利用生物转化技术获得肉苁蓉苯乙醇苷类化合物的方法

摘要

利用生物转化技术获得肉苁蓉次生代谢产物的方法，属于生物转化技术领域，包括以下步骤：1)在改良的MS培养基中，按每升培养液添加蔗糖或葡萄糖20～50g，吲哚乙酸0.1～4mg和细胞分裂素0.1～4mg制成基本培养基；在基本培养基中添加前体物质，将pH值调整到5.5～7.0制成合成培养基，在125℃，0.1Mpa压力下消毒后经冷却待用；将肉苁蓉愈伤组织细胞接种到合成培养基上，然后在25℃避光条件下振荡培养1周后，收获细胞经冷冻干燥后用溶剂萃取获得粗提物，再经过纯化获得苯乙醇苷类化合物。利用本发明所述方法生产肉苁蓉的次生代谢产物，生产成本低，培养周期短，不受自然环境影响，可以实现周年生产。

说明书

技术领域

本发明涉及一种获得肉苁蓉次生代谢产物的方法，特别是涉及一种利用肉苁蓉细胞生物转化技术获得肉苁蓉苯乙醇苷类化合物的方法。

背景技术

肉苁蓉(Cistanche)是列当科肉苁蓉属多年生寄生草本植物，原生于我国的内蒙古、陕西、甘肃、宁夏和新疆等地区的盐碱地、干河沟或戈壁滩上。主要寄生在红沙柳、盐爪爪、着叶盐爪、珍珠和西伯利亚刺等植物的根上。由于其栖息地的环境恶劣且生长速度缓慢，产量非常有限。肉苁蓉是一味传统中药，具有补肾、益精、强筋健髓之功效，主治下部虚损、老年血液枯槁。久服可以强身壮体，返老还童。近年来常被作为抗衰老和抗癌药物使用，特别是在保健药品或食品当中大都添加肉苁蓉提取物。目前已经发现，肉苁蓉中含有苁蓉素、苯乙醇甙(松果菊甙、麦角甾苷、海胆苷、顺式麦角甾苷、异麦角甾苷、乙酰基麦角甾苷、肉苁蓉苷)、梓醇、丁香苷、红景天苷、甘露醇、β-谷甾醇、胡萝卜甙、甜菜碱、升麻甙、鼠李糖苷等多种活性成分，特别是苯乙醇甙类化合物具有增强学习记忆力、抗衰老和健身等重要功能。据报道我国每年的肉苁蓉市场需求量在500～1000吨左右，而我国自己的产量不足300吨，除了部分从中东地区进口以外，还远远满足不了市场的需要。此外，日本也是肉苁蓉的应用大国，其健康保健饮料当中几乎都要添加肉苁蓉提取液。

由于肉苁蓉栖息于干燥的荒漠或盐湖周边，生育环境极为恶劣，而且其被寄生植物的资源也十分短缺，因此肉苁蓉野生资源十分匮乏。特别是近些年来的狂采乱挖，现有的野生资源已经遭到严重破坏，肉苁蓉的产量日益下降。长此以往，会加速野生肉苁蓉灭绝的危险。虽然肉苁蓉的人工栽培已经被列为“十五”攻关项目，遗憾的是到目前为止还很难通过人工栽培来满足市场的需求。更何况肉苁蓉也是防沙固沙保持生态系统的重要植物材料之一，通过人工栽培恢复生态环境非常重要，采挖肉苁蓉是破坏固沙生态的一种行为。

为了减少对野生资源的采摘和破坏，为了将肉苁蓉的自然生产方式转变为工业化生产方式，利用现代生物技术生产肉苁蓉的次生代谢产物非常重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种在不破坏自然环境条件下，利用生物工程技术获得肉苁蓉次生代谢产物的方法。

本发明的技术方案是一种利用生物转化技术获得肉苁蓉次生代谢产物的方法，其特征在于该方法主要包括以下步骤：

1)在改良的Murashige & Skoog培养基(简称，MS培养基)中，按每升培养液添加蔗糖或葡萄糖20～50g，吲哚乙酸0.1～4mg和细胞分裂素0.1～4mg制成基本培养基；

2)在所述基本培养基中添加氨基酸前体(苯丙氨酸和/或酪氨酸)，或黄瓜汁前体，或咖啡酸前体，用酸或碱将pH值调整到5.5～7.0制成合成培养基，在125℃，0.1Mpa压力下消毒后经冷却待用；

3)将肉苁蓉愈伤组织细胞接种到所述合成培养基上，然后在25℃避光条件下振荡培养1周后，收获细胞经冷冻干燥后用溶剂萃取获得粗提物，再经过纯化获得苯乙醇苷类化合物。

本发明中所述细胞分裂素为6-苄氨基嘌呤或激动素(kinetin)。

本发明中所述黄瓜汁的获取方法是将黄瓜搅拌粉碎后在4000r.p.m，20℃下离心30min，取上清液过滤获得。

利用本发明的方法来生产肉苁蓉的次生代谢产物，生产成本低，培养周期短，不受自然环境影响，可以实现周年生产，在不进行野外采挖的情况下，获得大量肉苁蓉的次生代谢产物。该方法可以满足人们越来越多的对肉苁蓉及其次生代谢产物的需求。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

实施例中所用的肉苁蓉愈伤组织(优选CS2002荒漠肉苁蓉细胞系或CS2001盐生肉苁蓉细胞系)可以通过如下方法获得：在改良的MS培养基中，按每升培养液添加蔗糖或葡萄糖20～50g，吲哚乙酸(IAA)0.1～4mg和6-苄氨基嘌呤(BA)0.1～4mg制成基本培养基。在基本培养基中按每升培养液添加2g高效凝固剂(Gellan gum)，经高温消毒并冷却后做成固体平板培养基，将肉苁蓉细胞系接种在该培养基上，在25℃黑暗条件下静止培养28天，肉苁蓉愈伤组织将增长5～10倍，待用。

实施例1：添加两种氨基酸前体进行生物转化

(1)在改良的MS培养基中，按每升培养液添加蔗糖或葡萄糖20～50g，吲哚乙酸(IAA)0.1～4mg和6-苄氨基嘌呤(BA)0.1～4mg制成基本培养基。

(2)向所述基本培养基中按每升培养液添加苯丙氨酸50～500mg和酪氨酸50～400mg，然后用酸或碱将pH值调整到5.5～7.0制成合成培养基，在125℃，0.1Mpa压力下消毒后经冷却后待用。

(3)将所述肉苁蓉愈伤组织细胞接种到步骤(2)中所述合成培养基上，接种量为20％左右。然后在25℃避光条件下培养1周后，收获细胞经冷冻干燥后用溶剂萃取获得粗提物，再经过纯化处理就可以获得苯乙醇苷类化合物。

实施例2：添加黄瓜汁前体进行生物转化

本实施例中的黄瓜汁可用如下方法获取：选取新鲜的黄瓜，搅拌粉碎后在4000r.p.m，20℃下离心30min，取上清液过滤即得，4℃保存备用。

(1)在改良的MS培养基中，按每升培养液添加蔗糖或葡萄糖20～50g，吲哚乙酸(IAA)0.1～4mg和激动素(kinetin)0.1～4mg制成基本培养基。

(2)向所述基本培养基中按每升培养液添加黄瓜汁40～200ml，然后用酸或碱将pH值调整到5.5～7.0制成合成培养基，在125℃，0.1Mpa压力下消毒后经冷却后待用。

(3)将所述肉苁蓉愈伤组织细胞接种到步骤(2)中所述合成培养基上，接种量为30％左右。然后在25℃避光条件下培养1周后，收获细胞经冷冻干燥后用溶剂萃取获得粗提物，再经过纯化处理就可以获得苯乙醇苷类化合物。

实施例3：添加咖啡酸前体进行生物转化

(1)在改良的MS培养基中，按每升培养液添加蔗糖或葡萄糖20～50g，吲哚乙酸(IAA)0.1～4mg和6-苄氨基嘌呤(BA)0.1～4mg制成基本培养基。

(2)向所述基本培养基中按每升培养液添加咖啡酸5～100ml，然后用酸或碱将pH值调整到5.5～7.0制成合成培养基，在125℃，0.1Mpa压力下消毒后经冷却后待用。

(3)将所述肉苁蓉愈伤组织细胞接种到步骤(2)中所述合成培养基上，接种量为50％左右。然后在25℃避光条件下培养1周后，收获细胞经冷冻干燥后用溶剂萃取获得粗提物，再经过纯化处理就可以获得苯乙醇苷类化合物。

实施例4：添加一种氨基酸前体进行生物转化

(1)在改良的MS培养基中，按每升培养液添加蔗糖或葡萄糖20～50g，吲哚乙酸(IAA)0.1～4mg和6-苄氨基嘌呤(BA)0.1～4mg制成基本培养基。

(2)向所述基本培养基中按每升培养液添加苯丙氨酸50～500mg(或酪氨酸50～400mg)，然后用酸或碱将pH值调整到5.5～7.0制成合成培养基，在125℃，0.1Mpa压力下消毒后经冷却后待用。

(3)将所述肉苁蓉愈伤组织细胞接种到步骤(2)中所述合成培养基上，接种量为20％左右。然后在25℃避光条件下培养1周后，收获细胞经冷冻干燥后用溶剂萃取获得粗提物，再经过纯化处理就可以获得苯乙醇苷类化合物。

通过高效液相色谱分析(HPLC)按照以上方法将肉苁蓉愈伤组织细胞作为微反应器进行生物转化，其松果菊苷，洋丁香酚苷(类叶升麻苷)，2′-乙酰基洋丁香酚苷(2′-乙酰基类叶升麻苷)的总产量可以达到15％以上。

本发明中所述的改良的Murashige&Skoog培养基、也可以由Miller培养基替代，产生的技术效果相似。