内切β－1,4－葡聚糖酶的分离提纯方法

摘要

本发明公开了一种内切β－1，4－葡聚糖酶的分离提纯方法。方法的步骤如下：1)首先，将粗纤维素酶溶于乙醇－水溶液中，配制粗纤维素酶质量百分比浓度为1～3％，乙醇体积百分比浓度为10～40％的溶液，充分振荡使溶液混合均匀；2)然后，取20mL上述混合溶液加入到预热温度为20℃～40℃的高压釜中，继而通入预热温度为20℃～40℃，压力为3.5～8.0MPa的CO

说明书

技术领域

本发明涉及一种分离纯化方法，尤其是涉及一种采用加压CO₂作为挥发性酸，乙醇作为助沉淀剂的等电沉淀技术分离提纯内切β-1，4-葡聚糖酶的方法。

背景技术

内切β-1，4-葡聚糖酶是纤维素酶中的一种。纤维素酶(cellulase)指的是降解纤维素的一类酶的总称，其最大的用途是把纤维素通过酶法水解成葡萄糖。纤维素是自然界中含量最丰富的碳水化合物，超过其他碳水化合物的总和，是一类重要的可再生资源和能源。因而纤维素酶的研究被认为是新世纪开发利用可再生性资源的关键，对于解决工农业原料来源、能源危机、环境污染等问题具有十分重要的意义。现在纤维素酶应用已扩展到医药、纺织、日用化工、造纸、食品发酵、工业洗涤、烟草、石油开采、废水处理及饲料等许多领域。目前尚未有专门针对内切β-1，4-葡聚糖酶的分离提纯工艺，该酶主要存在于粗纤维素酶之中。作为本方法原料的粗纤维素酶由里氏木霉(菌株3.3006经诱变得到，CGMCC菌种目录，1997第三版)经固体培养后，盐析制得[1]。该提纯工艺存在酶活损失较为严重等缺点，且产品一般为多种酶类混合制品，不利于单一酶组分性质的研究和单一酶组分的应用。

参考文献

[1]Yao Shanjing，Guan Yixin，Yu Lihua，Characterization of crude cellulase fromTrichoderma reesei and purification of cellulase，Chinese Journal of ChemicalEngineering，2002，10(6)，723-725

发明内容

本发明的目的是提供一种内切β-1，4-葡聚糖酶的分离提纯方法。

方法的步骤如下：

1)首先，将粗纤维素酶溶于乙醇-水溶液中，配制纤维素酶浓度为1～3％(质量百分比)，乙醇浓度为10～40％(体积百分比)的溶液，充分振荡使溶液混合均匀；

2)然后，取20mL上述混合溶液加入到预热温度为20～40℃的高压釜中，继而通入预热温度为20～40℃，压力为3.5～8.0MPa的CO₂，调节pH为3.8～4.2，并保持25～60分钟，过滤得内切β-1，4-葡聚糖酶。

本发明与传统等电沉淀方法相比，酶活损失少，同时又比传统的等电沉淀体系具有较多的优势，如乙醇的加入可使水溶性较强的蛋白质也能沉淀，而所加助剂乙醇量较有机溶剂沉淀法要少很多，采用加压CO₂进行pH的调节可以避免用无机酸等调节溶液pH时酸过量或局部pH过低的情况出现，CO₂在溶液中大多以分子形式存在，这使得溶液离子强度不会因此过多升高，因而比无机酸更适于等电沉淀中的pH调节。本发明还解决了现有沉淀技术所存在的酶活损失较为严重，亲水性蛋白质难于沉淀等技术问题，提供了一种可保持较高酶活，亲水性蛋白质易于形成沉淀的一种纤维素酶的分离提纯方法。本发明还解决了现有等电沉淀技术所存在的操作条件难以精确控制，操作过程波动较大，沉淀能力不强等技术问题，提供了一种操作参数可精确控制，操作过程无波动，沉淀能力较强的内切β-1，4-葡聚糖酶的分离提纯方法。

具体实施方式

本发明采用加压CO₂作为挥发性酸，乙醇作为助沉淀剂，形成加压CO₂-乙醇-水体系蛋白质等电沉淀技术，可以在水溶液中沉淀那些等电点与体系pH相近的蛋白质；分离提纯步骤包括纤维素酶(粗品)的乙醇-水溶液配制，用加压CO₂将溶液pH调至所需范围，内切β-1，4-葡聚糖酶在体系中沉淀出来，过滤沉淀出来的蛋白质，最终内切β-1，4-葡聚糖酶被纯化。为实现该过程，首先配制合适浓度的纤维素酶(粗品)的乙醇-水溶液，然后取合适量的溶液加入到高压釜中，继而通入加压CO₂，用来调节溶液的pH至所需范围，当pH接近内切β-1，4-葡聚糖酶的等电点时，内切β-1，4-葡聚糖酶被沉淀出来。本发明所采用的加压CO₂-乙醇-水体系用于等电沉淀蛋白质，内切β-1，4-葡聚糖酶的分离提纯方法的高压釜预热温度和CO₂预热温度为20～40℃，CO₂压力为3.5～8.0MPa，纤维素酶质量百分比浓度为1～3％，乙醇溶液体积百分比浓度为10～40％，CO₂压力维持时间为25～60分钟。

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。

实施例1：

首先配制浓度为1％(质量百分比)的纤维素酶的乙醇-水溶液，其中乙醇浓度为25％(体积百分比)，充分振荡使溶液混合均匀，然后取20mL的溶液加入到预热至25℃的高压釜中。继而通入预热温度25℃的加压CO₂，使压力增至4.5MPa，调节操作温度至25℃，此时溶液的pH约为4.0。在该状态下保压40分钟，其中的内切β-1，4-葡聚糖酶在该条件下完全沉淀出来。过滤得内切β-1，4-葡聚糖酶沉淀，对其纯度和酶活进行测定，此时内切β-1，4-葡聚糖酶的纯化倍数为1.65，酶活得率为84.1％。本方法采用加压CO₂作为挥发性酸，乙醇作为助沉淀剂，形成加压CO₂-乙醇-水体系蛋白质等电沉淀技术。该方法具有分离后所得产品酶活损失较小，亲水性蛋白质易于形成沉淀等的特点。

实施例2：

首先配制浓度为3％(质量百分比)的纤维素酶的乙醇-水溶液，其中乙醇浓度为40％(体积百分比)，充分振荡使溶液混合均匀，然后取20mL的溶液加入到预热至20℃的高压釜中。继而通入预热温度20℃的加压CO₂，使压力增至4.5MPa，调节操作温度至20℃，在该状态下保压55分钟，其中的内切β-1，4-葡聚糖酶在该条件下完全沉淀出来。过滤得内切β-1，4-葡聚糖酶沉淀，对其纯度和酶活进行测定，此时内切β-1，4-葡聚糖酶的纯化倍数为1.43，酶活得率为89.2％。本方法采用加压CO₂作为挥发性酸，乙醇作为助沉淀剂，形成加压CO₂-乙醇-水体系蛋白质等电沉淀技术。该方法具有分离后所得产品酶活损失较小，亲水性蛋白质易于形成沉淀等的特点。

实施例3：

首先配制浓度为1％(质量百分比)的纤维素酶的乙醇-水溶液，其中乙醇浓度为20％(体积百分比)，充分振荡使溶液混合均匀，然后取20mL的溶液加入到预热至20℃的高压釜中。继而通入预热温度20℃的加压CO₂，使压力增至3.5MPa，调节操作温度至20℃，在该状态下保压30分钟，其中的内切β-1，4-葡聚糖酶在该条件下完全沉淀出来。过滤得内切β-1，4-葡聚糖酶沉淀，对其纯度和酶活进行测定，此时内切β-1，4-葡聚糖酶的纯化倍数为1.52，酶活得率为73.6％。本方法采用加压CO₂作为挥发性酸，乙醇作为助沉淀剂，形成加压CO₂-乙醇-水体系蛋白质等电沉淀技术。该方法具有分离后所得产品酶活损失较小，亲水性蛋白质易于形成沉淀等的特点。

实施例4：

首先配制浓度为1％(质量百分比)的纤维素酶的乙醇-水溶液，其中乙醇浓度为10％(体积百分比)，充分振荡使溶液混合均匀，然后取20mL的溶液加入到预热至40℃的高压釜中。继而通入预热温度40℃的加压CO₂，使压力增至7.0MPa，调节操作温度至40℃，在该状态下保压25分钟，其中的内切β-1，4-葡聚糖酶在该条件下完全沉淀出来。过滤得内切β-1，4-葡聚糖酶沉淀，对其纯度和酶活进行测定，此时内切β-1，4-葡聚糖酶的纯化倍数为1.45，酶活得率为91.2％。本方法采用加压CO₂作为挥发性酸，乙醇作为助沉淀剂，形成加压CO₂-乙醇-水体系蛋白质等电沉淀技术。该方法具有分离后所得产品酶活损失较小，亲水性蛋白质易于形成沉淀等的特点。

实施例5：

首先配制浓度为2％(质量百分比)的纤维素酶的乙醇-水溶液，其中乙醇浓度为30％(体积百分比)，充分振荡使溶液混合均匀，然后取20mL的溶液加入到预热至35℃的高压釜中。继而通入预热温度35℃的加压CO₂，使压力增至3.5MPa，调节操作温度至35℃，在该状态下保压60分钟，其中的内切β-1，4-葡聚糖酶在该条件下完全沉淀出来。过滤得内切β-1，4-葡聚糖酶沉淀，对其纯度和酶活进行测定，此时内切β-1，4-葡聚糖酶的纯化倍数为1.35，酶活得率为76.3％。本方法采用加压CO₂作为挥发性酸，乙醇作为助沉淀剂，形成加压CO₂-乙醇-水体系蛋白质等电沉淀技术。该方法具有分离后所得产品酶活损失较小，亲水性蛋白质易于形成沉淀等的特点。

实施例6：

首先配制浓度为1％(质量百分比)的纤维素酶的乙醇-水溶液，其中乙醇浓度为20％(体积百分比)，充分振荡使溶液混合均匀，然后取20mL的溶液加入到预热至30℃的高压釜中。继而通入预热温度30℃的加压CO₂，使压力增至6.5MPa，调节操作温度至30℃，在该状态下保压50分钟，其中的内切β-1，4-葡聚糖酶在该条件下完全沉淀出来。过滤得内切β-1，4-葡聚糖酶沉淀，对其纯度和酶活进行测定，此时内切β-1，4-葡聚糖酶的纯化倍数为1.30，酶活得率为94.2％。本方法采用加压CO₂作为挥发性酸，乙醇作为助沉淀剂，形成加压CO₂-乙醇-水体系蛋白质等电沉淀技术。该方法具有分离后所得产品酶活损失较小，亲水性蛋白质易于形成沉淀等的特点。

实施例7：

首先配制浓度为3％(质量百分比)的纤维素酶的乙醇-水溶液，其中乙醇浓度为35％(体积百分比)，充分振荡使溶液混合均匀，然后取20mL的溶液加入到预热至25℃的高压釜中。继而通入预热温度25℃的加压CO₂，使压力增至8.0MPa，调节操作温度至25℃，在该状态下保压35分钟，其中的内切β-1，4-葡聚糖酶在该条件下完全沉淀出来。过滤得内切β-1，4-葡聚糖酶沉淀，对其纯度和酶活进行测定，此时内切β-1，4-葡聚糖酶的纯化倍数为1.32，酶活得率为97.9％。本方法采用加压CO₂作为挥发性酸，乙醇作为助沉淀剂，形成加压CO₂-乙醇-水体系蛋白质等电沉淀技术。该方法具有分离后所得产品酶活损失较小，亲水性蛋白质易于形成沉淀等的特点。