从小麦麸皮中提取草酸氧化酶的方法

摘要

从小麦麸皮中提取草酸氧化酶的方法涉及酶的制备技术。先用水冲洗麸皮，然后用缓冲液匀浆，离心收集沉淀。用相同缓冲液或蒸馏水淋洗沉淀至洗出液澄清后收集沉淀。接着用含1mol/L Nacl的缓冲液悬浮沉淀，水浴中保温1－1.5h后离心收集沉淀。用缓冲液或蒸馏水淋洗沉淀至洗出液澄清后收集沉淀。向沉淀中加入缓冲液，沸水浴15－20min后离心取沉淀，用缓冲液或蒸馏水淋洗沉淀至洗出液澄清后收集沉淀。然后用含胃蛋白的水溶液悬浮沉淀，在水浴中保温1－1.5h后离心收集沉淀，用缓冲液或蒸馏水淋洗沉淀至洗出液澄清。最后用真空浓缩干燥系统除去沉淀中的水分，得草酸氧化酶。每克麸皮可生产0.3－0.4g的酶制品，其活性为0.001－0.0015U/mg酶制品。本方法简便易行，成本低为此酶在医药、食品、饮料、造纸、农业等方面的应用奠定了基础。

说明书

                        技术领域

本发明涉及酶的制备技术，特别涉及小麦麸皮中草酸氧化酶的发现及其制备。

                        技术背景

草酸氧化酶催化草酸氧化产生CO₂和H₂O₂，是Zaleski和Reinhard在研究小麦面粉时发现的，后来发现细菌、苔藓和许多高等植物中都有草酸氧化酶的活性。在实际中，草酸氧化酶是一个很有用的分析酶，可用于测定生物流体或饮料中草酸的含量，而且简单、专一性强、快速且不需特殊的设备，还可排除维生素C的干扰。此外，Malpass等(2002)还发现固定化的草酸氧化酶在老鼠体内不但可以降解草酸，而且在抑制草酸钙晶体的形成中起积极作用，这为利用酶法治疗高草酸尿病开辟了新的前景。

由于草酸氧化酶是一个很有用的分析酶，不少研究者试图分离纯化草酸氧化酶。在早期的研究中，Chiriboga(1963)曾采用(NH₄)₂SO₄分级沉淀和离子交换层析从小麦幼苗中纯化草酸氧化酶，但回收率和纯化倍数都很低，也有人通过离子交换层析或\和sephadex-200从高梁、苋菜中纯化草酸氧化酶，纯化倍数均小于150，回收率均小于20％。Kotsira和Clonis(1 997)利用热变性及Procion turquoise MX-G染料亲和层析和ConA亲和层析从大麦根中纯化了草酸氧化酶，纯化倍数为1096，回收率为42％，这是已报道的最好的纯化结果。正是由于草酸氧化酶分离纯化复杂，市场上的草酸氧化酶价格非常昂贵，Sigma公司从大麦幼苗中纯化的草酸氧化酶最新售价为24.7US$/U。他们在此基础上开发的利用草酸氧化酶测定草酸的诊断试剂盒测一个样品至少需要3.89US$。这样，使草酸氧化酶在实际中的应用受到限制。不少研究者尝试通过固定化酶和酶电极来降低成本，但目前还未见到将其用于实际中的报道。我们首次发现小麦麸皮中具有较高的草酸氧化酶活性，研究表明此酶主要以共价结合的方式结合在细胞壁上，稳定性很高，大大有利于此酶在实际中的推广应用。

                          发明内容

我们在实验过程中发现小麦麸皮中具有较高的草酸氧化酶活性，它以共价结合的方式与细胞壁相连，如同一个固定化酶。研究表明此酶的稳定性较以往报道的草酸氧化酶皆高，这为在实际中应用此酶提供了方便。我们根据其特性，设计了一个从小麦麸皮中提取草酸氧化酶的方案，本技术方案可通过以下步骤实现：

(1)淀粉的去除用水反复淋洗麸皮至淋洗液澄清。由于麸皮中除了大量的纤维素和半纤维素外，还含有少量的淀粉，因此在制备草酸氧化酶时首先要去除淀粉，其方法是将麸皮放于200目尼龙膜上，用水淋洗直至淋洗液澄清。

(2)草酸氧化酶的抽提  按麸皮质量与缓冲液体积比为1∶10的比例加入50mmol/L pH7.5的Tris-HCl缓冲液匀浆麸皮，然后4℃-常温下1000-4000g离心15-20min，弃上清液，收集沉淀，再按相同比例加入50mmol/L pH7.5的Tris-HCl缓冲液或蒸馏水，淋洗沉淀至洗出液澄清后，离心收集沉淀。

(3)杂蛋白的去除  我们的研究表明麸皮草酸氧化酶的热稳定性极高，其活性不受NaCl和胃蛋白酶的影响，于是我们进行下述处理以去除杂蛋白：

NaCl处理  将上步得到的沉淀用含1mol/L NaCl 50mmol/L pH7.5的Tris-HCl缓冲液悬浮，加入上述缓冲液的体积为麸皮质量的10倍，在25-37℃的水浴中保温1-1.5h，然后4℃-常温下1000-4000g离心15-20min，取沉淀。再用50mmol/L pH7.5的Tris-HCl缓冲液或蒸馏水淋洗沉淀至洗出液澄清后，离心收集沉淀。此步主要目的是去除以离子键与细胞壁的杂蛋白。

热处理在上步得到的沉淀中按麸皮质量/缓冲液体积之比为1∶10的比例加入50mmol/L pH7.5的Tris-HCl缓冲液，沸水浴15-20min，然后4℃-常温下1000-4000g离心15-20min，取沉淀。再用50mmol/L pH7.5的Tris-HCl缓冲液或蒸馏水淋洗沉淀至洗出液澄清后，离心收集沉淀。此步主要目的是失活所有热不稳定的蛋白。

胃蛋白酶处理将上部得到的沉淀用体积为麸皮质量10倍pH为1.5-5.0每毫升含有50μg胃蛋白酶的水溶液悬浮，其中胃蛋白酶购自Amresco公司，3000NFu/mg，在25-37℃水浴中保温1-1.5h。然后4℃-常温下1000-4000g离心20min，取沉淀，再用50mmol/L pH7.5的Tris-HCl缓冲液或蒸馏水淋洗沉淀至洗出液澄清，接着将所得沉淀在4℃下12,000g离心20min收集沉淀。此步主要目的是去除一些对胃蛋白酶敏感的蛋白。

最后用真空浓缩干燥系统除去沉淀中的水分，所得产品即为草酸氧化酶。

                      具体实施方式

实施例一：取麸皮1.5g，先用蒸馏水淋洗至淋洗液澄清，然后加15mL50mmol/L pH为7.5的Tris-HCl缓冲液充分匀浆，4℃下4000g离心20min后收集沉淀，再加入相同缓冲液淋洗沉淀至洗出液澄清，4000g离心15min收集沉淀，用同样的方法再淋洗一次。将上步得到的沉淀用15mL含1mol/LNaCl的50mmol/L pH7.5的Tris-HCl缓冲液悬浮后，在37℃水浴中保温1h，然后在4℃下4000g离心20min，收集沉淀，用15mL不含NaCl的50mmol/L pH7.5的Tris-HCl缓冲液淋洗沉淀，4000g离心15min收集沉淀，用同样的方法再洗一次。接着用15mL 50mmol/L pH7.5的Tris-HCl缓冲液将沉淀悬浮，沸水浴中保温20min，然后4℃下4000g离心20min，收集沉淀，用15mL 50mmol/L pH7.5的Tris-HCl缓冲液淋洗沉淀至洗出液澄清，4000g离心15min收集沉淀，用同样的方法再洗一次。然后在沉淀中加入15mL含0.75mg胃蛋白酶pH为2.0的水溶液，在37℃水浴中保温1h后，4℃下4000g离心20min收集沉淀，用50mmol/L pH7.5的Tris-HCl缓冲液淋洗沉淀至洗出液澄清，4000g离心15min收集沉淀，用同样的方法再洗一次。接着将所得沉淀在4℃下12,000g离心20min，然后用真空浓缩干燥系统除去沉淀中的水分，得酶制品0.55g，测定其活性为0.00138U/mg酶，1U定义为在pH为3.5温度为室温的条件下每分钟产生1μmolH₂O₂所需要的酶量。

实施例二：取麸皮1.5g，先用自来水淋洗至淋洗液清亮，然后用15mL50mmol/L pH为7.5的Tris-HCl缓冲液匀浆麸皮，4℃下4000g离心20min后，收集沉淀，再加入15mL蒸馏水淋洗沉淀至洗出液澄清，4000g离心15 min收集沉淀，用同样的方法再淋洗一次。将上步得到的沉淀用15mL含1mol/L NaCl 50mmol/L pH7.5的Tris-HCl缓冲液悬浮后，在37℃水浴中保温1h，然后4℃下4000g离心20min收集沉淀，加入15mL蒸馏水淋洗沉淀至洗出液澄清，4000g离心15min收集沉淀，用同样的方法再淋洗一次。接着用15mL 50mmol/L pH7.5的Tris-HCl缓冲液将上述沉淀悬浮，沸水浴中保温20min，然后4℃下4000g离心20min收集沉淀，再加入15mL蒸馏水淋洗沉淀至洗出液澄清，4000g离心15min收集沉淀，用同样的方法再淋洗一次。然后用15mL含0.75mg胃蛋白酶pH为2.0的水溶液将沉淀悬浮，在37℃水浴中保温1h后，4℃下4000g离心20min收集沉淀，再加入15mL蒸馏水淋洗沉淀至洗出液澄清，4000g离心15min收集沉淀，用同样的方法再淋洗一次。接着将所得沉淀在4℃下12,000g离心20min，然后用真空浓缩干燥系统除去沉淀中的水分，得酶制品0.5g，测定其活性为0.0011U/mg酶制品，1U定义为在pH为3.5温度为室温的条件下每分钟产生1μmolH₂O₂所需要的酶量。