红车轴草总黄酮高含量提取物与制备及其在制药用组合物中的应用

摘要

本发明公开了红车轴草总黄酮高含量提取物与制备及其在制药用组合物中的应用。该提取物的制备，是在常规含水醇溶媒提取方法基础上，增加了吸附材料吸附的柱层析分离。即将含水的醇溶媒提取的红车轴草提取液，回收醇溶媒至4－6倍药材体积，含醇浓度10－60％，上柱，待上完柱后，再用吸附剂体积14－16倍量20－70％醇溶液洗脱，回收洗脱液，得沉淀物，将沉淀用含醇10－80％的低级脂肪醇或丙酮分级处理，得沉淀，干燥后得总黄酮含量50－90％，其中刺芒柄花素含量为25－70％，鹰嘴豆芽素含量在5－25％的红车轴草提取物。提取物与常规用辅料混合加工制成用于妇女更年期综合症、雌激素低下以及男性前列腺肥大的口服制剂。

说明书

技术领域

本发明涉及红车轴草提取物与制备及其在制药用组合物中的应用。

背景技术

随着社会的进步与发展，人们生活水平的逐渐提高，对生活质量的要求也越来越高。而以一系列植物神经功能失调和情感障碍为主的女性更年期综合症和进入老年社会的男性前列腺增生等疾病给患者和家庭极大的痛苦。妇女中约有70％妇女绝经期有更年期综合症状，症状比较严重的约占10～30％，其更年期的时间长达10年，10～15％的妇女出现比较严重的症状，必须治疗。西方发达国家45岁以上的妇女70％采用激素替代疗法，至少需连服8～10年，长期服用激素类药虽可缓解更年期的症状，但长期的激素治疗有增加生殖系统肿瘤，血栓形成和体重增加的危险。最新研究表明，不论单用的雌激素，还是雌、孕激素合用，乳腺癌的总发病率增加60～85％，乳腺非小叶癌发病危险增加50％。美国国立卫生研究院(NIH)的研究表明激素替代疗法存在潜在的致病危险。

随着年龄的增长，男性前列腺疾病是一种极为普遍的疾病，在美国60～70岁之间半数以上患有前列腺增生疾病，70～90岁之间90％以上男性会有前列腺肥大。虽然前列腺肥大的药物治疗和手术治疗均有疗效，但往往产生一些副作用、价格昂贵、特别是手术治疗可能造成性功能障碍。据以上原因，人们将目光投向了价廉、低毒、有效的植物药的开发，红车轴草提取物为近期开发的一种治疗更年期综合症和前列腺肥大的有效药物或食品补充剂。

大量临床研究表明红车轴草提取物对更年期妇女的潮热、盗汗等有明显的改善作用；调节血脂，素有“血液清道夫”之称；增加骨密度；抑制前列腺增生，从而改善前列腺肥大所致的尿急、尿频、尿痛等症状。

红车轴草在欧、美等国分别作为草药及食品添加剂广泛使用，主要用于抗肿瘤、慢性退行性病变的风湿病、关节炎、湿疹、皮炎、百日咳、更年期综合症和前列腺肥大等疾病。

近几年红车轴草的开发也引起了我国一些研究开发单位的重视，红车轴草在我国分布很广，主要含有鹰嘴豆芽素A(BiochaninA)和B(刺芒柄花素Formononetin)、染料木素(Genistein)、大豆黄酮(daidzein)、红车轴草根苷(trifolirhizin)及红车轴草根素(pratensein)等黄酮成分。鹰嘴豆芽素A、B及染料木素、大豆黄酮都有雌激素作用。各种异黄酮化合物中，鹰嘴豆芽素A、B是该植物的主要成分。据统计，国内发表的关于红车轴草的研究论文较少，仅含量测定和指纹图谱方面的研究，且有粗提物出口欧美等国。其粗提物中总异黄酮的含量多为8％、10％、20％，检索国内外的文献资料，有关其生产工艺的报道也极少，多采用含水的醇溶媒提取、干燥的粗提取物。总黄酮含量≥50％的产品尚未见到，其制剂工艺也未见报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，在常规提取方法的基础上，增加精制、纯化的过程，除去一些非活性成分，高度富集其活性成分—总异黄酮，从而减少药物的服用量，降低药物不良反应。另外考虑到异黄酮化合物水溶性差，拟采用超微粉碎、固体分散技术，增加其生物利用度。为此，提供一种红车轴草总黄酮高含量提取物与制备及其在制药用组合物中的应用。

本发明的红车轴草总黄酮高含量提取物为以红车轴草的总异黄酮为主的有效部位提取物，其特点是提取物中总黄酮的含量为50-90％，其中刺芒柄花素(Formononetin)含量为25-70％，鹰嘴豆芽素A(BiochaninA)含量为5-25％。

制备含红车轴草总异黄酮50～90％的提取物的方法，其制备过程如下：

a.用常规的含水醇提取得到红车轴草提取液，回收醇溶媒，然后加水或醇溶媒使其体积为药材体积4～6倍，醇浓度10～60％，滤过，得滤液，

b.滤液流经填充有吸附材料的吸附柱，填充的吸附材料选自聚酰胺、大孔树脂、硅胶中的任一种，

c.用体积为填充材料10-15倍的水淋洗吸附柱至无色，

d.用含20～70％的C_1～4低级脂肪醇溶液洗脱，收集洗脱液，洗脱液体积为填充材料的14-16倍(以下同)，

e.浓缩回收洗脱液，得稠膏，

f.用10～80％的C_1～4低级脂肪醇或丙酮分级处理，得析出沉淀物，干燥即得含红车轴草总异黄酮50-90％的提取物。

将所得提取物采用固体分散技术或超微粉碎，使其提取物呈分子状态或微米或纳米级粉末。

所述的洗脱液C_1～4低级脂肪醇优选为乙醇或甲醇。

所述的上柱提取液的醇浓度最佳范围为40～55％，

所述的洗脱液的醇浓度较佳范围为30～60％，

所述的洗脱液的醇浓度最佳范围为40～55％，

所述分级处理的低级脂肪醇或丙酮最佳浓度20～70％，

所述分级处理的低级脂肪醇或丙酮最佳浓度30～45％，

本发明中，术语“醇溶液”是指甲醇，乙醇或丙酮的水溶液。

本发明中，所制备的红车轴草提取物，或者经固体分散或超微粉碎后，加入适量的辅料制备成用于妇女更年期综合症合症、雌激素低下、男性前列腺肥大的口服制剂。提取物可以与常规药用辅料混合加工精制成片剂(素片、糖衣片、薄膜衣片)、胶囊(硬胶囊、软胶囊)、颗粒剂、滴丸。药用辅料是指填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂及其包衣材料以及用于软胶囊的植物油类、脂肪类填充剂。

使用本发明制备红车轴草提取物与使用其它方法制备的提取物的质量比较如下：

                表1原提取物与本发明提取物的质量比较

  样品性状  总异黄酮含  量(％) 刺芒柄花素 (％) 鹰嘴豆芽素 A (％)  原提取物棕褐色，易吸潮结块呈膏状  8  10  20 3.15 - - 5.15 - -  本发明淡黄色粉末  ≥50 25～70 5～25

本发明所制提取物的药效学研究：

a.家兔骨髓的成骨髓细胞的影响表明提取物对家兔骨髓细胞DNA，胶原蛋白的合成和碱性磷酸酶活性等均有不同的促进作用，其作用呈剂量—效应相依赖的关系，在2～16mg/L(以总异黄酮的量计)四个计量组中，16mg/L组的促进作用最强。

b.对未成熟雌性小鼠子宫发育的影响

选取健康雌性小鼠40只，体重为11～13g，分为空白对照组和给药组。给药量分250，500，750mg/kg(以总异黄酮计)，空白对照组给予相同体积的蒸馏水，每日一次，连续7天，末次给药后第2天，小鼠称重，颈椎脱臼处死动物，剖取子宫，精密称重，计算子宫系数，比较各组的差异。结果见表2。

表2对未成熟雌性小鼠子宫发育的影响

组别     N      剂量      子宫系数(X±S)        (只)    (mg/kg.)  mg/10g蒸馏水  10      -         14.53±5.35提取物  10      250       16.70±3.10        10      500       24.60±7.80^**        10      750       32.68±9.13^**

[注]“^*”：与正常组比较P＜0.05；“^**”：与模型组比较P＜0.05。

表2可知红车轴草的精制提取物中、高剂量组均能促进未成熟雌性小鼠子宫的发育。增重作用与对照组比较差异显著(P＜0.01)

c红车轴草精制提取物对去卵巢大鼠脂肪代谢的作用。

选取wistar大鼠60只，随机分成正常组、假手术组、模型组、雌激素组、高、低剂量异黄酮组，共6组，每组10只，各组每日均给予普通全价饲料喂养，饮水为自来水。造模，除正常组和假手术组外，其余各组大鼠切除双侧卵巢。假手术组的大鼠重复摘除卵巢步骤，但不摘除卵巢。正常大鼠组不做任何处理。手术后，各组大鼠正常饮食1周，以恢复创伤。手术后第2周开始给药，持续6周。正常组、模型组和假手术组每日灌喂蒸馏水10ml.kg^-1；雌激素组每周1次灌胃尼尔雌醇混悬液，剂量为1mg.kg^-1；红车轴草提取物以总异黄酮计算，每日给予高剂量组为100mg.kg^-1、低剂量组为50mg.kg^-1。测定血脂及肝脏中胆固醇。结果见表3，表4。

    表3红车轴草提取物对去卵巢大鼠血清TC，TG的作用(X±S)

                    N(只)        TC/mg.dl^-1       TG/mg.dl^-1

正常组              10           2.76±0.41        1.13±0.43

假手术组            10           3.05±0.44        1.02±0.49

模型组              8            3.69±0.31^*      0.32±0.07^*

雌激素组            9            3.46±0.47^*      0.89±0.25^**

高100mg.kg^-1       8            2.58±0.43^**     0.51±0.36^*

低50mg.kg^-1        9            3.41±0.87^*      0.37±0.08

[注]“^*”：与正常组比较P＜0.05；“^**”：与模型组比较P＜0.05。

由表3可知，正常组与假手术组大鼠TC无显著差异，模型组大鼠的TC比正常组升高了34％，有显著性差异。雌激素组的TC浓度没有降低，高剂量提取物组显著降TC浓度，并降到了正常水平。

表4红车轴草提取物对去卵巢大鼠HDL，LDL的作用(X±S)

                     N(只)        HDL/mg.dl^-1      LDL/mg.dl^-1

正常组               10           0.67±0.14        1.00±0.18

假手术               10           0.78±0.18        1.01±0.20

模型组               8            0.79±0.16        1.21±0.24

雌激素               9            0.71±0.16        1.25±0.24

高100mg.kg^-1        8            0.57±0.14        0.93±0.23

低50mg.kg^-1         9            0.74±0.18        0.93±0.16

[注]“^*”：与正常组比较P＜0.05；“^**”：与模型组比较P＜0.05。

由表4可知，各组大鼠HDL无显著性影响，而高、低剂量组可降低LDL到正常水平。

d.红车轴草提取物对去卵巢大鼠肝脏中脂类的作用。

正常组和假手术组hTc没有显著性差异。模型组的hTc比正常组和假手术组增加了近一倍。给予雌激素治疗后，hTc降到了正常水平，高、低剂量的提取物均能降低hTc、hTG在肝脏中的蓄积。结果见表5。

表5红车轴草提取物对去卵巢大鼠hTC，hTG的作用(X±S)

                        N(只)        hTC/mg.g^-1        hTG/mg.g^-1

正常组                  10           1.13±0.16         5.51±1.62

假手术                  10           1.09±0.18         5.49±0.78

模型组                  8            2.02±0.17^*       9.03±1.59^*

雌激素                  9            1.13±0.17^**      4.47±0.53^**

高100mg.kg^-1           8            1.35±0.25^*’**    6.46±1.50^**

低50mg.kg^-1            9            1.62±0.20^*’**    6.67±1.43^**

[注+]“^*”：与正常组比较P＜0.05；“^**”：与模型组比较P＜0.05。

此外，该提取物还有抑制前列腺增生和抗炎等作用。以上初步药效学证实，红车轴草的精制提取物即本发明所制备的提取物有较弱雌激素作用、降脂、增加骨密度等作用，值得进一步研究开发。

具体实施方式

实施例1

用常规的含水醇溶媒提取，取红车轴草药材1Kg，切成1-2cm长的小段或粉碎成粗粉，用药材重量15倍量含水的乙醇溶媒提取，得提取液(以下相同)，减压回收醇溶媒至乙醇浓度10％，静置过夜，滤过，得滤液。

将常规方法制得提取液，流经用聚酰胺填充的吸附柱，首先用10-15倍量(吸附柱填充吸附材料体积的倍数，下同)的水淋洗至无色，再用16倍量20％甲醇洗脱，减压回收溶剂，得稠膏，用10％甲醇进行分级处理，得沉淀物，干燥即得红车轴草总黄酮高含量提取物。重8g，收率0.8％，提取物经紫外分光光度法测定总异黄酮51.2％，HPLC测定Biochanin A 13％；Formononetin 31％。

实施例2

用常规的含水乙醇溶媒获得红车轴草提取液，回收醇溶媒至醇浓度30％，静置过夜，滤过，得滤液。

将备用液流经用大孔树脂填充的吸附柱，首先用10-15倍的水淋洗至无色，再用15倍量50％甲醇洗脱，减压回收溶剂，得稠膏，用40％甲醇进行分级处理，得沉淀物，干燥即得红车轴草总黄酮高含量提取物。重7.5g，收率0.75％，提取物经紫外分光光度法测定总异黄酮58.3％，HPLC测定Biochanin A8％；Formononetin 39.3％。

实施例3

用常规的含水乙醇溶媒获得红车轴草提取液；回收醇溶媒至醇浓度55％，静置过夜，滤过，得滤液。

将备用液流经用聚酰胺填充的吸附柱；首先用10-15倍量的水淋洗至无色，再用70％的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液回收醇溶媒；得稠膏，用80％乙醇溶剂进行分级处理，得沉淀物，干燥即得红车轴草总黄酮高含量提取物。重5.4g，收率0.54％，提取物经紫外分光光度法测定总异黄酮90.0％，HPLC测定Biochanin A 5.4％；Formononetin 66.5％。

实施例4

用常规的含水乙醇溶媒提取得到的红车轴草提取液，回收溶媒至含醇浓度40％，静置过夜，滤过，得滤液。

将备用液流经用大孔树脂填充的吸附柱，首先用10-15倍量的水淋洗到无色，用50％的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，回收醇溶媒；得稠膏，用35％丙酮进行分级处理，得沉淀物，即得红车轴草总黄酮高含量提取物。重7.3g，收率0.73％；提取物经紫外分光光度法测定总异黄酮61.2％，HPLC检测Biochanin A12.5％；Formononetin 45.1％。

实施例5

将实施例3所得干燥提取物，采用超微粉碎法粉碎成微米或纳米级粉末、置已熔化的PEG中，待药物完全分散在液态的载体中后，置滴丸设备中，滴入液体石蜡中，滴制成小丸，每丸含红车轴草提取物80mg。

实施例6含有红车轴草提取物片剂的制取

处方每粒：红车轴草提取物                             80mg

          微晶纤维                                   80mg

          淀粉                                       20mg

          乳糖                                       18mg

          糊精                                       2mg

制法：红车轴草提取物与各种辅料混合均匀；用80％乙醇制粒，整粒；装胶囊或压制成片，每粒(片)200mg。

实施例7

含有红车轴草提取物胶囊的制取

红车轴草提取物80mg

辛基十二烷醇(药用植物油)120mg

制法：红车轴草提取物分散到辛基十二烷醇(药用植物油)中，并加工成软胶囊。

实施例8

含红车轴草提取物的颗粒剂的制取

红车轴草提取物            80mg

乳糖                      920mg

制法：经粉碎的红车轴草提取物与乳糖混合均匀，用70％乙醇制软材料，制粒，整粒，分装即得(每小袋1g)。