一种预测急性髓细胞性白血病患者化疗效果的方法

摘要

本发明涉及一种用药前对急性髓细胞性白血病患者的化疗效果进行预测的方法，包括以下步骤：抽提白血病患者自身正常组织的DNA；进行脱氧胞苷激酶基因(dCK)启动子区域两个多态位点的基因型分析；若患者的基因型为－199CG/－40CT、－199CC/－40CT、－199GG/－40TT，则可以预测该患者对阿糖胞苷的反应性好；若患者的基因型为－199CC/－40CC，则可以预测该患者对阿糖胞苷的反应性差。

说明书

技术领域

本发明涉及一种根据该人体基因片段的基因型预测急性髓细胞性白血病患者对化疗药物反应的方法。

背景技术

临床上，急性髓细胞性白血病(AML)的治疗效果通常依靠化疗后患者的骨髓象，外周血象结合临床症状、体征加以判断，在实验室技术条件支持的情况下，也可综合染色体、融合基因水平的检测结果为临床治疗提供参考，有的实验室出于科研目的，甚至还能够进行白血病化疗相关药物的血药浓度监测。

对于急性髓细胞性白血病患者的骨髓象，染色体、融合基因水平的检测结果必须通过化疗后定期骨穿采样后获得，在检测的同时也增加了患者的痛苦，并且由于只有少数的急性髓细胞性白血病患者具有特征性的染色体、融合基因水平的异常，如急性髓细胞性白血病中的急性早幼粒细胞白血病亚型具有特征性的15号和17号染色体易位而形成PML-RAR融合基因以及部分M2b型白血病伴有8号和21号染色体易位而形成AML1-ETO融合基因，大部分的急性髓细胞性白血病患者并不能利用这项检测为临床治疗提供依据，且检测费用也较昂贵。而血药浓度监测由于目前只在具备条件的实验室以科研性质开展，并不能作为临床的一项常规检测。另外，这些现有技术最关键的不足还在于只能在用药后进行监测，使临床医师最初的用药方案带有一定的盲目性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种在用药前对急性髓细胞性白血病患者的化疗效果进行预测的方法，使临床医师根据不同患者的遗传学水平制定出相应的化疗方案，克服盲目用药给患者躯体和经济所带来的损失。

本发明用药前对急性髓细胞性白血病患者的化疗效果进行预测的方法，包括如下步骤：

抽提白血病患者自身正常组织的DNA；

进行脱氧胞苷激酶基因(dCK)启动子区域两个多态位点的基因型分析；

若患者的基因型为-199CG/-40CT、-199CC/-40CT、-199GG/-40TT，则可以预测该患者对阿糖胞苷的反应性好；

若患者的基因型为-199CC/-40CC，则可以预测该患者对阿糖胞苷的反应性差。

本发明的优点为克服了必须在患者用药后判定疗效的不足，可以在用药前抽提白血病患者自身正常组织(如漱口液中脱落的口腔黏膜细胞等)的DNA进行dCK基因启动子区域两个多态位点的基因型分析，以了解患者对阿糖胞苷的反应性，而不必进行骨穿获取骨髓标本，减少了患者的痛苦，为临床用药提供依据，减少了盲目性，检测花费相对较少。

附图说明

图1为PCR产物电泳结果图。

图2为-199CG/-40CT型脱氧胞苷激酶基因部分启动子区域序列。

图3为利用自动程序装置(ABI3700)测出的脱氧胞苷激酶基因序列图。

图4为四例基因型为-199CC/-40CC，及四例基因型为-199CG/-40CT患者的半定量RT-PCR结果。

图5表示在COS-7细胞中进行荧光素酶活性实验的结果。

具体实施方式

急性髓细胞性白血病化疗方案以阿糖胞苷和蒽环类抗生素联合用药为主，阿糖胞苷进入体内后主要在脱氧胞苷激酶的催化下形成药物的活性形式--阿糖胞苷三磷酸，本发明在分子生物学水平利用测序技术发现了两个与急性髓细胞性白血病患者化疗效果密切相关的单核苷酸多态性位点。这两个单核苷酸多态性位点就是位于脱氧胞苷激酶基因的启动子区域，根据现有分子生物学知识，基因的启动子区域对基因的表达起者关键作用。

下面具体介绍本发明在实验中的DCK基因的提取分离方法及不同基因类型对阿糖胞苷药物反应的实验结果。

脱氧胞苷激酶基因的提取分离包括以下过程：

1、引物设计

引物设计采用的软件采用的是网页界面的Primer3，为麻省理工生物医学白头研究所开发(http：//www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3 www.cgi)。我们引物设计主要是针对基因的启动子区(转录起始点上游1.5-2kb范围)进行的，引物序列如下：

dCK-P-F：5’ctctcagtgcctgttttccca 3’

dCK-P-R：5’ccgctaagccagatcctgac 3’，

扩增片断长度为701bp，退火温度为60℃。

2、DNA抽提

(1)经肝素抗凝的骨髓标本5ml，当天用淋巴细胞分离液(Ficoll)分离单个核细胞，1×PBS(磷酸缓冲盐溶液)洗涤后，加入5-10ml白细胞裂解液(一般10-20×10⁶个细胞加1ml裂解液)和蛋白酶K(终浓度为200ng/ml)，37℃下以40转/分摇床震摇过夜，加入等体积的已用1MTris-HCl(一种酸碱缓冲液，pH8.0)平衡至pH＞7.8的等体积苯酚-氯仿(1∶1)混合液，缓慢地来回颠倒数分钟，室温下3000rpm离心10分钟，吸去下层有机相，重复抽提1-2次，等体积氯仿抽提1次，加入2倍体积无水乙醇和1/20体积3M氯化钠(NaCl)，轻轻混匀后，移出云絮状DNA沉淀，70％乙醇洗涤2次，自然晾干后加入适量TE(pH8.0)溶解(37℃温箱过夜)。紫外分光光度计测其浓度后，取适量稀释至25ng/ul。

(2)采集无活动性出血患者的漱口液标本(口含15ml无菌生理盐水漱口1分钟后吐于50ml离心管，间隔数分钟后重复2次)，当日3000rpm离心15分钟，收集口腔黏膜脱落细胞。根据Wizard基因组DNA纯化试剂盒提供的试剂和操作流程抽提口腔黏膜脱落细胞中的DNA。

3、样本DNA的体外扩增(PCR)

采用申友公司的Taq酶，反应体系(25μl)为：10×Buffer(缓冲液)2.5μl，引物(10μM)0.4μl×2，dNTPmix(10mM)0.5μl，Mgcl₂(25mM)1.5μl，Taq酶0.25μl，ddH₂o18.65μl，DNA模板25ng。采用Touch-down的PCR反应程序：95℃2分钟；94℃30分钟；63℃(1分钟-0.5℃/循环)；72℃45分钟，10个循环；94℃30分钟；58℃40分钟；72℃45分钟；33cycles；72℃7分钟；在4℃的条件下保存。

4、PCR产物电泳鉴定

PCR结束后，吸取2μl加入2μl 2×Loading Buffer(上样缓冲液)2000rpm(转/分)离心30秒后上样，在1.5％的琼脂糖(agarose)胶中100V电压20分钟。凝胶摄像仪拍摄结果请参阅图1，dCK启动子区域PCR产物电泳结果图，M代表区分PCR产物大小的标记，右侧条带为701bp大小的PCR产物条带。

5、PCR产物纯化

1)取特异PCR产物50ng左右，加入0.5单位虾碱酶和5单位外切酶I，补足水至7ul。

2)纯化反应程序：37℃60分钟，80℃15分钟，4℃保存。

3)取2μl纯化产物与2μl上样缓冲液混和后，电泳检测、定量。

6、对PCR片段进行测序

1)-20℃冰箱中取出PCR纯化产物(15ng/ul左右)、BigDye TerminationSequence Mix(一种商品化的测序反应混合液)、0.8uM单向引物(上文提到的PCR扩增反应中的反向引物dCK-P-R：5’ccgctaagccagatcctgac3’)，各取2ul加入96孔PCR反应管中。

2)PCR扩增：(9700型号PCR扩增仪，PE公司)

3)扩增结束后，加入70％乙醇(加入量与反应体系之比为9∶1)即50ul左右于室温进行沉淀，时间15分钟以上，不得超过24小时。

4)4000转/分，4℃离心30分钟。

5)轻轻倒去上清液，将96孔板倒置离心，达800转/分即停。

6)每孔加入200ul左右三蒸水，2000转/分1分钟离心，待上样。

7)在自动程序装置(ABI3700 Automatic Sequencer)上进行电泳。电泳胶用POP5标准测序胶，时间为3小时。

7、SNP位点的搜寻

将Sequence Analysis3.3分析产生的图形文件传至带有Phredphrap，Polyphred和Consed软件的UNIX主机上。先创建四个子目录chromat_dir，edit_dir，poly_dir和phd_dir，然后将每个样本的测序图形文件移至chromat_dir目录下，在edit_dir下先后运行phredphrap和polyphred。事实上，常常将phredphrap和polyphred做成批处理文件，只有运行这个文件即可，例如我们将之做成snp文件，故只要运行snp命令就可以了。运行结束后，还是在edit_dir目录下运行Consed命令，将结果以直观的图形界面显示。Polyphred会将软件怀疑的SNP位点标上提示信号如各种颜色。

根据上述实验，对脱氧胞苷激酶基因的编码区域，外显子和内含子的结合区，基因的启动子区域进行测序，在启动子区域区域发现了两个频率较高的单核苷酸多态性位点，它们在人群中组成了四种基因型。图2所示为一种脱氧胞苷激酶基因部分启动子区域序列，其中为起始密码子，aaagtca为转录起始点，两个单核苷酸多态性位点分别位于转录起始点上游第199个和第40个碱基处，对于此种脱氧胞苷激酶基因可以用-199CG/-40CT表示，另外其它三种类型分别为-199CC/-40CC，-199CC/-40CT，-199GG/-40TT。

请参阅图3，箭头所指为脱氧胞苷激酶基因转录起始点上游第199和40个碱基的多态分布，a代表脱氧胞苷激酶基因(dCK)启动子区域转录起始点上游第40个碱基处CC纯合子，CT杂合子和TT纯合子；b代表脱氧胞苷激酶基因(dCK)启动子区域转录起始点上游第199个碱基处CC纯合子，CG杂合子和GG纯合子。

根据临床白血病化疗疗效的判断依据，一个疗程获得完全缓解者判断为疗效好，若超过两个疗程仍未缓解则判断为疗效差。用化疗效果有差异的这两组急性髓细胞性白血病患者的骨髓标本，根据上述步骤抽提基因组DNA，PCR扩增后产物纯化并测序，进行基因型的检测，经过统计学分析，发现在疗效好(n＝60)和疗效差的(n＝64)的患者中，这四种基因型的分布存在显著性差异。如表1所示为脱氧胞苷激酶基因(dCK)启动子区域的两个单核苷酸多态性所组成的四种基因型在治疗效果好和差的急性髓细胞性白血病患者中的分布及统计学分析，可以看出，基因型为-199CC/-40CC的患者治疗效果较差，基因型为-199CG/-40CT，-199CC/-40CT，-199GG/-40TT的患者治疗效果相对较好。

                                  治疗疗效

基因型

                         好(n＝60)          差(n＝64)

-199CC/-40CC(％)         34(56.7)           50(78.1)

-199CG/-40CT(％)         23(38.3)           14(21.9)

-199CC/-40CT(％)         1(1.7)             0

-199GG/-40TT(％)         2(3.3)             0

T％                      23％               11％

确切概率                 0.018

                           表1

根据抽提部分患者(n＝30)漱口液中脱落的口腔黏膜细胞DNA，作为自身正常对照检测，发现这两个单核苷酸多态性为患者本身所具有，与疾病无关。

通过半定量RT-PCR检测，发现这四种基因型中的两种在基因mRNA表达水平存在差异，荧光素酶活性实验结果也提示基因型在转录水平存在差异。如图4所示，B1-B4代表四例dCK启动子区域转录起始点上游第40个和第199个碱基分别为CC和CC纯合子患者半定量RT-PCR结果；G1-G4代表四例dCK启动子区域转录起始点上游第40个和第199个碱基分别为CT和CG杂合子患者半定量RT-PCR结果，GAPDH为内对照，G1-G4患者dCK基因在mRNA水平表达高于B1-B4患者。根据已知基因理论，基因启动子区域能够调节基因的表达，dCK基因表达越高，患者对化疗药物阿糖胞苷越敏感(即疗效越好)，所以-199CG/-40CT基因型的患者的疗效比-199CC/-40CC基因型的患者好。

图5表示在COS-7细胞中进行荧光素酶活性实验的结果，纵坐标表示相对荧光素酶活性值，可以看出dCK基因启动子区域两个多态位点为-199CC/-40CC和-199GG/-40TT基因型的转录活性有10倍差异。pGL3-basic代表转录活性实验中的内对照，-199GG/-40TT和-199CC/-40CC转录活性都是以此为比较的，pGL3-CC+GG代表将-199GG/-40TT和-199CC/-40CC质粒共同转染COS-7细胞，造成类似于-199CG/-40CT杂合子的情况。转录活性的差异代表dCK基因启动子区域这两个多态位点所构成的基因型对基因表达有影响。

根据以上实验结果，本发明的方法在用药前对急性髓细胞性白血病患者的化疗效果进行预测，包括如下步骤：

抽提急性髓细胞性白血病患者自身正常组织的DNA；

进行脱氧胞苷激酶基因(dCK)启动子区域两个多态位点的基因型分析；

若患者的基因型为-199CG/-40CT、-199CC/-40CT、-199GG/-40TT，则可以预测该患者对阿糖胞苷的反应性好；

若患者的基因型为-199CC/-40CC，则可以预测该患者对阿糖胞苷的反应性差。

本发明技术方案克服了必须在患者用药后判定疗效的不足，可以在用药前抽提白血病患者自身正常组织(如漱口液中脱落的口腔黏膜细胞等)的DNA进行dCK基因启动子区域两个多态位点的基因型分析，以了解患者对阿糖胞苷的反应性，而不必进行骨穿获取骨髓标本，减少了患者的痛苦，为临床用药提供依据，减少了盲目性，检测花费相对较少。