甘蔗斑茅杂种的DNA鉴定方法

摘要

甘蔗斑茅杂种的DNA鉴定方法，包括甘蔗、斑茅基因组DNA提取、试剂配制、扩增和电泳检测。该鉴定方法能从DNA分子水平上获得最直接的杂种证据，具有准确、直观、便捷的特点，鉴定速度快，环境影响因素小，鉴定的准确率高，成功地解决了长期以来甘蔗斑茅杂种鉴定的困难，确保了被鉴定杂种的真实性，提高了育种利用的有效性。

说明书

所属技术领域    本发明涉及一种植物杂交后代的鉴定方法，特别是甘蔗斑茅杂种的DNA鉴定方法。

技术背景    近百年的甘蔗有性杂交育种实践表明，甘蔗遗传改良是发展蔗糖生产的最经济有效的措施。甘蔗的“高贵化育种”曾经创造了一个多世纪甘蔗糖业辉煌，但是，由于亲本材料少，“种”的血缘狭窄，导致在亲本选配中出现近亲杂交、而且距离野生种的代数越来越远，导致育成品种生活力、适应性、抗逆性、宿根性普遍下降。斑茅[Erianthus arundinaceus(Retz.)Jeswiet]为甘蔗近缘属植物，具有较强的抗病虫性、抗旱性、抗寒性及耐瘠性，宿根性好，分蘖性强，极粗生，适应性广。若通过甘蔗斑茅远缘杂交，对斑茅的多种强抗逆性基因加以开发利用是甘蔗育种界长期致力解决的关键问题。在甘蔗远缘杂交史中，曾有过近百例的甘蔗栽培种的种间甚至属间杂交报道，但其中大部分杂种的真实性受到怀疑。主要原因是甘蔗栽培种是由种间杂交而来，本身含有近缘物种的血缘，即使自交也会分离出野生的形态性状。杂交利用时杂种的真假鉴定显得非常重要，因为利用属间或种间杂种一定要充分了解杂种的真实性，才能提高育种利用的有效性。甘蔗种间、属间杂种鉴定经历了由生物学的形态鉴定到染色体鉴定、同功酶鉴定，使鉴定结果较为可靠，但由于甘蔗染色体数量多、传递行为复杂，同一材料计数差别达十多条，同功酶谱带受材料、环境等影响大，因此鉴定结果也不能令人十分信服。

发明内容    本发明的目的是探索从DNA分子水平上获得最直接的杂种证据，通过分子技术准确、直观地查明染色体或片断的来源。

本发明的甘蔗斑茅杂种的DNA鉴定方法，其特征如下：

1、基因组DNA提取：供鉴定的甘蔗斑茅杂种叶片经液氮研磨，依次加入CTAB提取缓冲液、聚乙烯基吡咯烷酮、月桂酰肌氨酸钠、CTAB溶液；经水浴加温，室温冷却，再用酚、氯仿抽提纯化、异丙醇沉淀、然后TE溶解；

2、试剂配制：反应体系含1/10体积的10倍PCR反应缓冲液；dNTP各0.1～0.3mmol/L；Taq DNA聚合酶0.1～5国际单位；分离纯化的DNA模板液0.1～5μl，；PCR引物1对，各0.1～2μmol/L；加无菌去离子水使总体积达到10～100μl；

上述PCR引物在以下引物中选取：

ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGT

ITS2：TCCTCCGCTTATTGATATGC

ITS3：TTGGCCGCCGTCCCATCCTC

ITS4：AGAAAAAGAAAAACAAAGGC

ITS5：TTCAGGTTTTTGGAGAACGG

ITS6：ACAAATTGGACTCTTGGAGC

ITS7：GGAAGAAAGAAAACAAGGGT

ITS8：GGGACGGMCMAAACAAAATT

ITS9：ACCCTTGTTTTCTTTCTTCC

ITS10：AATTTTGTTTGGGCCGTCCC

3、扩增程序：90-98℃预变性1-10min，90-98℃变性10-120s，45-65℃退火10-120s，65-80℃延伸10-120s，共20-40个循环，最后65-80℃保温1-10min；

4、电泳检测：扩增结束后，以GeneRuler100bp DNA Ladder Plus为marker，用含有EB的1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。

本发明的甘蔗斑茅杂种的DNA鉴定方法，具有准确、直观、便捷的特点，鉴定速度快，环境影响因素小，鉴定的准确率高，成功地解决了长期以来甘蔗斑茅杂种鉴定的困难，确保了被鉴定杂种的真实性，提高了育种利用的有效性。

附图说明    附图是甘蔗(拔地拉)、斑茅(崖城92-105)及其F1杂种(崖城96-66)，崖城96-66与甘蔗商业栽培种(CP84-1198)的回交后代(崖城01-1～崖城01-9)的杂种鉴定电泳检测图。

具体实施例    为了充分公开本发明的甘蔗斑茅杂种的DNA鉴定方法，结合以下实施例加以说明。

本发明是通过以下方法实现的：

1、基因组DNA的提取：

(1)取稍嫩的叶片100mg，剪碎后放入2.0ml的Eppendorf管中，在液氮处理下，用洁净的玻璃棒迅速研成粉末状；

(2)加入800ul 65℃预热的CTAB提取缓冲液(200mM Tris-HCl，50mM EDTA，2.2M NaCl，2％CTAB，0.06％亚硫酸钠，pH8.0)。颠倒离心管，使叶片粉末与提取缓冲液充分混均；

(3)然后依次加入200ul 10％聚乙烯基吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone，PVP)，200ul 5％月桂酰肌氨酸钠(Sodium lauroyl sarcosine)，200ul 20％十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，200ul无水乙醇，充分混合均匀；

(4)于65℃恒温水浴箱中温浴30min；

(5)取出离心管自然冷却至室温后6000g离心3min；

(6)吸取上层清夜，加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醉(25∶24∶1)，颠倒混匀后，在室温下8000g离心5min；

(7)转移上层清夜至另一个新的离心管中，加入等体积的冰预冷的异丙醇，轻轻混匀；

(8)-20℃下放置20min，使DNA充分缠绕成团；

(9)在室温下4000g离心2min，尽弃上层液；

(10)用70％的乙醇洗涤二次，在真空浓缩仪中将DNA沉淀抽干。

加入100ul TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0)，充分溶解DNA沉淀，-20℃下贮存备用。

2、配制试剂  反应体系含1/10体积的10倍PCR反应缓冲液；dNTP各0.2mmol/L；Taq DNA聚合酶1.5国际单位；分离纯化的DNA模板液1μl(50ng)；0.5ul引物I(5μmol/L)，0.5ul引物II(5μmol/L)；加无菌去离子水使总体积达到45μl。

上述引物I和引物II，在采用常规方法设计的具有适合本发明鉴定方法的PCR引物ITS1-ITS10中选取；以能够清晰显示甘蔗与斑茅杂种特异谱带为主要指标，经选择发现引物I为ITS7、引物II为ITS 8是最佳组合，具体如下：

ITS7：GGAAGAAAGAAAACAAGGGT

ITS8：GGGACGGMCMAAACAAAATT

3、扩增程序：95℃预变性5min，93℃变性50s，52℃退火20s，72℃延伸40s，共30个循环，最后72℃保温5min。

4、电泳检测：扩增结束后，以GeneRuler100bp DNA Ladder Plus为marker，用含有EB的1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，VILBERLOURMAT公司凝胶成像系统照相并保存，观察特异谱带的差异。如附图所示，荧光条带即317bp的条带所对应的样品均为斑茅的真实后代。图中，1为拔地拉；2为海南92-105；3为崖城96-66；4为CP84-1198；5～13依次为崖城96-66/CP84-1198组合的后代崖城01-1～崖城01-9；M为DNA分子量标记。测定结果表明：除拔地拉、CP84-1198和崖城01-4无317bp的条带，为非斑茅后代外，其余的样品都是斑茅的真实后代。