一种短棒状杆菌制剂或无细胞短棒状杆菌制剂在制备治疗HIV感染或爱滋病药剂中的应用

摘要

本发明公开了一种短棒状杆菌制剂(CPP)或无细胞短棒状杆菌制剂(NCP)在制备治疗HIV感染或爱滋病药剂中的应用，所述短棒状杆菌制剂是由短棒状杆菌(CP)经甲醛灭活后制成的制剂，所述无细胞短棒状杆菌制剂为纳米级、颗粒大小均一、吸收度及扩散度提高，低热原、无甲醛残留；本发明的CPP与NCP均具有脾激活及抑瘤等生物学活性，具有明显的抗小鼠逆转录白血病病毒作用，可用于HIV感染或爱滋病的治疗或辅助治疗。

说明书

技术领域

本发明涉及一种短棒状杆菌制剂(CPP)或无细胞短棒状杆菌制剂(NCP)在制药领域中的应用，尤其涉及在制备治疗HIV感染或爱滋病(AIDS)药剂中的应用，属于药物领域。

背景技术

爱滋病即获得性免疫缺陷综合症(acquied immunodeficiencysyndrome，AIDS)，是由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)引起的一种严重传染病。病毒特异性地侵犯并损耗淋巴细胞分化群4⁺T淋巴细胞(cluster of differentiation 4⁺T cell)，即CD4⁺T细胞，又称T4细胞，造成机体细胞免疫受损。临床上初始表现为无症状病毒携带者，继续发展为持续性全身淋巴结肿大综合症(persistent generalized lymphadenopathy，PGL)和爱滋病相关复合症(AIDS related complex，ARC)，出现发热、倦怠、盗汗、消瘦、恶心、呕吐、腹痛、腹泻、全身淋巴肿大、鹅口疮、口唇疱疹及带状疱疹等，最后并发各种严重机会性感染和恶性肿瘤，成为爱滋病(AIDS)。因目前尚无特效疗法，病死率极高，故被称为“20世纪的瘟疫”。

爱滋病是一种全球性的传染病，预防和控制这种疾病已成为一个需要各国认真对待的“全球性政治问题”。据联合国爱滋病规划署资料，截止到目前全球已有6000万人感染了爱滋病病毒，其中2000万人已被爱滋病夺去生命。目前，全球有4000万感染者，其中90％在发展中国家，如不加强预防措施，到2020年，全球爱滋病还将夺走6800万人的生命。同时据报道，目前中国实际爱滋病病毒感染人数已超过100万人，如不加以有效控制，到2010年将超过1000万人。爱滋病已经成为全世界第四大死亡原因。

爱滋病的诊断标准国际上常用的有美国疾病控制中心(CDC)Walter Reed的分类。最主要的条件是卡波氏肉瘤和机会性感染。实验室诊断为CD4细胞下降和爱滋病病毒抗体阳性。1993年美国CDC修订的HIV感染分类及AIDS诊断标准中，将CD4水平和临床症候综合考虑在内，新分类的重要变化是可根据CD4计数＜200/μL确定患有艾滋病。

爱滋病病毒(HIV)是单链RNA病毒，可在体外淋巴细胞系中培养，属逆转录病毒科慢病毒属，分两个型，即HIV-1型和HIV-2型，HIV-1型选择性侵犯CD4⁺T淋巴细胞，也能感染单核巨噬细胞、B细胞、小神经胶质细胞及骨髓干细胞，是引起爱滋病的主要毒株；HIV-2型的毒力不如HIV-1型强。HIV-1型和HIV-2型两者均能引起AIDS，但一般所指的AIDS为HIV-1型所致。

人是爱滋病的传染源，无症状HIV感染者及爱滋病患者均具有传染性。已发现病毒存在于血液、唾液、泪水、乳汁、精子及阴道分泌物中，提示能造成传播，汗液中尚未能检出HIV。

爱滋病的传染途径为：性接触传播、注射传播、血源传播和母婴传播等。发病年龄主要为40岁以下的青壮年。

HIV对CD₄⁺T淋巴细胞(包括淋巴细胞、单核细胞及巨噬细胞等)有特殊的亲嗜性。据目前的研究，爱滋病的发病与HIV含量、毒力、变异及CD₄⁺T淋巴细胞数量、功能和机体免疫状况有关。

1、HIV侵入及复制过程  HIV侵入人体后，在辅助受体(趋化因子受体)CCR₅、CXCR₄等的协同作用下，病毒表面gp120与CD₄⁺T淋巴细胞的CD₄分子特异受体结合，借助于gp41脱去衣壳后，病毒核心蛋白及RNA进入细胞浆，两条病毒RNA链在逆转录酶的作用下，逆转录成单链DNA，然后以此DNA为模板在DNA多聚酶作用下复制DNA，部分存留在胞浆内，部分与宿主细胞的DNA整合，成为潜伏状态的前病毒DNA(proviral DNA)。Proviral DNA可被某种因素所激活，复制、转录成病毒RNA和mRNA，翻译病毒蛋白，装配成新病毒，以芽生方式释出，再感染其他细胞。

2、CD₄⁺T淋巴细胞受损伤的方式和表现

(1)直接损伤：HIV在细胞内大量复制，导致细胞溶解或破裂。

(2)间接损伤：又称融合性损伤，爱感染的CD₄⁺T淋巴细胞HIV-env基因高度编码gp120和gp41，使受染的细胞表面有gp120表达，可与邻近未受感染的CD₄⁺T淋巴细胞结合，形成融合细胞，使细胞膜通透性改变，细胞发生溶解破坏。

(3)骨髓干细胞受损：HIV可以感染破坏干细胞，使CD₄⁺T淋巴细胞产生减少。

(4)免疫损伤：血液中游离的gp120可以与CD₄⁺T淋巴细胞结合，使之成为靶细胞而被免疫细胞损伤，使其数量减少。

CD4⁺T还表现功能异常，主要表现在识别功能障碍，淋巴因子产生减少，白细胞介素受体表达减少，对同种异型抗原的反应性减低，对B细胞的辅助功能减低等。

3、HIV对其他细胞的影响  HIV可导致单核-巨噬细胞受损和功能异常，单核-巨噬细胞表面有CD₄分子和辅助受体CCR₅、CXCR₄分子等，因此HIV可以感染单核-巨噬细胞，使之成为病毒的储存场所，并在病毒的扩散中起重要作用，携带病毒通过血-脑屏障，引起中枢神经系统感染。

HIV可以感染并破坏骨髓的单核-巨噬干细胞系统。巨噬细胞具有抗HIV感染所致的细胞病变作用，但随着病毒不断复制，巨噬细胞功能出现异常，处理抗原的能力减弱，使机体对抗HIV感染和其他病原体感染的能力降低。

4、B淋巴细胞受损和功能异常  B淋巴细胞有低水平CD₄分子的表达，但还不能确定是否有CCR₅、CXCR₄等辅助受体的存在，因此HIV是否能直接攻击B细胞尚有争论，但HIV感染者B细胞功能异常是肯定的。随着CD₄⁺T淋巴细胞的功能异常，B细胞的数量及功能也发生改变。在HIV感染早期，由于病毒和病毒蛋白的刺激，多克隆B细胞激活，外周血B淋巴细胞增多，循环免疫复合物出现，IgG、IgA水平增高。随着病情的进展，B淋巴细胞功能异常，对新抗原刺激的反应性降低，并可出现自身免疫现象。

5、自然杀伤细胞(NK细胞)损伤的异常表现  NK细胞具有免疫监督功能，有抗感染和抗肿瘤的作用，HIV感染者和AIDS病人NK细胞计数虽然正常，但功能缺陷，失去监督对抗感染和抗肿瘤细胞的功能。

6、机体免疫系统崩溃  感染初期，机体对HIV产生了极好的免疫反应，血清中HIV被抑制或被清除，CD₄⁺T淋巴细胞内病毒复制呈相对静止状态，因此没有造成机体的免疫功能损伤和耗竭，并在血清抗-HIV转阳后仍保持长期的无症状期。但在感染过程中，HIV基因不断产生变异，抗原和毒力也不断变异，抗原变异能使HIV逃避机体的体液和细胞免疫的攻击，毒力变异可影响疾病的进程和严重性。致使不断产生复制快、毒力强的新变异株，使CD₄⁺T淋巴细胞数量逐渐减少，免疫功能受到损害，最后CD₄⁺T淋巴细胞迅速减少及耗竭，导致整个免疫系统崩溃，使感染者在2-10年时间内从无症状期发展至AIDS。

由于目前尚未发现抗HIV的特效药物，因而强调综合治疗，包括抗病毒、免疫调节、抗肿瘤及控制机会性感染的治疗等。爱滋病的临床治疗多针对病毒生活周期中的某一特殊阶段，通过干扰HIV RNA的复制、抑制起关键作用的酶或调节因子的活性、破坏病毒颗粒的装配过程和感染细胞的能力来达到治疗的目的。

常用的抗病毒药物有：(1)齐夫多定(叠氮脱氧胸苷，zidovudine，AZT)是目前疗效较好的、已广泛用于临床的第一线抗HIV药。其通过抑制逆转录酶而阻止爱滋病病毒复制，可使CD₄⁺细胞增加，改善免疫功能及临床症状，还能使短期进展成爱滋病的病例减少。主要毒性作用是骨髓抑制，其他副作用有肌炎、头痛、恶心、呕吐等。(2)双脱氧胞苷(ddC)及双脱氧肌苷(ddI)是目前用于临床的第二线抗HIV药。优点是无AZT的骨髓抑制作用，能有效抑制病毒_P24抗原，并使辅助性T细胞绝对计数增加，临床表现改善，体重增加等，副作用为周围神经炎及胰腺炎等，但这里副作用与剂量有关。(3)膦甲酸钠(foscarnet sodium)通过抑制逆转录酶活性而达到阻止HIV复制的目的。其副作用是恶心、头痛、乏力、贫血及血肌酐升高等。(4)α-干扰素(α-interferon)具有抗逆转录酶、抑制HIV复制及减少病毒抗原产生等活性。常见副作用有发热、乏力、流感样综合症、白细胞减少及血小板减少等，可与其他抗病毒药如AZT等联合应用。(5)阿昔洛韦(acyclovir)能抑制多种病毒包括HIV的复制，副作用有发热、乏力、局部刺激等，偶见肾损害。

爱滋病毒受体阻断剂如重组可溶性CD4⁺制备物(rsCD4)能防止HIV与CD4细胞结合，还能阻止HIV感染的细胞与未感染的CD4⁺细胞的融合，从而阻断病毒在细胞间的扩散。

免疫调节治疗可增强HIV感染者的免疫功能，常用的有：(1)胸腺素(thymosin)细胞免疫增强剂，适用于免疫缺陷及免疫功能失调所致的病毒性及肿瘤性疾病，副作用少而轻，偶见一过性头晕、胸闷等。(2)香菇多糖(lentinan)能兴奋体液及细胞免疫，具有广泛的药理活性，无明显毒副作用。(3)白介素-2(IL-2)能增强T淋巴细胞及自然杀伤细胞(NK)的活性，及抑制病毒DNA聚合酶活性的作用，具有兴奋细胞免疫和抗病毒作用，副作用有发热、寒战、厌食及疲劳感。

上述药物尽管在体内应用或体外试验均显示一定的抗病毒作用，能延长患者的生存期，但效果有限，药物的毒性如骨髓抑制和抗药病毒株的不断出现等因素仍限制了这些药物的长期大剂量使用，所以目前强调联合治疗，适当的联合用药可望降低每种药物的用量和降低抗药株产生的频率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种短棒状杆菌制剂(CPP)或无细胞短棒状杆菌制剂(NCP)在制药中的新应用，即在制备治疗HIV感染或爱滋病药剂中的应用，所述短棒状杆菌制剂是由短棒状杆菌(CP)经甲醛灭活后制成的制剂，所述NCP为纳米级、颗粒大小均一、吸收度及扩散度提高，低热原、无甲醛残留，与全菌体制剂具有相同的脾激活及抑瘤等生物学活性，可减少CPP的发烧、胸痛，注射局部红肿、硬结，肝肾毒性等副作用；短棒状杆菌制剂(CPP)或无细胞短棒状杆菌制剂(NCP)作为一种非特异性免疫调节剂，均具有明显的抗小鼠逆转录白血病病毒的作用，可用于HIV感染或爱滋病的治疗或辅助治疗。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种短棒状杆菌制剂在制备治疗HIV感染或爱滋病药剂中的应用。

一种无细胞短棒状杆菌制剂在制备治疗HIV感染或爱滋病药剂中的应用。

本发明所述的短棒状杆菌制剂(CPP，2000版《中国生物制品规程》)是一种非特异性免疫调节剂。它是由短棒状杆菌(CP)经甲醛灭活后制成的死菌苗，其制备过程公开在1995版及2000版《中国生物制品规程》。目前应用的CPP制剂还有法国Merleux研究所生产的灭活菌苗；英国Wellcome药厂生产的灭活菌苗等。

CPP具有激活单核吞噬细胞系统的能力。CPP对免疫系统的作用主要表现在：激活单核巨噬细胞、使NK细胞活性增强、促进机体对多种抗原产生IgG和IgM、诱生干扰素、白细胞介素-2等，因此具有抗肿瘤和抗感染作用。

CPP的抗肿瘤作用已为许多实验和临床研究所证实。对实验动物接种肿瘤前后应用CPP，能显著抑制某些实体瘤(如乳腺癌、黑色素瘤等)、腹水型肿瘤及白血病的生长。肿瘤消退的动物对于再次攻击的肿瘤细胞有特异性的抵抗力。CPP对肿瘤转移亦有抑制作用。

CPP抗肿瘤及抗感染的核心是通过激活巨噬细胞，使其数量和质量大大提高，激活的巨噬细胞可将肿瘤细胞及感染的微生物杀死。

CPP作为免疫调节剂用于肿瘤及其它疾病的治疗已有数十年的历史，其通过激活单核巨噬细胞系统抗肿瘤、抗感染的效果已被公认。

02123571.6、02123570.8和02123572.4已经申请了一种无细胞短棒状杆菌制剂、其制备方法和在制备治疗结核病药物上的用途。

本发明所述无细胞短棒状杆菌制剂(NCP)为由短棒状杆菌(CP)经破碎制备的无细胞制剂，粒度小于100nm。

其中所述的CP，学名为粉刺丙酸杆菌(propionibacterium acnes)菌号为65101(76-27或7627)、65102(H-84)或65103(77-1或771)。

所述的NCP的热原小于160EU/ml，蛋白质含量10-40％(g/g)，核酸含量3-25％(g/g)，其余为多糖。

优选本发明NCP的热原小于60EU/ml，蛋白质含量20-30％(g/g)，核酸含量3-10％(g/g)，其余为多糖。

本发明NCP的粒度优选为10-50nm。

本发明所述的NCP是通过下述步骤制备的：

1).CP工作种子批菌种连续2-4次传代后接种于大瓶或营养罐，在培养基中培养5-7天；

2).收集无杂菌污染的菌体，加热煮沸15-60分钟得到菌液；

3).无菌试验合格的菌液经洗涤后，用破碎装置破碎菌体；

4).菌体破碎后的悬液经离心后收集沉淀，洗涤沉淀制成悬液；

5).将悬液加热灭菌，得到NCP。

其中步骤1)中所述的CP学名为粉刺丙酸杆菌，菌号为65101(76-27或7627)、65102(H-84)或65103(77-1或771)。

培养基为选自硫乙醇酸盐、蛋白胨、肝或酵母透析液培养基中的一种，且为低热原培养基。

步骤1)中培养条件为36-37℃培养。

优选所述培养基为不含琼脂的硫乙醇酸盐培养基。

其中步骤3)中所述的菌体是灭活菌，菌体浓度为50-500亿/ml。

所述破碎装置是将菌体破碎到小于100nm，优选粒度为10-50nm的超高压射流对撞机。

其中所述菌体破碎是在无菌条件下进行。

其中步骤3)中所述的洗涤是将沉淀物用无菌生理盐水离心洗涤至少2次；步骤4)中所述的洗涤是将沉淀物用无菌生理盐水离心洗涤0-5次。

步骤4)菌体破碎后悬液的离心条件是在4℃-室温，6000-12000rpm离心30-150分钟。

步骤5)中所述的加热为在60-65℃加热0.5-2小时。

本发明的制备方法中，进一步包括将步骤5)得到的NCP分装后，安瓿在60+2℃加热30分钟。

本发明中所述培养基优选为经过0.22μm或μm0.45μm膜过滤的低热原培养基。

本发明所述的制备方法中，还包括将步骤5)得到的NCP冷冻干燥，得到NCP的冻干制剂。

上述方法制备的NCP热原小于160EU/ml，蛋白质含量10-40％(g/g)，核酸含量3-25％(g/g)，其余为多糖。

优选上述方法制备的NCP热原小于60EU/ml，蛋白质含量20-30％(g/g)，核酸含量3-10％(g/g)，其余为多糖。

上述方法制备的NCP粒度小于100nm，优选粒度为10-50nm。

本发明中所述的无菌检验合格是指按照《中国生物制品规程》规定的方法检验不得有任何细菌生长。

本发明中由于采用低热原培养基，特别是硫乙醇酸盐培养基，并结合严格的质控，以及整个生产过程中无菌低热原操作，保证了最终产品低热原和无杂菌的污染。

本发明通过超高压射流对撞机将CP破碎至纳米级，通过选择不同的离心力(转速)，确定了离心提取条件，获得的沉淀部分为NCP，经多次动物试验证明，该制剂与全菌体具有相同的脾激活及抑瘤等生物学活性，上清部分则无脾激活及抑瘤作用，表明本发明的NCP具有良好的生物学活性。

为了消除CPP中残留甲醛对机体的刺激性，尤其是对敏感胸膜的刺激性，本发明中采用加热灭活替代了甲醛灭活。动物实验表明，加热灭活的NCP、CPP较甲醛灭活的CPP具有相同的脾激活及抑瘤等生物学活性。

超高压射流对撞机的工作原理是将混有被加工物的液体用高压泵(工作压力为10-3000kgf/cm²)加压后分成两股，以高速射流进入两片直径为8MM人造金刚石晶片组成的通道中，相向对撞后流出。由于液体的速度很高，流体相向对撞时产生很强的冲击波，使金刚石晶片产生高频、高强超声波。大功率高频超声波使被加工物颗粒瞬间粉碎、超微化。

本发明的制备过程中，为更好地破碎菌体，采用超高压射流对撞机，在菌体浓度为50-500亿/ml，工作压力为800-1500kgf/cm²的条件下破碎，破碎后的菌体悬液在4℃-室温下，6000-12000rpm离心30-150分钟，弃上清，沉淀用无菌生理盐水溶液洗涤0-5次后制成悬液，在60-65℃加温0.5-2小时，无菌试验合格后合并，经配制、分装，分装后安瓿在60+2℃加热15-60分钟，得到高质量、粒度和均一性良好的目的产品。

本发明的NCP是将CP的细胞破碎至纳米级，经离心去除无效的上清部分，收集沉淀部分制备的，产品具有低热原、无杂菌污染、无甲醛残留，颗粒具有纳米级，粒度均一，吸收度和扩散度提高，有利于人体吸收并提高药效；同时可减少发烧、胸痛，注射局部红肿、硬结等副作用，是一种有前途的免疫制剂。

根据需要，本发明的NCP可以制成无菌生理盐水的悬浮制剂，固体含量为1.0mg/ml或2.0mg/ml，也可以制成冻干粉针或适合药用的其他剂型；本发明的CPP可为目前常用的剂型，如悬浮制剂、冻干粉针或适合药用的其他剂型。

本发明所用的CPP、NCP均为非特异性免疫增强剂，NCP是由CP经破碎制备的无细胞制剂，为纳米级、颗粒大小均一、吸收度及扩散度提高，低热原、无甲醛残留，与全菌体制剂具有相同的脾激活及抑瘤等生物学活性，可减少CPP的发烧、胸痛，注射局部红肿、硬结，肝肾毒性等副作用，因此NCP克服了CPP的一些不足，可作为一种性能优异的非特异性免疫增强剂应用于抗肿瘤和抗感染等疾病的治疗。

本发明经过对短棒状杆菌制剂(CPP)或无细胞短棒状杆菌制剂(NCP)的药效学研究，表明CPP、NCP具有明显的小鼠抗逆转录白血病病毒作用，显示具一定的抗AIDS作用，可应用在制备治疗HIV感染或爱滋病药剂中；由于NCP产品具有低热原、无杂菌污染、无甲醛残留，颗粒具有纳米级，粒度均一，吸收度和扩散度高，易于人体吸收，同时还降低发烧、胸痛，注射局部红肿、硬结等副作用，因此NCP在制备治疗HIV感染或爱滋病药剂中的效果更为明显。

由于爱滋病患者体内的免疫系统受到毁灭性破坏，T淋巴细胞数量少而且功能障碍，患者因多种病原难以控制的感染不治身亡。感染中以卡氏肺囊虫肺炎最为常见，它是HIV潜伏感染已经活化的临床标志。爱滋病的临床表现非常复杂，机会性感染及恶性肿瘤可累及全身各个系统及器官，且常有多种感染和肿瘤并存，并常死于这些并发症。比如机会性感染引起的肺炎、卡波齐肉瘤以及肺结核等。

本发明的CPP、NCP均为非特异性免疫增强剂，主要作用于MΦ，对单核巨噬细胞系统具有强大而持久的刺激，且可通过促进造血多能干细胞分化为单核巨噬细胞，调动机体免疫系统蕴藏的潜力，发挥抗癌、杀微生物功能。

CPP、NCP抗HIV作用主要是通过对单核巨噬细胞系统强大而持久的刺激，引起MΦ增生、活化、吞噬功能增强及诱导分泌干扰素(IFN-γ)、白细胞介素(IL-2)活性氧(H₂O₂、NO)等杀伤因子及增强NK细胞杀伤活性，达到抑制和杀伤HIV的目的。

随着对HIV发病机理的深入认识和分子免疫学理论的发展，非特异性免疫在抗HIV中的作用，越来越被人们所重视。MΦ不但在机体非特异性免疫中起重要作用，而且在特异性免疫中也起着非常重要的作用。单核吞噬细胞系统除具有吞噬功能，还可发挥抗原呈递(antigen presentation)作用，也属于抗原呈递细胞(antigen-presentation cell，APC)，可辅助T淋巴细胞活化，并与淋巴细胞相互刺激其功能，从而放大特异性免疫效应。然而只有活化的MΦ才能发挥抗HIV效应，且活化的MΦ的抗HIV不变HIV变异及耐药性的影响。故充分调动机体的免疫功能，配合化疗在AIDS的治疗中有着重要的作用。

本发明的一种短棒状杆菌制剂或无细胞短棒状杆菌制剂在用于制备治疗HIV感染或爱滋病药剂时，其用法为：1～7次/周，每次1～20mg，肌肉注射或其他适宜途径给药，1～12个月一个疗程或遵医嘱。可间隔用或连续服用几个疗程。

本发明所用的CPP、NCP为一种免疫调节剂，用于制备治疗HIV感染或爱滋病药剂，具有如下优点：

1.本发明提供了CPP、NCP新的医药用途，对治疗HIV感染或AIDS提供了新的途径。

2.本发明的NCP制剂具有低热原、无杂菌污染、无甲醛残留，颗粒具有纳米级，粒度均一，吸收度和扩散度提高，有利于人体吸收并提高药效；同时可减少发烧、胸痛，注射局部红肿、硬结，肝肾毒性等副作用，是一种有前途的免疫制剂，可作为用于制备治疗HIV感染或爱滋病药剂。

3.本发明的制备工艺简单，可作成口服、注射、片剂等，使用方便。

4.经药效研究表明，本发明的CPP、NCP具有脾激活及抑瘤等生物学活性，能抗结核(TB)感染、抗小鼠逆转录白血病病毒感染作用，对于HIV感染者有利于病情控制，延缓病情发作；对爱滋病伴有的机会性感染或肿瘤有抑制作用，有利于AIDS病情的好转；由于NCP为纳米级，具有吸收好、副作用小等优点，其效果更佳。

具体实施方式

下面是本发明的具体实施例用于详细描述本发明，所述的实施例用于描述本发明而不是限制本发明。其中CP学名为粉刺丙酸杆菌(propionibacterium acnes)，菌号为65101(76-27)、65102(H-84)公开于1993版《中国医学细菌菌种目录》，北京理工大学出版社(ISBN7-81013-859-6/R.7)，65103(77-1或771)公开于2000版《中国生物制品规程》，化学工业出版社。

                           实施例1

参照2000版《中国生物制品规程》中描述的方法进行细菌种子批的建立、检定以及其它检定。

本实施例中采用的培养基为北京三药科技开发公司出品的硫乙醇酸盐培养基(不含琼脂)，成分为：胰酪胨15g/l，酵母浸粉5g/l，葡萄糖5g/l，氯化钠2.5g/l，L-胱氨酸0.5g/l，硫乙醇酸钠0.5g/l。使用前将培养基用0.22μm膜过滤。

启开CP(学名粉刺丙酸杆菌，propionibacterium acnes)771(见《中国生物制品规程》)菌种管，每管含菌60亿，用毛细管吸取约0.2-0.3ml硫乙醇酸盐培养基(不含琼脂)，加在菌种管底部使之完全溶解后吸出，加入中管(容量38ml)中，用上述培养基8-10ml混合，置37℃培养2天。取菌液用上述培养基(菌液∶培养基体积比＝1∶9)混合，置37℃培养2天。取上述培养的菌液用上述培养基(按1∶9)混合，置37℃培养3天，收获菌液。逐瓶镜检，有杂菌污染者弃之。合并收集无杂菌污染的菌体加热煮沸15分钟，用超高压射流对撞击(日本Nanonizer Inc.产品，型号NMG-75-200)在1000kgf/cm²压力下破碎菌体3次；破碎后的悬液在室温、6000rpm离心90分钟，收集沉淀，用无菌生理盐水洗涤沉淀3次，无菌检验(2000版《中国生物制品规程》)及热原检测(2000版《中国人民共和国药典》)合格后制成固体含量为0.5mg/ml的悬液，60℃加热1小时，得到NCP。

其中CP，学名为粉刺丙酸杆菌65103(77-1)或771。

经鲎试剂法(2000版《中华人民共和国药典》)检测(固体含量1mg/ml)，本发明的NCP热原20EU/ml；考马斯亮兰法(《生物化学实验原理和方法》，北京大学出版社)测定蛋白质含量25％(g/g)；紫外法(2000版《中国生物制品规程》)260nm测定核酸含量10％(g/g)；蒽酮法(2000版《中国生物制品规程》)测定多糖含量为10％(g/g)。考虑到蛋白质和核酸的测定结果比较准确，估计其余的多糖未测出。电镜测定粒度为60-100nm。

分装后，安瓿在60+2℃加热20分钟。

                           实施例2

参照实施例1的方法，将CP(学名粉刺丙酸杆菌，propionibacterium acnes)65101(76-27)连续4次传代后接种于营养罐，在硫乙醇酸盐培养基(不含琼脂)(使用前将培养基用0.45μm膜过滤)中，36-37℃培养6天；逐瓶镜检，有杂菌污染者弃之；合并收集无杂菌污染的菌体加热煮沸60分钟，用超高压射流对撞机在1500kgf/cm²压力下破碎菌体5次；破碎后的悬液8000rpm离心1小时，用无菌生理盐水洗涤沉淀5次，无菌检验(2000版《中国生物制品规程》)及热原检测(2000版《中国人民共和国药典》)合格后制成固体含量为2.0mg/ml的悬液，65℃加热60分钟，得到NCP。

经鲎试剂法(2000版《中华人民共和国药典》)检测(固体含量1mg/ml)，NCP热原160EU/ml；考马斯亮兰法(《生物化学实验原理和方法》，北京大学出版社)测定蛋白质含量40％(g/g)；紫外法(2000版《中国生物制品规程》)260nm测定核酸含量5％(g/g)；蒽酮法(2000版《中国生物制品规程》)测定多糖含量为20％(g/g)。考虑到蛋白质和核酸的测定结果比较准确，估计其余的多糖可能未测出。电镜检测粒度为10-50nm，粒度均匀。

分装后，安瓿在60+2℃加热30分钟。

                           实施例3

参照实施例1的方法，将CP(学名粉刺丙酸杆菌，propionibacterium acnes)65102(H-84)连续4次传代后接种于营养罐，在蛋白胨培养基中36-37℃培养7天；逐瓶镜检，有杂菌污染者弃之；合并收集无杂菌污染的菌体加热煮沸30分钟，用超高压射流对撞机(日本Nanonizer Inc.产品，型号AQUA300)800kgf/cm²压力下破碎菌体10次；破碎后的悬液12000rpm离心，用无菌生理盐水洗涤沉淀4次，无菌检验(2000版《中国生物制品规程》)及热原检测(2000版《中华人民共和国药典》)合格后制成固体含量为1.0mg/ml的悬液，65℃加热100分钟，得到NCP。

经鲎试剂法(2000版《中华人民共和国药典》)检测(固体含量1mg/ml)NCP热原60EU/ml，考马斯亮兰法(《生物化学实验原理和方法》，北京大学出版社)测定蛋白质含量12％(g/g)，紫外法(2000版《中国生物制品规程》)260nm测定核酸含量25％(g/g)，蒽酮法(2000版《中国生物制品规程》)测定多糖含量为16％(g/g)，考虑到蛋白质和核酸的测定结果比较准确，估计其余的多糖未测出。电镜检测平均粒度为40-80nm，粒度均匀。分装后，安瓿在60+2℃加热30分钟。

                           实施例4

其他同实施例1，不同之处在于破碎后的悬液在8000rpm离心1小时后，用冻干机冻干，得到粉针剂。

                           实施例5

采用2000版《中国生物制品规程》中描述的方法将CP(学名粉刺丙酸杆菌，propionibacterium acnes)771连续3次传代后接种于营养罐，在硫乙醇酸盐培养基(不含琼脂)中36-37℃培养5天；逐瓶镜检，有杂菌污染者弃之；合并收集无杂菌污染的菌体分别加热煮沸30、60分钟进行无菌试验，无菌试验合格的菌液经离心后，用新鲜无菌生理盐水溶液洗涤沉淀3次并制成悬液，60-65℃加热1小时，无菌检测合格后分装，安瓿在60+2℃加热30分钟，经检测两种样品每瓶含菌为6.0×10⁹。

                           实施例6

其他同实施例5，不同之处在于采集之无杂菌污染的菌体加入甲醛溶液至最终浓度约为0.5％(ml/ml)杀菌48小时，经检测每瓶含菌为6.0×10⁹，游离甲醛含量为0.06g/L。

                           实验例1

CPP中残留有微量的甲醛，甲醛能固定蛋白质，杀死细菌，但对机体具有较强的刺激性。CPP中甲醛残留量虽然很少(应不高于0.06g/l)，但仍会对人体，尤其是对敏感的胸膜产生刺激性。

本发明中按照2000版《中国生物制品规程》中第240-241页中CPP制造及检定规程中规定的方法制备的CPP的脾激活及抑瘤生物学活性进行了试验，结果见表1。

同时，本发明中按照下述方法对本发明实施例1-6的CPP、NCP脾激活及抑瘤生物学活性进行了试验，结果见表1。

脾激活试验：用体重18-20g纯种小鼠(C₃H、615或C₅₇BL)，试验组及对照组各10只，雌雄各半。试验组每只小鼠腹腔分别注射CPP 0.5ml(含菌1.5×10⁹)及实施例1-3的NCP制剂0.5ml(1-3的NCP固体含量都调整到1mg/ml)，对照组注射同量生理氯化钠溶液。14天处死小鼠，分别称体重、脾重、计算脾指数，其指数应不低于2.0。

抑瘤实验(艾氏腹水瘤)：用体重18-20g纯种小鼠(C₃H、615、C₅₇BL、K-LACA或昆明鼠)，试验组及对照组各10只，雌雄各半。每只小鼠腹腔注射活的瘤细胞(5.0×10⁶/ml)0.2ml(用传代5-8天非血性腹水)。试验组于注射瘤细胞前1天及注射后次日起，连续腹腔分别注射CPP 0.25ml(含菌1.5×10⁹)及实施例1-3的NCP 0.25ml(1-3的NCP固体含量调整到2mg/ml)5次，每次间隔1天。对照组注射同量生理氯化钠溶液。对照组小鼠全部因癌性腹水死亡为起点计算试验组小鼠存活率，观察期30天，其存活率应不低于70％。

表1

    脾指数    抑瘤实验CPP(甲醛灭活，实施例6)    ＞2.0    合格CPP(加热煮沸灭活30分钟，实施例5)    ＞2.0    合格CPP(加热煮沸灭活60分钟，实施例6)    ＞2.0    合格NCP(实施例1)    ＞2.0    合格NCP(实施例2)    ＞2.0    合格NCP(实施例3)    ＞2.0    合格NCP(实施例4)    ＞2.0    合格

脾激活及抑瘤实验可说明CPP或NCP的生物学活性及药效。表1的结果表明，加热煮沸30分钟、加热煮沸60分钟、0.5％甲醛溶液灭活制备的CPP以及本发明的NCP，其小鼠脾激活及抑瘤实验效果相同，无明显差异，说明加热煮沸灭活以及破碎提取对CPP及NCP的生物学活性及药效无明显影响。

                           实验例2

本实验例涉及NCP的吸收性能及与CPP吸收性能的比较。

内容：家兔CPP及NCP皮内吸收实验。

家兔：1500-2000克，雌雄各半。

分组：分为CPP组及NCP组，每组各4只。

给药：每只兔背部皮内注射，对照组CPP组0.2ml/只(150亿/ml，相当于2.5mg/ml)，NCP组0.2ml/只(2.5mg/ml)，观察并测试注射局部，结果见表2。

表2

    时间    兔号          NCP组          CPP组  24小时    1#0.2×0.2cm无红肿、硬结0.8×0.8cm红肿、硬结  结果    2#0.2×0.2cm无红肿、硬结0.8×0.8cm红肿、硬结    3#0.2×0.2cm无红肿、硬结0.8×0.8cm红肿、硬结    4#0.2×0.2cm无红肿、硬结0.8×0.8cm红肿、硬结  48小时结果    1#0.2×0.2cm无红肿、硬结1.0×1.0cm红肿、硬结    2#0.2×0.2cm无红肿、硬结1.0×1.0cm红肿、硬结    3#0.2×0.2cm无红肿、硬结1.0×1.0cm红肿、硬结    4#0.2×0.2cm无红肿、硬结1.0×1.0cm红肿、硬结  72小时结果    1#0.2×0.2cm无红肿、硬结1.2×1.2cm红肿、硬结    2#0.3×0.3cm无红肿、硬结1.2×1.2cm红肿、硬结    3#0.3×0.4cm无红肿、硬结1.5×1.5cm红肿、硬结    4#0.4×0.4cm无红肿、硬结1.5×1.5cm红肿、硬结

结论：观察72小时，NCP易于被吸收，未产生明显红肿、硬结，CPP不易被吸收，产生了明显的红肿、硬结反应。此结果说明将CPP的细胞破碎至纳米级制备的NCP更有利于机体的吸收，并能减少副作用，因此NCP效果更佳，为优选的非特异性免疫增强剂。

                           实验例3

本实验例涉及NCP的动物急性毒性试验。

药物：采用实施例1的方法制备，但NCP含量31.7mg/ml，由中国药品生物制品检定所提供。

动物：昆明种小鼠，雌雄各半，由中国药品生物制品检定所动物中心提供。

最大给药量测定，取上述健康小鼠40只，随机分为两组，雌雄各半，给药组小鼠一次肌注最大浓度(31.7mg/ml)，最大体积(0.1m/每侧×2)的NCP，对照组一次肌注等体积生理盐水，记录以上两组给药前后第三天及第七天的体重与临床表现，结果见表3。

表3

  组别  动物  剂量   给药前体重         给药后体重第三天         第七天 相当临床用药倍数  只mg/kg       g             gNCP组  2031.7  20.61+0.61  20.80+1.50   26.67+2.19 452.9对照组  200  20.10+0.48  22.00+1.70   27.41+1.84

上述结果表明，小鼠一次肌注最大剂量的NCP 31.7mg/ml，小鼠未出现死亡，未发现与给药有关的临床表现，也未发现给药对体重的影响，给药剂量相当临床用药量的452.9倍，说明人临床拟用剂量是一个安全剂量。

                           实验例4

本发明的CPP、NCP均为非特异性免疫增强剂，具有脾激活及抑瘤等生物学活性，能抗小鼠逆转录白血病病毒感染作用。本实施例选择优选的NCP对逆转录病毒鼠白血病感染小鼠模型的药效学进行评价。

体内动物实验

由于HIV种特异性强，不能感染非灵长类动物，人们设法由与HIV同属逆转录病毒的相关病毒，或由基因重组方法建立动物模型，最常用的模型是猴免疫缺陷病毒(sinian immmodeficiency virus，SIV)及小鼠白血病病毒(murineleukemia virus，MuLV)，由于小鼠模型易于操作，用药量少，价格便宜，所以最常被采用。

1.实验设计依据、目的

根据卫生部《新药临床前研究指导原则》，采用逆转录病毒鼠白血病感染小鼠模型对其抗AIDS疗效进行研究，以评价NCP抗AIDS的药效作用。

2.材料与方法

2.1动物、设施与饲养：Balb/c小鼠，雌性，6周龄，16-19克，由山东大学实验动物中心提供，动物合格证号：鲁动质[20021239]；实验动物设施合格：鲁动环字200101004；常规小鼠饲养。

2.2供试品

NCP(2mg/ml)，由中国药品生物制品检定所提供，批号：020117；4℃存放，用时生理盐水配制。

2.3阳性对照药

双汰芝，片剂，每片含拉米夫啶150mg，齐多夫啶300mg；Glaxowellcom提供，批号：MAR2001。

2.4动物模型

小鼠逆转录白血病病毒(SRS8)，由上海复旦大学医学部生物物理教研室提供；该病毒株复苏后先离心去上清，随后加新鲜10％小牛血清培养液进行培养，小鼠腹腔接种。

病毒毒力测定：每只小鼠腹腔注射1×10⁵～1×10⁶个细胞/0.3ml；接种后观察小鼠死亡情况。以动物死亡50％接种量为模型接种量。

2.5剂量、分组与给药

1)正常对照组：20只

2)模型对照组：20只

3)阳性对照组：20只。染毒4小时后给药，200mg/kg·天双汰芝灌胃，连续给药14天。

4)NCP高剂量组：2.0mg/次·只，10只

5)NCP中剂量组：0.5mg/次·只，20只

6)NCP低剂量绷带：0.125mg/次·只，10只

NCP给药方法：动物腹腔染毒4小时后肌肉注射给药，隔日1次，共5次。

2.6观察、测定

雌性Balb/c小鼠腹腔感染后4小时，按给药方案给药；隔2日称体重；14天时1)、2)、3)、5)组各杀死10只小鼠，解剖取脾，观察脾病灶并计数；称脾重计算脾系数；取血测血常规，与各试验组比较；剩余动物观察存活率及平均生活日，观察至60天，计算保护率和统计学意义。

3.结果

3.1病毒活力测定(见表4)

表4 病毒活力测定

接种量(个细胞/只)       N_o       21天存活率(％)

1×10⁶                 10             0.0

5×10⁵                 10             0.0

3×10⁵                 10             0.0

1×10⁵                 10             40.0

小鼠接种SRS8病毒株细胞后，死亡时间集中在16～21天，接种量为1×10⁵时，动物存活在50％左右，故小鼠感染模型接种量为1×10⁵个细胞/只。

3.2给药14天时指标变化

3.2.1第一次实验结果

小鼠感染病毒给药后14天内，体重各组变化不明显(表5)；血液学变化明显，双汰芝对照组及NCP组WBC计数、淋巴百分比，血小板计数明显高于模型对照组，NCP组脾指数明显高于正常对照及模型组(表6)，且差异显著。

3.2.2存活时间

攻毒、给药至22天时，模型组腹水明显，其他组不明显；

30天存活率：NCP高、中剂量组明显高于对照组、模型组，并显示一定剂量效应关系；60天时模型组存活率为0，NCP高、中剂量组大于40％，低剂量组仅为10％。

表5 小鼠给药体重变化(g)

                                             给药后时间(d)

组别       N

                 2       4       6      8       10     12      14

                 22.17±   22.08±   21.80±   23.40±   23.36±   23.48±   23.02±

正常对照  10

                 2.57    2.88   3.34    3.24    2.87   2.72    2.67

                 20.57±   21.68±   21.90±   22.36±   22.30±   22.43±   18.38±

模型组    10

                 1.10    1.09   0.96    1.00    1.41   1.49    2.15

NCP组            19.89±   20.36±   20.62±   20.84±   21.31±   21.51±   20.95±

          10

(0.5mg/          2.67    2.32   2.16    2.39    2.33   2.26    2.33

只)

                 21.72±   19.76±   19.16±   21.8±   20.18±   20.68±   20.68±

双汰芝    10

                 1.53    2.55    3.71   2.94   2.15    1.80   2.39

表6 NCP给药14天时血液学变化

                                    WBC分类                PBC

            WBC×                                                                                                       HB        PLT×          脾指数

组别                                                        ×

            10⁹/L      N(％)       L(％)      M(％)               g/l       10⁹/L    (％)

                                                          10¹²/L

            12.71±                                                                                7.46±        141.7±                           0.60±

正常对照              79.5±7.9   9.3±3.1   11.2±5.3                      1788±572

            9.89                                          1.06     7.0                 0.16

            5.68±            70.9±                                                           8.63±        154.8±                            0.45±

模型组                            13.4±5.2  15.7±5.9                      1229±503

            3.23       10.3                               0.98     12.9                0.12

            12.37±          64.1±           21.0±                                      7.99±                              2967±       1.35±

双汰芝                                       15.0±7.6             133±10.7

            4.86**     10.2       6.7**ΔΔ                                 0.93                1061**   0.33

            13.29±          64.8±           18.4±                                      8.59±        143.7±          1785±       1.27±

NCP组                                        16.7±7.8Δ

            5.69**     12.6       5.7*ΔΔ                                   1.22     14.8       354**    0.18

N＝10：NCP＝0.5mg/只，隔日1次共5次；^**P＜0.01，^*P＜0.05，与模型组相比；ΔΔP＜0.01，与正常组相比。

WBC：白细胞；N(％)：中性粒细胞；L(％)：淋巴细胞；M(％)：嗜酸、嗜碱及单核细胞

RBC：红细胞；Hb；血红蛋白；PLT：血小板

结论：

NCP试验结果，表明NCP具有明显的抗小鼠逆转录白血病病毒作用，显示具一定的抗AIDS作用。