一组抗丙型肝炎病毒感染及防治丙型肝炎的核苷酸序列、其片段及其应用

摘要

本发明公开了一种抗丙型肝炎病毒感染及防治丙型肝炎的RNA序列及其片段，该序列及其片段为序列表中SEQ ID NO：1－SEQ ID NO：6所述的单链RNA序列及其片段、或该单链RNA序列及其片段与其互补序列及其片段杂交形成的双链RNA序列。本发明的优点是：通过同源比较，获得一系列与所有已经发表的HCV序列高度同源的RNA序列片段，使用该系列片段衍生的双链RNA序列可以有效地抑制HCV基因的表达；使用质粒转录的该系列RNA也可在细胞内抑制HCV基因的表达；携带该片段对应DNA的腺病毒伴随病毒感染细胞后可以转录出对应的双链RNA并抑制HCV基因的表达。

说明书

技术领域

本发明涉及一组抗丙型肝炎病毒(HCV)感染及防治丙型肝炎的核苷酸序列、其片段及其应用，属于病毒基因工程领域。

背景技术

近两年的研究结果证实短的双链RNA在多种哺乳动物细胞中具有干扰RNA功能，可以特异抑制特定基因在细胞内的表达。通过该途径也可抑制病毒(包括HCV病毒)基因在细胞内的表达。但是由于HCV病毒具有极大的变异性，目前所使用的序列均只与少数HCV株序列同源，因此不能作为普遍有效的基因治疗药物使用。

发明内容

本发明的目的是提供一组抗HCV感染及防治丙型肝炎的核苷酸序列。

本发明的另一个目的是提供上述核苷酸序列的应用。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一组抗丙型肝炎病毒感染及防治丙型肝炎的RNA序列及其片段，该序列及其片段为序列表中SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：6所述的单链RNA序列及其片段、或该单链RNA序列及其片段与其互补序列及其片段杂交形成的双链RNA序列。本发明通过同源比较，获得一系列在所有已发表丙型肝炎病毒株间特别保守的核酸序列，该RNA序列导入细胞后，可以导致特异mRNA降解，从而降低HCV基因表达并导致基因组降解。使用该序列研制的治疗药物可以避免因病毒基因突变带来的抗药性问题。

该单链RNA序列如下：

1)CCCCCCCUCCCGGGAGAGCCAUAGU；

2)CGGAACCGGUGAGUACACCG；

3)GCGAAAGGCCUUGUGGUACUGCCUGAUAGG；

4)GCUUGCGAGUGCCCCGGGAGGUCUCGUAGACCGUG；

5)UGGGUAARGUCAUCGAYACCCU；

其中R为G或A，Y为U或C；

6)AUGGCWUGGGAYAUGAUGAUGAAYUGGU

其中W为U或A，Y为U或C。

片段是指所述序列的不小于19bp的任何部分。

所述RNA序列及其片段在其5’端或3’端加有核苷酸修饰。常见的修饰如在合成RNA的3端加UU，以利于正确配对。

一组抗丙型肝炎病毒感染及防治丙型肝炎的RNA序列，该序列为序列表中SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：6所述的单链RNA序列及其片段和与之互补的RNA序列及其片段形成的互补双链、或为序列表中SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：6所述的单链RNA序列及其片段和与之互补的RNA序列及其片段加上中间非互补连接序列形成的发夹样RNA序列。发夹样双链具有干扰RNA的相同活性，由于是一条RNA链配对而成，因此尤其适用于细胞内表达干扰RNA。

一组抗丙型肝炎病毒感染及防治丙型肝炎的DNA序列及其片段：

1)该DNA序列及其片段与序列表中SEQ ID NO：1-6所述的单链RNA序列及其片段、或该单链RNA序列及其片段与其互补序列及其片段形成的双链RNA序列对应；或

2)该DNA序列及其片段与1)所述RNA序列及其片段在其5’端或3’端加有核苷酸修饰的序列对应；或

3)该DNA序列及其片段与序列表中SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：6所述的单链RNA序列及其片段和与之互补的RNA序列及其片段形成的杂交双链RNA序列、或序列表中SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：6所述的单链RNA序列及其片段和与之互补的RNA序列及其片段加上中间非互补连接序列形成的发夹样RNA序列对应。

一种抗丙型肝炎病毒感染及防治丙型肝炎的表达载体，该载体整合有以上所述的RNA或DNA序列及其片段。这些序列及其片段构建到合适的表达载体中、加入合适的调控序列并导入细胞后可表达干扰RNA。表达载体包括RNA表达载体和DNA表达载体。RNA表达载体如逆转录病毒载体，DNA表达载体是指携带有所述DNA序列和其他表达调控序列的质粒载体、病毒载体等，如腺病毒伴随病毒(AAV)。

一种抗丙型肝炎病毒感染及防治丙型肝炎的脂质体，该脂质体包裹有以上所述的RNA或DNA序列及其片段、或包裹有上述抗丙型肝炎病毒感染及防治丙型肝炎的表达载体。使用该类脂质体可以将干扰RNA或可表达干扰RNA的质粒载体导入细胞。

一种抗丙型肝炎病毒感染及防治丙型肝炎的方法，是将以上所述的RNA或DNA序列及其片段、或表达载体、或脂质体在体内或体外导入真核细胞系、动物细胞及人体。例如通过脂质体导入的方法、通过病毒载体导入的方法。

一种抗丙型肝炎病毒感染及防治丙型肝炎的核苷酸序列的应用，将以上所述的RNA或DNA序列及其片段、或表达载体、或脂质体、或方法应用于制备抗丙型肝炎病毒感染及防治丙型肝炎的诊断、治疗和预防的药物。

本发明的优点是：通过同源比较，获得一系列与所有已经发表的HCV序列高度同源的RNA序列片段，使用该系列片段衍生的双链RNA序列可以有效地抑制HCV基因的表达；使用质粒转录的该系列RNA也可在细胞内抑制HCV基因的表达；携带该片段对应DNA的腺病毒伴随病毒感染细胞后可以转录出对应的双链RNA并抑制HCV基因的表达。

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的说明。

附图说明

图1为报告质粒pHCV-GFP的构建图。

图2为表达内部双链RNA的质粒pH1-HCV-E1的构建图。

图3为质粒pAAV-HCVE1的构建图。

图4为通过荧光显微镜检测，表明RNAi可有效降低丙型肝炎病毒E蛋白的表达。

具体实施方式

实施例中采用的方法均为本领域常规操作，详见《分子克隆》第三版。

实施例1：极度保守HCV RNA序列的获得

选择已经发表的所有HCV全基因组序列，使用Clustal X 1.83版软件逐一进行比较，获得序列间同源性最高的序列。选择出符合以下条件的核苷酸序列：(1)该片段大于或等于19个核苷酸；(2)该片段在所比较的HCV序列中完全同源，或其中仅有1-2碱基有1种变异形式；所获得的序列见表1，其中3号片段与所发表所有的序列完全同源。

表1.通过同源比较发现的HCV序列中极度保守的RNA序列

  编号    HCV基因 RNA序列    1    UTR CCCCCCCUCCCGGGAGAGCCAUAGU    2    UTR CGGAACCGGUGAGUACACCG    3    UTR GCGAAAGGCCUUGUGGUACUGCCUGAUAGG    4    UTR GCUUGCGAGUGCCCCGGGAGGUCUCGUAGACCGUG    5    C UGGGUAARGUCAUCGAYACCCU； 其中R为G或A，Y为U或C    6    E1 AUGGCWUGGGAYAUGAUGAUGAAYUGGU 其中W为U或A，Y为U或C

实施例2.使用合成E基因对应的RNA双链，降低HCV多聚蛋白的表达

HCV系单链RNA病毒，其基因组在9000个核苷酸左右，仅编码一个多聚前体蛋白，该蛋白经蛋白酶裂解，形成HCV的结构蛋白和非结构蛋白。因此只要mRNA发生降解，所有的结构蛋白和非结构蛋白的表达水平均会降低。为了克隆方便，我们构建了含HCV N端基因(5’UTR、c基因、E基因)与GFP基因的融合基因，可在细胞中表达HCV基因绿色荧光蛋白的融合蛋白，用作本发明研究的报告质粒，构建方法如下：

1.引物设计：根据HCV(NC_004102)基因序列，设计了两组引物，第一组引物扩增HCV 5’端的的结构基因和非结构基因，第二组引物用于扩增HCV3’端的非结构区基因。

HCV5A：GCGACACTCCACCATAGATCAC

HCV5B：TGGGATATGATGATGAACTGGT

取丙肝病人血清5ml，用QIAgen公司RNA抽提试剂盒抽提RNA(见试剂盒说明书)，加入HCV5B引物各100ng，用Promega Sensiscript反转录试剂盒进行反转录，取反转录产物各5μl，加入引物HCV5A 100ng，使用Roche公司Expand长片段PCR试剂盒在PE公司9700型PCR仪上进行PCR扩增(扩增条件：94℃40s，50℃ 40s，72℃ 2min)，扩增35循环后72℃保温20分钟，加入Taq酶(2.5单位，QIAGEN公司产品)继续保温30分钟。扩增产物经电泳表明获得了1.2kbDNA片断。用QIAGEN公司的核酸纯化试剂盒纯化后备用。

取100ng Invitrogen公司的pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO载体，加入上述片段200ng，在TOPO试剂盒(Invitrogen公司)提供的反应体系中反应5分，取5μl反应产物，加至50μl One Shot TOP10大肠杆菌感受态细胞中，冰浴30分钟，42℃激活45秒，加入1ml SOC培养基，37℃ 250rpm培养45分钟后涂氨苄青霉素抗性平板，获得转化子后抽提质粒(QIAGEN试剂盒)，酶切鉴定并经DNA序列分析正确，获得报告质粒pHCV-GFP。使用QIAGEN公司的MAXIPrep质粒抽提试剂盒抽提足量质粒备用(图1)。

根据上述HCV E基因的保守序列(表1中6号序列)19核苷酸的RNA片段根据互补原则合成该链的互补RNA链，在RNA链3’端加UU修饰：

5’ggauaugaugaugaacugguu

3’uuccuauacuacuacuugacc

上述合成的RNA链各1μg，加1μl退火缓冲液(10mmol/LTrisHCl(PH7.4)，100mmol/L NaCl)，加不含RNase的去离子水至总体积10μl。90℃加热5分后25℃保温1h，取2μg退火后的RNA双链、经4IU单链RNA特异的RNase及DNase I37℃消化30分钟后，用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴别双链RNA的形成情况。结果发现，20bp处有一单一的RNA条带出现。说明合成的两条互补RNA单链已杂交成RNA双链。

分别取两支试管，每支管中均加入1.5ml无抗生素的DMEM培养基，2μg质粒pHCV-GFP，然后分别加入2μg合成的双链RNA以及2μg合成的单链RNA为对照，然后各加入1.5ml无抗生素DMEM稀释的适量Oligofectamine转染试剂(Invitrogen公司产品)，轻微混匀后室温中放置20分钟。将转染液加入到培养至80％密度的HEK293细胞中，转染细胞6小时。弃去转染液，加入含10％FCS的DMEM培养液，继续培养72小时。在荧光显微镜下观察GFP的表达量。

结果：如图4所示，与对照比较，E基因特异的双链RNA使融合蛋白的总GFP的表达产量显著降低；重复该实验两次，结果均一致。

实施例3.使用合成c基因对应的RNA双链，降低报告质粒中融合蛋白的表达。

根据上述HCV c基因的保守序列(表1中5号序列)19核苷酸的RNA片断，并根据互补原则合成该链的互补RNA链，在RNA链3’端加UU修饰：

5’uggguaaggucaucgauacuu

3’uuacccauuccaguagcuaug

上述合成的RNA链各1μg，如实施例2退火，转染293细胞，培养72小时。在荧光显微镜下观察GFP的表达量。

结果：与对照比较，E基因特异的双链RNA使融合蛋白的总GFP的表达产量显著降低；重复该实验两次，结果均一致。

实施例4.使用合成UTR对应的RNA双链，降低报告质粒中融合蛋白的表达。

由于UTR对应的干扰RNA可导致病毒基因组RNA和mRNA的降解，从而具有抗病毒作用。再如实施例2的系统中，可以导致其下游的融合基因的表达量降低，从而验证针对非翻译区的干扰RNA的效果。

根据上述HCV c基因的保守序列(表1中4号序列)19核苷酸的RNA片断，并根据互补原则合成该链的互补RNA链，在RNA链3’端加UU修饰：

5’ggaggucucguagaccguguu

3’uuccuccagagcaucuggcac

上述合成的RNA链各1μg，如实施例2退火，转染293细胞，培养72小时。在荧光显微镜下观察GFP的表达量。

结果：与对照比较，E基因特异的双链RNA使融合蛋白的总GFP的表达产量显著降低；重复该实验两次，结果均一致。

实施例5、合成含有E基因保守序列对应的DNA片段及其杂交序列，克隆至真核表达载体，在细胞内表达干扰RNA，抑制HCV膜蛋白的表达

合成含有E基因保守序列(表1中6号序列)对应的DNA片段及其杂交序列(黑斜体)的DNA片断，退火后形成DNA片段，5’端为BamHI位点的末端，3’端为HindIII位点的末端，在同源序列及其互补序列中间含有间隔序列。B为A的互补序列：

A：5’gatccccggatatgatgatgaactggttcaagagaccagttcatcatcatatcctttttggaaa

B：5’agcttttccaaaaaggatatgatgatgaactggtctcttgaaccagttcatcatcatatccggg

如图2所示，通过PCR(以人基因组DNA 1μg为模板，引物15’-TAATTAATGCGGCCGCAATTCGAACGCTGACGTC-3’，引物25’-GCACTAGTAAGCTTGGATCCGTGGTCTCATACAGAACTTATAAGATTCCC-3’，扩增条件同实施例2)获得人H1 RNA基因的启动子区，质粒pEGFPCI(Clontech)用AseI和XbaI酶切后回收大片段作为载体，上述扩增片段用AseI和SpeI酶切后回收，与载体连接，转化大肠杆菌后获得质粒pH1。将上述合成的DNA片段(A，B)退火后克隆至pH1质粒的BamHI和HindIII位点，构建质粒pH1-HCVE1。该质粒在细胞中，在RNA聚合酶III的作用下，表达发夹状RNA，形成RNA双链。

用4μg pH1-HCVE1质粒(使用同量pHI质粒作为对照)与表达GFP-HCV 5’融合蛋白的质粒共转染HEK293细胞，通过如实施例2所述方法比较融合蛋白的表达产量的差异，结果表明GFP-HCV融合蛋白的表达产量有显著降低；该结果说明使用质粒载体携带编码上述RNA的DNA序列可以有效抑制HCV靶基因的表达。

实施例6.使用腺病毒伴随病毒载体，携带如实施例3中所述的H1启动子及编码发夹状双链RNA的DNA片段，重组病毒感染细胞后抑制HCV E基因的表达。

如图3所示，质粒pAAV-MCS(购于Stratagene)用NotI和HindIII酶切；含H1启动子和编码HCV E1的发夹状RNA的DNA片段从质粒pH1-HCVE1中用NotI和HindII酶切获得，并克隆至pAAV-MCS的相应位点.构建质粒pAAV-HCVE1，将该质粒(4μg)(对照病毒载体用pAAV-MCS)与辅助质粒pHelper(1μg，Stratagene)和质粒pAAV-RC(2μg Stratagene)一起用LIPOFECTamine法共转染HEK 293FT细胞，48小时后取上清制备“重组AAV病毒”及对照病毒；将pHCV-GFP(1μg)的质粒转染HEK293细胞，然后加入上述含重组病毒的制备上清，24小时后用荧光显微镜分析细胞内GFP发光强度。

结果如图4所示，表明携带可转录HCV HCVE1发夹样双链RNA的重组AAV病毒可使GFP-HCV-5融合蛋白表达水平显著降低。

                       序列表

<110>北京三诺佳邑生物技术有限责任公司

<120>一组抗丙型肝炎病毒感染及防治丙型肝炎的核苷酸序列、其片段及其应用

<130>

<160>6

<170>Patent In version 3.1

<210>1

<211>25

<212>RNA

<213>丙型肝炎病毒属(virus hepatitis C)

<400>1

cccccccucc cgggagagcc auagu    25

<210>2

<211>20

<212>RNA

<213>丙型肝炎病毒属(virus hepatitis C)

<400>2

cggaaccggu gaguacaccg    20

<210>3

<211>30

<212>RNA

<213>丙型肝炎病毒属(virus hepatitis C)

<400>3

gcgaaaggcc uugugguacu gccugauagg  30

<210>4

<211>35

<212>RNA

<213>丙型肝炎病毒属(virus hepatitis C)

<400>4

gcuugcgagu gccccgggag gucucguaga ccgug  35

<210>5

<211>22

<212>RNA

<213>丙型肝炎病毒属(virus hepatitis C)

<220>

<221>misc_RNA

<222>(8)

<223>R＝G或A

<220>

<221>misc_RNA

<222>(17)

<223>Y＝U或C

<400>5

uggguaargu caucgayacc cu  22

<210>6

<211>28

<212>RNA

<213>丙型肝炎病毒属(virus hepatitis C)

<220>

<221>misc_RNA

<222>(6)

<223>W＝U或A

<220>

<221>misc_RNA

<222>(12，24)

<223>Y＝U或C

<400>6

auggcwuggg ayaugaugau gaayuggu    28