重组大肠杆菌高效生产可溶性的人β防御素

摘要

人β防御素-2(HBD-2)是一种由41个氨基酸组成并富含半胱氨酸残基的阳离子抗菌短肽,内有三个二硫键.它具有广泛的抗菌谱,尤其对革兰氏阴性菌和酵母有很强的杀伤作用;而且致病微生物不会对它产生耐药性,因此有很好的药用前景.该文的目的在于实现HBD-2在大肠杆菌内的高效表达,研究内容包括重组表达体系的构建和筛选,发酵条件的优化及放大,抗菌活性的初步检测,以及同族的HBD-3和HBD-4的重组表达.人β防御素-3(HBD-3)和人β防御素-4(HBD-4)与HBD-2同属人β防御素家族.在成功实现HBD-2的大肠杆菌表达的基础上,用经密码子优化的HBD-3和HBD-4成熟肽编码序列作为目的基因,构建了表达载体pET32-smhBD3和pET32-smhBD4,表达所得两目的蛋白分别占细胞总蛋白的33.6％和51.3％且溶解性高达90％.而且发现将HBD-2成熟肽与载体蛋白TRX直接融合也可以实现其在37℃的高可溶性表达.

目录

摘要

ABSTRACT

第一章文献综述

1.1人防御素

1.1.1人防御素的组织分布

1.1.2人防御素的分子生物学特征

1.1.3人防御素的抗菌活性及其机理

1.1.4人防御素的医学价值及应用前景

1.2人β防御素-2(HBD-2)的重组生产

1.3密码子优化

1.4融合表达

1.4.1pre-pro序列

1.4.2重复序列

1.4.3常用的融合表达体系

1.4.4温度对包含体形成的影响

第二章HBD-2表达载体的构建

2.1引言

2.2材料和方法

2.2.1质粒和菌种

2.2.2培养基

2.2.3工具酶和试剂盒

2.2.4质粒抽提

2.2.5感受态细胞的制备和质粒转化

2.2.6DNA的检测

2.2.7含重复序列的克隆载体和表达载体的构建

2.3克隆载体的鉴定

2.4表达载体的鉴定

2.5小结

第三章各种HBD-2表达载体的表达比较

3.1引言

3.2材料和方法

3.2.1质粒和菌种

3.2.2培养基

3.2.3培养条件

3.2.4分析方法

3.3不同重复序列表达载体的表达情况

3.4重复序列对宿主菌生长及质粒稳定性的影响

3.4.1重复序列对宿主菌生长的影响

3.4.2重复序列对质粒稳定性的影响

3.5密码子优化对目的蛋白表达的影响

3.6小结

第四章E.coli BL21(DE3)/pET32-shBD2发酵条件的研究

4.1引言

4.2材料与方法

4.2.1菌种

4.2.2培养基

4.2.3摇瓶发酵

4.2.410L发酵罐发酵

4.2.5分析方法

4.3摇瓶发酵条件的优化

4.3.1培养基的选择

4.3.2培养温度

4.3.3摇瓶装液量

4.3.4诱导条件

4.410L台式发酵罐的间歇发酵

4.5小结

第五章HBD-3和HBD-4的重组表达

5.1引言

5.2材料和方法

5.2.1质粒和菌种

5.2.2培养基

5.2.3培养条件

5.2.4工具酶和试剂盒

5.2.5基于PCR的基因SOEing合成

5.2.6表达载体的构建

5.2.7分析方法

5.3经过密码子优化的HBD-3和HBD-4的基因合成

5.4 HBD-3和HBD-4在pET-32a(+)系统中的表达

5.5小结

第六章HBD-2的初步活性检测

6.1引言

6.2材料和方法

6.2.1敏感菌

6.2.2培养基

6.2.3固体培养法

6.2.4液体培养法

6.2.5分析方法

6.3固体培养法抑菌结果

6.4液体培养法抑菌结果

6.5小结

第七章结论

参考文献

致谢

附录发表论文情况