-28，Tβ4^20-43和Tβ4^17-23)在这些实验中一般具有很高的活性。相反，不含肌动蛋白结合序列的合成肽和蛋白水解片段(Tβ4^1-6和Tβ4^13-19)是没活性的，而Tβ4^1-15。仅在血管芽生实验中表示出很弱的活性。最小的有活性的合成肽是Tβ4^17-23，含有7个氨基酸，对迁移和芽生具有完全的活性(表2，以前和表里的数据没有显示，发现SEQ ID NO：1中第17-22位的氨基酸残基能促进内皮细胞迁移)。具有保守的肌动蛋白结合区，即SEQ ID NO：1中第17-22位氨基酸残基的β胸腺素的所有其他成员(β4-亚砜，β4^Ala，β9和β10)，也是有活性的(表2)。包含在第13-23位氨基酸中的胸腺素β15的肌动蛋白结合区在芽生实验中是有活性的。这些数据表明胸腺素β4内包含的肌动蛋白结合区具有共同的生理活性。因此，有理由相信具序列同源性的这些和其他相关家族成员具有这个对促进毛发生长重要的活性。

表2.Tβ4的蛋白水解片段和合成肽研究的总结

表2联想：肌动蛋白结合基元下面划了线。每个实验的活性打分：n.t.＝没有测试；-＝没有活性；+/-＝活性低；+＝有活性；和++＝活性高。从天然产生的肽中制备前7种成分，如亚砜的形式，命名为“(O)”。

在β胸腺素家族中，肌动蛋白结合基元已知是高度保守的。参看例如，Huff等人，Int.J.Biochem.Cell Biol.33：205-220(2001)。这些分子的大多数异质性是出现在C端。根据肌动蛋白结合序列的保守性，以及根据被测试的β胸腺素的其它成员对内皮细胞迁移和血管芽生是有活性的这样一个事实，对本领域一名普通技术人员来说，许多本申请提供的序列的变体和/或同源物很明显可用于这些公开的方法中。此外，因为这些肽和相似的肽体外活性和体内活性相关，前述的结果表明哪种肽对促进毛发生长有用。

实施例11

Western杂交分析和免疫化学

在前面的实施例中，Western杂交分析按下列方法进行。添加RIPA缓冲液裂解细胞，标准化成等量蛋白的细胞裂解液在4-12％的Bis-TrisNuPAGE胶中进行分离(Invitrogen，Carlsbad，CA)。将蛋白转移到硝酸纤维素膜(Invitrogen，Carlsbad，CA)上，并用能和小鼠角蛋白1，5，6，10，14，15(Covance Research Product，Richmond，CA)拮抗的多克隆抗体检测。用抗GAPDH的抗体(Research Diagnostics，Flanders，NJ)对同一块膜进行重新检测，利用NIH成像软件，通过光密度法将结果标准化。

利用和全长胸腺素β4肽序列拮抗的多克隆兔抗体(A.Goldstein博士，GWU，Washington DC馈赠的礼物)对5μm石蜡切片进行免疫组化染色。用Dako EnVision试剂盒(DakoCytomation，Denmark)检测一级抗体，并用苏木精对组织切片进行复染。

在不偏离本申请介绍的原则的精神和范围下，可以对本申请介绍的方法和组合物进行修饰和改动，这对本领域的技术人员是很明显的。尽管本发明结合特定的实施例已加以介绍了，但还是应该意识到所列举的实施例仅仅是本公开内容的一些特定的实施例，不应看成对本申请的范围进行限制。事实上，对介绍的用来实施本发明方法所作的修改还是在本发明的范围之内，这对相关领域和/或分子生物学，皮肤病学，或相关领域的技术人员而言是明显的。

                                  序列表

<110>美国政府健康及人类服务部

     (Government of the United States)

<120>利用肌动蛋白结合肽促进毛发生长的方法和组合物

     (METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE PROMOTION OF HAIR GROWTH UTILIZING ACTIN

     BINDING PEPTIDES)

<130>SCT042794-47

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>43

<212>PRT

<213>胸腺素β4

<400>1

Ser Asp Lys Pro Asp Met Ala Glu Ile Glu Lys Phe Asp Lys Ser Lys

1               5                   10                  15

Leu Lys Lys Thr Glu Thr Gln Glu Lys Asn Pro Leu Pro Ser Lys Glu

            20                  25                  30

Thr Ile Glu Gln Glu Lys Gln Ala Gly Glu Ser

        35                  40