具有偶联到B细胞表位上的人造T辅助细胞表位的分枝合成肽免疫原构建体

摘要

本发明涉及合成肽免疫原的构建以诱导特异于指定B表位的抗体的产生，所述B表位通常是自身分子。采用人工Th表位以分枝形式合成肽免疫原，其中所述Th表位以特定的方向直接或通过一个间隔物连接到B表位上。设计这种新型肽免疫原以引发高水平的抗体用于免疫治疗或免疫调整机体调节过程。

说明书

发明背景

1.发明领域

一般来说，本发明涉及无载体的合成肽免疫原的构建，更具体的说，涉及多种不同类型的新型多抗原肽系统的构建，该系统包含具有连接到B细胞表位(B表位)上的特定T辅助细胞表位(Th表位)的单体，其能有效的引发针对此B表位的免疫反应。这些新型多抗原肽系统在机体功能的免疫治疗和免疫调节方面是理想的疫苗候选物。

2.相关领域说明

脊椎动物的免疫系统通过许多种方法保护机体使之免受抗原性侵略者的攻击。通常，免疫反应可以被分为两类，即(1)涉及B淋巴细胞和B细胞分泌的抗体的体液反应和(2)涉及一类被称为细胞毒(杀伤)T细胞的T淋巴细胞的细胞介导的反应。体液反应是通过抗体对抗原的识别和结合从而触发免疫系统的其他成分来摧毁抗原而实现的。整个机制首先由被抗原呈递细胞加工过的抗原启动，抗原呈递细胞通过蛋白水解作用加工抗原产生肽片段，肽片段然后与MHC II类分子一起以复合物的形式暴露在细胞表面。当B细胞通过它们的特异表面免疫球蛋白受体吞噬抗原后，它们可以作为高效的抗原呈递细胞。接下来，T细胞受体(TCR)识别B细胞表面由MHC II类分子呈递的肽上的T辅助细胞(Th)表位，这种识别导致指导T细胞帮助B细胞，最终导致针对完整的抗原的抗体的产生。由于细胞表面受体与配体结合后的二聚化或寡聚化是启动信号转导的通常的机制，或许，TCR对MHC/肽抗原复合物的结合启动了信号的转导。T辅助细胞为B细胞提供了信号，从而使它们分泌特异于抗原的抗体。

由于免疫系统能产生具有高特异性分子识别能力的分子而且其适用于任何的分子靶标，抗体技术已成为治疗疾病和免疫调整机体调节过程的一个有力工具。但是，这种方法亦有缺陷，即，当抗原是“自身”抗原时，其免疫原性差。通过使用包含促性腺激素释放激素(GnRH)的免疫去势疫苗的长期经验，这一点已经得到很好的说明。GnRH通过调节促性腺激素的分泌，在繁殖中起到关键性的作用。它在下丘脑中产生，并通过专门的血管系统转运到垂体前叶腺。它负责选择性地导致促卵泡激素(FSH)和促黄体素(LH)自垂体前叶腺释放。FSH和LH控制精子发生、排卵和发情期并最终指导雄性激素(雄激素和睾酮)和雌性激素(雌激素和黄体激素)的分泌。已知针对GnRH的有效免疫能减少这些性激素并可以用作可逆避孕的方法。并且，抑制GnRH并进而抑制性激素可以成为一种治疗手段，用于治疗激素依赖性的疾病，例如前列腺癌、乳腺癌和子宫内膜异位——雌激素介导的子宫内膜组织在子宫外部的生长。此外，GnRH可以被用于雄性动物的免疫去势，以避免发情气味(boar taint)——一种在未阉割的雄性动物食品中出现的、由于高水平的雄甾酮而产生的令人讨厌的气味或味道，这通常通过机械阉割来消除，然而机械阉割会削弱去势动物的生长性状。因而，免疫去势具有在保持正常的生长性状的同时消除发情气味的优点。

然而，就算是进行多次免疫接种，免疫去势疫苗也并非对所有的接种动物都产生同样的效果。只有在使用最小量的接种能对所有的动物达到相同效果时，免疫去势疫苗才会被接受作为外科阉割的替代方案。然而，以GnRH肽本身为基础的疫苗无法达到此目标，因为该疫苗无法诱导有效数量的对抗此自身分子的抗体。

已经进行了一些尝试来诱导对抗自身分子的抗体。有报告显示，当小鼠用共价偶联载体蛋白(以提供和B表位连接的新T辅助表位)的抗原免疫时，在小鼠体内，抗原特异性B细胞可以被激发以产生高效价的高亲和性IgG中和抗体；这种类型的抗体出现在许多自身免疫性疾病，例如重症肌无力、红斑狼疮、类风湿性关节炎等中。因此，一般是将包含B表位的小肽(其独自施用时是弱免疫原)与外来蛋白载体(决定簇的来源)偶联以刺激T辅助细胞。但是，一些问题伴随着载体蛋白的使用而产生，即，1)肽与载体蛋白的化学偶联可能会造成目的决定簇的改变并且随机的反应会导致制品在大小和组成方面不均一，2)载体蛋白也许会导致不想要的免疫反应，和3)肽-载体缀合物可能会激发不相关的免疫反应，错误地针对载体蛋白而非目标位点。为了避免这些问题，Th表位被用于替换载体蛋白来引发T辅助细胞反应。Th表位可以与B表位串联连结形成合成肽构建体。作为选择方案，多抗原性肽(multiple antigenic peptide，MAP)的合成已经被描述(Fitzmaurice等人，包含T细胞和B细胞决定簇的非线性合成免疫原的组装和免疫学特性，vol 14，Vaccine 1996，pp553-560)，在多抗原性肽中，同一个肽(连接至B表位的Th表位)以多个拷贝通过α和ε氨基基团组装在赖氨酸核心上。

目前亦有理论假设，一般，具有多个拷贝的B表位的分枝免疫原是优良的免疫原(Fitzmaurice等人，包含T细胞和B细胞决定簇的非线性合成免疫原的组装和免疫学特性，vol 14，Vaccine 1996，pp553-560)。然而，有例外的情况，当B细胞决定簇由序列TLKLATG决定、T细胞决定簇为ALNNRFQIKGVELKS或PKYVKQNTLKLA时，分枝的决定簇不象其串联对应物那样能在CBA小鼠体内引发出可检测的抗体水平(Fitzmaurice等人，包含T细胞和B细胞决定簇的非线性合成免疫原的组装和免疫学特性，vol 14，Vaccine 1996，pp553-560)。附图7显示了一个实验结果，其中分枝形式的GnRH B表位没能在小鼠体内引发免疫反应。并且，在组装设计的免疫原时，Th表位的选择会影响合成的免疫原的效能。通过截短、添加和/或修饰已知的Th表位来仿造已知的天然Th表位所获得的人工Th表位，已经用于实验中与通常的弱免疫原偶联以引发有效的免疫反应。

发明简述

本发明涉及多种不同类型的新型非线性的、分枝的合成肽免疫原构建体。每一个构建体使用不同的人工Th表位。所述Th表位以MAP形式连接到B表位上，用来诱导靶向其所连接的B表位的抗体。这些新型肽免疫原构建体引发高效价的特异地靶向所述B表位的抗体，并产生可测量的生物效力结果。本发明的组合物可以用于制备疫苗，以针对感染性疾病产生免疫保护，或用于免疫疗法治疗由于正常生理过程的失调导致的病症，或用于免疫疗法治疗癌症，以及干预和修饰正常生理过程。

附图的简要说明

1.图1显示了在用T1G和GT1免疫的雄性BALB/c小鼠体内产生的抗G4抗体的数量和相应的血清睾酮的水平。

2.图1A显示了所产生的抗体在结合G4，(T1)⁸，(sT1)⁸和(tT1)⁸方面的精细特异性。

3.图2显示了在用T1G和GT1免疫的雄性大鼠体内产生的抗G4抗体的数量。

4.图2A显示了所产生的抗体在结合G4，(T1)⁸，(sT1)⁸和(tT1)⁸方面的精细特异性。

5.图2B显示了在用T1G，GT1和PEK8G免疫的雄性大鼠体内的血清睾酮水平。

6.图3显示了在用T1G免疫的小猎犬(beagle)体内产生的抗G4抗体的数量和血清睾酮的水平。

7.图4显示了在用sT1G免疫的雄性BALB/c小鼠体内产生的抗G4抗体的数量和血清睾酮的水平。

8.图4A显示了在用sT1G免疫的雄性BALB/c小鼠体内产生的抗体在结合G4，(T1)⁸，(sT1)⁸和(tT1)⁸方面的精细特异性。

9.图5显示了在用tT1G免疫的雄性BALB/c小鼠体内产生的抗G4抗体的数量和血清睾酮的水平。

10.图5A显示了在用tT1G免疫的雄性BALB/c小鼠体内产生的抗体在结合G4，(T1)⁸，(sT1)⁸和(tT1)⁸方面的精细特异性。

11.图6显示了在用PG和GP免疫的雄性BALB/c小鼠体内产生的抗G4抗体的数量和血清睾酮的水平。

12.图7显示了在用G4免疫的雄性BALB/c小鼠体内产生的抗G4抗体的数量和血清睾酮的水平。

13.图8是包含4和8个通过赖氨酸核心连接的单体的MAP构建体的示意图。每一个单体包括一个拷贝的GnRH和/或一个拷贝的来源于流感病毒血细胞凝集素重链(T1，sT1，和tT1)或I型脊髓灰质炎病毒VP1蛋白(P)的T细胞表位。

发明的详细描述

本发明涉及多种不同的新型肽免疫原构建体。在每一个构建体中，与B表位(例如，免疫沉默表位)偶联的Th表位被共价连接到一个分枝的树状核心上，这个核心由一个或多个双官能单元例如赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和鸟氨酸构成，每一类型的构建体使用不同的Th表位。在这里使用的术语“肽免疫原”是指分枝的嵌合Th表位/B表位肽。通过将B表位连接到人工的Th表位上，可以诱导指向所述B表位的免疫反应。因而，肽免疫原可以作为诱导针对自身分子的抗体的有用工具，以达到免疫治疗和免疫调整机体调节过程的目的。

在某些实施方案中，Th表位衍生自流感病毒血细胞凝集素蛋白的重链。例如，SEQ ID NO 1(T1)能被用于引发针对以MAP形式连接到其上的B表位的抗体反应。在所述肽免疫原中，SEQ ID NO 1通过常规的肽键共价连接到B表位的氨基端(N末端)或羧基端(C末端)，形成一个单体亚单位。在每一个单体中，Th表位可以直接地或通过一个间隔物连接到B表位上，间隔物通常包含一个或多个氨基酸残基例如甘氨酸。间隔物在物理上将Th表位和B表位分隔开来，使得TCR可以更好地实现结合。间隔物还可以打断由串联的Th表位/B表位形成的人为二级结构，并且由此消除对T辅助细胞和B细胞反应可能造成的干扰。如图8所示，在MAP形式中，四个或八个单体亚单位可以作为树枝臂分布在树状核心基体上。四聚体和八聚体的MAP肽的合成可以利用Fmoc策略通过逐步的固相步骤人工完成，例如，分别在[Fmoc-Lys(Fmoc)]2-Lys-βAla-Wang树脂(0.77mmol/g，ACT，Louisville，Kentucky，USA)上和在[Fmoc-Lys(Fmoc)]4-Lys2-Lys-βAla-Wang树脂(0.77mmol/g，ACT，Louisville，Kentucky，USA)上合成。Fmoc氨基酸的偶联是通过使用二环己基碳二亚胺/羟基苯并三唑方法在N-甲基吡咯烷酮中完成的。在MAP合成完成以后，可以通过用三氟醋酸处理来解保护和从树脂支持物上裂解合成的肽。最终的产物通过反相高效液相色谱和MALDI TOF质谱来鉴定。

作为一个实例，SEQ ID NO 1能通过肽键直接连接在促性腺激素释放激素(GnRH)的N末端(T1G)或C末端(GT1)形成单体，所述促性腺激素释放激素(GnRH)为一个十氨基酸肽，即，SEQ ID NO 5。优选连接在N末端。然后四个单体聚合成四聚体MAP形式。四聚体MAP形式中，T1G和GT1都诱导高效价的抗GnRH抗体。发现具有在N末端优选连接的肽免疫原能降低雄性动物体内的睾酮水平。

另一个肽免疫原构建体利用衍生自流感病毒血细胞凝集素蛋白的缩短的重链的Th表位，SEQ ID NO 2(sT1)。如上所述，SEQ ID NO 2既可以直接地也可以通过间隔物利用肽键与B表位共价连接。与B表位连接的SEQ ID NO 2的多个拷贝可以被聚合成四聚体或八聚体的MAP形式，见图8，所述聚合可以通过Fmoc策略分别在[Fmoc-Lys(Fmoc)]2-Lys-βAla-Wang树脂(0.77mmol/g，ACT，Louisville，Kentucky，USA)上或在[Fmoc-Lys(Fmoc)]4-Lys2-Lys-βAla-Wang树脂(0.77mmol/g，ACT，Louisville，Kentucky，USA)上利用逐步的固相合成方法来实现。Fmoc氨基酸的偶联是通过使用二环己基碳二亚胺/羟基苯并三唑方法在N-甲基吡咯烷酮中完成的。在MAP肽合成完成以后，解保护和从树脂支持物上裂解通过用三氟醋酸处理来完成。最终的产物通过反相高效液相色谱和MALDI TOF质谱来鉴定。

例如，SEQ ID NO 2可以通过肽键直接连接到GnRH B表位的N末端(sT1G)。此肽免疫原可以聚合成四聚体MAP形式。它能够诱导针对GnRH B表位的免疫反应。

源自流感病毒血细胞凝集素蛋白的截短重链的人工Th表位，SEQ IDNO 3(tT1)，也能够引发针对其所连接的B表位的免疫反应。如上述，SEQ ID NO 3可以直接或通过间隔物连接到B表位上。肽免疫原可以聚合形成四聚体或八聚体MAP形式，见图8。四聚体和八聚体的MAP形式可以通过Fmoc策略分别在[Fmoc-Lys(Fmoc)]2-Lys-βAla-Wang树脂(0.77mmol/g，ACT，Louisville，Kentucky，USA)上或在[Fmoc-Lys(Fmoc)]4-Lys2-Lys-βAla-Wang树脂(0.77mmol/g，ACT，Louisville，Kentucky，USA)上利用逐步的固相方法来合成。Fmoc氨基酸的偶联通过使用二环己基碳二亚胺/羟基苯并三唑法在N-甲基吡咯烷酮中完成。在MAP肽合成完成以后，解保护和从树脂支持物上裂解通过用三氟醋酸处理来完成。最终的产物通过反相高效液相色谱和MALDI TOF质谱来鉴定。

例如，SEQ ID NO 3可以通过肽键直接连接到GnRH B表位的N末端(tT1G)，肽免疫原以四聚体MAP形式聚合。它能够诱导针对所述B表位的免疫反应。

在本发明的另一个肽免疫原构建体中，源自I型脊髓灰质炎病毒VP1蛋白的Th表位，SEQ ID NO 4(P)，可以连接到B表位的N末端或C末端以引发免疫反应。SEQ ID NO 4可以在B表位的N末端或C末端被直接地或通过间隔物连接到B表位。这个肽免疫原构建体可以采取四聚体或八聚体MAP聚合物形式，见图8。此四聚体或八聚体的MAP聚合物可以通过Fmoc策略分别在[Fmoc-Lys(Fmoc)]2-Lys-βAla-Wang树脂(0.77mmol/g，ACT，Louisville，Kentucky，USA)上或在[Fmoc-Lys(Fmoc)]4-Lys2-Lys-βAla-Wang树脂(0.77mmol/g，ACT，Louisville，Kentucky，USA)上利用逐步的固相过程来合成。Fmoc氨基酸的偶联可以通过使用二环己基碳二亚胺/羟基苯并三唑法在N-甲基吡咯烷酮中完成。在MAP肽合成完成以后，解保护和从树脂支持物上裂解通过用三氟醋酸处理来完成。最终的产物通过反相高效液相色谱和MALDITOF质谱来鉴定。

作为实例，SEQ ID NO 4被连接到GnRH B表位上，在一个实验中连接到N末端(PG)，在另一个实验中连接到C末端(GP)。在这两个实验中，SEQ ID NO 4通过肽键直接连接GnRH B表位，而肽免疫原以四聚体MAP形式聚合。

由于Th表位可以由连续的或不连续的氨基酸片段组成，因此并非每一个Th表位的氨基酸片段都必然参与MHC识别。前述的Th表位可以包括免疫功能性同系物，包括免疫增强同系物，交叉反应同系物，保守性替换、添加、缺失和插入，Th表位的片段，和与前述的Th表位序列有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％或95％同源性(一致性)的序列。这里所使用的两个氨基酸或核酸序列的同源性或一致性百分比使用Karlin和Aitschul修改(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90-5873-5877，1993)的Karlin和Altschul的运算法则(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268，1990)来确定。这一算法被加入Altschul等人的XBLAST程序中(J.Mol.Biol.215：403-410，1990)。可以用XBLAST程序进行BLAST蛋白检索，得分＝50，字长＝3，以获得与参照多肽同源的氨基酸序列。当使用XBALST程序时，使用该程序的默认参数。

本发明还涉及包含免疫学有效量的肽免疫原和药学上可接受的载体的组合物的递送系统。肽免疫原的合适剂量通常包括每千克体重约0.005mg到约1.5mg肽免疫原。这一剂量可以分成多次施用，此时，每一剂中分到合适的量。正如免疫和治疗领域所熟知的，给药量依赖于患者的年龄、体重和健康状况。合适量的肽免疫原可以以疫苗组合物的形式配制在佐剂、乳化剂、或其他任何可药用载体，如明矾、不完全弗氏佐剂和ISA206(Montanide)中。本领域普通技术人员可以很容易地确定此制剂，包括立即和/或持续释放的制剂。该制剂可以通过任何一种便利的途径施用，包括皮下的、口服的、肌内的、腹膜内的，或其他肠胃外的或肠道的途径。

作为一个具体实例，本发明提供一种方法诱导抗GnRH抗体以使睾酮降低到一个可以实现小鼠有效避孕的水平，该方法涉及向哺乳动物施用一段合适时间的包含含有GnRH的肽免疫原的药物组合物。适当的剂量是每千克体重约1.428mg肽免疫原。

实施例1

A.肽的合成。包含连接到GnRH B表位的N末端和C末端的SEQID NO 1的Th表位的肽免疫原，以四聚体MAP形式被合成。四聚体MAP肽的合成是通过逐步的固相方法以Fmoc策略在[Fmoc-Lys(Fmoc)]2-Lys-βAla-Wang树脂(0.77mmo/g，ACT，Louisville，Kentucky，USA)上人工完成的。Fmoc氨基酸的偶联通过使用二环己基碳二亚胺/羟基苯并三唑法在N-甲基吡咯烷酮中进行。在MAP肽合成完成以后，解保护和从树脂支持物上裂解通过用三氟醋酸处理来完成。最终的产物通过反相高效液相色谱和MALDI TOF质谱来鉴定。

B.免疫方案。使用三组每组五只4-5周龄雄性BALB/c小鼠，其中一组是对照组。它们在特殊的无病原体条件下饲养，之后被转移到常规的动物房用于实验。所有工作，包括动物的笼养、实验和处理，一般都是按照动物相关生物医学研究的国际施行准则(CIOMS Publication No.ISBN92 90360194，1985)来实施的。首先，小鼠被称重。4-5周龄雄性BALB/c小鼠的平均重量是35克。第二步，对于第一组，50μg的免疫原肽(具有连接到GnRH B表位N末端的SEQ ID NO 1的四聚体MAP肽)被溶解在100μl PBS中，用相等体积的佐剂ISA206(Montanide)乳化，并使用POLYTRON PT3100(kinematic model)在2000rpm下混合1小时。对于第二组，50μg的免疫原肽(具有连接到GnRH B表位C末端的SEQ ID NO1的四聚体MAP肽)被溶解在100μl PBS中，在100μl ISA206(Montanide)中乳化，并使用POLYTRON PT3100(kinematic model)在2000rpm下混合1小时。对于对照组，使用佐剂加上PBS。第三步，在第0周时，第一组和第二组中的每一只小鼠使用各自的肽免疫原以50μg/200μl的剂量进行皮下接种。对照组的小鼠注射200μl包括PBS和佐剂(1∶1)的溶液。在第2周和第4周，皮下加增注射相同接种物。第四步，在第6周和第10周通过眼眶后血管丛穿刺收集血液进行ELISA分析。收集到的血液在5000r.p.m.下离心10分钟，血清在冰箱中以-20℃保存。

C.免疫原性测定。血清样品通过ELISA检验对抗不同肽——G4(GnRH的四聚体MAP形式)、八聚体MAP形式的T1(T1)₈，八聚体MAP形式的sT1(sT1)₈，和八聚体MAP形式的tT1(tT1)₈——的抗体。ELISA分析使用96孔ELISA板(Nalge nunc)来进行。各种肽抗原被吸附在ELISA板上，浓度为0.5μg/孔于100μl/孔的碳酸氢盐包被缓冲液(1.378g Na₂CO₃，2.94g NaHCO₃于1L ddH₂O中)中，并在4℃下孵育过夜。然后，包被缓冲液被丢弃，使用洗涤缓冲液(0.5ml Tween-20于1升1X PBS中)洗ELISA板三次。然后ELISA板使用5％BSA以100μl/孔封闭并在4℃下孵育过夜。丢弃封闭溶液，ELISA板保存在-20℃供使用。测试血清在5％BSA中以1∶100X稀释，每孔放置100μl。使测试血清在室温反应2小时。然后丢弃测试血清稀释物，用洗涤缓冲液洗ELISA板三次。然后，山羊抗小鼠IgG(Sigma，Fab特异性，A-1293，Lot 28H4859，碱性磷酸酶缀合物)以1∶5000X稀释，每孔放置100μl，在室温下反应2小时。然后弃去血清稀释物，用洗涤缓冲液洗ELISA板三次。100μl/孔的显色缓冲液(15mg pNPP(对硝基苯磷酸)(3片，Pierce的产品号34047)于15ml的10mM二乙醇胺缓冲液(pH9.5)中)被添加到ELISA板，在37℃下显色半小时。吸光值，即光密度，在405nm处测量。

D.免疫原生物效能检测。三组小鼠的睾酮水平在6wpi和10wpi时使用Ciba Corning自动化学发光(ACS^TM)睾酮检测试剂盒来测定。ACS睾酮检测试验的睾酮测量浓度最高可以达到1500ng/dL而最小可测浓度为10ng/dL(＝0.347nmol/L)。血清睾酮水平低于10ng/dL被认为是“去势”水平，而，低于57.6ng/dL(2nmol/L)被认为是所研究的免疫避孕疫苗的应答者。

E.结果。如图1所示，在免疫后第10周，肽免疫原T1G和GT1都引发了针对G4的高抗体反应，然而，GT1引起更强的针对G4的抗体反应。所激发的抗体的精细特异性见图2，与GT1比，T1G产生了抗(T1)⁸及其衍生物(sT1)⁸和(tT1)⁸的高抗体反应。至于睾酮的降低，T1G在降低雄性小鼠的睾酮水平方面具有显著的结果，如图1所示，读数为46ng/dL。

实施例2

A.肽的合成。包含连接到GnRH B表位的N末端和C末端的SEQID NO 1的Th表位的肽免疫原，以四聚体MAP形式被合成。四聚体MAP肽的合成是通过逐步固相方法以Fmoc策略在[Fmoc-Lys(Fmoc)]2-Lys-βAla-Wang树脂(0.77mmo/g，ACT，Louisville，Kentucky，USA)上人工完成的。Fmoc氨基酸的偶联通过使用二环己基碳二亚胺/羟基苯并三唑法在N-甲基吡咯烷酮中进行。在MAP肽合成完成以后，解保护和从树脂支持物上裂解通过用三氟醋酸处理来完成。最终的产物通过反相高效液相色谱和MALDI TOF质谱来鉴定。

B.免疫方案。使用五组4-5周龄雄性大鼠，三组为对照组。除第五组包括5只阉割的大鼠外，所有的组都包括4只大鼠。它们在特殊的无病原体条件下饲养，并被转移到常规的动物房用于实验。所有工作，包括动物的笼养、实验和处理，一般都是按照动物相关生物医学研究的国际施行准则(CIOMS Publication No.ISBN92 90360194，1985)来实施的。首先，大鼠被称重。4-5周龄雄性大鼠的平均重量是100克。第二步，对于第一组，每100μg的免疫原肽(具有连接到GnRH B表位N末端的SEQ ID NO 1的四聚体MAP肽)被溶解在200μl PBS中，用相等体积的佐剂ISA206(Montanide)乳化，并使用POLYTRON PT3100(kinematic model)在2000rpm下混合1小时。对于第二组，每100μg的免疫原肽(具有连接到GnRH B表位C末端的SEQ ID NO 1的四聚体MAP肽)被溶解在200μl PBS中，在200μl的ISA206(Montanide)中乳化，并使用POLYTRONPT3100(kinematic model)在2000rpm下混合1小时。对于第一个对照组(第三组)，使用化学偶联到GnRH上的载体蛋白PEK8(有附加的C末端8个赖氨酸的假单胞菌外毒素)(PEK8G)。对于第二个对照组(第四组)，使用佐剂加PBS。对于第三个对照组(第五组)，这些被阉割的大鼠不接受注射。第三步，在第0、2和4周，第一组和第二组中的每一只大鼠用相应的肽免疫原以100μg/400μl的剂量进行皮下接种。第三组中的大鼠注射400μl的佐剂加PEK8G。在一个对照组(第四组)中的大鼠注射400μl的佐剂加PBS。另一个对照组中的被阉割的大鼠不进行任何注射。在2wpsb，也就是第二次加强注射后的2周，收集血液。血液在5000r.p.m.下离心10分钟，血清被保存在-20℃的冰箱中。

C.免疫原性测定。用血清样品来检测抗不同肽——G4(GnRH的四聚体MAP形式)、(T1)⁸，(sT1)⁸和(tT1)⁸——的抗体。ELISA分析使用96孔ELISA板(Nalge nunc)来进行。各种肽抗原被吸附到ELISA板上，浓度为0.5μg/孔于100μl/孔的碳酸氢盐包被缓冲液(1.378g Na₂CO₃，2.94gNaHCO₃于1L ddH₂O中)中，并在4℃下孵育过夜。然后，包被缓冲液被丢弃，使用洗涤缓冲液(0.5ml Tween-20于1升1X PBS中)洗ELISA板三次。然后ELISA板使用5％BSA以100μl/孔封闭并在4℃下孵育过夜。封闭溶液被丢弃，ELISA板被保存在-20℃供使用。测试血清在5％BSA中以1∶100X稀释，每孔放置100μl。测试血清在室温反应2小时。然后丢弃测试血清稀释物，用洗涤缓冲液洗ELISA板三次。然后，山羊抗大鼠IgG(Sigma，全分子，A-8438，Lot 95H8940，碱性磷酸酶缀合物)以1∶10000X稀释，每孔放置100μl，在室温下反应2小时。然后血清稀释物丢弃，用洗涤缓冲液洗ELISA板三次。100μl/孔的显色缓冲液(15mg pNPP(3片，Pierce产品No.34047)于15ml的10mM二乙醇胺缓冲液(pH9.5)中)被添加到ELISA板，在37℃下显色半小时。吸收值，即光密度，在405nm处测量。

D.免疫原生物效能检测。四组大鼠的睾酮水平在2wpb时，也就是加强注射后2周，使用Ciba Corning自动化学发光(ACS^TM)睾酮检测试剂盒来测定。ACS睾酮检测试验的睾酮测量浓度最高可达到1500ng/dL，最小可测浓度为10ng/dL(＝0.347nmol/L)。

E.结果。如图2所示，在2wpb时，肽免疫原T1G和GT1都激发了针对G4的抗体反应。在激发的抗体的精细特异性方面，与GT1相比，T1G产生了抗(T1)⁸及其衍生物(sT1)⁸和(tT1)⁸的高抗体反应，见图2A。至于睾酮的降低，所有四只注射了T1G的大鼠均具有在应答者水平上的降低的睾酮水平，见图2B。

实施例3

A.肽的合成。包含连接到GnRH B表位的N末端的SEQ ID NO 1的Th表位的肽免疫原，以四聚体MAP形式被合成。四聚体MAP肽的合成是通过逐步固相方法以Fmoc策略在[Fmoc-Lys(Fmoc)]2-Lys-βAla-Wang树脂(0.77mmo/g，ACT，Louisville，Kentucky，USA)上人工完成的。Fmoc氨基酸的偶联通过使用二环己基碳二亚胺/羟基苯并三唑法在N-甲基吡咯烷酮中进行。在MAP肽合成完成以后，解保护和从树脂支持物上裂解通过用三氟醋酸处理来完成。最终的产物通过反相高效液相色谱和MALDI TOF质谱来鉴定。

B.免疫方案。使用五只3.5月龄的小猎犬。它们在特殊的无病原体条件下饲养，并被转移到常规的动物房用于实验。所有工作，包括动物的笼养、实验和处理，一般都是按照动物相关生物医学研究的国际施行准则(CIOMS Publicaiton No.ISBN92 90360194，1985)来实施的。首先，猎犬被称重。3.5月龄猎犬平均重量为5.83kg。第二步，对于测试组1(猎犬号B83，B87)，40μg的免疫原肽(具有连接到GnRH B表位的N末端的SEQ ID NO 1的四聚体MAP肽)被溶解在100μl PBS中，用相等体积的佐剂ISA206(Montanide)乳化，并使用POLYTRON PT3100(kinematicmodel)在2000rpm下混合1小时。对于测试组2，(猎犬号B84，B85，B86)，160μg的免疫原肽(连接到GnRH B表位的N末端的SEQ ID NO1的四聚体MAP肽)被溶解在200μl PBS中，用相等体积的佐剂ISA206(Montanide)乳化，并使用POLYTRON PT3100(kinematic model)在2000rpm下混合1小时。第三步，在0月时，测试组1和测试组2中的猎犬分别以40μg/200μl和160μg/400μl的剂量皮下接种T1G肽免疫原。第3月时用相同接种物进行皮下加强注射。第四步，每个月从肘正中静脉收集血液。血液在5000r.p.m.下离心10分钟，血清被保存在-20℃的冰箱中。

C.免疫原性测定。用血清样品来检测抗G4的抗体。ELISA分析使用96孔ELISA板(Nalge nunc)来进行。各种肽抗原被吸附到ELISA板上，浓度为0.5μg/孔于100μl/孔的碳酸氢盐包被缓冲液(1.378g Na₂CO₃，2.94g NaHCO₃于1L ddH₂O中)中，并在4℃下孵育过夜。然后，包被缓冲液被丢弃，使用洗涤缓冲液(0.5ml Tween-20于1升1X PBS缓中)洗ELISA板三次。然后ELISA板使用5％BSA以100μl/孔封闭并在4℃下孵育过夜。封闭溶液被丢弃，ELISA板被保存在-20℃供使用。测试血清在5％BSA中以1∶100X稀释，每孔放置100μl。测试血清在室温反应2小时。然后测试血清稀释物被弃去，用洗涤缓冲液洗ELISA板三次。然后，与碱性磷酸酶缀合的兔抗狗IgG(全分子)(Sigma，A0793)以1∶4000X稀释，每孔放置100μl，在室温下反应2小时。然后抗体稀释物被弃去，用洗涤缓冲液洗ELISA板三次。100μl/孔的显色缓冲液(15mg pNPP(3片，Pierce产品No.34047)于15ml的10mM二乙醇胺缓冲液(pH9.5)中)被添加到ELISA板，在37℃下显色半小时。吸收值，即光密度，在405nm处测量。

D.免疫原生物效能检测。两组猎犬的睾酮水平在2mpi(第一次接种后的月份数)，3mpi，4mpi和5.5mpi时，使用Ciba Corning自动化学发光(ACS^TM)睾酮检测试剂盒来测定。ACS睾酮检测试验的睾酮测量浓度最高可达到1500ng/dL，最小可测浓度为10ng/dL(＝0.347nmol/L)。血清睾酮水平低于10ng/dL被认为是“去势”水平，然而，低于57.6ng/dL(2nmol/L)被认为是所研究的免疫避孕疫苗的应答者。

E.结果。如图3所示，在以剂量160μg首次接种后的第4个月T1G产生了针对G4的最高抗体反应。在首次接种后的第4个月，T1G也显著地降低了猎犬B85和B86的睾酮水平，读数分别是9和7ng/dL。

实施例4

A.肽的合成。包含连接到GnRH的SEQ ID NO 2的Th表位的肽免疫原，以四聚体MAP形式被合成。四聚体MAP肽的合成是通过逐步固相方法以Fmoc策略在[Fmoc-Lys(Fmoc)]2-Lys-β Ala-Wang树脂(0.77mmo/g，ACT，Louisville，Kentucky，USA)上人工完成的。Fmoc氨基酸的偶联通过使用二环己基碳二亚胺/羟基苯并三唑法在N-甲基吡咯烷酮中进行。在MAP肽合成完成以后，解保护和从树脂支持物上裂解通过用三氟醋酸处理来完成。最终的产物通过反相高效液相色谱和MALDITOF质谱来鉴定。

B.免疫方案。使用两组每组五只4-5周龄雄性BALB/c小鼠，一组作为对照组。它们在特殊的无病原体条件下饲养，并被转移到常规的动物房用于实验。所有工作，包括动物的笼养、实验和处理，一般都是按照动物相关生物医学研究的国际施行准则(CIOMS Publicaiton No.ISBN9290360194，1985)来实施的。小鼠被称重。4-5周龄雄性BALB/c小鼠的平均重量是35克。第二步，对于测试组，50μg的免疫原肽(具有连接到GnRH B表位N末端的SEQ ID NO 2的四聚体MAP肽)被溶解在100μl PBS中，用相等体积的佐剂ISA206(Montanide)乳化，并使用POLYTRON PT3100(kinematic model)在2000rpm下混合1小时。对于对照组，使用佐剂加PBS。第三步，在第0周时，测试组中的每一只小鼠使用相应肽免疫原以50μg/200μl的剂量进行皮下接种。对照组的小鼠注射200μl PBS加佐剂。在第2周和第4周，用同样的接种物进行皮下的加强注射。第四步，在第6周、第8周和第10周通过眼眶后丛穿刺收集血液进行ELISA分析。收集到的血液在5000r.p.m.下离心10分钟，血清在冰箱中以-20℃保存。

C.免疫原性测定。血清样品通过ELISA来检测抗不同肽——G4、(T1)⁸，(sT1)⁸和(tT1)⁸的抗体。ELISA分析使用96孔ELISA板(Nalge nunc)来进行。各种肽抗原被吸附到ELISA板上，浓度为0.5μg/孔于100μl/孔的碳酸氢盐包被缓冲液(1.378g Na₂CO₃，2.94g NaHCO₃于1L ddH₂O中)中，并在4℃下孵育过夜。然后，包被缓冲液被丢弃，使用洗涤缓冲液(0.5mlTween-20于1升1X PBS中)洗ELISA板三次。然后ELISA板使用5％BSA以100μl/孔封闭并在4℃下孵育过夜。封闭溶液被丢弃，ELISA板被保存在-20℃供使用。测试血清在5％BSA中以1∶100X稀释，每孔放置100μl。测试血清在室温反应2小时。然后测试血清稀释物被丢弃，用洗涤缓冲液洗ELISA板三次。然后，山羊抗小鼠IgG(Sigma，Fab特异性，A-1293，Lot 28H4859，碱性磷酸酶缀合物)以1∶5000X稀释，每孔放置100μl，在室温下反应2小时。然后抗体稀释物被丢弃，用洗涤缓冲液洗ELISA板三次。100μl/孔的显色缓冲液(15mg pNPP(3片，Pierce产品No.34047)于15ml的10mM二乙醇胺缓冲液(pH9.5)中)被添加到ELISA板，在37℃下显色半小时。吸收值，即光密度，在405nm处测量。

D.免疫原生物效能检测。两组小鼠的睾酮水平在6wpi、8wpi和10wpi时使用Ciba Corning自动化学发光(ACS^TM)睾酮检测试剂盒来测定。ACS睾酮检测试验的睾酮测量浓度最高可达到1500ng/dL，最小可测浓度为10ng/dL(＝0.347nmol/L)。血清睾酮水平低于10ng/dL被认为是“去势”水平，而，低于57.6ng/dL(2nmol/L)被认为是所研究的免疫避孕疫苗的应答者。

E.结果。如图4所示，在首次接种后第10周，sT1G引发了针对G4的最高抗体反应。在所激发的抗体的精细特异性方面，sT1G也引起了抗(T1)⁸及其衍生物(sT1)⁸和(tT1)⁸的抗体反应，其中抗(tT1)⁸反应更强。至于睾酮的降低，sT1G没有显示在降低雄性小鼠体内睾酮水平方面有显著的结果。

实施例5

A.肽的合成。包含连接到GnRH的SEQ ID NO 3的Th表位的肽免疫原，以四聚体MAP形式被合成。四聚体MAP肽的合成是通过逐步固相法以Fmoc策略在[Fmoc-Lys(Fmoc)]2-Lys-βAla-Wang树脂(0.77mmo/g，ACT，Louisville，Kentucky，USA)上人工完成的。Fmoc氨基酸的偶联通过使用二环己基碳二亚胺/羟基苯并三唑法在N-甲基吡咯烷酮中进行。在MAP肽合成完成以后，解保护和从树脂支持物上裂解通过用三氟醋酸处理来完成。最终的产物通过反相高效液相色谱和MALDITOF质谱来鉴定。

B.免疫方案。使用两组每组五只4-5周龄雄性BALB/c小鼠，一组作为对照组。它们在特殊的无病原体条件下饲养，并被转移到常规的动物房用于实验。所有工作，包括动物的笼养、实验和处理，一般都是按照动物相关生物医学研究的国际施行准则(CIOMS Publicaiton No.ISBN9290360194，1985)来实施的。首先，小鼠被称重。4-5周龄雄性BALB/c小鼠的平均重量是35克。第二步，对于测试组，50μg的免疫原肽(具有连接到GnRH B表位N末端的SEQ ID NO 3的四聚体MAP肽)被溶解在100μl PBS中，用相等体积的佐剂ISA206(Montanide)乳化，并使用POLYTRON PT3100(kinematic model)在2000rpm下混合1小时。对于对照组，使用佐剂加PBS。第三步，在第0周时，测试组中的每一只小鼠使用相应的肽免疫原以50μg/200μl的剂量进行皮下接种。对照组的小鼠注射200μl PBS加佐剂。在第2周和第4周，用同样的接种物进行皮下加强注射。第四步，在第6周、第8周和第10周通过眼眶后丛穿刺收集血液进行ELISA分析。收集到的血液在5000r.p.m.下离心10分钟，血清在冰箱中-20℃保存。

C.免疫原性测定。血清样品通过ELISA来检测抗不同肽——G4、(T1)₈，(sT1)₈和(tT1)₈的抗体。ELISA分析使用96孔ELISA板(Nalge nunc)来进行。各种肽抗原被吸附到ELISA板上，浓度为0.5μg/孔于100μl/孔的碳酸氢盐包被缓冲液(1.378g Na₂CO₃，2.94g NaHCO₃于1L ddH₂O中)中，并在4℃下孵育过夜。然后，包被缓冲液被丢弃，使用洗涤缓冲液(0.5mlTween-20于1升1X PBS中)洗ELISA板三次。然后ELISA板使用5％BSA以100μl/孔封闭并在4℃下孵育过夜。封闭溶液被丢弃，ELISA板被保存在-20℃供使用。测试血清在5％BSA中以1∶100X稀释，每孔放置100μl。测试血清在室温反应2小时。然后测试血清稀释物被丢弃，用洗涤缓冲液洗ELISA板三次。然后，山羊抗小鼠IgG(Sigma，Fab特异性，A-1293，Lot 28H4859，碱性磷酸酶缀合物)以1∶5000X稀释，每孔放置100μl，在室温下反应2小时。然后抗体稀释物丢弃，用洗涤缓冲液洗ELISA板三次。100μl/孔的显色缓冲液(15mg pNPP(3片，Pierce产品No.34047)于15ml的10mM二乙醇胺缓冲液(pH9.5)中)被添加到ELISA板，在37℃下显色半小时。吸收值，即光密度，在405nm处测量。

D.免疫原生物效能检测。两组小鼠的睾酮水平在6wpi、8wpi和10wpi时使用Ciba Corning自动化学发光(ACS^TM)睾酮检测试剂盒来测定。ACS睾酮检测试验的睾酮测量浓度最高可达到1500ng/dL，最小可测浓度为10ng/dL(＝0.347nmol/L)。血清睾酮水平低于10ng/dL被认为是“去势”水平，而，低于57.6ng/dL(2nmol/L)被认为是所研究的免疫避孕疫苗的应答者。

E.结果。如图5所示，在首次接种后第6周，tT1G引发了针对G4的最高抗体反应。在所激发的抗体的精细特异性方面，sT1G也引起了抗(T1)⁸及其衍生物(sT1)⁸和(tT1)⁸的抗体反应，其中抗(tT1))⁸的反应更强。至于睾酮的降低，tT1G在首次接种后第10周显著降低雄性小鼠体内的睾酮水平，读数是34ng/dL。

实施例6

A.肽的合成。包含连接到GnRH B表位的N末端和C末端的SEQID NO 4的Th表位的肽免疫原，以四聚体MAP形式被合成。四聚体MAP肽的合成是通过逐步固相法以Fmoc策略在[Fmoc-Lys(Fmoc)]2-Lys-βAla-Wang树脂(0.77mmo/g，ACT，Louisville，Kentucky，USA)上人工完成的。Fmoc氨基酸的偶联通过使用二环己基碳二亚胺/羟基苯并三唑法在N-甲基吡咯烷酮中进行。在MAP肽合成完成以后，解保护和从树脂支持物上裂解通过用三氟醋酸处理来完成。最终的产物通过反相高效液相色谱和MALDI TOF质谱来鉴定。

B.免疫方案。使用三组每组五只4-5周龄雄性BALB/c小鼠，一组作为对照组。它们在特殊的无病原体条件下饲养，并被转移到常规的动物房用于实验。所有工作，包括动物的笼养、实验和处理，都是按照动物相关生物医学研究的国际施行准则(CIOMS Publicaiton No.ISBN9290360194，1985)来实施的。首先，小鼠被称重。4-5周龄雄性BALB/c小鼠的平均重量是35克。第二步，对于第一组，50μg的免疫原肽(具有连接到GnRH B表位N末端的SEQ ID NO 4的四聚体MAP肽)被溶解在100μl PBS中，用相等体积的佐剂ISA206(Montanide)乳化，并使用POLYTRON PT3100(kinematic model)在2000rpm下混合1小时。对于第二组，50μg的免疫原肽(具有连接到GnRH B表位C末端的SEQ ID NO4的四聚体MAP肽)被溶解在100μl PBS中，用100μl ISA206(Montanide)乳化，并使用POLYTRON PT3100(kinematic model)在2000rpm下混合1小时。对于对照组，使用佐剂加PBS。第三步，在第0周时，第一组和第二组中的每一只小鼠使用相应的肽免疫原以50μg/200μl的剂量进行皮下接种。对照组的小鼠注射200μl PBS加佐剂。在第2周和第4周，用同样的接种物进行皮下加强注射。第四步，在第6周、第8周和第10周通过眼眶后丛穿刺收集血液进行ELISA分析。收集到的血液在5000r.p.m.下离心10分钟，血清在冰箱中以-20℃保存。

C.免疫原性测定。血清样品通过ELISA来检测抗各种肽——G4、(T1)⁸，(sT1)⁸和(tT1)⁸的抗体。ELISA分析使用96孔ELISA板(Nalge nunc)来进行。各种肽抗原被吸附到ELISA板上，浓度为0.5μg/孔于100μl/孔的碳酸氢盐包被缓冲液(1.378g Na₂CO₃，2.94g NaHCO₃于1L ddH₂O中)中，并在4℃下孵育过夜。然后，包被缓冲液被丢弃，使用洗涤缓冲液(0.5mlTween-20于1升1X PBS中)洗ELISA板三次。然后ELISA板使用5％BSA以100μl/孔封闭并在4℃下孵育过夜。封闭溶液被丢弃，ELISA板被保存在-20℃供使用。测试血清在5％BSA中以1∶100X稀释，每孔放置100μl。测试血清在室温反应2小时。然后丢弃测试血清稀释物，用洗涤缓冲液洗ELISA板三次。然后，山羊抗小鼠IgG(Sigma，Fab特异性，A-1293，Lot 28H4859，碱性磷酸酶缀合物)以1∶5000X稀释，每孔放置100μl，在室温下反应2小时。然后抗体稀释物丢弃，用洗涤缓冲液洗ELISA板三次。100μl/孔的显色缓冲液(15mg pNPP(3片，Pierce产品No.34047)于15ml的10mM二乙醇胺缓冲液(pH9.5)中)被添加到ELISA板，在37℃下显色半小时。吸收值，即光密度，在405nm处测量。

D.免疫原生物效能检测。这三组小鼠的睾酮水平在6wpi、8wpi和10wpi时使用Ciba Corning自动化学发光(ACS^TM)睾酮检测试剂盒来测定。ACS睾酮检测试验的睾酮测量浓度最高可达到1500ng/dL，最小可测浓度为10ng/dL(＝0.347nmol/L)。血清睾酮水平低于10ng/dL被认为是“去势”水平，而，低于57.6ng/dL(2nmol/L)被认为是所研究的免疫避孕疫苗的应答者。

E.结果。如图6所示，在首次接种后第10周，肽免疫原PG和GP都引发了针对G4的高抗体反应，但，PG具有更强的抗G4的抗体反应。至于睾酮的降低，PG和GP都没有在降低雄性小鼠体内睾酮水平方面显示出显著结果。

                              序列表

<110>创生生物科技股份有限公司

<120>具有偶联到B细胞表位上的人造T辅助细胞表位的分枝合成肽免疫原构建体

<130>87155176-002001

<160>5

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>13

<212>PRT

<213>流感病毒(Influenza virus)

<220>

<221>肽

<222>(1)..(13)

<400>1

Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr

1               5                   10

<210>2

<211>10

<212>PRT

<213>流感病毒

<220>

<221>肽

<222>(1)..(10)

<400>2

Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu

1               5                   10

<210>3

<211>8

<212>PRT

<213>流感病毒

<220>

<221>肽

<222>(1)..(8)

<400>3

Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr

1               5

<210>4

<211>13

<212>PRT

<213>Enterovirus Poliovirus

<220>

<221>肽

<222>(1)..(13)

<400>4

Lys Leu Phe Ala Val Trp Lys Ile Thr Tyr Lys Asp Thr

1               5                   10

<210>5

<211>10

<212>PRT

<213>哺乳动物

<220>

<221>肽

<222>(1)..(10)

<400>5

Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly

1               5                   10