巨大芽孢杆菌内切葡聚糖酶的基因及其制备方法

摘要

巨大芽孢杆菌内切葡聚糖酶的基因及其制备方法，属于生物技术领域。在小麦根部土壤中筛选获得巨大芽孢杆菌Ap25，菌种保藏号是：CGMCC No.1213，经检测具有内切葡聚糖酶活性。利用SDS、蛋白酶K、CTAB/NaCl方法提取巨大芽孢杆菌基因组DNA，用Sau3A进行部分酶切，酶切后的基因片段同已线性化质粒pBluescriptII连接，转化大肠杆菌DH5α，通过内切葡聚糖酶酶活性检测，筛选阳性克隆子共74株，提取酶活性表达较好的转化子中的重组质粒，获得了内切葡聚糖酶编码基因片段共941bp。本发明基因片段沿着多糖链可以随意水解β－键，释放出寡糖，降解病原真菌的细胞壁，抑制真菌生长，达到生防效果。

说明书

技术领域：

本发明涉及巨大芽孢杆菌内切葡聚糖酶的基因及其制备方法，属于生物技术领域。

背景技术：

葡聚糖酶是一种可将葡聚糖降解为葡萄糖的一类水解酶。根据葡聚糖酶作用于糖苷键位点的不同，可分为β-1，2-、β-1，3-、β-1，4-、β-1，6-葡聚糖酶。葡聚糖酶切点位置的不同，又可分为内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶，外切葡聚糖酶主要是水解非还原端断裂的葡聚糖残基，内切葡聚糖酶沿着多糖链可以随意水解β-键，释放出寡糖，真菌中β-葡聚糖的降解通常是内切和外切葡聚糖酶共同作用的结果。事实上，在许多微生物中发现多种葡聚糖酶的存在，葡聚糖的水解是内切葡聚糖酶(EC3.2.1.39)和外切葡聚糖酶(EC3.2.1.58)共同作用的结果。

许多种葡聚糖酶的编码基因及一级结构已被详细的研究，尤其是微生物方面的研究。马丁，β-葡聚糖酶在芽孢杆菌属的分布，应用与环境微生物学，1988年4月，(D.F.Martin Distribution of β-glucanases within the genus Bacillus.Appliedand Environmental Microbiology，Apr.1998，)分析了β-葡聚糖酶在Bacillus中的分布，已从B.circulans WL-12、B.subtilis、B.polymyx及一嗜碱性分离株中分离到了β-葡聚糖酶，这些酶在生态学上具有重要的意义，它们可以作为探针来分析酵母细胞壁的结构及为酵母原生质作准备，而且，微生物β-葡聚糖酶在真菌生物防治和啤酒生产上具有重要的商业价值。北京农业大学的毛世宏提取B.circulans的染色体DNA，选用EcoRI进行部分酶切，获得的片段与载体pUC19相连，转化大肠杆菌，获得两株阳性克隆子。特伯奈若，嗜碱性芽孢杆菌中内切-β-1，3-1，4-葡聚糖酶bgaA的克隆及序列分析，应用与环境微生物学，1994年4月(C.Tabernero Cloning and DNA sequencing of bgaA，agene encoding an endo-beta-1，3-1，4-glucanase，from an alkalophilic Bacillusstrain(N137).Applied and Environmental Microbiology，Apr.1994)从一嗜碱性Bacillus(N137)中克隆了内切-β-1，3-1，4-葡聚糖酶的基因bagA，该片段含有自身的启动子，大肠杆菌可以识别其启动子，使之能有效的表达酶活性。含bagA的1416bpDNA片段的核苷酸序列编码828个氨基酸的开放阅读框架，具有31个氨基酸的信号肽；BagA蛋白主要处于细胞周质部位，其适宜的pH在6-12，适宜温度为60-70℃，70℃保温一小时，仍具有60％的酶活性，并且C-端具有一个富含Lys区域。马凯，枯草芽孢杆菌内切-β-1，4-葡聚糖酶基因的结构研究，核苷酸研究，1986年11月(RM.Mackay Structureof a Bacillus subtilis endo-beta-1，4-glucanase gene Nucleic Acids Research，November 1986)从B.subtilis(AP115)中分离到了含有内切-β-1，4-葡聚糖酶基因的3kb大小的PstI片段，并进行测序。该基因编码的蛋白含有499个氨基酸残基(Mr＝55,234)，并具有典型的B.subtilis的信号肽。转基因后的大肠杆菌产生的胞外内切葡聚糖酶具有一个大约30个氨基酸的N-端，同时该基因隐藏的阅读框架中具有不依赖于ρ-因子的终止结构，测得的氨基酸序列同已知的Clostridium thermocellum的celB基因编码的蛋白的氨基酸序列比较，二者仅有一小部分具有相似性，但这一小部分可能包含有底物结合和/或催化位点。杨智源，短小芽孢杆菌葡聚糖酶内切酶基因的克隆及序列测定，微生物学报，2001年，曾从短小芽孢杆菌S-27中分离了葡聚糖内切酶，对该酶的研究显示其作用最适温度为55℃，最适pH为5-7，在pH9的条件下仍具有79.0％的活力。对于葡聚糖酶的应用方面曾有报道，水解β-D-葡糖苷的内切-β-葡聚糖酶可以作为报告基因使用。

作为植物葡聚糖酶的研究，目前至少已报道了9种植物的26种β-1，3-葡聚糖酶的氨基酸顺序和cDNA，并从cDNA或基因组DNA克隆推导出它们的基本结构。烟草中的葡聚糖酶研究的最多，根据其氨基酸顺序主要分为三种结构。第一类以GLA为代表的至少包括4个碱性异构体，氨基酸序列上存在1％差异，第二类包括6种异构体，4种为酸性的，主要是PR-2，PR-N，PR-O，GL153，GL161，Sp41a，第三类为酸性蛋白。关于基因克隆方面，目前已在3种植物上获得了7种β-1，3-葡聚糖酶基因，但对不同基因结构进行比较并明确编码其序列特殊特征的仅有少数。根据GenBank及各种生物学报刊上的查询结果，未发现有关巨大芽孢杆菌葡聚糖酶编码基因片段方面的报告。

发明内容：

本发明针对现有技术的不足，提供一种巨大芽孢杆菌内切葡聚糖酶的基因及其制备方法。

本发明在小麦根部土壤中获得一株巨大芽孢杆菌Ap25，菌种保藏号是：CGMCCNo.1213，经检测具有内切葡聚糖酶活性，含内切葡聚糖酶基因片段的保藏号是：CGMCC No.1214。

提取巨大芽孢杆菌的基因组DNA，利用Sau3A部分酶切基因组DNA，与经BamHI酶切后的pBluescriptII(缩写pBS)质粒连接，转化大肠杆菌DH5α，经酶活性检测筛选得到具有内切葡聚糖酶活性的转基因大肠杆菌DH5α共74株。载体质粒pBS与外源DNA片段的连接，通过大肠杆菌感受态细胞的制备和转化，将其中活性表达较好的菌株提取质粒并测序，测序结果显示该基因片段共941bp，含有一个具有348个核苷酸的开放阅读框架，起始密码子位于571bp，终止密码子位于919bp，共编码氨基酸116个。

本发明巨大芽孢杆菌内切葡聚糖酶编码基因片段序列如下：

ggctgcgcaa ctgttggaag ggcgatcggt gcgggcctct tcgctataac gcccagctgg     60

cgaaaggggg atgtgctgca aaggcgatta aagttgggta acgccagggt tttcccagtc    120

acgacgttgt aaaacgacgg cccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta taggcgaatt    180

gggtaccggg ccccccctcg aggtcgacgg tatcgataag cttgatatcg aattcctgca    240

gcccggggga tcagatatac gacgtttttc cctttagcgc cggcccgctc aaattcttca    300

cgtgtatcag aaagcgcttt cgctatcggt gtccagccgg ttggtttaat cttgctgagt    360

gattgctcaa atggagtcac ggcgtacggc tgaaggccgt ataacgtttc tgtcgcgtta    420

catgatacgg ctttgcctga gtttttatta ttgcccttat gcccgaatac ccgaagcatc    480

agattcgtgt cttcaggaag aacttccgca aaagaagtga cagactcttt cgcaacatct    540

attttacgct ctccccctgt tttttgtatc atgctcccgc ttgcgtcaaa cagcacggcg    600

acgtttgttt cttcgtgctt tttctcagct gcaaaaacag gtgatccgaa gctggctcgt    660

aagcatcagg ctgtccgtcc gcattccctc aataaagtat ctgccgattg aataccagat    720

ccactagttc tagagcggcc gccaccgcgg tggagctcca gcttttgtcc ctttagttga    780

gggttaattg cgcgcttggc gtaatcatgg tcatagctgt ttcctggtgt gaaatttggt    840

tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaacat aaagtggtaa agcctggggg    900

tggcctaatg agttgagcta actcacatta attgcgtttg c                        941

基因组DNA与氨基酸对应关系如下：

5′GGC TGC GCA ACT GTT GGA AGG GCG ATC GGT GCG GGC CTC TTC GCT ATA ACG CCC   54

    G   C   A   T   V   G   R   A   I   G   A   G   L   F   A   I   T   P

   AGC TGG CGA AAG GGG GAT GTG CTG CAA AGG CGA TTA AAG TTG GGT AAC GCC AGG  108

    S   W   R   K   G   D   V   L   Q   R   R   L   K   L   G   N   A   R

   GTT TTC CCA GTC ACG ACG TTG TAA AAC GAC GGC CCA GTG AGC GCG CGT AAT ACG  162

    V   F   P   V   T   T   L   *   N   D   G   P   V   S   A   R   N   T

   ACT CAC TAT AGG CGA ATT GGG TAC CGG GCC CCC CCT CGA GGT CGA CGG TAT CGA  216

    T   H   Y   R   R   I   G   Y   R   A   P   P   R   G   R   R   Y   R

   TAA GCT TGA TAT CGA ATT CCT GCA GCC CGG GGG ATC AGA TAT ACG ACG TTT TTC  270

    *   A   *   Y   R   I   P   A   A   R   G   I   R   Y   T   T   F   F

   CCT TTA GCG CCG GCC CGC TCA AAT TCT TCA CGT GTA TCA GAA AGC GCT TTC GCT  324

    P   L   A   P   A   R   S   N   S   S   R   V   S   E   S   A   F   A

   ATC GGT GTC CAG CCG GTT GGT TTA ATC TTG CTG AGT GAT TGC TCA AAT GGA GTC  378

    I   G   V   Q   P   V   G   L   I   L   L   S   D   C   S   N   G   V

   ACG GCG TAC GGC TGA AGG CCG TAT AAC GTT TCT GTC GCG TTA CAT GAT ACG GCT  432

    T   A   Y   G   *   R   P   Y   N   V   S   V   A   L   H   D   T   A

   TTG CCT GAG TTT TTA TTA TTG CCC TTA TGC CCG AAT ACC CGA AGC ATC AGA TTC  486

    L   P   E   F   L   L   L   P   L   C   P   N   T   R   S   I   R   F

   GTG TCT TCA GGA AGA ACT TCC GCA AAA GAA GTG ACA GAC TCT TTC GCA ACA TCT  540

    V   S   S   G   R   T   S   A   K   E   V   T   D   S   F   A   T   S

   ATT TTA CGC TCT CCC CCT GTT TTT TGT ATC ATG CTC CCG CTT GCG TCA AAC AGC  594

    I   L   R   S   P   P   V   F   C   I   M   L   P   L   A   S   N   S

   ACG GCG ACG TTT GTT TCT TCG TGC TTT TTC TCA GCT GCA AAA ACA GGT GAT CCG  648

    T   A   T   F   V   S   S   C   F   F   S   A   A   K   T   G   D   P

   AAG CTG GCT CGT AAG CAT CAG GCT GTC CGT CCG CAT TCC CTC AAT AAA GTA TCT  702

    K   L   A   R   K   H   Q   A   V   R   P   H   S   L   N   K   V   S

   GCC GAT TGA ATA CCA GAT CCA CTA GTT CTA GAG CGG CCG CCA CCG CGG TGG AGC  756

    A   D   *   I   P   D   P   L   V   L   E   R   P   P   P   R   W   S

   TCC AGC TTT TGT CCC TTT AGT TGA GGG TTA ATT GCG CGC TTG GCG TAA TCA TGG  810

    S   S   F   C   P   F   S   *   G   L   I   A   R   L   A   *   S   W

   TCA TAG CTG TTT CCT GGT GTG AAA TTT GGT TAT CCG CTC ACA ATT CCA CAC AAC  864

    S   *   L   F   P   G   V   K   F   G   Y   P   L   T   I   P   H   N

   ATA CGA GCC GGA ACA TAA AGT GGT AAA GCC TGG GGG TGG CCT AAT GAG TTG AGC  918

    I   R   A   G   T   *   S   G   K   A   W   G   W   P   N   E   L   S

   TAA CTC ACA TTA ATT GCG TTT GC 3′  941

    *   L   T   L   I   A   F

基因片段共941bp，含有一个具有348个核苷酸的开放阅读框架，起始密码子位于571bp，终止密码子位于919bp，共编码氨基酸116个。

本发明内切葡聚糖酶基因的克隆方法如下：

关于基因克隆方面主要是采取两种手段，一是根据同源序列设计PCR引物，通过PCR扩增获得基因片段；另一种方法是建立基因组文库，进行特异性筛选获得基因片段。本发明采用基因组文库方法，获得了巨大芽孢杆菌内切葡聚糖酶编码基因片段。

本发明基因克隆方法主要包括，首先利用SDS、蛋白酶K、CTAB/NaCl方法提取巨大芽孢杆菌基因组DNA，用Sau3A进行部分酶切，酶切后的基因片段同已线性化质粒pBluescriptII连接，转化大肠杆菌DH5α获得具有内切葡聚糖酶活性的转化子共74株，提取重组质粒，获得了内切葡聚糖酶编码基因片段。测序结果显示该基因片段共941bp，含有一个具有348个核苷酸的开放阅读框架，起始密码子位于571bp，终止密码子位于919bp，共编码氨基酸116个。

本发明基因片段的成功克隆及其基因序列测定弥补了巨大芽孢杆菌内切葡聚糖酶编码基因技术的空白，并为开发基因工程产品创造良好条件。克隆得到的该基因片段沿着多糖链可以随意水解β-键，释放出寡糖，降解病原真菌的细胞壁，抑制真菌生长，达到生防效果。

附图说明：

图1是Ap25染色体的部分酶切琼脂糖凝胶电泳，其中，M：标记(Mark)；列1：酶切1分钟；列2：酶切30秒；列3：酶切5秒；列4：Ap25染色体DNA。

图2是重组质粒pBSGlu的酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳，M：标记(Mark)；列1：XbaI酶切；列2：HandIII酶切；列3：EcoRV酶切。

图3是重组质粒pBSGlu的单、双酶切琼脂糖凝胶电泳，M：标记(Mark)；列1：SalI酶切；列2：EcoRI酶切；列3：双酶切。

图4是葡聚糖酶基因序列比较树，其中，

1：环状芽孢杆菌编码内切葡聚糖酶N257的egl257基因(B.circulans egl257 genefor endoglucanase-N257)；

2：解淀粉芽孢杆菌UMAS1002内切葡聚糖酶A编码基因(engA)(B.amyloliquefaciens strain UMAS 1002 endoglucanase A(engA))

3：芽孢杆菌菌株KSM-64内切-1，4-β-葡聚糖酶基因(B.sp.KSM-64endo-1，4-beta-glucanase gene)；

4：芽孢杆菌菌株BP23celB基因(B.sp.BP23 celB gene)；

5：芽孢杆菌菌株BP23celA基因(Bacillus sp.BP23 celA gene)；

6：短小芽孢杆菌内切葡聚糖酶编码基因(B.pumilus endoglucanase gene)；

7：枯草芽孢杆菌染色体DNA，76-78范围之间(B.subtilis chromosomal DNA，region 76-78 degrees)

8：芽孢杆菌纤维素酶前体编码基因(cel)(B.sp.bifunctional cellulase precursor(cel)gene)；

9：粘琼脂芽孢杆菌碱性纤维素酶编码基因(Cel5A)(B.agaradhaerens alkalinecellulase Cel5A(Cel5A)gene)；

10：枯草芽孢杆菌(BR151)抗终止子编码基因(licT)(B.subtilis(BR151)licT genefor transcription antiterminator)；

11枯草芽孢杆菌beta-葡聚糖酶(1-3)，(1-4)-beta-D-葡聚糖内切葡聚糖酶编码基因(B.subtilis gene for beta-glucanase(1-3)，(1-4)-beta-D-glucan endoglucanase)；

12：多粘芽孢杆菌beta-1，4-内切葡聚糖酶编码基因；13、芽孢杆菌内切葡聚糖酶编码基因(celC)(B.polymyxa beta-1，4-endoglucanase gene；13：B.sp.endoglucanase(celC)gene)；

sis全序：本实验测定的序列

图5是B.megaterium Ap25内切葡聚糖酶酶活性检测照片。

图6是转化子E.coli Glu3-27内切葡聚糖酶酶活性检测照片。

具体实施方式：

实施例1：

巨大芽孢杆菌内切葡聚糖酶编码基因片段序列如下：

ggctgcgcaa ctgttggaag ggcgatcggt gcgggcctct tcgctataac gcccagctgg     60

cgaaaggggg atgtgctgca aaggcgatta aagttgggta acgccagggt tttcccagtc    120

acgacgttgt aaaacgacgg cccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta taggcgaatt    180

gggtaccggg ccccccctcg aggtcgacgg tatcgataag cttgatatcg aattcctgca    240

gcccggggga tcagatatac gacgtttttc cctttagcgc cggcccgctc aaattcttca    300

cgtgtatcag aaagcgcttt cgctatcggt gtccagccgg ttggtttaat cttgctgagt    360

gattgctcaa atggagtcac ggcgtacggc tgaaggccgt ataacgtttc tgtcgcgtta    420

catgatacgg ctttgcctga gtttttatta ttgcccttat gcccgaatac ccgaagcatc    480

agattcgtgt cttcaggaag aacttccgca aaagaagtga cagactcttt cgcaacatct    540

attttacgct ctccccctgt tttttgtatc atgctcccgc ttgcgtcaaa cagcacggcg    600

acgtttgttt cttcgtgctt tttctcagct gcaaaaacag gtgatccgaa gctggctcgt    660

aagcatcagg ctgtccgtcc gcattccctc aataaagtat ctgccgattg aataccagat    720

ccactagttc tagagcggcc gccaccgcgg tggagctcca gcttttgtcc ctttagttga    780

gggttaattg cgcgcttggc gtaatcatgg tcatagctgt ttcctggtgt gaaatttggt    840

tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaacat aaagtggtaa agcctggggg    900

tggcctaatg agttgagcta actcacatta attgcgtttg c                        941

基因组DNA与氨基酸对应关系如下：

5′GGC TGC GCA ACT GTT GGA AGG GCG ATC GGT GCG GGC CTC TTC GCT ATA ACG CCC   54

    G   C   A   T   V   G   R   A   I   G   A   G   L   F   A   I   T   P

   AGC TGG CGA AAG GGG GAT GTG CTG CAA AGG CGA TTA AAG TTG GGT AAC GCC AGG  108

    S   W   R   K   G   D   V   L   Q   R   R   L   K   L   G   N   A   R

   GTT TTC CCA GTC ACG ACG TTG TAA AAC GAC GGC CCA GTG AGC GCG CGT AAT ACG  162

    V   F   P   V   T   T   L   *   N   D   G   P   V   S   A   R   N   T

   ACT CAC TAT AGG CGA ATT GGG TAC CGG GCC CCC CCT CGA GGT CGA CGG TAT CGA  216

    T   H   Y   R   R   I   G   Y   R   A   P   P   R   G   R   R   Y   R

   TAA GCT TGA TAT CGA ATT CCT GCA GCC CGG GGG ATC AGA TAT ACG ACG TTT TTC  270

    *   A   *   Y   R   I   P   A   A   R   G   I   R   Y   T   T   F   F

   CCT TTA GCG CCG GCC CGC TCA AAT TCT TCA CGT GTA TCA GAA AGC GCT TTC GCT  324

    P   L   A   P   A   R   S   N   S   S   R   V   S   E   S   A   F   A

   ATC GGT GTC CAG CCG GTT GGT TTA ATC TTG CTG AGT GAT TGC TCA AAT GGA GTC  378

    I   G   V   Q   P   V   G   L   I   L   L   S   D   C   S   N   G   V

ACG GCG TAC GGC TGA AGG CCG TAT AAC GTT TCT GTC GCG TTA CAT GAT ACG GCT  432

 T   A   Y   G   *   R   P   Y   N   V   S   V   A   L   H   D   T   A

TTG CCT GAG TTT TTA TTA TTG CCC TTA TGC CCG AAT ACC CGA AGC ATC AGA TTC  486

 L   P   E   F   L   L   L   P   L   C   P   N   T   R   S   I   R   F

GTG TCT TCA GGA AGA ACT TCC GCA AAA GAA GTG ACA GAC TCT TTC GCA ACA TCT  540

 V   S   S   G   R   T   S   A   K   E   V   T   D   S   F   A   T   S

ATT TTA CGC TCT CCC CCT GTT TTT TGT ATC ATG CTC CCG CTT GCG TCA AAC AGC  594

 I   L   R   S   P   P   V   F   C   I   M   L   P   L   A   S   N   S

ACG GCG ACG TTT GTT TCT TCG TGC TTT TTC TCA GCT GCA AAA ACA GGT GAT CCG  648

 T   A   T   F   V   S   S   C   F   F   S   A   A   K   T   G   D   P

AAG CTG GCT CGT AAG CAT CAG GCT GTC CGT CCG CAT TCC CTC AAT AAA GTA TCT  702

 K   L   A   R   K   H   Q   A   V   R   P   H   S   L   N   K   V   S

GCC GAT TGA ATA CCA GAT CCA CTA GTT CTA GAG CGG CCG CCA CCG CGG TGG AGC  756

 A   D   *   I   P   D   P   L   V   L   E   R   P   P   P   R   W   S

TCC AGC TTT TGT CCC TTT AGT TGA GGG TTA ATT GCG CGC TTG GCG TAA TCA TGG  810

 S   S   F   C   P   F   S   *   G   L   I   A   R   L   A   *   S   W

TCA TAG CTG TTT CCT GGT GTG AAA TTT GGT TAT CCG CTC ACA ATT CCA CAC AAC  864

 S   *   L   F   P   G   V   K   F   G   Y   P   L   T   I   P   H   N

ATA CGA GCC GGA ACA TAA AGT GGT AAA GCC TGG GGG TGG CCT AAT GAG TTG AGC  918

 I   R   A   G   T   *   S   G   K   A   W   G   W   P   N   E   L   S

TAA CTC ACA TTA ATT GCG TTT GC 3′  941

 *   L   T   L   I   A   F

基因片段共941bp，含有一个具有348个核苷酸的开放阅读框架，起始密码子位于571bp，终止密码子位于919bp，共编码氨基酸116个。

实施例2：本发明的基因片段克隆方法

菌种来源：巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)Ap25在小麦根际土壤中筛选得到，菌种保藏号是：CGMCC No.1213。

具体方法如下：

1、内切葡聚糖酶酶活性的检测

内切葡聚糖酶活性的测定：将纯化的巨大芽孢杆菌接于羧甲基纤维素平板上，28℃培养60h，取出，用1mg/ml的刚果红染色20min，再用1mol/L的NaCl浸泡20分钟，用水冲洗，去掉表面附着的刚果红，检测菌落周围和下面的透明区域，根据透明区域判断酶活性。

-    ——无酶活性

+    ——透明区域＜菌落大小

++   ——透明区域＝菌落

+++  ——透明区域＞菌落

2、葡聚糖酶编码基因的克隆

2.1巨大芽孢杆菌基因组的提取

参照《精编分子生物学实验指南》。

(1)培养50ml细菌培养物至饱和状态，取15ml的培养物12000g离心5min；

(2)沉淀物加入5670μl TE，用吸管反复吹打使之重悬。加入300μl 10％SDS和30μl20mg/mL蛋白酶K，混匀，37℃温育2.5-3h；

(3)加入1000μl 5M NaCl，充分混匀，再加入800μl CTAB/NaCl溶液，混匀，于65℃温育30-60min(从这一步开始可以除去多糖及其它污染的大分子)；

(4)加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)，混匀，4℃，12000g离心20min，将上清液转入一个新管中，如难移出上清，先用牙签除去界面物质；

(5)加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)，混匀，4℃，14000g离心30min，将上清转到一只新管中；

(6)加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)，混匀，4℃，16000g离心30min，将上清转到一只新管中；

(7)加入0.6倍体积异丙醇，轻轻混合(缓慢上下颠倒3分钟)，置于4℃冰箱中保持10min，用一细弯玻棒将絮状沉淀沟出，转入一5ml的离心管中；

(8)用3ml的70％乙醇中洗涤2次，再用无水乙醇洗涤2次，各12000g离心2min，弃上清，超净工作台上风干(勿使沉淀完全干燥，否则极其难溶)；

(9)加入100-200μl TE缓冲液，4℃过夜溶解DNA；

(10)加10mg/ml RNase至终浓度为50ug/mL，37℃温育1h；

(11)加等体积酚/氯仿/异戊醇抽提1次，上清液再用氯仿/异戊醇抽提1次；

(12)向上清中加入1/10体积3M NaAc(pH5.2)和2倍体积预冷的无水乙醇，倒置混合；

(13)离心后轻轻弃去上清，DNA沉淀用70％乙醇和无水乙醇各洗涤1次，稍干后溶于适量TE buffer中，用紫外分光光度计测定DNA浓度及纯度后置于4℃冰箱保存(可于-20℃长期保存)。

2.2Sau3A部分酶切基因组DNA

酶切反应体系：

      10×Sau3A缓冲液             12μl

      基因组DNA                   107μl

取出5支灭菌的1.5ml的离心管，标上数字，冰浴。向第一管中加入1μl的Sau3A，混合。分别吸取20μl加到另5管中，于37℃水浴。第一管水浴1sec，第二管水浴5sec，第三管水浴10sec，第四管水浴20sec，第五管水浴30sec，第六管水浴1min，将各管置冰浴，加入EDTA至20mM终止反应。将1-6管样品和已知分子量的DNA样品加在0.8％琼脂糖凝胶上，电泳，紫外灯下观察，根据已知分子量的DNA带，确定合适的反应时间。在最适条件下，消化108μl的DNA，取5μl经0.8％琼脂糖凝胶电泳，确定DNA片段的大小。

2.3DNA片段的回收

按照上海生工提供的DNA Fragment Recovery Kit使用说明书进行。

(1)根据溶液的体积和所要回收的DNA的含量，加入3倍体积的Binding Buffer，如果溶液的体积不足50μl，加TE缓冲液到50μl，再加150μl的Binding Buffer混匀；

(2)将混匀后的溶液加到UNIQ-10柱中，室温放置2min，8000rpm室温离心1min；

(3)取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，加入500μl Wash Solution，8000rpm室温离心1min；

(4)重复步骤(3)一次；

(5)取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，12000rpm室温离心15sec；

(6)将UNIQ-10柱放入一个新的1.5ml的离心管中，在柱子膜中央加30μl的ElutionBuffer或水，室温或37℃放置2min；

(7)12000rpm室温离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA片段，可立即使用或保存于-20℃

2.4质粒pBS的酶切脱磷酸化

酶切反应体系：

      BamHI缓冲液                  2μl

      质粒DNA                      10μl

      限制性内切酶BamHI            1μl

      RNase                        1μl

      补加ddH₂O                   至20μl，

37℃水浴1h，取出，取2μl电泳检测，然后加入1μl的BamHI，ddH₂O 1μl，继续水浴1h，于65℃水浴20min，终止反应，电泳检测，是否酶切完全。确定酶切反应的最佳条件，大量酶切质粒。

2.5线形质粒的脱磷酸化

1.5ml的灭菌的离心管中加入：

      CIAP缓冲液                      5μl

      已酶切的质粒                    20μl

      CIAP                            2μl

      补加ddH₂O                      至50μl

37℃水浴30分钟，加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)进行抽提两次，加入3M的NaCl 2.5μl，加入125μl的无水乙醇，-20℃保存30-60min，离心分离回收沉淀，用200μl 70％乙醇洗净后，干燥，用一定量的TE缓冲液溶解沉淀。

利用宝生物的DNA凝胶回收试剂盒回收已脱磷酸化的质粒DNA。

2.6线形质粒的回收

按照TaKaRa Biotech公司提供的PCR Fragment Recovery Kit使用说明书进行。

(1)脱磷酸化后的质粒经琼脂糖凝胶电泳后在长波紫外光下操作切下含目的条带的琼脂糖块，放入1.5ml离心管中；

(2)加入1.5-3倍凝胶量的NaI溶液(通常600μl)，55℃温育5-10min，使胶块完全融化；

(3)估计样品中DNA总量，按20μl硅胶树脂结合约1μg DNA的比例，加入适量硅胶树脂(预先混匀)后充分混匀，室温放置20min以充分吸附DNA；

(4)10000rpm离心1min，尽弃上清；

(5)加入500μl洗净缓冲液，振荡混匀后离心(10000rpm，1min)，尽弃上清；

(6)重复洗涤上步操作1次；

(7)离心后尽弃上清，加入2倍硅胶体积的TE缓冲液或灭菌ddH₂O重悬沉淀，55℃水浴中放置5min；

(8)10000rpm离心1min，回收上清液，即为所回收的目标DNA溶液。

2.7载体质粒pBS与外源DNA片段的连接

连接反应体系：

      连接酶Buffer                    1μl

      载体pBS                         1.5μl

      外源DNA片段                     4.5μl

      T4连接酶                        1μl

      补加ddH₂O                      至10μl

盖紧盖子，手指轻弹离心管，混匀样品，在离心机上转2sec，把样品集中在管底，16℃水浴中连接过夜。

2.8大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

参照《精编分子生物学实验指南》，略有改动。

(1)取冻存的DH5α菌种于LB平板上划线，同时在含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上划线作对照(不应生长)，37℃温箱培养过夜；

(2)次日挑取生长良好的单菌落接种5ml LB液体培养基中，37℃ 200rpm摇培过夜；

(3)取1ml活化后的菌液接入100ml LB液体培养基中，37℃ 200rpm摇培2-3h使A₆₆₀达到0.2-0.4；

(4)菌液冰浴10min，4℃ 5000g离心10min，尽弃上清，收获细胞；

(5)用冷预冷的0.1倍原培养物体积的1×TSS致敏缓冲液悬浮细胞，然后分装成0.1ml一份速置于冰乙醇中冷冻，然后于-70℃贮存。

也可用其他的大肠杆菌。

2.9连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞

(1)制备LB/Amp/IPTG/X-gal平板：在事先制备好的含100μg/ml Amp的LB琼脂平板上加入40μl X-gal贮存液和4μl IPTG溶液，用无菌玻璃涂布器把溶液均匀涂布于整个平板表面，超净工作台上吹干后备用；

(2)从-70℃取出的E.coli DH5α感受态细胞置于冰上融化5min，轻弹混匀；

(3)取5uL连接产物加入到感受态细胞中，轻弹混匀后于冰上放置20min；

(4)42℃水浴中热激45-60sec；

(5)迅速放回冰上放置2min；

(6)向管中加入900μl SOC培养液(预先放置于室温下)，可用LB培养液代替SOC培养液，但转化效率低一些；

(7)37℃150rpm摇培1.5h；

(8)取100μl培养物涂布于步骤(1)中制备好的LB平板上，待菌液充分吸收后，倒置平板于37℃培养12-16h；

(9)在4℃将平板放置数小时，使蓝色充分显现，以利于蓝白斑筛选。

2.10重组质粒pBSGlu的快速检测及其提取

pBS上具有LacZ编码基因，多克隆位点位于LacZ编码基因内，所以可根据蓝/白斑进行筛选重组质粒。常规方法提取重组质粒。

2.11重组质粒的酶切检测

用位于pBS载体克隆位点两侧的EcoRI、SalI、XbaI、SmaI和HindIII进行单、双酶切，鉴定目的基因与克隆载体的连接情况。

酶切反应体系：

单酶切：

      质粒                5μl

      10×buffer          2μl

      酶                  1U

      ddH₂O              补足20μl

双酶切：

      质粒                30μl

      10×buffer          4μl

      两种酶分别为        2U

      ddH₂O              补足40μl

上述反应体系于37℃反应2-4h，电泳检测酶切结果。

2.12重组质粒pBSGlu的酶活性检测

检测方法同芽孢杆菌内切葡聚糖酶酶活性的检测方法。

3、结果：

3.1葡聚糖酶基因文库的构建及转化、筛选

根据已知资料推测，巨大芽孢杆菌Ap25编码内切葡聚糖酶的基因在1-2kb，确定Sau3A的最适反应条件，1μl的Sau3A部分酶切100μl的Ap25基因组DNA后，经0.8％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯检测，发现酶切后DNA片段大部分在0.7-3kb之间(图1)，所以可直接从液体中大量回收DNA片段，不必经过琼脂糖凝胶电泳回收。

质粒pBS经BamHI酶切，脱磷酸化后，质粒与纯化的染色体DNA片段按1∶3比例混匀，加入T4连接酶，16℃过夜连接，转化大肠杆菌DH5α，转化子直接涂布在含有X-gal和IPTG的氨苄青霉素的LB培养基上，37℃培养过夜，蓝白斑筛选到108株菌株。

3.2转化子的内切葡聚糖酶活性测定及重组质粒的鉴定、测序

将筛选得到的108株菌株重新接在含氨苄青霉素的LB培养基和羧甲基纤维素培养基上，5-7天后检测酶活性，得到74株具有内切葡聚糖酶活性的菌株，占转化子的68.52％，其中6株的活性较好。将可以水解羧甲基纤维素的菌株纯化、保存，选其中的一株菌株提取重组质粒。利用载体上的多克隆位点的EcoRV、HandIII和XbaI对重组质粒进行单酶切鉴定，结果见图2，pBS的分子量大小为2.96kb，单酶切后对照标准分子量其大小在3.47kb。同时，用SalI和EcoRI进行单、双酶切后，由图3可看到，重组质粒产生一个0.7kb左右的片段。将这株转化子中所带的重组质粒命名为pBSGlu。

重组质粒pBSGlu在上海生物工程有限公司进行测序，测序结果如下：

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所克隆基因941nt，将所克隆的几丁质酶基因与GeneBank所报道的几种葡聚糖酶基因进行同源性比较，结果见图4：

由图4可以看到实验中所克隆到的B.megaterium Ap25内切葡聚糖酶的编码基因同GeneBank中发表的几种葡聚糖酶的编码基因的同源性较低，同B.subtilischromosomal DNA，region 76-78 degrees：between glyB-aprE的同源性是最高的，只有35％；同Bacillus sp.BP23 celB gene，B.pumilus endoglucanase gene和B.polymyxa beta-1，4-endoglucanase gene的同源性只有27％。同时此片段只是葡聚糖酶基因中的一部分。

                             序列表

<110>山东省科学院生物研究所

<120>巨大芽孢杆菌内切葡聚糖酶的基因及其制备方法

<140>

<141>

<160>1

<170>Patent In3.1

<210>1

<211>941

<212>DNA

<213>巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)

<400>1

ggctgcgcaa ctgttggaag ggcgatcggt gcgggcctct tcgctataac gcccagctgg     60

cgaaaggggg atgtgctgca aaggcgatta aagttgggta acgccagggt tttcccagtc    120

acgacgttgt aaaacgacgg cccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta taggcgaatt    180

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