通过麦芽糖改进花旗松的胚胎发生培养的起始

摘要

一方面，本发明提供了产生花旗松体细胞胚的方法。一方面，本发明的方法包括如下步骤：将花旗松外植体培养在起始培养基中或者之上，所述起始培养基包括选自麦芽糖，葡萄糖，及其组合物的主要糖源，从而形成包括早期体细胞胚的胚柄团。在另一方面，本发明的方法还另外包括如下步骤：将花旗松胚柄团培养在维持培养基中，所述维持培养基包括选自麦芽糖，葡萄糖，及其组合物的主要糖源，从而形成包括早期体细胞胚的成形的胚柄团。

说明书

发明领域

本发明涉及产生花旗松体细胞胚的方法。

发明背景

对于诸如松树和枞树的针叶树制造木材产品的需要持续增加。这个问题的一种建议的解决方式就是鉴定具有诸如生长快速的需要特征的单个树，并且通过体细胞克隆产生优良树的大量遗传一致的克隆。

体细胞克隆就是从树的组织而非雌雄配子产生遗传一致的树的过程。在体细胞克隆的一种方法中，植物组织培养在起始培养基中，所述培养基包括诸如植物生长素和/或细胞因子的激素以起始诸如胚柄团的胚胎发生细胞，所述胚胎发生细胞能够发育形成体细胞胚。胚胎发生细胞进一步培养在维持培养基中以促进胚胎发生细胞的建立和增殖。随后增殖的胚胎细胞培养在发育培养基中以促进针叶树体细胞胚的发育，所述发育的体细胞胚例如可以放入人工种子中并播种在土壤中，在土壤中它们发芽产生针叶树苗。树苗可以移植到生长地进行随后的生长并最终收获获得木材或者木材来源的产品。

体细胞克隆花旗松(Douglas-fir)胚的一个持续存在的问题是刺激有效的起始和建立能够生成体细胞胚的花旗松胚胎发生细胞。本发明提供了满足这种需要的方法。

发明概述

一方面，本发明提供了产生花旗松体细胞胚的方法。一方面，本发明的方法包括如下步骤：将花旗松外植体培养在起始培养基中或者之上，所述培养基包括选自麦芽糖，葡萄糖，及其组合物的主要糖源从而形成包括早期体细胞胚的胚柄团。起始培养基中麦芽糖或者葡萄糖或者其混合物的浓度可以从大约5g/L到大约60g/L，诸如从大约20g/L到大约50g/L或者从大约30g/L到大约40g/L。在一些实施方案中，花旗松外植体培养在起始培养基中或者之上从大约4星期到大约12星期，诸如从大约5星期到大约10星期，诸如大约6星期的时间段。

在另一方面，本发明的方法另外包括如下步骤：将花旗松胚柄团培养在维持培养基中，所述培养基包括选自麦芽糖，葡萄糖，及其组合物的主要糖源从而形成包括早期体细胞胚的成形的胚柄团。成形的胚柄团进行生长和增殖。未成形的胚柄团变成褐色并死亡。维持培养基中麦芽糖或者葡萄糖或者其混合物的浓度可以从大约5g/L到大约60g/L，诸如从大约20g/L到大约50g/L或者从大约30g/L到大约40g/L。在一些实施方案中，花旗松外植体培养在维持培养基中或者之上直到大约6个月的时间段。

在一些方法实施方案中，至少27％的花旗松外植体形成胚柄团。本发明的方法与起始培养基不含麦芽糖或葡萄糖或其组合物作为主要糖源的方法相比增加了起始的花旗松外植体的数目。例如，利用本发明的起始培养基产生的胚柄团的数目至少比利用相同的起始培养基但是用蔗糖作为主要糖源所产生的胚柄团的数目多大约51％。

在一些实施方案中，至少18％的花旗松胚柄团形成成形的胚柄团。本发明的方法与维持培养基不含麦芽糖或葡萄糖或其组合物作为主要糖源的方法相比增加了成形的花旗松胚柄团的数目。在一些实施方案中，根据本发明的方法产生的成形的花旗松胚柄团的数目至少比利用相同的维持培养基但是用蔗糖作为主要糖源所产生的成形胚柄团的数目多大约65％。

本发明的方法可用于例如制备花旗松体细胞胚，所述体细胞胚可通过例如遗传或者生化方法进行鉴定，或者如果需要可进行发芽从而获得可以长成成熟的花旗松树的花旗松外植体。因此，例如本发明的方法可被用于产生单个花旗松树的克隆，所述单个花旗松树具有诸如生长快速或者树质改良的一种或者多种的需要特征。例如，本发明的花旗松体细胞胚群可用于产生花旗松树的林分或者森林，所述的花旗松树具有诸如生长快速或者树质改良的一种或者多种需要的特征。这些树可用于生产木制品。

本发明优选实施方案的详细描述

除非本文具体限制，此处所用的所有术语具有对于本发明的技术领域的技术人员而言相同的含义。

此处所用的术语“外植体”是指来自供体植物的一块组织。通常根据本发明的方法使用的外植体是来自未成熟种子的受精胚。

此处所用的术语“胚柄团”或者“ESM”是指白色透明的粘质团，包括各个早期发育阶段的胚，每种胚都含有胚头和胚柄系统。

此处所用的术语“成形的胚柄系统”是指正在生长和增殖的胚胎细胞团。没有成形的胚柄团变成褐色并死亡。成形的胚柄团通常重达250mg和500mg之间或者多次继代培养以后测定的直径为1-2cm。

此处所用的术语“早期体细胞胚”是指在发育的前圆形细胞阶段的胚。术语“子叶体细胞胚”是指具有至少一个子叶的胚。

此处所用的术语“主要的糖源”是指以最高浓度存在的糖源。

除非另有说明，所有以百分比表示的浓度值为每体积的重量百分比。

在一方面，本发明提供了产生花旗松体细胞胚的方法，所述方法包括如下步骤：将花旗松外植体培养在起始培养基中或者之上，所述培养基包括选自麦芽糖，葡萄糖，及其组合物的主要糖源从而形成包括早期体细胞胚的胚柄团。

本发明实施中使用的外植体的一个例子是描述于实施例1中的来自花旗松圆锥种子的前圆形细胞和圆形细胞阶段的胚。通常，在除去胚之前对种子进行表面消毒，然后将胚培养在起始培养基中或者之上。根据本发明，起始培养基含有麦芽糖或者葡萄糖或者其组合作为唯一，或者主要的可代谢的糖源。花旗松外植体的起始培养基的现有技术使用蔗糖作为糖源。蔗糖是由葡萄糖和果糖分子通过共价连接组成的二糖。相比于果糖，葡萄糖是生物合成较好的糖源。麦芽糖是有两个葡萄糖单元组成的二糖。因此，使用麦芽糖作为主要的糖源，提供的每糖单元的葡萄糖的量是由蔗糖提供的两倍。起始培养基中主要糖源的浓度可以从大约5g/L到大约60g/L，诸如从大约20g/L到大约50g/L或者从大约30g/L到大约40g/L。

起始培养基可以是半固体培养基或者固体培养基。起始培养基通常包括无机盐和有机营养物。起始培养基的重量摩尔渗透浓度通常为大约160mM/kg甚至更低，但是也可以高达170mM/kg。起始培养基通常包括生长激素。可以包括在起始培养基中的激素的例子为植物生长素(例如，2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D))和细胞因子(例如，6-苄氨基嘌呤(BAP))。植物生长素可以使用，例如从大约1mg/L到大约200mg/L的浓度。细胞因子可以使用，例如从大约0.1mg/L到大约50mg/L的浓度。

起始培养基可含有吉兰糖胶，通常存在的浓度为大约1g/L到大约2g/L。起始培养基可含有吸收性组分，尤其是当使用非常高水平的生长激素时。吸收性组分可以任意组分，条件是在本发明的使用浓度下对于细胞无毒并且能够吸收培养基中存在的促进生长的激素和在胚胎发育期间由植物细胞产生的毒性化合物。使用的吸收性组分的非限制性的例子包括活性炭，可溶性聚(乙烯吡咯烷酮)，不溶性聚(乙烯吡咯烷酮)，活性氧化铝，和硅胶。吸收性组分的存在量为例如，从大约0.1g/L到大约5g/L。

本发明实施中使用的起始培养基的例子为列举在实施例1中的培养基BM₁。

花旗松外植体通常培养在起始培养基中或之上从4周到12周，诸如从5周到10周，或者诸如大约6周的时间段，培养温度为从10℃到30℃，诸如从15℃到25℃，或者诸如从20℃到23℃。

另一方面，本发明提供了产生花旗松体细胞胚的方法，所述方法包括如下步骤：(a)将花旗松外植体培养在起始培养基中或者之上，所述起始培养基含有选自包括麦芽糖，葡萄糖及其组合的主要糖源，从而形成包括早期体细胞胚的胚柄团，和(b)将胚柄团培养在维持培养基中或者之上，所述维持培养基含有选自包括麦芽糖，葡萄糖及其组合的主要糖源，从而形成成形的胚柄团。成形的胚柄团正在生长和增殖。没有成形的胚柄团变成褐色并死亡。

起始培养基的组分描述如上。通常，麦芽糖或者葡萄糖或者其组合是维持培养基中唯一，或者主要的可代谢的糖源。维持培养基中麦芽糖或者葡萄糖或者其组合的浓度可以从大约5g/L到大约60g/L，诸如从大约20g/L到大约50g/L或者从大约30g/L到大约40g/L。

维持培养基可以是固体培养基，或者可以是液体培养基，可以振荡培养基以促进ESM的生长和增殖。维持培养基的重量摩尔渗透浓度通常高于起始培养基的重量摩尔渗透浓度，通常的范围是180-400mM/kg。维持培养基可以含有维持胚胎发生组织的养分，并且可能包括激素，诸如一种或者多种植物生长素和/或细胞因子以促进胚胎发生组织的细胞分裂和生长。通常，维持培养基中激素的浓度低于其起始培养基的浓度。合适的维持培养基的例子为列举在实施例1中的培养基BM₂。

花旗松ESM通常培养在维持培养基中或者之上达6个月的时间，培养温度为从10℃到30℃，诸如从15℃到25℃，或者诸如从20℃到23℃。当使用固体维持培养基时，大约每两周对ESM进行一次继代培养，当使用液体维持培养基时，通常每周对ESM进行一次继代培养。

在一些实施方案中，本发明提供了产生花旗松体细胞胚的方法，所述方法包括如下步骤：(a)将花旗松外植体培养在起始培养基中或者之上，所述起始培养基含有选自包括麦芽糖，葡萄糖及其组合的主要糖源，从而形成包括早期体细胞胚的胚柄团，(b)将胚柄团培养在维持培养基中或者之上，所述维持培养基含有选自包括麦芽糖，葡萄糖及其组合的主要糖源，从而形成成形的包括早期体细胞胚的胚柄团；(c)将来自成形的胚柄团的早期体细胞胚培养单独(Singulation)培养基中或者之上形成单独(singulatecl)的早期体细胞胚；和(d)将早期体细胞胚培养在发育培养基中或者之上形成子叶体细胞胚。

根据这个实施方案，含有早期体细胞胚的成形的ESM可以进一步培养在单独培养基中或之上以形成单独的胚。合适的单独培养基通常不包括促进生长的激素，诸如植物生长素和细胞因子，但是通常包括激素脱落酸。脱落酸是一种倍半萜烯类化合物植物激素，参与植物的多种生理过程(例如参见，Milborrow(2001)J.Exp.Botany 52：1145-1164；Leung和Giraudat(1998)Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Bio.49：199-123)。当脱落酸用于发育培养基时，使用浓度一般为从大约1mg/L到大约200mg/L的范围。通常，单独培养基是液体培养基并且含有维持胚胎发生组织的养分。单独培养基可含有麦芽糖，葡萄糖或者其组合作为主要的可代谢糖源。单独培养基的重量摩尔渗透浓度可以调整到需要范围内的值，诸如从大约150mM/kg到大约250mM/kg。通常200mM/kg或者更高的重量摩尔渗透浓度是优选的。合适的发育培养基的例子为列举在实施例1中的培养基BM₃。

花旗松早期阶段的体细胞胚可以培养在单独培养基中或者之上，每周进行一次继代培养，培养时间为从1周到3周的时间，培养温度为从10℃到30℃，诸如从15℃到25℃，或者诸如从20℃到23℃。

单独培养后，早期阶段的体细胞胚可以培养在发育培养基上从而形成子叶体细胞胚。发育培养基通常为固体培养基，虽然发育培养基可以是液体培养基。发育培养基通常含有维持胚胎发生组织的养分。麦芽糖可以包含在发育培养基中作为用于胚胎发生组织的主要或者唯一糖源。麦芽糖的合适浓度的范围是从大约1％到大约2.5％。

合适的发育培养基通常不包括促进生长的激素，诸如植物生长素和细胞因子，但是可包括激素脱落酸。当脱落酸用于发育培养基时，通常的使用浓度为从大约1mg/L到大约200mg/L的范围。

发育培养基可含有吉兰糖胶，其存在浓度通常可高达大约0.35％。发育培养基的重量摩尔渗透浓度可以调整到需要范围内的值，诸如从大约250mM/kg到大约450mM/kg。通常，350mM/kg或者更高的重量摩尔渗透浓度是优选的。合适的发育培养基的例子为列举在实施例1中的培养基BM₃。

花旗松单独的早期胚可以培养在发育培养基中或者之上，从而形成子叶体细胞胚，培养时间为从4周到14周，诸如从8周到12周，或者诸如大约12周，培养温度为从10℃到30℃，诸如从15℃到25℃，或者诸如从20℃到23℃。

利用本发明的方法产生的子叶体细胞胚如果需要可任选进行发芽形成可以长成花旗松树的花旗松植物体。或者，成熟的胚可放入人工种子中进行随后的发芽。子叶花旗松体细胞胚可以例如发芽在固体发芽培养基上，诸如列举在实施例1中的培养基BM₅。

在一些实施方案中，花旗松子叶体细胞胚转化到成层培养基以在发芽之前进行冷处理。通常，成层培养基类似于发芽培养基，但缺乏琼脂。子叶体细胞胚通常在黑暗中培养在成层培养基中或之上，培养时间为从3周到6周，诸如大约4周，培养温度为从1℃到10℃，诸如从1℃到8℃。

发芽的植物体可以转移到土壤中进行进一步生长。例如，发芽的植物体可以种植在温室的土壤中，并且在移植到室外以前进行生长。通常，成熟花旗松体细胞胚加以照明来刺激发芽。通常，本发明的方法的所有步骤除了发芽都在黑暗中进行。

在本发明的一些实施方案中，至少27％(诸如至少40％或者至少60％)的花旗松外植体形成胚柄团。本发明的方法与起始培养基不含麦芽糖或葡萄糖或其组合物作为主要糖源的方法相比增加了从花旗松外植体起始的胚柄团的数目。例如，根据本发明的方法产生的胚柄团的数目至少比利用相同的起始培养基但是用蔗糖作为主要糖源所产生的胚柄团的数目多大约51％(诸如多大约60％或多大约80％)。

在本发明的一些实施方案中，至少18％(诸如至少25％或者至少40％)的花旗松胚柄团形成成形的胚柄团。本发明的方法与维持培养基中不含麦芽糖或葡萄糖或其组合物作为主要糖源的方法相比增加了成形的花旗松胚柄团的数目。在一些实施方案中，根据本发明的方法产生的成形的花旗松胚柄团的数目至少比利用相同的维持培养基但是用蔗糖作为主要糖源所产生的成形花旗松胚柄团的数目多大约65％(诸如多大约75％或多大约90％)。

本发明的方法可用于，例如产生单个花旗松树的克隆，所述的花旗松树具有一种或者多种需要的特性，诸如快速生长率。因此，一方面，本发明提供了用于产生一群遗传相同的成熟花旗松胚的方法。此处描述的任意方法可用于产生遗传相同的成熟的花旗松胚群。

下列实施例仅仅列举了现在考虑到的实施本发明的最佳方式，但是不应解释为限制本发明。

实施例1

这个实施例显示了利用含有麦芽糖或者蔗糖作为主要糖源的起始和维持培养基获得的花旗松胚柄团的起始和形成概率的比较。

锥体细胞收集自四株杂交母树(全同科)，此时胚为发育阶段的前圆形细胞和圆形细胞阶段。锥体细胞转移在蓝冰上并在0-4℃保存在冷室的塑料袋中直到需要解剖。在同一天从锥体细胞去处种子并进行解剖。去除种子后，放入到含有预先灭菌的水的烧杯中。

将种子分成每等分60到80颗种子。在进行随后的程序之前，每份放置在分离的预先灭菌的滤茶网中。首先，种子在10％的Liqui-nox(每升加入2滴的全吐温-20)中搅动10分钟。在去离子水(18兆欧)中冲洗种子30分钟后，在通风橱中旋转振荡器(175rpm)上滤茶网暴露于20％(v/v)H₂O₂ 10分钟。在正好使用之前用无菌去离子水稀释H₂O₂。在使用H₂O₂后，每个滤茶网放置在灭菌去离子水的单独的烧杯中，用金箔纸盖住并移入层流净化罩中。所有随后的步骤都在层流净化罩中进行。每个滤茶网在5个单独部分的每一个无菌去离子水中振荡4到8次进行清洗。每个滤茶网中的物质倒入含有无菌滤纸和几毫米无菌水(有助于防止种子干燥)的大培养皿中。种子放入每个含有0.2ml无菌去离子水的60×15mm的无菌培养皿中。在灭菌后没有解剖的那些种子在当天结束时扔掉。

在洁净的层流净化罩中进行解剖。在整个制备步骤和解剖的过程中戴上干净的手套。利用无菌镊子和解剖刀仔细的切开种子，去除雌配子体和珠心并切开雌配子体。拉出胚柄但是保持附着到(或者接触)雌配子体。胚和雌配子体放置在起始培养基BM₁上这样通过培养皿盖可以看见胚。

表1和2列举了用于产生花旗松体细胞胚的培养基的组成。

表1.用于花旗松胚胎发生培养的基本培养基(BM)的组成

    组分    浓度(mg/L)    KNO₃    不定    MgSO₄.7H₂O    400    KH₂PO₄    340    CaCl₂.4H₂O    200    KI    1    H₃BO₃    5    MnSO₄.H₂O    20.8    ZnSO₄.7H₂O    8    NaMoO₄.2H₂O    0.2    CuSO₄.5H₂O    0.024    CoCl₂.6H₂O    0.025    Ca(NO₃)₂.2H₂O    不定    FeSO₄.7H₂O    27.85    Na₂EDTA    37.25    烟酸    0.5    吡哆醇.HCl    0.5    硫胺素.HCl    1    甘氨酸    2    酪蛋白氨基酸    500    L-谷氨酰胺    不定    肌醇    不定    糖    不定    pH调整到5.7

表2.花旗松胚胎发生培养基的组成

组分               BM₁      BM₂      BM₃     BM₄      BM₅

                   起始      维持      单独      发育      发芽

KNO₃              1250      1250      1050      2500      1170

Ca(NO₃)₂·2H₂O -         -         200       -         220

肌醇               1000      5000      100       100       100

L-谷氨酰胺         450       1000      1000      750       -

L-脯氨酸           -         -         -         100       -

L-天冬酰胺         -         -         -         100       -

L-精氨酸           -         -         -         50        -

L-丙氨酸           -         -         -         20        -

L-丝氨酸           -         -         -         20        -

麦芽糖             15,000    30,000    20,000    25,000    -

蔗糖               -         -         -         -         20,000

PEG 8000           -         -         -         190,000   -

2，4-D             110       1.1       -         -         -

N6-                45        0.22      -         -         -

苄基腺嘌呤

激动素             43        0.22      -         -         -

脱落酸             -         -         10/5/5    10        -

赤霉素4/7          -         -         -         7.5       -

活化的             2500      -         -         1000      2500

活性炭

琼脂               -         5000^*    -         -         8000

Gelrite            1800      -         -         -         -

           所有培养基的pH被调整到5.7

^*不用于液体培养基

^**组织培养琼脂

起始：从每次杂交获得的胚和雌配子体中的一半(第一组)放置在半固体BM₁起始培养基(表2)上，另一半(第二组)放置在半固体BM₁起始培养基上，其中用蔗糖(15000mg/L)代替麦芽糖。外植体保持在22到25℃，24小时暗光周期的环境下，时间为5到6周。时间的长短依赖于培养的特定基因型。在接种后2到3周开始观察到胚柄团(ESM)(白色，半透明和粘质)。显微检测通常显示大量的早期胚与胚柄团相连。

每组从外植体起始的ESM培养物的数目显示在表3。起始被限定为从外植体生长胚柄团。总之，从外植体起始的ESM的百分比对于A组而言为27％，而对于B组而言为18％。当外植体培养在含麦芽糖的起始培养基(A组)上时检测4个杂交中每个的起始的提高。总之，与培养在含蔗糖的起始培养基上的外植体相比在含有麦芽糖的起始培养基上的外植体的数目增加51％起始的外植体。

表3.A组和B组的起始概率

杂交    组     外植体(#)    起始(#)     起始(％)

1       A       136          63          46

        B       138          42          30

2       A       108          30          28

        B       108          20          19

3       A       110          21          19

        B       108          14          13

4       A       112          13          12

        B       111          8           7

总      A       466          127         27

        B       465          84          18

维持：5到6周以后，来自A组的ESM继代培养到固体BM₂维持培养基(表2)上，而来自B组的ESM继代培养到BM₂维持培养基上，其中麦芽糖用蔗糖(30000mg/L)代替。维持培养基与起始培养基的区别在于生长激素(植物生长素和细胞因子)减少至少一个完整的数量级。这个培养基的重量摩尔渗透浓度通常从起始培养基的重量摩尔渗透浓度升高到大约180mM/kg或者更高(通常在大约180-400mM/kg的范围内)，其途经是增加肌醇的浓度到0.5％w/v。温度和光周期仍然是在22到25℃，24小时的黑暗中。每12天将ESM继代培养在新鲜的维持培养基上。

总共12到15次继代培养在维持培养基上后，每组外植体形成的ESM的数量显示在表4中。如果多次继代培养后重量在250mg和500mg(鲜重)或者如果测定到的直径为1到2cm就认为形成了ESM。获得的成形的EMS的比例对于A组的外植体为18％，而对于B组的外植体为11％。当外植体培养在含麦芽糖(A组)的维持培养基上时检测到4个杂交中每个的ESM成形概率提高。总之，对于培养在含麦芽糖的维持培养基上的外植体与培养在含蔗糖的维持培养基上的外植体相比成形的ESM数量增加51％。

表4.A组和B组的成形概率

杂交    组     外植体(#)    起始(#)    起始(％)

1       A       136          36         26

        B       138          20         14

2       A       108          11         10

        B       108          6          6

3       A       110          20         18

        B       108          12         11

4       A       112          17         15

        B       111          13         12

总      A       466          84         18

        B       465          51         11

虽然已经列举和描述了本发明的优选的实施方案，应该认识到在不离开本发明的精神和范围的情况下可以进行多种改变。