鉴定在不同盐浓度中快速生长的鱼的方法

摘要

本发明公开了选择能在各种盐浓度的水中繁殖和最佳生长的鱼的方法。根据鱼的催乳素1基因型选择能在特定盐浓度水中生长的鱼。罗非鱼催乳素1(prl 1)启动子中的单序列重复多态性(微卫星)与prl 1表达的差异和“受盐攻击的”或“受盐影响的”鱼类的生长差异相关联。此发现提示二核苷酸微卫星可能代表一种调节进化遗传变异的潜在来源，与教课书解释的非编码微卫星长度变异缺乏功能意义不一致。因此本发明方法包括：测定或选择鱼生长环境的盐浓度；测定要繁殖的至少一条雄鱼和至少一条雌鱼的催乳素基因型；繁殖具有所需基因型的雄鱼和雌鱼，以产生具有已知和可预测基因型的鱼后代；在与鱼的基因型相容的盐水环境中培养鱼。

说明书

相关申请

本申请要求2001年8月27日提交的序号60/315.156的专利申请的权益。

政府资助

本发明部分得到NSF DBI 9803845、USDN/NRICGP 00352059287的资助。

版权

本专利文件所公开的内容的一部分包括要求版权保护的材料。当其出现在美国专利商标局专利文献中时，该版权拥有者不反对意任何人摹仿复制该专利文件或专利公开物，但无论如何都要保留所有的版权。

发明领域

本发明涉及能最佳生长鱼类的选择。更具体讲，本发明涉及能在不同盐浓度的水中最佳生长的鱼类(特别是罗非鱼)的选择方法。最具体讲，本发明涉及利用罗非鱼催乳素基因中的多态性，根据基因型，选择能在不同的咸水中最佳生长的鱼类并繁殖它们。

发明背景

罗非鱼是世界最重要的水产养殖鱼类，包括天然生长于非洲的各种鱼种，通常是淡水鱼种(罗非属，Cichlidae科)。罗非鱼类似于北美洲太阳鱼，一种可长至20磅(9分斤)的鳓。罗非鱼种是普及性水产养殖鱼类，因为作为食物它们易于饲养和收获，它们生长迅速，抗病，乐吃丰富的海藻和zooplankton。结果，早期埃及文明以来罗非鱼已用于温水水产养殖系统，现已引入许多淡水动植物栖息地。此外在咸水中罗非鱼也生长良好。但各品系对咸水的耐受性有所不同。例如，世界某些地区优选在海湾或稍咸的水中饲养罗非鱼，但不是所有的个体鱼在这些条件下都生长良好。事实上，罗非鱼对盐的耐受和在不同盐浓度水中的生长反应有很大的不同。因此，选择或预测哪些个体在何种盐浓度水中生长最好一直是困难的并将会继续有某种难度的。

已进行多项研究致力于更快地养殖大罗非鱼的方法。对于食用动物，生产者们均寻找选择和在较短时间培养较大动物的方法。已不同程度地研究了生长激素对大多数类型的食用鱼，包括罗非鱼的作用。此外进行了水温、盐浓度和杂交实验。然而除试验和失误外，目前的方法不能鉴定在不同盐浓度水中生长的罗非鱼品系。

关於激素，知道最多的是关於肽激素在鱼渗透压调节中的作用。催乳素是GH/Prl基因家族的一个成员，其“淡水适应能力”是通过降低鳃中的Na+-K+ATP酶活性而提高血浆渗透压。

罗非鱼脑垂体产生两种催乳素，它们由不同的基因Prl1和Prl2所编码，分子量(分别为24和20KD)和氨基酸残基数(分别为188和177个)均不相同。这两种催乳素的氨基酸序列大约70％相同，看来具有不同的渗透压调节作用和亲体细胞作用。以往实验提示，当此鱼进入更咸的环境中时，其催乳素mRNA和催乳素的血浆水平降低，催乳素Prl1的此种效应尤其显著。

罗非鱼Prl1的启动子与大鼠催乳素的启动子共享有非规范(canonical)元件，二启动子在假定的垂体特异性转录因子Pit-1结合位点内散布着两个(CA)n微卫星(重复性核苷酸短序列)(见图1)。Naylor and Clark(Naylor L.H.and ClarkeE.M.Nucleic Acids Res 18：159501601，1990)证明大鼠中这些重复序列形成了体外左手Z-DNA并表达了Prl1。目前，对此鱼个体中的微卫星和非编码微卫星长度的变异通常认为是中性的和缺乏功能意义，除非可能与某些遗传性疾病有关，一般不作长度研究，尽管教课书解释说这种非编码单序列以中性方式进化。然而最近报道表明，事实上真核基因组中与高突变相关联的二核苷酸微卫星的丰富程度和位置提示此微卫星在基因调节中可能有潜在和广泛的作用。

因此，理想的是有一种简单的方法，可根据基因型的不同来监定和选择能在不同盐浓度条件下最佳生长的鱼(如罗非鱼)。这种方法将不需要对鱼生长环境/水产养殖条件进行实验，也不需要给鱼补充生长刺激剂或其它人造物质。

发明概述

本发明总体上涉及提供一种可靠的方法来选择和繁殖能在不同盐浓度水中最佳生长的鱼。在本发明开发过程中，申请人简单地采用了天然系统来评价二核苷酸微卫星变异、基因表达量的差异和对差别悬殊环境生理反应之间的相关性。申请人的工作事实上提供了第一手体内证据，证明鱼个体中微卫星长度上的差异可能的确影响到基因表达，这种表达的差异伴有生理意义。

因此，本发明基本的实施方式优选利用鱼个体催乳素1启动子DNA的单序列重复伸展区(微卫星)长度的差异，来选择能在各种盐浓度条件下最佳生长的鱼个体。本发明包括在不同盐浓度条件下最佳生长的鱼个体的选择方法。根据催乳素基因型选择鱼以在特定的盐水中培养繁殖。

申请人发现，罗非鱼催乳素1(prl1)启动子中的单序列重复多态性(微卫星)与差异蛋白(differencesin)prl1的表达和在“受盐攻击的”或“受盐影响的”鱼类的生长相关联。此发现提示，此二核苷酸微卫星可能代表了调节进化的基因异变的一种尚未意识到的来源。与教课书解释的非编码微卫星长度的变异缺乏功能意义不一致。在本发明开发中，申请人据理认为其它鱼种中可能发现类似于大鼠中形成Z-DNA和表达的微卫星重复序列的调节作用(Naylor L.H.andClarke E.M.Nucleic Acids Res 18：1595-1601，1990)，即使一般认为微卫星长度变异缺乏功能意义。本发明中申请人研究了罗非鱼prl1启动子中微卫星长度是否可能有调节作用，微卫星长度的个体差异是否影响prl1体内表达，是否可能引起已知的罗非鱼盐耐受性的差异和在不同浓度盐水中生长的差异？

事实上，申请人发现罗非鱼催乳素启动子中DNA单序列重复伸展区长度的差异的确引起了垂体产生的催乳素量的变化。催乳素表达的这种个体差异与鱼个体在不同盐浓度条件下的不同生长速度相关联。申请人发现罗非鱼微卫星长度的个体差异的确影响到prl1的体内表达，并引起已知的盐耐受性和生长的差异。知道基因型/盐浓度的最佳组合从而产生了本发明的方法，用此方法可以高得多的生长速度和较少的培养时间获得上市规格的罗非鱼。本发明方法中，测定鱼的prl1基因型，选出具有所需基因型的鱼，在特定的盐水中饲养此基因型的鱼达到最佳生长。一旦发现和选出所需基因型的鱼，繁殖此鱼，产生的后代都具有所需的基因型，它们能在饲养鱼的水产养殖环境中最佳生长。

因此本发明提供了一种简单和花费少的根据鱼的催乳素基因型选择能在各种盐浓度水中快速生长的鱼个体的方法。

本发明还利用罗非鱼催乳素基因中的多态性和小鱼在不同盐水(从淡水到完全海水)中生长速度之间的遗传连系，来选择能在各种盐浓度的水中繁殖和最佳生长的鱼个体。

本发明还提供实现所选鱼个体在各自基因型最适盐水中极大提高生长速率的方法。事实上，根据鱼个体的催乳素基因型和盐水浓度组合的最佳选择，如果将鱼个体培养在与其基因型相适应的盐浓度水中，其生长速率与在与该鱼个体基因型不相容的盐水中相比，有两倍差异。

此外，本发明还提供选择繁殖使其所有后代prl1基因型与给定的或选择的(当地可得到的，或水产养殖场选择的、构建的和维持的)盐水环境最相容的鱼的方法。

附图简要说明

图1(现有技术)是罗非鱼prl1启动子区域的示意图。按照Swennen等.DNA and Cell Biol.11a；673-684，1992的方法鉴定推测的转录因子结合位点(如Pit1)。

图2a-f说明不同盐水处理对prl1不同表达和鱼重量的影响。

发明详述

本发明的最基本的实施方式，是一种可根据鱼的催乳素基因型选择鱼(优先拣选罗非鱼)，然后在与其催乳素基因型相容的盐水环境中饲养和繁殖以获得最佳生长的方法。

如人们注意到的那样，过去的实验提出，当罗非鱼移到更咸的环境时催乳素1和2的mRNA水平及其催乳素血清水平均下降，催乳素1的这种效应更显著。因此，申请人的实验和实施例都涉及了催乳素1，但本发明的方法并不仅仅限于催乳素1。

在本发明开发时，申请人起初注意力集中在最靠近prl1转录区起始处(约200碱基对bp)的微卫星。申请人将莫桑比克的Oreochromis(咸水适应)雌鱼与尼罗河Oreochromis(淡水适应)雄鱼交配，后者携带有17个重复单元(CA31 vs CA14)不同的微卫星等位基因。莫桑比克雌鱼为长等位基因(CA31)纯合性，尼罗河雄鱼为长与短等位基因杂合性。见图1罗非鱼prl1启动子区示意图。此200bp的CAn是实施例中所述的区域。

选择F个体鱼饲养的F2代有三种基因型：短等位基因纯合子(“SS”)、长等位基因纯合子(“LL”)和杂合子(“SL”)。将同一批卵孵出的75条F2代鱼在分开的200升罐中用三种盐水(从淡水每一千升水NaCl为0ppt、16ppt到海水的32ppt)饲养。使二周龄鱼苗适应此环境3天并继续饲养直到鱼重平均15克(约6个月)。在同一罐盐水中培养所有三种基因型的鱼。实验结束时处死所有的鱼、区别性别和称重。收集垂体，-20℃保存在RNAlater(Ambion)中直到提取RNA。采用Taqman探针(PE Biosystems)以b-肌动蛋白作为参比品进行实时PCR检测了F2代鱼垂体(cDNA制品)中的Prl表达。用引物表达软件(Prlmer Express，version 1.5 AppliedBiosystems)为各cDNA设计了引物和探针。探针的结合位点位于内含子和外显子边界以防止扩增基因组DNA。用荧光在3’端标记探针。在GeneAmp 5700序列检测系统(Applied Biosystems)上进行40轮PCR：95℃15秒，55℃30秒，60℃1分钟，监测荧光。

测定荧光超过接近本底的阈值时临界循环数。接照公式2B-r“‘CT-P’1CT测定Prl1相关基因的表达，其中CT是临界循环数。实时PCR引物和探针序列如下：正向引物，CCCATCAACGAACTGTTCGA(SEQ.ID.NO.1)；

反向引物，GCATGATCACCCTGCCTATAGG(SEQ.ID.NO.2)；探针CTCACCCAGGAGCTGGACTCTCACTTCCCTC(SEQ.ID.NO.3)。

如Lee W.J.and Kocher T.D.：罗非鱼催乳素基因组微卫星图，Anim.Genet.29：68-69，1998(其内容纳入本文参考文献)所述，或prl1cDNA中能鉴别亲代等位基因的aSac H RFLP测定了F2代鱼个体的基因型。本领域的技术人员知道Sacll方法。用单向ANOVA和适当的hoc后多项比较检验评价基因型和盐水环境之间的差异。

结果

在所有盐水环境中雌鱼都比雄鱼大，但prl1表达与雄鱼没有差别。一般，鱼的平均体重随盐水浓度增加而增加(p＝8.4×10^-6)。0ppt时各基因型表达有差异(p＝0.006)。SS鱼表达prl1大约为SL鱼的两倍，为LL鱼的大约7倍。这些结果见图2a。图2a-f所示均为平均值±标准误。

16ppt时各基因型鱼之间表达有差异(p＝0.0005)，但与淡水中所见方式几近相反，LL基因型鱼表达prl1为SS和SL基因型鱼的两倍，如图2b所示。然而，显然，16ppt时LL型鱼几乎比其它基因型鱼小两倍，见图2d所示；而在0ppt时SS鱼最小，见图2c。

然而，三种基因型鱼在32ppt时无论prl1表达或鱼重都没有差异。32ppt时所有基因型的鱼都生长得很好，这些数据没显示，但可参见图2f，32ppt时三种基因型鱼的体重。

所有基因型都测到存在基因型与环境之间的显著相互作用。对于所有基因型，prl1表达和鱼重均随盐水处理而不同。SS的表达为p＝1.5×10^-5，鱼重为p＝0.03；SL的表达为p＝3.8×10^-6，鱼重为p＝0.008；LL的表达为p＝0.0008，鱼重为p＝0.06。SS和SL基因型鱼显示0-16 ppt时prl1的表达显著降低(10倍以上)。对于LL基因型鱼此反应几乎看不出来，如图2e所示。

各基因型鱼在不同盐水中生长很好，如图2f所示，各基因型鱼平均增长与不同盐水中prl1的平均表达率呈反相关。

SS的r2＝0.957，SL的r2＝0.971，LL的r2＝0.530。然而，图2e和2f显示各基因型鱼对外部盐浓度的反应中有不同的反应标准。在天然鱼群中这些“交叉相互作用”是遗传变异在波动的环境中适应性维持的第一手证据。

换句话说，在某些基因型鱼比其它基因型鱼生长更佳的条件下所有三种基因型鱼都能在淡水至海水的盐浓度条件下生长。不同基因型鱼可利用同一基因适应不同的环境。这与申请人最初的研究相关，支持微卫星中的非功能性变异可能的确具有非常重要的功能。

Alexander Rich等(Nordheim，A.and Rich，A；Proc Natl.Acad.Sci.USA80：1821-1825，1983)在大约20年前提出改变嘌呤和嘧啶的可能性，可能影响到基因的表达.。此提议和申请人惊人的结果提示，不同长度的重复序列可能诱导启动子构型发生变化，使其结合转录调节剂的能力不同。有很好的证据表明，罗非鱼在对血浆渗透压的反应中prl1的表达受到调节，可能通过与Pit-1的相互反应。长prl1微卫星等位基因可能起着绝缘体作用，限制增强子(如淡水)和阻抑子(如海水)接近Pit-1位点。

因为F2代鱼不是分离的不同微卫星等位基因的同基因系，不可能正式排除申请人提出的，等位基因存在与由某种原因引起的未测出的多态性的连锁不平衡这种可能性。然而，SS和LL鱼中1.2kb prl1启动子序列揭示在已知的调节元件结合位点中没有一致的替代.事实上发现在起始密码子上游800bp第二单一重复序列中此区域有其它序列差异。在此重复序列中SS基因型鱼(GT14)具有比LL基因型鱼(GT39)更短的等位基因。

综合在一起，SS鱼prl1启动子中的二个微卫星长度不到LL鱼中相应序列的一半。此结果表明阳性协方差的模式与其它有骨鱼的资料相反。有可能这些单一重复序列彼此相互作用引起转录变化。

虽然其他人提出，微卫星可能具有功能作用，申请人的结果提供了体内的第一手证据，证明鱼个体中微卫星长度的差异可能影响到基因表达，并且这种表达差异伴有生理意义。这些结果与教课书说的二核苷酸微卫星变异缺乏功能意义相反。

Prl1表达和鱼重量负相关较难解释。Pit-1可激活不同垂体细胞系的催乳素和生长激素，这些激素对鱼的渗透压调节具有拮抗作用。申请人的资料不能分辨生长效应是否通过渗透性调节差异或GH-表达促生长的转录性抑制所介导。 

从进化角度看，如上所述，申请人的结果与教课书说的二核苷酸微卫星变异缺乏功能意义相反。这些基因座进化很快，成为真核生物基因组的遍在性成分。优先见于非编码DNA中，二核苷酸重复序列提供了一种改变个体中基因产物的量而不改变蛋白质或肽的氨基酸序列的工具。微卫星与转录因子长目录和环境调节基因的相关性，提示微卫星在基因表达的精细规模调节中具有潜在作用。虽然申请人没能确定调节罗非鱼盐浓度耐受性的确切机制，但申请人发现了微卫星变异和盐水耐受之间的连系，这使申请人得以开发一种简单、花费少的根据鱼的催乳素基因型选择能在不同盐浓度水中快速生长的鱼个体的方法。

因此，本发明的方法包括：确定或选择培养鱼的环境盐浓度，测定要繁殖的至少一条雄鱼和至少一条雌鱼的催乳素(prl1)基因型，繁殖具有所需基因型的至少一条雄鱼和至少一条雌鱼以产生具有已知可预测基因型的鱼后代，并在所选择的盐水环境中培养这些后代。

例如，如果淡水更易得到又便宜，可在淡水环境中饲养在淡水中生长最好的鱼(即SL和LL鱼)是理想的，并选出来繁殖。如果当地供水是微咸水(8ppt-16ppt范围)或更易得到，理想的基因型选择是SS或SL鱼。

按照Lee and kocher方法(1998)进行鱼的基因型分析，此文内容纳入本文参考文献中，或如上述通过prl1cDNA中的a Sac II RFLP进行鱼的基因型分析。简言之，在类似于人毛发DNA测定的方法中，从剪下的鱼鳍(鱼鳍的组织碎片)中抽提分型用的鱼DNA。

用PCR扩增催乳素1等位基因，在丙烯酰胺凝胶上显现。分型方法是该领域普通技术人员熟悉的。基因分型试验所用的引物和探针见以上SEQ.ID.NO1-3所述，也参见Lee and Kocher 1998。

一旦发现适合繁殖的鱼，可将其用作贮备以建立均一的鱼群，它们都具有所选择的所需基因型，最适合在所选盐水中最佳最快生长。

此外，本方法提供了一种便宜的建立最适合特定生长环境盐水条件的鱼群的方法，因为一旦发现了适合繁殖的鱼，建立各鱼群要做的事只是进行基因型测定步骤。一旦选出和饲养合适的鱼，其所有的后代都具有所需的基因型，在所选的盐水中将会旺盛繁殖。因为所有的鱼后代是已知的基因型，可选择任何一条鱼用于繁殖建立具有已知基因型的新鱼群，而无须测定用于建立新繁殖贮备群的各条鱼的基因型.。

虽然以上描述和实施例公开了本发明的一些优选实施方案，例如罗非鱼和催乳素1，但本发明并不限于具体实施方案所述的范围。上述实施方案意图是简明扼要说明本发明的各个方面，及本发明范围内功能等同的方法和成分。例如，可采纳本发明的方法用于其它种类的鱼，特别是用于饲养其它食用鱼如鲑鱼或海鳊。本发明的方法和原理也可用于其它基因，如催乳素2。因此除了本文所示和所述外，可对本发明作某些改良和修饰，但这些不背离本发明以上所述和所附权利要求书的精神和范围，本领域技术人员从以上所述和附图中会明白这种精神和范围。这类修改都落在本发明的权利要求的范围内。

序列表

<110>新罕布什尔州立大学(Universiry of New Hampshire)

     J.T.斯特利尔曼(Streelman，J Todd)

<120>鉴定在不同盐浓度中快速生长的鱼的方法

<130>9815/62185

<160>3

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>罗非鱼

<400>1

gcatgatcac cctgcctata gg                                         22

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>罗非鱼

<400>2

cccatacaac gaactgttcg a                                          21

<210>3

<211>31

<212>DNA

<213>罗非鱼

<400>3

ctcacccagg agctggactc tcacttccct c                               31