一种在大肠杆菌中生产可溶性重组蛋白质的方法及其应用

摘要

本发明属于基因工程技术领域。一种在大肠杆菌中将目标蛋白质表达菌株在低温下和分子伴侣一起共表达，从而非常有效地防止目标蛋白质包涵体的形成，大量增加可溶性产物的产量的方法。利用该技术方法能够显著增加提高可溶性重组人内皮抑素和重组人血管抑素的产量。本发明建立了一种适用、简便、廉价地在大肠杆菌中生产可溶性的、有生物活性的重组蛋白质的工艺和方法，具有高效、价廉、适用面广、推广性强的特点，适用于生物工程制药业及基因工程、生物化学、分子生物学等研究。

说明书

一、技术领域：

本发明属基因工程生物技术领域。

二、背景技术：

大肠杆菌表达系统，具有生长快、遗传背景清晰、表达水平高及成本低的特点，是理想的外源蛋白表达系统。但是，这个表达系统最大的不足是外源蛋白往往不能正确折叠而以无活性的包涵体形式存在，包涵体再折叠的产率通常很低。寻找简便、易行、通用性强的改善或防止包涵体形成的方法是目前大肠杆菌表达体系的一个难点和瓶颈环节。

血管生成对实体瘤的生长和转移是必须的。为了促进血管生成，肿瘤组织生成一系列的血管生成因子(如bFGF)，同时许多肿瘤也会产生抗血管生成蛋白，其中之一内皮抑素(endostatin)，是由美国哈佛大学Folkman博士研究组首次从鼠血管内皮瘤细胞系条件培养基中分离得到的(0’Reilly，M.S.，Boehm，T.，Folkman，J.Cell 88：277-285，1997)。内皮抑素是胶原XVIII的C-端片段，分子量为20kDa，能够特异性抑制内皮细胞的增殖和迁移，减少胶质细胞瘤血管和血流，有效抑制小鼠各种原发肿瘤。Vasostatin是钙网蛋白(calreticulin)N端1-180个氨基酸组成的血管生成抑制因子，它能够呈剂量依赖性地抑制内皮细胞的增殖，抑制新生血管生成，在实验动物上能够防止或减小肿瘤的生长。近来的研究发现calreticulin的抗肿瘤活性主要位于其第120-180氨基酸的结构域。本发明中，我们称calreticulin第120-180氨基酸的结构域为血管抑素。

人们试图生产具有生物活性的内皮抑素，但重组内皮抑素蛋白在大肠杆菌细胞质中易聚集成无生物活性的、不溶性的包涵体。在体外变复性过程中，可溶性的活性内皮抑素的产率很低，而且由于含有多对二硫键和非有效折叠，大部分沉淀的蛋白又再次沉淀(O’Reilly，M.S.，Boehm，T.，Folkman，J.Cell88：277-285，1997；You，W.K.，So，S.H.，Lee，H.，Park，S.Y.，Yoon，M.R.，Chang，S.L.，Hong，Y.K.，Chung，S.L.Experimental and Molecular Medicine31：197-202，1999)。曾经有报道在酵母中表达活性内皮抑素(Dhanabal，M.，Ramchandran，R.，Volk，R.，Stillman，I.E.，Lombardo，M.，Iruela-Arispe，M.L.，Simons，M.Sukhatme，V.P.Cancer Res.59：189-197，1999)，与大肠杆菌表达系统相比，酵母表达系统比较昂贵，费时。在小鼠动物模型给药中，需要大量内皮抑素(20mg/kg)，才能使肿瘤消退。血管抑素在表达时也容易形成包涵体。因此，高效、大量、低成本地生产具有生物活性的内皮抑素或血管抑素，是其作为抗肿瘤药物的开发和应用的一个重要的瓶颈环节，也是目前内皮抑素和血管抑素研究中的一个难点。目前国内处于临床研究中的重组人内皮抑素大多是通过大肠杆菌包涵体产物体外重新折叠的工艺生产的，其生产过程费时、费力，分离纯化和质量控制难度较大。

三、发明内容：

本发明专利需要解决的问题是建立适用、简便、廉价地在大肠杆菌中生产可溶性的、有生物活性的重组人内皮抑素和血管抑素的工艺和方法、为重组人内皮抑素和血管抑素作为抑制血管新生和肿瘤转移的治疗药物用于治疗肿瘤和其它血管生成相关疾病建立大规模、廉价生产的方法和工艺。本发明对于重组人内皮抑素和血管抑素作为治疗肿瘤和其它血管生成相关疾病药物的开发和研究具有重要的实用意义。

本发明的目的可以通过以下措施来达到：

将人内皮抑素或血管抑素cDNA基因克隆在大肠杆菌表达质粒中，转化大肠杆菌，经IPTG()诱导表达，其表达产物几乎全部为包涵体产物。将具有分子伴侣活性的蛋白质或一组分子伴侣蛋白质(如大肠杆菌Trigger Factor(TF)和分子伴侣GroEL/ES，DnaK-DnaJ-GrpE和GroEL/ES)分别在不同温度和不同诱导时间下与人内皮抑素或血管抑素共表达，来评价其对可溶性的人内皮抑素或血管抑素产率的影响。结果显示：低温和分子伴侣都分别能够促进可溶性人内皮抑素的产量，当将人内皮抑素或血管抑素表达菌株在低温(35℃～16℃)下生长和表达，同时结合共表达分子伴侣能够更有效防止人内皮抑素或血管抑素的包涵体形成。例如，在25℃时，当人内皮抑素和分子伴侣DnaK-DnaJ-GrpE和GroEL/ES共表达时，可溶性人内皮抑素的产率约为36mg/L，每升培养液至少可纯化获得16mg的人内皮抑素。人内皮抑素或血管抑素能够特异性、剂量依赖性地抑制内皮细胞-牛毛细管内皮细胞(BCE)或人内皮细胞的增殖，在鸡胚尿囊绒膜(CAM)上，具有抑制新生血管生成的作用。

本发明提供了一种可行地、方便地生产可溶性的、具有生物活性的重组人内皮抑素或血管抑素方法。本发明工艺生产的重组人内皮抑素或血管抑素可在制备治疗肿瘤和血管生成相关性疾病药物中应用。

同已有的重组人内皮抑素和人血管抑素生产工艺相比，本发明的特色和创新之处在于：本发明建立了一个简便、价廉、高效地在大肠杆菌体系中提高可溶性重组蛋白质产量的方法。利用分子伴侣共表达和低温生长联合使用的方法，可以很容易地将原本几乎都以包涵体形式表达的重组人内皮抑素和人血管抑素转变为几乎全部可溶的重组人内皮抑素和人血管抑素，获得的产物具有明显的抑制血管新生和抑制血管内皮细胞增殖的活性，方法简便、实用性强。避免了重组人内皮抑素和血管抑素生产中常用的、烦琐、低效、困难的体外复性工艺。而Xu Ren等人则是将人内皮抑素克隆在专门的带有信号肽的表达载体中，通过信号肽的引导才实现人内皮抑素的分泌表达(Xu，R.，Du，P.，Fan，J.J.，Zhang Q.，Li，T.P.，Gan，R.B.Protein Expression and Purification 24：453-459，2002)。

四、附图说明：

图1.不同温度和分子伴侣共表达对重组人内皮抑素可溶性的影响。

1.37℃，pET23a-人内皮抑素；

2.37℃，pET23a-人内皮抑素，pGTf2，人内皮抑素和分子伴侣同时表达；

3.37℃，pET23a-人内皮抑素，pGTf2；分子伴侣先表达0.5小时；

4.37℃，pET23a-人内皮抑素，pGKJE8，人内皮抑素和分子伴侣同时表达；

5.37℃，pET23a-人内皮抑素，pGKJE8，分子伴侣先表达0.5小时；

1’.16℃，pET23a-人内皮抑素；

2’.16℃，pET23a-人内皮抑素，pGTf2，人内皮抑素和分子伴侣同时表达；

3’.16℃，pET23a-人内皮抑素，pGTf2；分子伴侣先表达0.5小时；

4’.16℃，pET23a-人内皮抑素，pGKJE8，人内皮抑素和分子伴侣同时表达；

5’.16℃，pET23a-人内皮抑素，pGKJE8，分子伴侣先表达0.5小时。

图2.重组人内皮抑素抑制b-FGF刺激的血管内皮细胞增殖实验。

黑色：NIH3T3细胞；白色：血管内皮细胞。

图2.重组人内皮抑素抑制b-FGF刺激的血管内皮细胞增殖实验。

黑色：NIH3T3细胞；白色：血管内皮细胞。

图3.重组人内皮抑素抑制鸡胚尿囊膜新生血管生成活性实验。

图4.不同培养条件下，重组GST-VAS蛋白的可溶性分析。

A.37℃培养，分子伴侣和GST-VAS同时表达3个小时；

B.37℃培养，分子伴侣先表达20分钟，GST-VAS表达3个小时；

C.28℃培养，分子伴侣和GST-VAS同时表达5个小时；

D.28℃培养，分子伴侣先表达20分钟，GST-VAS表达5个小时。

图5.重组人血管抑素抑制b-FGF刺激的血管内皮细胞增殖实验。

图6.重组人血管抑素抑制鸡胚尿囊膜新生血管生成活性实验。

对孵育8天的鸡胚尿囊膜施以不同剂量的VAS及其它蛋白质。48小时后，观察并测定每个尿囊膜上的无血管区域，无血管区域内径大于8mm的确定为阳性。鸡胚尿囊膜血管生成抑制率(％)定义为：无血管区域内径大于8m的鸡胚数占每个VAS剂量参试鸡胚总数的比例(6B)。例如：3/7所表示的意思是：在VAS的剂量为0.5μg/鸡胚的时候，参试的7个鸡胚中有3个鸡胚呈阳性抑制。6A上和下图分别图示的是5μg GST和5μg VAS处理的结果。正方形表示加样部位，只有VAS的处理组观察到了无血管区域的出现。

五、具体实施方式：

实施例1：重组人内皮抑素基因的克隆、表达、分离纯化和性质鉴定：

1.人内皮抑素cDNA的克隆和表达质粒的构建：将50mg人肝脏组织研磨，溶解于1ml TRIZOL RNA Isolation Reagent(Gibco BRL)，根据试剂说明分离RNA，并将分离到的RNA作为模板，进行一步RT-RNA，扩增cDNA，方法按照OneStep RT-RNA PCR Kit(TaKaRa)说明进行，所用正向引物：5’-ttc cat atg cacagc cac cgc gac ttc cag-3’，其中加入了Nde I酶切位点(见黑体部分)；反向引物5’-ccg ctc gag cta ctt gga ggc agt cat g-3’，在内皮抑素编码序列后面加入了翻译终止密码子(CTA)，为了克隆方便，还加入了酶切位点XhoI(黑体)。获得的PCR产物大约550bp，获得的PCR产物和质粒pET23a(Novagen公司)分别用Nde I和Xho I限制酶于37℃消化8小时，经1％琼脂糖凝胶电泳提取质粒DNA，经NcoI和XhoI双酶切、1％琼脂糖凝胶电泳，筛选获得阳性克隆，获得的阳性克隆进行DNA序列分析测定。

2.重组人内皮抑素的表达：获得的阳性克隆pET23a-hE重组质粒转化E.coliBL21(DE3)菌株(Novagen公司)，过夜菌以1∶100稀释接种于LB培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.6～0.8后，加入IPTG诱导表达，表达产物经SDS-PAGE(分离胶15％，浓缩胶为5％，考马斯亮蓝R250染色)(见附图1)。表达菌体经超声破碎细胞，8000rpm离心10min收集菌体。

3.重组人内皮抑素在不同温度下与分子伴侣的共表达：

将重组人内皮抑素表达质粒和分子伴侣表达质粒pG-TF2(共表达分子伴侣TF和GroEL/ES)和pG-KJE8(共表达分子伴侣DnaK-DnaJ-GrpE和GroEL/ES)共转化大肠杆菌BL21(DE3)(分子伴侣表达质粒pG-TF2和pG-KJE8请参见：Nishihara，K.，Kanemori，M.，Yanagi，H.，Yura，T.Appl.Envir.Microbiol.66：884-889，2000)。TF和GroEL/ES由20ng/ml四环素诱导表达，DnaK-DnaJ-GrpE由0.3mg/ml L-阿拉伯糖诱导表达。1mM IPTG用来在对数期诱导重组人内皮抑素表达。

4.重组蛋白质表达分析：收获细胞并超声破菌，离心分离上清和沉淀，15％SDS-PAGE电泳分析，将考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE扫描(UVPWhite/Ultraviolet transilluminator)，分析结果并根据定量的分子量标准，计算重组人内皮抑素的产率(使用UVP公司的软件Grab-it 2.5和Gelwork)。用western blot分析确定重组人内皮抑素或血管抑素纯化产物，实验中使用PVDF western blotting膜(Roche)，鼠多克隆抗人内皮抑素抗体(Santa Cruz)。

6.重组内皮抑素的细胞测活：在添加20％小牛血清、抗生素及3ng/ml的人重组bFGF的DMEM培养基中培养BCE细胞(牛毛细血管内皮细胞)或者NIH 3T3细胞至足够数量，加入0.05％胰蛋白酶消化，细胞重悬于含20％小牛血清的DMEM培养基中。约12500个细胞/0.5ml(孔)加入24孔板中，37℃(10％CO₂)培养24小时后分别加入25μl空白对照及不同剂量的重组人内皮抑素于各个孔中。30分钟后加入bFGF至终浓度1ng/ml。进一步培养48h，胰蛋白酶消化细胞，重悬于PBS，用70％冰冷乙醇固定30min，7-AAD染色，用流式细胞仪分析结果，比较样品及空白孔中的活细胞数，可以计算出不同浓度的抑制率。

7.鸡胚尿囊膜血管检测重组人内皮抑素活性实验：取孵化8～9天鸡胚，在血管丰富处挑去三角形蛋壳，挑破壳膜，将重组人内皮抑素加在灭菌滤纸上，再将滤纸贴在尿囊膜上面。用无菌胶带封口。给药3天后，打开鸡胚，在给药处滴加等量甲醇和丙酮的混合液，室温固定15分钟，待血液凝固后剪下尿囊膜，放入水中展平，进行观察和拍照。

实施例2：重组人血管抑素基因的合成、克隆、表达、分离纯化和性质鉴定：

1.人血管抑素基因的合成、克隆及其表达载体的构建：参照大肠杆菌偏爱的密码字，化学合成了十条寡核苷酸，寡核苷酸的长度为28-35碱基，相邻的寡核苷酸有5-8碱基相互配对，寡核苷酸的序列以及它们之间的重叠模式参见图。首先将所有的寡核苷酸稀释至100pmol/μl，而后按照以下的步骤依次处理：T4多聚核苷酸激酶磷酸化，30℃退火，Klenow大片段补平缺口，T4 DNA连接酶连接所有缺刻(nick)，最后得到编码人calreticulin 120至180位氨基酸的183bp的双链DNA片断。用PCR的方法将该片断进行扩增，所用的正向引物为：5’-CGGGATCCTGGACGACGACGACAAGATGACTGACATGCACGGTGAC-3’，反向引物为：5’-CCCTCGAGTCATTAGTTGTCTGGACGAATCAG-3’。在正向引物中有一个BamH I的酶切位点(黑体)以及编码肠激酶识别位点DDDDK的序列(下划线部分)，反向引物中有一个Xho I的酶切位点(黑体)。PCR反应的条件为：94℃热变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸30秒，共进行25个循环。纯化的PCR产物采用BamH I和Xho I进行双酶切，然后插入pALEX的多克隆位点。pALEX是一个T7启动子控制下的GST融合表达的原核表达载体(Christos，A.，Panagiotidis，Silverstein，S.J.Gene 164：45-47，1995)。对重组表达载体pALEX-VAS进行DNA测序，分析其阅读框和编码序列的正确性。

2.融合蛋白GST-VAS的表达：分别将GST-VAS融合蛋白表达载体pALEX-VAS和对照载体pALEX转入表达宿主菌E.coli BL21(DE3)，挑取单克隆接种至新鲜的LB液体培养基(含50mg/l的氨苄青霉素)。待细菌长至OD600为0.6左右，分别加入终浓度为0.6mM的IPTG诱导GST-VAS和GST的表达。诱导两个小时后收集菌体，处理后的菌体蛋白样品进行12％SDS-PAGE分析，使用UVP white/ultraviolet transilluminator对考马斯亮兰染色的凝胶进行扫描记录，采用专业分析软件Grab-it 2.5和Gelwork分析目的蛋白占菌体总蛋白的比例。

3.在不同的温度下，GST-VAS和分子伴侣共表达：将pALEX-VAS和pG-TF2共同转入E.coli BL21(DE3)，在双抗性的LB培养基平板(含有50mg/l的氨苄青霉素和34mg/l的氯霉素)上筛选得到阳性克隆。

单克隆的过夜培养菌液分别接种至含有3ml液体LB的试管中，每只试管含有50mg/L氨苄青霉素和34mg/L氯霉素，将上述试管均分成A、B、C和D四组。A组和B组置37℃摇床培养，C组和D组在28℃培养，转速为250rpm，在细菌生长至OD600约为0.5时，向B组和D组的试管中加入终浓度为20μg/L的四环素诱导分子伴侣的表达，20分钟后，向四组所有试管中加入终浓度为0.6mM的IPTG诱导GST-VAS的表达，诱导后继续培养3个小时(A组和B组)或者5个小时(C组和D组)。

4.蛋白表达的定量分析：为了比较在不同的表达条件下GST-VAS可溶性的高低，采用赵景辉等报道的方法处理表达样品(Zhao，J.H.，Xu，Z.，Hua，Z.C.Protein Express.Purif.18：316-319，2000)，收集数量相同的细胞，而后用300μl冰浴的PBS缓冲液重悬菌体，充分超声处理后，采用离心的方法将细菌裂解物分成总蛋白、上清和沉淀三个组分，并走12％SDS-PAGE。凝胶的染色、扫描以及蛋白的定量如2所述。在这里，可溶性定义为：可溶性的目的蛋白/总的目的蛋白×100％。

5.GST酶活性分析方法分析可溶性表达产物的产量：理论上，可溶性的等摩尔GST-VAS和GST具有相同的GST酶活性，基于此，采用测定GST酶活性的方法对GST-VAS的可溶性进行了进一步的分析。用MicroBCA试剂盒(PierceChemical Company)将所有的细胞裂解上清都调整至相同的蛋白浓度，分别取5μl上清加入1.5ml的GST测活缓冲液(0.1M K3PO4，1.0mM还原型谷胱苷肽，1.0mM1-氯-2，4-二硝基苯，pH6.5)，每隔1分钟记录一次OD340nm值，共记录5分钟。以OD340为纵坐标，时间为横坐标作图，曲线的斜率反映了GST的相对酶活。

6.血管内皮细胞增殖抑制试验：将3-5代的HUVEC接种到明胶包被的24孔板中，每个孔约1×104细胞，细胞培养于DMEM培养基(含10％胎牛血清，2ng/ml bFGF，90μg/ml肝素，1％抗生素)，温度为37℃，CO₂浓度为5％，培养24h后，将不同浓度的GST-VAS，人血管抑素和GST加入相应的孔中，继续培养72小时后，胰酶消化后，重悬细胞并计数。每个实验，每个样品均重复三次。

9.鸡胚尿囊膜血管生成抑制实验：为了确认人血管抑素在活体内的对新血管生成的抑制作用，我们进行了鸡胚尿囊膜血管生成抑制实验。实验选用的是孵化八天的非免鸡胚。具体做法如下：首先用小钻子在鸡胚的气室上凿一小洞，然后用小镊子将气室上方的部分蛋壳去除，进而剥去气囊膜，然后将带有不同剂量人血管抑素的滤膜覆于尿囊膜的血管密集处，用封口膜封闭气室。将鸡胚置于37.5℃和相对湿度为80-90％的培养箱中培养，48小时后，用甲醇和丙酮(1∶1)的溶液固定滤膜覆盖处尿囊膜，15分钟后，用小剪刀剪下固定部位，用PBS洗涤，而后在解剖镜下观察并用数码相机拍照，无血管区域内径大于或者等于8mm的处理确定为阳性。

分子伴侣和目标蛋白质的诱导表达的顺序也对目标产物的可溶性有一定影响。例如，当重组人内皮抑素和分子伴侣在16℃下同时诱导表达时，约有69％(与TF和GroEL/ES共表达时)或89％(与GroEL/ES和DnaK-DnaJ-GrpE共表达时)重组人内皮抑素为可溶性；如果先诱导分子伴侣表达半小时，再诱导目标蛋白质的表达，16℃下，约有74％(与TF和GroEL/ES共表达时)或95％(与GroEL/ES和DnaK-DnaJ-GrpE共表达时)重组人内皮抑素为可溶性的。在37℃下分子伴侣和目标蛋白质同时诱导表达时，约有26％(与TF和GroEL/ES共表达时)或36％(与GroEL/ES和DnaK-DnaJ-GrpE共表达时)重组人内皮抑素为可溶性；如果先诱导分子伴侣表达半小时，再诱导目标蛋白质的表达，约有36％(与TF和GroEL/ES共表达时)或42％(与GroEL/ES和DnaK-DnaJ-GrpE共表达时)重组人内皮抑素为可溶性的。在不同温度下，先诱导分子伴侣的诱导，再诱导目标蛋白质的表达都能够一定程度地改善可溶性目标产物的产量。

在25℃下，利用低温和分子伴侣共表达能够产生约36mg可溶性的重组人内皮抑素，通过上述纯化步骤能够纯化获得至少16mg的重组人内皮抑素。重组人内皮抑素可以抑制BCE细胞的增殖，并且呈剂量依赖关系(见附图)，其ED₅₀＝0.5μg/ml，对于其它细胞(如NIH3T3等)则没有抑制细胞增殖的活性。重组人内皮抑素具有明显的抑制鸡胚尿囊膜新生血管生成活性和明显的血管抑制作用，4μg重组人内皮抑素导致血管的完全被抑制，导致鸡胚死亡(见附图6)。

在实施例2中，当无分子伴侣共表达时，重组GST-VAS的分子量与预期分子量一致，约为35kD，其表达水平为菌体总蛋白质的45％，表达产物大多为包涵体。当分子伴侣TF和GroEL-GroES在37℃下与GST-VAS共表达时，大多数表达产物仍然以包涵体形式存在；当GST-VAS在28℃下单独表达时，约有10-25％的GST-VAS变为可溶性的；但GST-VAS与分子伴侣TF和GroEL/ES在28℃下共表达时，85％的GST-VAS表达产物变为可溶性的，出现在细胞裂解上清中，其可溶性产物的表达量较37℃时增加6倍。SDS-PAGE扫描定量分析的结果和GST酶活性分析测定的结果都一致证实了上述结果。分子伴侣和低温表达联合使用能够非常显著地提高可溶性重组人血管抑素的产量，避免包涵体产物的形成。纯化后的重组人血管抑素产量为7.2mg/升培养基。重组GST-VAS和人血管抑素都可以抑制血管内皮细胞的增殖，并且呈剂量依赖关系(见附图)，其ED₅₀＝60nM，高达300nM的人血管抑素对于其它细胞(如NIH3T3等)的细胞增殖没有抑制活性。重组人血管抑素具有明显的抑制鸡胚尿囊膜新生血管生成活性和明显的血管抑制作用，在0.5-10μg/鸡胚范围内，重组人血管抑素呈剂量依赖性地抑制鸡胚尿囊膜新生血管生成。

同以往的研究和报道相比较，本发明的一个显著创新之处在于：以往研究报道只单独使用低温表达或者单独将分子伴侣和目标蛋白质共表达，如同我们的研究结果所示，其改善目标产物可溶性的效果很有限的；而本发明中，我们将低温生长、表达和分子伴侣共表达同时使用，其改善目标产物可溶性的效果非常明显，几乎所有的目标蛋白质都能变为可溶性的，而且其总的表达水平还没有发生太大的变化。