多肽、其与阿霉素的结合物和基于结合物的药物组合物

摘要

本发明多肽是与从21到31氨基酸的表皮生长因子片段相似的片段，并且，作为直接提供抗癌剂至癌细胞的载体，能有效地与表皮生长因子受体结合。所述多肽的发明性结合物包含阿霉素并对肿瘤有选择性的作用，并能有效地减少肿瘤细胞对抗肿瘤药的抗药性。上述药物的结合物是在对酸水解不稳定的化学键的帮助下产生结合的。本发明的药物组合物含有有效量的结合物和一个适合于静脉注射的载体。本发明可用作治疗癌症病人的药物。

说明书

技术领域

本发明涉及天然化合物的化学、药理学和药物，并可用于治疗癌症病人的药物。

背景技术

癌细胞的先天和后天的抗药性以及抗癌剂的低选择性是限制抗癌化疗效果的主要因素。这些抗癌)的选择生可以通过以各种蛋白作为携带载体使它们对癌细胞的直接的靶向性投放来增加。这样，药物可通过一个结合物的受体介导的细胞内机制透过靶细胞，而该结合物内有一个载体蛋白与药物共价结合。上述结合物的选择性既可以通过癌细胞膜上存在的可被载体蛋白或抗体认识的特殊受体，也可由癌细胞膜上具有比正常细胞更高水平的载体蛋白的受体来获得。推测表皮生长因子(EGF)作为载体分子的效应来自于它的高稳定性、作为再结合蛋白的高利用度以及癌细胞膜上具有较健康细胞更高水平的表皮生长因子的受体。

已知许多研究和专利都描述了不同的表皮生长因子(EGF)与阿霉素(DR)和其它抗癌药结合的结合物以及在此基础上，它们的生产方法和药物组合物(美国专利号：5824805、5349066、5087616、5393737、5505931、5622929、5122368、5776458等)。

阿霉素是一种抗癌的抗生素类药物，虽然它被广泛用于临床实践，但却有许多实际缺点，如，高心脏毒性及其因反复静脉注射引起而快速形成的癌细胞的抗药性。而阿霉素用于一种结合物中可带来其治疗质量的极大改善。

短链表皮生长因子的肽类片段作为靶向投放阿霉素和其它抗癌药至癌细胞的载体分子，具有特殊的好处。因为它们的生产方法相对简单、经济而且不需任何生物源性的起始物，它们的结合物也更易标准化。

已知带有不同的表皮生长因子肽类片段的阿霉素(DR)(和其它抗癌药)的混合物(药物组合物)被用于癌症的化疗(美国专利号4863902)。作者解释由于癌细胞对阿霉素有更高的敏感性，而增加的专利药的抗癌效果是归咎于表皮生长因子及其活性片段产生的增殖方面的影响。然而，由于结合物中的阿霉素和表皮生长因子及其片段的连接是非共价性的，对靶细胞的靶向投放就不能确定，从而增加了药物的非特异性毒性。

同样，已知用于癌症治疗的是一个生物活性的环状多肽，该多肽具有与表皮生长因子32到48氨基酸片段相似的氨基酸序列(美国专利号5183805)。该专利说明此多肽片段可与阿霉素等化学剂结合，但在该专利中该结合物及其生产方法以及其生物学质量均未言及。

也已知一个多肽是一个表皮生长因子从21到31氨基酸的片段并具有如下的化学式：

H₂N-MYIEALDKYAC-COOH                 (I)，

(它)能够有效地与表皮生长因子受体结合和引起细胞增殖，其与阿霉素的结合物里面阿霉素与多肽的比例是1比1，并且，该结合部分与一个由用戊二醛作为交叉连接剂产生的、对酸不稳定的偶氮甲碱的联接联在一起(俄国肿瘤杂志，2001年第3期第33至37页：经蛋白载体对癌细胞的靶向投放引起的阿霉素抗癌活性的增加)。作为药物组合物，任何含有有效浓度的阿霉素-表皮生长因子和适于静脉给药的药学载体的成分都记载于号码为5349066，5087616，5122368的美国专利中。

发明内容

本发明的目的是为了达到所述目标拓宽所述药物的选择范围，和增加其效应。

该目的由提供一个新合成的、与表皮生长因子21到31氨基酸片段相似的多肽来实现。其能有效与表皮生长因子的受体结合，该多肽可引起细胞增殖并有靶向投放抗癌药至癌细胞的载体作用。此多肽的化学式如下：

H₂N-MYIEALDSYAC-COOH        (II)

与化学式(I)的多肽不同，(本发明)提出的多肽将人表皮生长因子受体结合片段的活性中心的丝氨酸(Ser)代替赖氨酸(Lys)，该丝氨酸是形成鼠科动物表皮生长因子结合部位的氨基酸之一。(我们)偶然发现以丝氨酸代替赖氨酸排除了受体结合片段的活性中心中不想要的赖氨酸ε-氨基团的结合，由此防止了对(本发明)提出的多肽结合到表皮生长因子受体的抑制作用。

虽然本发明提供的多肽的效应体现在和已知抗生素类阿霉素的结合物中，其它的具有抗癌作用的抗生素如长春新碱，顺铂，柔毛霉素，甲氨蝶呤以及其它抗癌剂，如毒素(如白喉毒素或蓖麻毒素)、环磷酰胺和其它制剂等均可应用。

本发明也提供了一个上述多肽与阿霉素的结合物，其中阿霉素通过一个对酸不稳定的偶氮甲碱与多肽联在一起，并且将多肽MYIEALDSYAC作为其中的多肽。该结合物选择性地作用于肿瘤并可充分地减少癌细胞对抗癌药的抗药性。

戊二醛或任何具有双功能基的试剂可作为交叉联接剂用来在氨基团处联接多肽和阿霉素。由此可得到一个带有对酸不稳定的联结的结合物。

本发明也提供了一个药物组合物，它具有细胞毒活性并且含有在有效浓度(0.05-0.1％)下带有阿霉素的表皮生长因子的受体结合片段和适于静脉注射载体的本发明提出的结合物。

一种生理盐溶液、磷酸盐盐溶液或镇痛剂均可用作该载体。该成分可另外含有微生物杀灭剂、抗病毒和抗寄生虫药物以及其它用于治疗癌症病人的药物，其含量不超过药物组合物总重量的50％。

附图说明

图1的数据比较了本发明提出的多肽与已知多肽(I)对鼠科动物关节间纤维软骨NIH3T3细胞系的增殖作用。

图2的数据显示在鼠科动物移植肿瘤的模型上含有阿霉素的药物组合物延缓肿瘤的发生和生长。

具体实施方式

以下举例说明本发明并证明应用本发明提出的表皮生长因子的受体结合片段、结合物以及基于结合物的药物组合物达到所述目的的可行性。

实施例1.多肽的制备

采用合成的Fmoc策略，以固体肽类化学的方法获得该多肽。选择洗脱树脂作为多聚体载体。用HOBt和N，N-二异丙基羰二酰胺，通过在每一步肽浓缩时转换到羟苯三唑乙酯，来激活Fmoc氨基酸的羧基团。所用HOBt和N，N-二异丙基羰二酰胺须超过该多聚体的氨基团摩尔数的10倍。化学反应过程由加入到反应物中的溴酚蓝溶液的变色来控制，溴酚蓝以相对于氨基团的比例为1/1000(摩尔)的浓度溶于二甲基亚砜(DMSO)中。反应持续1.5-2小时。浓缩完成后，树脂用二甲基甲酰胺洗4遍。然后，用溶于二甲基甲酰胺(DMF)中浓度为50％的哌啶处理。用三氟乙酸-95％、水-2.5％和1，2-乙二硫醇-2.5％的混合液将多肽从多聚体载体中移出。树脂滤出后，该多肽用乙醚从溶液中沉淀出来。将沉淀物离心分离，真空干燥，再在Phenomenex Luna C18 250*3柱上进行反相高压相液相(HPLC)层析。多肽从柱上的梯度洗提是在下列溶剂系统中进行的：乙腈-0.1％三氟醋酸/水。在相同条件下，在一个Nucleosil C18 250*8柱上进行半合成反相高压液相(HPLC)层析。采用层析法获得的多肽纯度大于96％。

所得多肽用质谱方法进行特征分析(分子离子-1265)。表1中给出了该多肽的结构。

            表1.已知和本发明提出的多肽的结构

原型多肽(表皮生长因子片段)的氨基酸序列：

(本发明)提出的多肽的氨基酸序列：

NH₂-蛋-酪-异亮-谷-丙-亮-天冬-丝-酪-丙-半胱-COOH

NH-Met-Tyr-Ile-3lu-Ala-Leu-Asp-Ser-Tyr-Ala-Cys-COOH

实施例2  多肽与阿霉素的结合物的制备

溶于5ml浓度为0.05M、pH值为7的磷酸缓冲液中(浓度为1mg/ml)的多肽与先溶于pH值为5.5的蒸馏水的阿霉素(浓度为1.2mg/ml)加在一起。采用方案1进行合成：

方案1

＝POLYPEPTIDE-N＝＝C-CH₂-CH₂-CH₂-C＝＝N-DR

将在pH值为7.2、浓度为0.05M磷酸缓冲液中的戊二醛一滴一滴地加入反应混合物中。共加入3ml。然后，将反应混合物在50℃下保持1小时。用PD-10 Sephadex G-25(瑞典Pharmacia公司产)柱将所得结合物从原始反应物中分离出来。在Nucleosil C 18250*4.6柱上将此结合物进行反相高压液相层析。再用含有乙腈-0.1％三氟醋酸/水的溶剂系统将多肽从柱上梯度洗提出来。

结合物中多肽的浓度用分光光度分析法(波长＝280nm)来测定。结合物中阿霉素的浓度则用波长为495nm的分光光度分析法测定。多肽/阿霉素的摩尔比例为1比1。

综合上述，本发明开发了一种以戊二醛为交叉连接剂，将(本发明)提出的多肽与阿霉素化学结合的方法。获得和特征化了一种多肽与阿霉素的结合物，其中多肽与阿霉素的比例为1比1。

实施例3.展示多肽的生物活性

在鼠科动物关节间纤维软骨NIH3T3细胞系上测定多肽的增殖活性。以结合于可酸溶的细胞碎片中氚标的替米啶(³H-timidine)的量来判断DNA生物合成率。鼠科动物关节间纤维软骨NIH3T3细胞系在37℃、含有5％的二氧化碳的湿环境下、于含有RPMI媒介(Sigma公司生产)塑料瓶中培养。该媒介含有10％的小牛血清(Sigma产)、100U/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素。同步的关节间纤维软骨NIH3T3细胞系的增殖由加入不同浓度(0.1-1000ng/ml)的本发明提出的多肽于细胞悬液中来诱导。将纤维软骨细胞置于96坑的培养板中进行培养，每一个坑中含有200微升培养基和200-800个细胞。于培养结束前2小时加入氚标的替米啶(³H-timidine)(1微居里/坑，40微居里/mol)。采用甲苯类闪烁液ZhS-8和闪烁计数器测定放射活性。DNA生物合成率表示为刺激指数(刺激细胞/对照细胞的比率)，该指数由下式计算：

I＝N/No×100％

其中，I为刺激指数；N为受表皮细胞生长因子(EGF)刺激的细胞的数量；No为对照细胞的数量。

图1的数据比较了本发明提出的多肽与已知多肽I(表皮细胞生长因子片段)对鼠科动物关节间纤维软骨NIH3T3细胞系的增殖作用。数据显示本发明提出的多肽比已知多肽对该细胞系有更明显的剂量依赖的增殖作用，这也许表明本发明提出的多肽对相关受体有更高的亲和力。由于癌细胞膜上表皮生长因子受体的表达比未变形细胞高出几个数量级，上述发现支持用本发明提出的多肽作为更有效的载体分子来靶向投放抗癌药至癌细胞的可能性。

实施例4 以存活率评价本发明提出多肽-阿霉素结合物对不同癌细胞系的效力

在下列细胞系上研究了结合物的效力：人类乳腺癌细胞系MCF-7^wt、抗人类乳腺癌细胞系MCF-7^AdrR、人类卵巢癌细胞系SKOV3和抗人类卵巢癌细胞系SKVLB以及鼠科黑素瘤细胞系B16。

所有测试的研究方案都是一样的。将于37℃、5％的二氧化碳的湿环境下、在含有RPMI媒介(Sigma公司生产，含有10％的小牛血清(Sigma产)、100U/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素)的塑料瓶(Costar产)中培养的细胞接种于96坑的培养板(Costar产)内，每一个坑中接种10000个细胞。然后加入不同浓度的要研究的药物。孵育细胞72小时。于孵育结束前2到4小时在每个坑中加入50微升(1mg/ml)的MTT溶液(溴化3-[4，5-二甲基噻唑-2基]-2，5-联苯四唑，Sigm产)于培养基中。着色后移去培养基，将甲晶体溶于150微升的二甲亚砜中，然后在540nm波长下用分光光度分析法测定其吸光率(度)。以对照细胞为100％，以非结合和结合的阿霉素处理的细胞存活相对于对照细胞存活的百分率来测定其存活率。

表2给出了用非结合和与本发明提出的多肽或表皮生长因子结合的阿霉素处理的细胞的存活率。

表2.非结合或结合阿霉素处理细胞的存活率

                                   细胞毒性(IC₅₀)  细胞系  阿霉素   表皮生长因子-阿霉素结合物   多肽-阿霉素结合物  MCF-7^wt  58.6nM   2.5nM   1.3nM  MCF-7^AdrR  3.7μM   0.3μM   0.15μM  SKOV3  209nM   35nM   22nM  SKVLB^AdrR  2.01μM   0.2μM   0.07μM  B16  35nM   1.5nM   1.1nM

上述数据说明本发明提出的多肽与阿霉素的结合物对对阿霉素敏感的人类癌细胞系MCF-7^wt和SKOV3、鼠类黑色素瘤细胞系B16具有比非结合的阿霉素或其与表皮生长因子片段(原型)的结合物更明显的毒性。本发明提出的多肽与阿霉素的结合物也显示了一个对细胞系MCF-7^AdrR和对蒽环类药抗生素具有抗药性的细胞系SKVLB的较高的细胞毒活性。

综合上述，一种抗癌药(阿霉素)与本发明提出的多肽的结合显示了对癌细胞的明显的毒性，无论该癌细胞是对阿霉素敏感还是有抗阿霉素特性。事实证明本发明提出的多肽在离体实验中作为引导抗癌药靶向投放的载体分子的效力。

实施例5注射用药物组合物由溶解结合物于生理盐溶液或pH值约为7.4的磷酸盐溶液中获得。结合物在上述溶液中的浓度为0.05-0.1％。

实施例6在鼠科移植瘤模型中带有生理溶液(如实施例5中所述)的多肽-阿霉素结合物成分显示的细胞毒活性

为了显示多肽-阿霉素结合物对固体瘤的细胞毒活性，将实施例5中的药物组合物静脉注射到皮下移植了B16系癌细胞的小鼠体内。所得结果见附图1和附图2。所给药物的剂量是每公斤体重0.2mg阿霉素，每4天一次。从癌细胞移植后3天开始给药，一共给3次。

由附图1可见，不象非结合阿霉素，其结合物相当程度地延迟了肿瘤的发生并减慢了其生长。对肿瘤生长的抑制率为58％。

如表3所示，从实验室动物平均存活时间(ADL)的增加可以看到(本发明)提

出的结合物当静脉给药时具有治疗作用。与非结合的阿霉素不同，给其结合物

使平均存活时间(ADL)增加了46％。

表3.静脉给含有阿霉素的药物组合物引起的动物平均存活时间的增加

动物分组  平均存活时间(天)  平均存活时间的增加(％)对照  31.4±4.8  -阿霉素  23.6±4.0  -24.8结合物  46.6±5.7  48.5

平均存活时间的增加和更高的肿瘤生长抑制率显示了在体外实验中本发明提出的药物组合物中抗癌剂靶向投放的治疗效应。

实施例4和实施例6显示本发明提出的多肽与一种蒽环类抗生素阿霉素的结合物(多肽-阿霉素)当静脉给药时对固体瘤具有治疗作用。