对大肠杆菌O139型的O－抗原特异的核苷酸

摘要

本发明提供一种对大肠杆菌O139型(Escherichiacoli O139)的O－抗原特异的核苷酸，它是大肠杆菌O139型中控制O－抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，如SEQ ID NO：1所示的分离的核苷酸，全长12654个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸；还包括源于大肠杆菌O139型的O－抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因的寡核苷酸；本发明通过PCR证实寡核苷酸对大肠杆菌O139型的O－抗原都有高度的特异性；本发明还公开了用本发明的寡核苷酸检测和鉴定人体及环境中的大肠杆菌O139型的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及大肠杆菌O139型(Escherichia coli O139)中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，特别是涉及大肠杆菌O139型中控制O-抗原合成的基因簇中的寡核苷酸，可利用这些对O-抗原特异的寡核苷酸快速、准确地检测人体及环境中的大肠杆菌O139型并鉴定这些致病菌中的O-抗原。

背景技术

O-抗原是革兰氏阴性细菌脂多糖中的O特异性多糖成分，它由许多重复的寡糖单位组成。O-抗原的合成过程研究得较清楚：先由糖基转移酶将核苷二磷酸单糖转移到一个固定在细胞内膜的脂分子上，然后在内膜的内侧合成寡糖单位，O-抗原的寡糖单位再通过转运酶被转移到内膜外侧，而后通过聚合酶聚合成多糖，再被连接到一个糖脂分子上形成脂多糖分子[Whitfield，C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide O antigens”.Trends inMicrobiology.3：178-185；Schnaitman，C.A.and J.D.Klena.(1993)“Genetics oflipopolysaccharide biosynthesis in entericbacteria”.MicrobiologicalReviews，57(3)：655-682]。编码负责O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色体上相邻排列，形成一个基因簇[Reeves，P.R.，et al.(1935)“Bacterialpolysaccharide synthesis and gene nomenclature”Trends in Microbiology，4：495-503]。在志贺氏菌、大肠杆菌和沙门氏菌中，O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之间[Lei Wang.et al(2001)“Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigenloci；implication for Escherichia coli and Shigella relationships”.Infection andImmunity，11：6923-6930；Lei Wang and Peter Reeves(2000)“The Escherichia coliO111 and Salmonella enterica O139 gene clusters：gene clusters encoding the samecolitose-containing O antigen are highly conserved”.Journal ofBacteriology.182：5256-5261]。O-抗原基因簇含有三类基因：糖合成路径基因，糖基转移酶基因，寡糖单位处理基因，其中糖合成路径基因编码的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸单糖；糖基转移酶基因编码的酶将核苷二磷酸单糖及其它分子转到单糖上从而使单糖聚合成寡糖单位；寡糖单位处理基因包括转运酶基因和聚合酶基因，它们将寡糖单位转移到细菌内膜外侧，再聚合成多糖。糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因只存在于携带这些基因的基因簇里。O-抗原中单糖的不同，单糖间联结键的不同和寡糖单位之间联结键的不同构成了O-抗原的多样性，而单糖的组成、单糖间的联结键及寡糖单位之间的联结键是由O-抗原基因簇中的基因控制着，所以O-抗原基因簇决定了O-抗原的合成，也决定了O-抗原的多样性。

因为O-抗原是极强的抗原，是大肠杆菌重要的致病因素之一，同时它又具有极强的多样性，这启示我们能研究一种快速、准确地检测大肠杆菌及其O-抗原的特异性好、灵敏度高的方法。以表面多糖为目标的血清学免疫反应自上世纪30年代以来一直被用于对细菌的分型和鉴定，是鉴定致病菌的唯一的手段。这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，所以，现在普遍认为这种传统的血清学检测方法将为现代分子生物学方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙门氏菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特异核苷酸序列通过PCR方法鉴定了沙门氏菌的O-抗原[Luk，J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification of abequose andparatose synthase genes(rfb)by polymerase chain reaction for identification ofS.enterica major serogroups(A，B，C2，andD)”，J.Clin.Microbiol.31：2118-2123]。Luk，et.al的方法是将相应于沙门氏菌血清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原内的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核苷酸序列排列后得到对不同血清型的沙门氏菌特异的寡核苷酸。1935年，Paton，A.W et.al用对E.coli O111的O-抗原特异的源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定了一株产毒素的E.coli O111的血清型[“Molecular microbiological investigation of an outbreak of Hemolytic-Uremic Syndrome caused by dry fermented sausage contaminated with Shiga-liketoxin producing Escherichia coli”.J.Clin.Microbiol.34：1622-1627]，但是后来的研究表明Paton，A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定E.coli O111的血清型的方法有假阳性结果出现。Bastin D.A.and Reeves，P.R.认为，这是由于wbdI基因是一个推测的糖合成路径基因[Bastin D.A.andReeves，P.R.(1995)Sequence and analysis of the O antigen gene (rfb) cluster ofEscherichia coli O111.Gene 164：17-23]，而在其它细菌的O-抗原的结构中也可能有这个糖，所以糖合成路径基因对于O-抗原并不是高度特异的

志贺氏菌有46种血清型，但只有33种不同的O-抗原，大肠杆菌有166种不同的O-抗原[Reeves，P.R(1992)“Variation in O antigens，niche specificselection and bacterial populations”.FEMS Microbiol.Lett，100：509-516]，二者亲缘关系非常近，并且有12种是大肠杆菌和志贺氏菌共有的[Ewing，W.H.(1986)“Edwards and Ewing’s identification of the Enterobacteriaceae”.Elsevier SciencePublishers，Amsterdam，The Netherlands；T.cheasty，et al.(1983)“Antigenicrelationships between the enteroinvasive Escherichia coli antigensO28ac，O112ac，O124，O136，O143，O144，O152 and and Shigella O antigens”J.clinMicrobiol，17(4)：681-684]

发明内容

本发明的目的是提供了一种对大肠杆菌O139型的O-抗原特异的核苷酸。它是大肠杆菌O139型的O-抗原基因簇中的核苷酸，是源于糖基转移酶基因和转运酶基因及聚合酶基因的特异的核苷酸。

本发明的次一目的是提供了大肠杆菌O139型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列。

本发明的另一目的是提供了构成大肠杆菌O139型的O-抗原基因簇的基因：转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；鼠李糖合成酶基因，包括orf1、orf2、orf3、orf4或与orf1、orf2、orf3、orf4有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf6、orf8、orf9、orf10基因。其中所述的基因。

本发明的又一目的是提供了寡核苷酸，它们源于编码转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；源于编码聚合酶的基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；它们是上述基因内的寡核苷酸，长度在10-20nt；它们对大肠杆菌O139型的O-抗原是特异的；尤其是表1中列出的寡核苷酸，它们对大肠杆菌O139型的O-抗原是高度特异的，而且这些寡核苷酸还可重新组合，组合后的寡核苷酸对大肠杆菌O139型的O-抗原也是高度特异的。

本发明的再一目的是提供的上述寡核苷酸可作为引物用于核酸扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列，从而通过这些方法检测和鉴定大肠杆菌O139型的O-抗原及检测和鉴定大肠杆菌O139型。

本发明的还一目的是提供了分离大肠杆菌O139型的O-抗原基因簇的全序列的方法。按照本方法操作可以获得其他细菌的O-抗原基因簇的全序列，也可以获得编码其他多糖抗原的细菌的基因簇的全序列。

本发明的目的是由以下技术方案实现的。

本发明对大肠杆菌O139型的O-抗原特异的核苷酸，其是如SEQ ID NO：1所示的分离的核苷酸，全长12654个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O139型的O-抗原特异的核苷酸，其由10个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。

前述的对大肠杆菌O139型的O-抗原特异的核苷酸，所述的基因是：转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；鼠李糖合成酶基因，包括orf1、orf2、orf3、orf4或与orf1、orf2、orf3、orf4有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf6、orf8、orf9、orf10基因。其中所述的基因。其中所述的基因：wzx是SEQID NO：1中的7016至8236碱基的核苷酸；wzy是SEQ ID NO：1中的4922至6160碱基的核苷酸；orf1是SEQ ID NO：1中的1140至2225碱基的核苷酸；orf2是SEQ ID NO：1中的2225至3124碱基的核苷酸；orf3是SEQ ID NO：1中的3182至4063碱基的核苷酸；orf4是SEQ ID NO：1中的4065至4595碱基的核苷酸；orf6是SEQ ID NO：1中的6157至7029碱基的核苷酸；orf8是SEQ ID NO：1中的8226至9284碱基的核苷酸；orf9是SEQ ID NO：1中的9277至10434碱基的核苷酸；orf10是SEQ ID NO：1中的10424至11080碱基的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O139型的O-抗原特异的核苷酸，其中它是源于所述的wzx基因、wzy基因以及它们的混合或它们的重组。

前述的对大肠杆菌O139型的O-抗原特异的核苷酸，所述的源于wzx基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的7219至7236碱基的核苷酸和7708至7725碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的7712至7729碱基的核苷酸和8100至8117碱基的核苷酸。源于wzy基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的5150至5167碱基的核苷酸和5393至5410碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的5344至5362碱基的核苷酸和6046至6063碱基的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O139型的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、在诊断中鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原的应用。

前述的对大肠杆菌O139型的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，而且通过插入表达可提供表达大肠杆菌O139型的O-抗原，并成为细菌疫苗。

前述的对大肠杆菌O139型的O-抗原特异的核苷酸的应用，其中它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，检测人体和环境中的细菌。

前述的对大肠杆菌O139型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，其包括下述步骤：

(1)基因组的提取：在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O139型，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟，加等体积酚抽提混合物，取上清液再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提两次，取上清液再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚。上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，将DNA重悬于30ul TE中；基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；

(2)通过PCR扩增大肠杆菌O139型中的O-抗原基因簇：以大肠杆菌O139型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇，首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物(#1523-ATT GTGGCT GCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，60℃退火15秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环，最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性，合并5管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物；

(3)构建O-抗原基因簇文库：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库，反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl₂，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行，酶切10分钟使DNA片段大小集中在1.5kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中，随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mMDTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10^-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接10小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶，最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物；用Bi0-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5α细胞，取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bi0-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒至6.0毫秒，电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上，在37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落，将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒，并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群构成了大肠杆菌O139型的O-抗原基因簇文库；

(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在1kb以上的96个克隆用本实验室ABI3730型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段进行测序，序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；

(5)核苷酸序列的拼接及分析：用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O139型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列；序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O139型的基因组作5个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库，2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率，在得到大肠杆菌O139型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到10个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O139型的O-抗原基因簇的结构；

(6)特异基因筛选：针对痢大肠杆菌O139型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物；在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，除在第13组中得到了预期大小的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何产物，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O139型的O-抗原都是高度特异的。

也就是，本发明的第一个方面，提供了大肠杆菌O139型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列，它的全序列如SEQ ID NO：1所示，全长12654个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。通过本发明的方法得到了大肠杆菌O139型的O-抗原基因簇的结构，如表3所示，它总共由10个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。

本发明的第二个方面，提供了大肠杆菌O139型的O-抗原基因簇中的基因，即转运酶基因(wzx基因或与wzx有相似功能的基因)；聚合酶基因(wzy基因或与wzy有相似功能的基因)；鼠李糖合成酶基因(orf1、orf2、orf3、orf4或与orf1、orf2、orf3、orf4有相似功能的基因)；糖基转移酶基因(orf6、orf8、orf9、orf10基因)。它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中；本发明尤其涉及到糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因，因为糖合成路径基因即合成核苷二磷酸单糖的基因现在被预示对较多胞外多糖是常见的、共同的，对细菌的O-抗原并不是很特异的，而本发明涉及到的糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因对大肠杆菌O139型的O-抗原是高度特异的。

本发明的第三个方面，提供了源于大肠杆菌O139型的O-抗原基因簇中的wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因、基因的寡核苷酸，它们是这些基因中的任何一段寡核苷酸。但是，优先被用的是列于表1中的寡核苷酸对，在表1中也列出了这些寡核苷酸对在O-抗原基因簇中的位置及以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应的产物的大小，这些PCR反应可用表中的退火温度进行。这些引物除在第13组中得到了预期大小的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何产物或有产物，但大小与第13组中的产物不同，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O139型的O-抗原都是高度特异的。

所述的对大肠杆菌O139型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法包括下述步骤：1)基因组的提取；2)PCR扩增大肠杆菌O139型中的O-抗原基因簇；3)构建O-抗原基因簇文库；4)对文库中的克隆测序；5)核苷酸序列的拼接及分析；6)特异基因的筛选。

本发明的其他方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

如本发明所用，“寡核苷酸”主要指来源于O-抗原基因簇中的编码转运酶的基因和编码聚合酶的基因内的一段核苷酸分子，它们在长度上可改变，一般在10到20个核苷酸范围内改变；更确切说这些寡核苷酸是源于wzx基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1中的7016至8236碱基的核苷酸)；wzy基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1中的4922至6160碱基的核苷酸)源于以上基因内的寡核苷酸对大肠杆菌O139型是高度特异的。

此外，有时两个遗传相似的编码不同O-抗原的基因簇通过基因重组或突变产生新的O-抗原，从而产生新的细菌类型，新的突变株。在这种环境中，需要筛选出多对寡核苷酸同重组基因杂交以提高检测的特异性。因此，本发明提供了一整套多对寡核苷酸的混合物，它们源于糖基转移酶基因；源于转运酶和聚合酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。这些基因的混合物对一个特殊的细菌多糖抗原来说是特异的，从而使这套寡核苷酸对这个细菌的多糖抗原是特异的。更具体地说，这些寡核苷酸的混合物是源于糖基转移酶基因、wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因中的寡核苷酸的组合。

在另一方面，本发明涉及寡核苷酸的鉴定，它们可以用于检测表达O-抗原的细菌和在诊断中鉴定细菌的O-抗原。

本发明涉及到一种检测食品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O139型。可用PCR方法检测，更可以将本发明方法中的核苷酸标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

本发明设计者考虑到以下情况：当单个的特异的寡核苷酸检测无效时，寡核苷酸的混合物能与靶区域特异性杂交以检测样品。因此本发明提供了一套寡核苷酸用于本发明所述的检测方法。这里所说的寡核苷酸是指源于编码糖基转移酶的基因、编码转运酶的基因和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌的O-抗原来说是特异的，这一特殊的细菌O-抗原是由大肠杆菌O139型表达的。

另一方面，本发明涉及到一种检测排泄物中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交。这些细菌是大肠杆菌O139型。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸分子标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

一般一对寡核苷酸可能与同样的基因杂交也可与不同的基因杂交，但它们中必须有一个寡核苷酸能特异性杂交到特殊抗原型的特异序列上，另一个寡核苷酸可杂交于非特异性区域。因此，当特殊的多糖抗原基因簇中的寡核苷酸被重新组合时，至少能选出一对寡核苷酸与多糖抗原基因簇中特异基因混合物杂交，或者选出多对寡核苷酸与特异基因的混合物杂交。甚至即使当一个特殊的基因簇中所有基因都独一无二时，此方法也能应用于识别此基因簇内的基因混合物的核苷酸分子。因此本发明提供了一整套用于检测本发明方法的多对寡核苷酸，在这里多对寡核苷酸是源于编码糖基转移酶的基因、编码转运酶和聚合酶的基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因，这套寡核苷酸对一个特殊的细菌多糖来说是特异的，这套寡核苷酸可能是糖合成中必须基因的核苷酸。

另一方面，本发明也涉及到一种检测源于病人的样品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法。样品中的一个或多个细菌多糖抗原可以使样品能与以下至少一个基因中的一对寡核苷酸中的一个特异性杂交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与样品中的至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O139型。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸标记后作为探针通过杂交反应，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

更详细地说，以上描述的方法可以理解为当寡核苷酸对被使用时，其中的一个寡核苷酸分子能杂交到一个并不是来源于糖基转移酶基因、wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的序列上。此外，当两个寡核苷酸都能杂交上时，它们可能杂交于同一基因也可能杂交到不同基因上。也即，当交叉反应出现问题时，可选择寡核苷酸的混合物来检测混合的基因以提供检测的特异性。

本发明者相信本发明不必限于以上所提的核苷酸序列编码的特定的O-抗原，而且广泛应用于检测所有表达O-抗原和鉴定O-抗原的细菌。而且，由于O-抗原合成和其他多糖抗原(如细菌胞外抗原)合成之间的相似性，本发明的方法和分子也应用于这些其他的多糖抗原。

本发明首次公开了大肠杆菌O139型的O-抗原基因簇的全长序列，而且可从这个未被克隆的全长基因簇的序列中产生重组分子，通过插入表达可产生表达大肠杆菌O139型的O-抗原，并成为有用的疫苗。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件。

实施例1：基因组的提取：

在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O139型，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清液再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇抽(25∶24∶1)混合溶液提两次，取上清液再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚，上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中。基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测。

实施例2：通过PCR扩增大肠杆菌O139型中的O-抗原基因簇：

以大肠杆菌O139型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇。首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物(#1523-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGATTA AGT TCG C)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，60℃退火15秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环。最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性。合并5管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物。

实施例3：构建O-抗原基因簇文库：

首先是连接产物的获得：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl₂，1ul1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行。酶切10分钟使DNA片段大小集中在1.5kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中。随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mMDTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10^-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接10小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶。最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物。

其次是感受态细胞的制备：参照Bio-Rad公司提供的方法制备感受态细胞大肠杆菌DH5□。取一环大肠杆菌DH5□单菌落于5ml的LB培养基中，180rpm培养10小时后，取2ml培养物转接到200ml的LB培养基中，37℃250rpm剧烈振荡培养到OD600 0.5左右，然后冰浴冷却20分钟，于4℃4000rpm离心15分钟。倾尽上清液，用冷的冰预冷的去离子灭菌水200ml吹散菌体，于4℃ 4000rpm离心15分钟。再用冷的冰预冷的去离子灭菌水100ml吹散菌体，于4℃ 4000rpm离心15分钟。用冷的冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，4℃ 6000rpm离心10分钟，弃上清液，最后沉淀用1ml冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，即为感受态细胞。将制得的感受态细胞分装为50ul一管，-70℃保存。

最后是电转化感受态细胞：取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5□混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒。电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏。然后立即将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃倒置过夜培养，次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到白色克隆群构成了大肠杆菌O139型的O-抗原基因簇文库。

实施例4：对文库中的克隆测序：

从文库中挑选插入片段在1kb以上的96个克隆用本实验室ABI3730型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列。

实施例5：核苷酸序列的拼接及分析：

用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O139型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列(见序列列表)。序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O139型的基因组作5个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率。在得到大肠杆菌O139型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)的orffinder发现基因，找到10个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用ClustralW软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O139型的O-抗原基因簇的结构，如表3所示。

通过检索和比较，发现orf1，2，3，4编码的蛋白与Shigella flexneri O-抗原基因簇中rmlBDAC基因编码的蛋白有很高的氨基酸序列一致性，通过对Pfam蛋白基序数据库的搜索，发现orf1，2，3，4编码的蛋白与已知的的共有序列的同源性预期值非常高。rmlBDAC基因负责鼠李糖合成的基因，我们推测orf1，2，3，4也是负责鼠李糖合成的基因，并且O139的O-抗原中含有鼠李糖。

orf5和orf7是大肠杆菌O139种仅有的两个编码存在跨膜片段的蛋白的基因。orf7编码的蛋白与Yersinia enterocolitica的O-抗原转移酶有23％的序列一致性，通过HMMTOP2.0程序分析蛋白的拓扑结构发现其含有12个均匀的跨膜片段，这是Wzx蛋白的典型特征。所以命名orf7为wzx。orf5编码的蛋白与Streptococcus pneumoniae的O-抗原聚合酶有21％的一致性，45％的相似性，通过HMMTOP2.0程序分析蛋白的拓扑结构发现其含有9个跨膜片段，并且有一个大的(61个氨基酸)胞质内亲水环(loop)，这是Wzy蛋白的典型特征。所以命名orf5为wzy。

orf6，8，9，10四个基因编码的蛋白与其他已知的糖基转移酶有34-47％的序列一致性和45-67％的序列相似性。通过对Pfam中糖基转移酶基序数据库的搜索，这四个基因编码的蛋白与已知的糖基转移酶家族1和2的共有序列的同源性预期值为1×e^-12至5×e^-17，因此我们推测这四个基因编码糖基转移酶，而且由于每个糖基转移酶特异性催化形成一种二糖键，因此我们推测大肠杆菌O139的O-抗原的寡糖单位可能由四个单糖组成。由于这四个基因的确切功能还不能确定，因此我们将这四个基因暂命名为orf6，8，9，10。

实施例6：特异基因的筛选：

针对大肠杆菌O139型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物，这些基因在核苷酸序列中的位置见表1。

表1列出了大肠杆菌O139型的O抗原基因簇中糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因及基因内的引物及PCR数据。在表中列出了大肠杆菌O139型的O抗原基因簇的糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因及它们的相应的功能和大小。在每个基因内，我们各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性。在表中还列出了每个引物在SEQ IDNO：1中的位置和大小。以每对引物用表中所列的相应的退火温度以表2中的所有菌的基因组为模板进行PCR，得到了相应的PCR产物，其大小也列于表中。

表2是用于筛选特异基因的166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源，为了检测的方便，我们将它们每8-10个菌分为一组，总共13组，它们的来源都列于表中。

在第13组中含有大肠杆菌O139型的基因组DNA作为阳性对照。以每组菌做模板，用表1中的每对引物按如下条件做PCR：在95℃预变性5分钟后，95℃变性30秒，退火时间是30秒，温度见表1，72℃延伸2分钟，这样进行25个循环。最后在72℃继续延伸5分钟，反应体系是25ul。模板为1∶20稀释，取1μl。反应完毕后，取10ulPCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测扩增出的片段。

对于wzx、wzy基因，每个基因都有两对引物被检测，每对引物除了在第13组中做PCR后得到了预期大小的正确的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带，也就是说，在大多数组中没有得到任何PCR产物带，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O139型及其O-抗原是高度特异的。

最后，通过PCR从大肠杆菌O139型中筛选到对大肠杆菌O139型的O-抗原高度特异的基因：wzx、wzy和五个糖基转移酶基因。而这些基因内的任何一段10-20nt的寡核苷酸对大肠杆菌O139型的O-抗原是特异的，尤其是上述每个基因中的引物即寡核苷酸对经PCR检测后证实对大肠杆菌O139型是高度特异的。所有的这些寡核苷酸都可用于快速准确地检测人体和环境中的大肠杆菌O139型，并能鉴定它们的O-抗原。

表3是大肠杆菌O139型的O-抗原基因簇的结构表，在表中列出了大肠杆菌O139型的O-抗原基因簇的结构，共由12个基因组成，每个基因用方框表示，并在方框内写入基因的名称，数字表示的是O-抗原基因簇中的开放阅读框(orf)的顺序。在O-抗原基因簇的两端是galF基因和gnd基因，它们不属于O-抗原基因簇，我们只是用它们的一段序列设计引物来扩增O-抗原基因簇的全长序列。

表4是大肠杆菌O139型的O-抗原基因簇中的基因的位置图，在图中列出了大肠杆菌O139型的O-抗原基因簇中的所有开放阅读框在全序列中的准确位置，在每个开放阅读框的起始密码子和终止密码子的下面划线。在大肠杆菌中开放阅读框的起始密码子有两个：ATG和GTG。

                      SEQUENCE LISTING

<110>南开大学

<120>对大肠杆菌O139型的O抗原特异的核苷酸

<130>对大肠杆菌O139型的O抗原特异的核苷酸

<160>1

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>12654

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<400>1

atcattgtgg ctgcagggat caaagaaatc ctcctggtaa ctcatgcgtc caagaacgca      60

gtcgaaaacc acttcgacac ctcttatgaa ttagaatctc tccttgaaca gcgcgtgaag     120

cgtcaactgc tggcggaagt acagtccatt tgcccgccgg gcgtgacaat tatgaacgtg     180

cgtcagggcg aacctttagg tttgggccac tccattttat gtgcacgacc tgccattggt     240

gacaatccat ttgtcgtggt gctgccagac gttgtgatcg acgacgccag cgccgacccg     300

ctgcgctaca accttgctgc catgattgcg cgcttcaacg aaacgggccg cagccaggtg     360

ctggcaaaac gtatgccggg tgacctctct gaatactccg tcattcagac caaagagccg     420

ctggaccgtg aaggcaaagt cagccgcatt gttgaattca tcgaaaaacc ggatcaaccg     480

cagacgctgg actcagacat catggccgtt ggtcgctatg tgctttctgc cgatatttgg     540

cctgaactgg agcgtactca acctggagca tggggacgta ttcagttgac tgatgccatt     600

gctgagttgg caaaaaaaca agcagttgac gcaatgctga tgactggggg acagttacga     660

ctgcggaaag aaaatgggtt atatgcaagc gtttgtgaag tatgggctgc gtaacctgaa     720

agaaggggcg aagttccgta aagggattga gaagctgtta agcgaataat gaaatctgac     780

cggatgtaac ggttgataag aaaattataa cggcagtgaa gattcgtggc gaaagtaatt     840

tgttgcgaat attcctgccg ttgttttata taaacaatca gaataacaac gagttagcaa     900

taggatttta gtcaaagttt tccaggattt tccttgtttc cagagcggat tggtaagaca     960

attagcgttt gagtttttcg agttaagcgc gagtgggtaa cgctcgtcac atcgtaggca    1020

tgcatgcagt gctctggtag ctgtaaagcc aggggcggta gcgtgcatta atacctctat    1080

taatcaacct aagagccgct tatttcacag catgctctga agtaatatgg aataataaag    1140

tgaagatact tgttactggt ggtgcaggat ttattggttc tgctgtagtt cgtcacatta    1200

taaataatac gcaagatagt gttgttaatg tcgataaatt aacgtacgcc ggaaacctgg    1260

aatcacttgc tgatgtttct gattctgaac gctatgtttt tgaacatgcg gatatttgcg    1320

atgcagctgc aatggcacgg atttttgctc agcatcagcc agatgcagta atgcacctgg    1380

ctgctgaaag ccatgttgac cgttcaatta caggtcctgc ggcatttatt gaaaccaata    1440

ttgttggtac atatgtcctt ttggaagccg ctcgcaatta ctggtctgct cttgatagcg    1500

acaagaaaac tagcttccgt tttcatcata tttctactga cgaagtctat ggtgatttgc    1560

ctcatccaga tgaagtaaat aataacgaag aattaccctt atttactgag acgacagctt    1620

acgcgccaag cagtccttat tccgcatcaa aagcatccag cgatcattta gttcgcgcgt    1680

ggaaacgtac ctatggttta ccgaccattg tgactaactg ttcgaataac tacggtcctt    1740

atcactttcc ggaaaaattg attccactag taattcttaa tgctctggaa ggtaaggcat    1800

tacctattta tggtaaaggg gatcaaattc gtgactggct gtatgttgaa gatcatgcgc    1860

gtgcgttata taccgtcgta accgaaggta aagcgggtga aacttataac attggtggac    1920

acaacgaaaa gaaaaacatc gatgtagtgc tcactatttg tgatttgttg gatgagattg    1980

tcccgaaaga gaaatcttac cgcgagcaaa ttacttatgt taccgatcgt ccgggacacg    2040

atcgccgtta tgcgattgat gctgagaaga ttggtcgcga attgggttgg aaaccacagg    2100

aaacgtttga gagcgggatt cggaagacag tggaatggta cctgtccaat acaaaatggg    2160

ttgataatgt gaaaagtggt gcctatcaat cgtggattga acagaactat gagggccgcc    2220

agtaatgaat atcctccttt tcggcaaaac agggcaggta ggttgggaac tacagcgtgc    2280

gctggcacct ttgggtaatt tgattgctct tgatgttcac tctactgatt attgtggtga    2340

ttttagtaac ccagaaggtg tggctgaaac cgtcaaaaaa attcgtcctg acgttattgt    2400

taatgctgct gctcataccg cggtagataa ggctgagtca gaacccgaat ttgcacaatt    2460

actcaatgcg acaagtgttg aagcgattgc aaaagcggct aatgaagttg gggcttgggt    2520

aattcattac tcaactgact acgtattccc tggaaatggc gacacgccat ggctggagac    2580

ggatgcaacc gcaccgctaa atgtttacgg tgaaaccaag ttagccggag aaaaagcgtt    2640

acaggaacat tgcgcgaagc atcttatttt ccggaccagc tgggtatatg caggtaaagg    2700

aaacaatttt gccaagacaa tgttacgtct ggcaaaagag cgcgaagaat tagctgtcat    2760

taacgatcag tttggtgcac caacaggtgc tgaactgctg gctgattgta cggcacatgc    2820

aattcgtatg gcactgaata aaccagaagt cgcaggcttg taccatctgg tagccactgg    2880

taccacaacc tggcacgatt atgctgcgct ggtttttgaa gaggcacgaa aagcaggtat    2940

tccccttgca ctcaacaagc tcaacgcagt accaacaaca gcctatccaa caccagctcg    3000

tcgtccacat aactctcgcc ttaatacaga aaaatttcag caaaattttg cgcttgtttt    3060

gcctgactgg caggttggcg tgaaacgaat gctcaacgaa ttatttacga ctacagcaat    3120

ttaatagttt ttgcatcttg ttcgtgatga tggagcaaga tgaattaaaa ggaatgatga    3180

aatgaaaacg cgtaaaggta ttattttagc gggtggttct ggtactcgtc tttatcctgt    3240

gactatggca gtcagtaaac agctgttacc tatttatgat aaaccgatga tctattaccc    3300

gctttctaca ctgatgttag cgggtattcg cgatattctg attatcagta caccacagga    3360

tactcctcgt tttcaacaac tgctgggtga cgggagccag tgggggctaa atcttcagta    3420

caaagtgcaa ccgactccag atggacttgc gcaggcgttt attatcggtg aagagtttat    3480

tggtggtgat gattgcgctt tggttcttgg tgataatatc ttctacggcc acgatctgcc    3540

gaagttaatg gacacagcag ttaataaaga aagtggcgca acggtatttg cctatcacgt    3600

taatgatcct gaacgctacg gtgtcgttga gtttgataaa aacggtacgg caataagcct    3660

ggaagaaaaa ccgctacaac caaaaagtaa ttatgcggta accgggcttt atttctatga    3720

taacgacgtt gtcgaaatgg cgaaaaacct taagccttct gcccgtggtg aactggaaat    3780

taccgatatt aaccgtattt atatggaaca ggggcgttta tccgttgcca tgatggggcg    3840

tggttatgcg tggctggaca cggggacaca tcaaagcctg attgaggcaa gcaacttcat    3900

tgctactatt gaagaacgtc aggggctgaa agtctcctgc ccggaagaaa ttgcttaccg    3960

taaagggttt gttgatgctg agcaggtgaa agtattagct gaacctctga aaaaaaatgc    4020

ttatggtcag tatctgctga aaatgattaa aggttattca taaaatgaac gtaattaaaa    4080

cagaaattcc tgatgtactg atttttgaac cgaaagtttt tggtgatgag cgtggtttct    4140

tttttgagag ctttaaccaa aagatttttg aggaagctgt aggccgcaaa gttgaatttg    4200

tccaggataa ccattcgaag tccacgaaag gtgttttacg cggactgcat tatcagttag    4260

aaccttatgc gcaagggaaa ttggtgcgct gcgttgttgg tgaggtttat gatgttgcgg    4320

ttgatattcg taaatcgtca cctacttttg gcaagtgggt tggggtgaat ttatctgctg    4380

agaataagcg ccagttgtgg atccctgagg gatttgcaca tggttttttg gtgctgagtg    4440

agacggcgga atttgtttat aagacgacga attattatca tcctgagagt gaaagaggaa    4500

ttatttggga tgataaaaat ataaatatcc attggcctat agttgatatt cctatattgt    4560

caaagaaaga tcataataac acttcattat tatgattagt aaatttggga catgattttt    4620

taaatgccgc cttttaaaag gcggtaaaaa actactgacc ggatgcttta atagaaaata    4680

taaaaaaata aatttcattt tacaaaattt gaatgtcaag ttagagaaat aaaactgtta    4740

tatgttagaa atactggtca cagcatgtaa attttcttga gtcagaatga attatatgtg    4800

tactatttct taaaaactat tgacattttt tagttggaaa taaaggttaa aaataaaaaa    4860

ctattcatat tgagagttaa atattacgta tgctaaaaat tttcctgtca gaggatacat    4920

tgtgagtttt attcatatct tattgctaat tattttattt tatttaccgt ttattttttt    4980

aaaatttggt ttacgaaaga aaataacgca tccgccaact ttattttgtg caatattttc    5040

atttgtacta tcaatggctt atatagctca cataactttg gggttttatg aaatatcata    5100

tgaaagctat gctatttatg gattagggaa tttatcattt attgctgggg ggatgattac    5160

tgatgcttta aatagacgaa acataaaaaa cagcactcaa cttgttatta acaagcaaga    5220

aataacccta ctaaagattc ttatttttac gctattgtta tattttccaa ttgcatatag    5280

cgagtttaaa catgcgacac ctgatatgcc tctcgcgtta aaaatattac gcattcgtga    5340

acgaggatta gaagagcagg tatatagtac cataacaaac aacatgataa tattgtcgtc    5400

gtgtttagtt atgtatatga catttatttt ctcaatcaaa aagataaatg tttattatta    5460

ttctctgaca tttgtcctct tctgtgctta taatttcatg actggcacga gggcagcaat    5520

tattcttatt tcaatcgcgt gtatttttat ttacttacta aataccaata aaaataataa    5580

aaccagtaag ctttttcttt tatcggtcgg gatgactgcc ataattctag gtgctctagt    5640

tgcgattttt atgggcaaag atggaatgga acgtgatgaa agtttattag ctaatttaaa    5700

taaggttgtt gataattatt tttcatatac tgttcaaggg gtgattttat ttgataatta    5760

tgtaattgga agagaaaaga ttactcctaa ttgggatata ttatcaggct cagctgaagt    5820

aattaataaa ataacaagct caaacatatt caaaactgac tcgaaattca gtgaattcag    5880

tcattttgca aaagataaag atggtaatgt atgtacaatt tattttgcta tttatccatt    5940

atatggttta gttggagtaa tattgttttt tttgttatat ggaaccgtat gtacaatact    6000

ttataatcat gggcctggca ttgtttccgt attagtcgga tatattaacg ccactctatg    6060

tttaaatata tttaatgaac aagtgttcat caatattata ttcacaatta aatttatttg    6120

ttttctgcta ttaatacgct gtttcgagag gataaaatga acgttggtgt tgtgattgtt    6180

tggtataacc ctacaaaggc tcagatagaa aatgtttata gtctcgcaaa tactagcgag    6240

ttaaaaatat gtatagtgga taactcaaat gatgagaatt tatttgaaaa aaaaacgttg    6300

agcagtaaaa acatatcata tattcataat agtaataaag gtggcatcgc tggagcattt    6360

aatagaggaa taaataaatt gttcgctgag agaactatga aacatatttt tacaatggat    6420

caggactcag agttaagcga agactatttc ttaagtatgt ggaagtttgt tagagataat    6480

aattgcgaaa tagcttgccc aaatttttat gaccggaatt caaaaacata tggtacgttt    6540

attaatttaa ctccgttttt ctataaggct gtaaataatg gtacaacaac attttgtatt    6600

tcatctggta tgattttttc ccgaaaagca tgggagatac tcggggattt tgacgaaaga    6660

cttataattg atcatgtcga tacagattat tgtttaaaag ctaataatca taaagtaaca    6720

atattggtta attatgagca gtgcttaaat catgctattg gggaacgaga gagtcatcga    6780

attttagggg ttactcttaa accaaaccat cataattata tcaggaaata ttatattgta    6840

agaaatggta catatttggc attaaaatat tttaaatttt cgaagggata ctttaacctc    6900

aatattctgc gcgtaattca tgaaacagta tgtgtgattc tatatgaaaa tgataaaata    6960

agaaaattat cgtatatgtt acgtggatta cgggatggta ttaaggggaa gttaggtgcc    7020

attaagtaaa agtatttatg caatcttaag tatttcatgt ttgctgttag gattatatat    7080

tcaatttctc tttgcggaat tttatcaagg agatttttta aatttattct atttgggggt    7140

tagtttttgt agtgttgtca taagtatgtc ttctggggga ttaggcggct ttttaatttc    7200

aagattttct aatctttcag aaacattacg ccttgatatt gcagtgtttt catttactat    7260

tgtcttttcg ataataggtg tgggtgtttt ctgtgctctt tcatatactt cattatttgt    7320

gcttaaaatg gcactgcatc agtcattaat tattgctttt ttattttttt tatatctttt    7380

atctcttgct ttaaatctaa tttttcaatc atactcctac tcgaaaaaag ggatttcagg    7440

gccaatattt tatgagtttt gtagccttat atcttatatt ctggttgcat ttcttcttgt    7500

gattaataaa gaagattata ttatttgctg catattgttt tgtgtgcgtg gttattttca    7560

actgattttg tactatattt tttgcaagga taaaatagct tgcaggctaa ttaacggcga    7620

cgaagttaaa tcttttttta atgaaattaa atacttaatg agtggtagtg catattataa    7680

atcagagcca ttaattgata ggttttttct tgttgccagt tctcataatt tagcagcata    7740

tcacttaatt agccaaattt ataatgcagc ccttggtctc tggtttaaaa tttctgtatc    7800

acctttagtt aataaactga ctcaaaatac aacaaatacc attgtattta tgaaattatt    7860

ccgtcgcggt ttattaagtc aatgcataat ctctatagta tctgctataa tccttttttt    7920

tacaccaaca cttcactatt tagaatcgat aaatatattt cgccccatcg ctcaaaatgc    7980

tgatgttgtc tatttacttt tcattttttt tgttgcgtct cttttggggc aagtagtttc    8040

taatgcatac tatagtattg gacaccataa aacaccggtt atagtttctt gtataacata    8100

taccctgttt ctaccagcaa aatattatct tgtcaaaaga tacggggtct ctggactgtg    8160

tattctagtt tctttatatc acacggttaa ttttattatt ctgtggttaa tgtttagagt    8220

taaagatgaa agttaataat atcgtaagaa ttatggcggt tacctccgga attaaaacgc    8280

catcaagcag atttagaatt cgtcaacata ttgaacaatt aaggaagtat aatttatatg    8340

tagatgaaat aatccctcct attgataaaa ataagtctgt gccatttcta tcaaaaatta    8400

gccctaaata ttatatccct ttatatatac cttggcagat aataaaaatt ctacagcgtc    8460

tccctgttct tcttaagcaa acgaggtata aatatatatg gttaaataga gagctgctta    8520

ctggaatacc aacattagaa gtatttttct gcaagaaaat tatacttgat gttgatgatg    8580

ctatctggaa aaatccccct atgggagaga taacagcgag atttttagca aagaaggcat    8640

ataaaataat atgtgggaat aattaccttg ccgaatggtt tagaagatat aataataatg    8700

tttatgtgat ccctacagca gtggatgtgc ataaatttat acctagatgt aataagagga    8760

aagatatagt tttgggatgg attggaacac atggtaattt aaaatacctt gaaaagattt    8820

atccaacttt gttaaaaatt ctgaatagca atcgtaatgt atatttgaat attgtttcag    8880

acaaaagacc cgagttttgt attgataact cacgtgcaaa ttacattgag tggtcagcgg    8940

aagatgaagt acaaaacttc caatcaatag atattggact tatgcctctt gatgataatg    9000

aatggacgag aggtaaatgt agctataaat tgttacagca tatggcctgt ggttcattag    9060

ttgttggatc gccggttggt atgaataagg aaattctgtt agaggataat ggtgcgtatc    9120

cggcaaatac tgaaaacgag tggatggata cgttatcgta cttaatatcg aattttgaag    9180

aaatttattg cattcagtct aaaaaagcaa gacgtttcat tgagtgtgaa tattccgcag    9240

atacaattag ggaaaaattg gcaagggtaa tgattgatga ctaaggttat aatggtgtta    9300

ccaaggtatt tacccatcat tggtggggct gaagttcaat gtagccgcct catccgcgaa    9360

tttaataaaa ctggtaaagt taacatagtg agcattgtta caagaagagt aagcaatacc    9420

ttggaaaaaa aagaatacat tgataatata cctgtaacga gaatcccacc aagcggaact    9480

ggaatgctcg ttgaatacat tttttgctta ttattgatat tctatctttt gcttaatcat    9540

aagaagtatg atgtaattca ttgccacgct tcctctattt ttggtctttc ttgttcctta    9600

gttggatttc tactcaaaaa gaaagtgatt attaagatct ctactaatgg tgaaattggc    9660

tcaatgcaga gttcgtctat aaaaagatgt atttcacggt ttctatcaaa atattgtacc    9720

tatatagcgt taaattctga gggctattct gaagtaaatt gttatttatc taaagctcat    9780

aaatgtatta ttcccaatgg aattgatttc aatatcaacc atgaaaaaaa tttggaattg    9840

gccactgtga ttagaaaaaa attacataat atgtatgggg aagatatata catatgtgtt    9900

tttgtcggtc gttttgttac aagaaaaggg ataagggaaa tatatgaatg tggtgcagac    9960

ctgactgcta atggtaaaaa aatcatattc gtgttaattg gtgattcgga attacaacgt   10020

gatgctatca atttcgaata tgatcatctt cataatttct atatcgctgg taggaaaaaa   10080

aatgtgttcc cctatttgat tgctggagat ttattcattt caccatcaca caaagaaggt   10140

ttgccaaaca ctgtccttga agctctttcc gttggcaagg tttgtattct ttcagatata   10200

cttccacatc aagagattgc ttatgaacat cctaaaaacg tcatactttt taaaacagga   10260

gacgctcagg agttgaagca aactataata aattatctgg aattaaatcc tcataaatca   10320

agtttgcata gttatgtgca gattgaggac aatgtcttat tagacaaata ttctatcagt   10380

tgtatagcgg aacaatattg tctactttac aaggacaagt ctaatgcctc gtgatgatta   10440

taaaatatat atatctatag tttcccataa tcacggtgag ttaataaaga atttagattg   10500

tattaagaat ttatctcaag agttcatagt ggttattaag aataactgtt atgatgaagt   10560

attattggac tatttaaaag atagcaatgc ctatctcatc aatgaagaat ataataaagg   10620

atttggctat aataataatg tcgtttttag ttattgtcgt ttgcaactaa atatgcaacc   10680

ttccgattat tttatagtac ttaatccaga tttggtcatc aaaaactcgt ctatcaaaga   10740

gttggttaac aaaatgcatt gcagcaatgt caaagctgca actattaacc tttacctaga   10800

tgataaactt catgactatg attattctgt gaggcatttt ccccgcttat atgactttat   10860

tttatcttta gtattaggta agaataaaac taaaatagac aaatcaataa ttaccaatcc   10920

aacagaagta gattggtgtg caggttcttt tatggcttta agtagtcatg tttatcaatc   10980

cattcaagga tttgatacag ggttatttta tgtattgcga ggatatcgat ctttgttttc   11040

gtttaaagaa aaaaaatatt ggaataattt attatcctga gattacaggc attcacaaag   11100

ctcagcataa aaatagaagt ttttttcgaa acattttatt tggcatgtta aaagtgtatt   11160

cagatttatg tttgctaaaa acgggttaat taggaataag tccaatattt gtcactaaag   11220

attgatttgt gcttagaaag aaaaattaaa ccagagtctt ttagatatct tttaaagcag   11280

tatatgctct atccccccct gacaggagta aacaatgtca aagcaacaga tcggcgtcgt   11340

cggtatggca gtgatggggc gcaaccttgc gctcaatatc gaaagccgtg gttataccgt   11400

ctctattttc aaccgttccc gtgagaaaac ggaagaagtg attgccgaaa atccgggcaa   11460

gaaactggtt ccttactata cggtgaaaga atttgttgaa tctctggaaa cgcctcgtcg   11520

catcctgtta atggtgaaag caggtgcagg cacggatgct gctattgatt ctctcaagcc   11580

atacctcgat aaaggtgaca tcatcattga tggcggtaac accttcttcc aggatactat   11640

ccgtcgtaac cgtgagcttt ctgccgaagg ctttaacttc attggtaccg gtgtctccgg   11700

tggtgaagaa ggcgcgctga aaggtccttc cattatgcct ggtgggcaga aagaagccta   11760

tgaactggtt gcaccgatcc tgaccaaaat cgccgcagta gctgaagacg gtgagccatg   11820

cgttacctat attggtgccg atggcgcagg tcactatgtg aagatggttc acaacggtat   11880

tgaatacggc gatatgcagc tgattgctga agcctattct ctgcttaaag gtggcctgaa   11940

tctttccaac gaagaactgg cgcagacgtt taccgagtgg aataacggtg aactgagcag   12000

ctacctgatc gacatcacca aagatatctt caccaaaaaa gatgaagacg gtaactacct   12060

ggttgatgtg attctggatg aagcagcaaa caaaggtacg ggcaaatgga ccagccagag   12120

cgcgctggat ctcggagaac cgctgtcgct gattaccgag tctgtgtttg cacgttatat   12180

ctcttctctg aaagatcagc gcgttgccgc atctaaagtt ctctctggtc cgcaagctca   12240

gtcagcaggc gacaaggctg agttcatcga aaaagttcgc cgtgcgctgt atctgggcaa   12300

aatcgtttct tacgctcagg gcttctctca gctgcgtgct gcgtctgaag aatacaactg   12360

ggatctgaac tacggcgaaa tcgcgaagat tttccgtgct ggctgcatta tccgtgcgca   12420

gttcctgcag aaaatcaccg atgcatatgc cgaaaatccg cagatcgcta acctgctgct   12480

ggctccgtac ttcaagcaaa ttgccgatga ctatcagcag gcgctgcgcg atgtcgtcgc   12540

ttacgcagta cagaacggta tcccggttcc gaccttcgcc gctgcggttg cctattatga   12600

cagctaccgt gccgctgttc tgcctgcgaa cctgatccag gcccagcgtg acta         12654

表1 大肠杆菌O139型的O抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因及其中的引物及PCR数据

  基因     功能   基因的碱基      位置    正向引物    反向引物   PCR产物   的长度 产生正确 大小电泳 带的组数  PCR的退  火温度  (℃)  Wzx  O-抗原转运酶    7016-8236    7219-7236    7708-7725    507bp    0^*    55    7712-7729    8100-8117    406bp    0^*    55  Wzy  O-抗原聚合酶    4922-6160    5150-5167    5393-5410    261bp    0^*    55    5344-5362    6046-6063    720bp    0^*    55

^*只在大肠杆菌O139型中得到正确的一条带

表2 166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源

       组号              该组中含有的菌株                                来源

1、野生型大肠杆菌    O1，O2，O5，O7，O12，O13，O14，O15，O16，O17，O19ab，O20，    IMVS^a

                     O21，O22，O23，O24，O59

2、野生型大肠杆菌    O25，O26，O27，O28，O29，O30，O32，O33，O35，O36，O37，       IMVS^a

                     O38，O40，O41，O42，O43

3、野生型大肠杆菌    O44，O45，O46，O48，O49，O50，O51，O52，O54，O55，O56，       IMVS^a

                     O57，O58，O60，O61，O62

4、野生型大肠杆菌    O63，O65，O66，O69，O70，O71，O74，O75，O76，O77，O78，       IMVS^a

                     O79，O80，O81，O82，O83

5、野生型大肠杆菌    O84，O85，O86，O87，O88，O89，O91，O92，O98，O99，O101，                 IMVS^a

                     O102，O103，O104，O106

6、野生型大肠杆菌    O107，O108，O109，O110，O111，O112ab，O112ac，O113，                     IMVS^a

                     O115，O116，O118，O120，O123，O125，O126，O128

7、野生型大肠杆菌    O129，O130，O131，O132，O133，O134，O135，O136，O137，                   IMVS^a

                     O138，O141，O142，O143，O144，O145

8、野生型大肠杆菌    O146，O147，O148，O150，O152，O154，O156，O157，O158，                   IMVS^a

                     O159，O160，O161，O163，O164，O165，O166                                 b

9、野生型大肠杆菌    O168，O169，O170，O171，O172，O173，                                     c

       和志贺氏菌    D1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8，D9，D10，D11，D12                        d

10、野生型志贺氏菌   B1，B2，B3，B4，B6，B7，B8，B9，B10，B11，B12，B13，B14，B15，           d

                     B16，B17，B18

11、野生型志贺氏菌   F1a，F1b，F2a，F2b，F3，F4b，F5(v:4)，F5(v:7)，F6，F_X变，F_Y变，DS，DR，d

12、野生型大肠杆菌   O3，O11，O39，O59，O64，O73，O96，O95，O100，O114，O151，                IMVS^a

                     O155，O124

13、第7组菌株加上大肠杆菌标准菌株O139                                                         IMVS

^*为了检测的方便，我们将每13-17个菌分为一组，总共13组

a.Institude of Medical and Veterinary Science，Anelaide，Australia

b.Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark

c.O172和O173来自于Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark，其余来自于IMVS

d.中国预防医学科学院流行病学研究所

表3 大肠杆菌O139型O抗原基因结构图

                         E.coli O139 O-antigen gene cluster

    

#orf   glf       rmlB      rmlD    rmlA    rmlC       wzy     orf6      wzx      orf8      orf9     orf10    gnd

％G+C            43％      46％    44％    39％       29％    31％      30％     33％      33％     29％

content

表4 大肠杆菌O139型O抗原基因簇基因位置

ATCATTGTGG CTGCAGGGAT CAAAGAAATC CTCCTGGTAA CTCATGCGTC CAAGAACGCA       60

GTCGAAAACC ACTTCGACAC CTCTTATGAA TTAGAATCTC TCCTTGAACA GCGCGTGAAG      120

CGTCAACTGC TGGCGGAAGT ACAGTCCATT TGCCCGCCGG GCGTGACAAT TATGAACGTG      180

CGTCAGGGCG AACCTTTAGG TTTGGGCCAC TCCATTTTAT GTGCACGACC TGCCATTGGT      240

GACAATCCAT TTGTCGTGGT GCTGCCAGAC GTTGTGATCG ACGACGCCAG CGCCGACCCG      300

CTGCGCTACA ACCTTGCTGC CATGATTGCG CGCTTCAACG AAACGGGCCG CAGCCAGGTG      360

CTGGCAAAAC GTATGCCGGG TGACCTCTCT GAATACTCCG TCATTCAGAC CAAAGAGCCG      420

CTGGACCGTG AAGGCAAAGT CAGCCGCATT GTTGAATTCA TCGAAAAACC GGATCAACCG      480

CAGACGCTGG ACTCAGACAT CATGGCCGTT GGTCGCTATG TGCTTTCTGC CGATATTTGG      540

CCTGAACTGG AGCGTACTCA ACCTGGAGCA TGGGGACGTA TTCAGTTGAC TGATGCCATT      600

GCTGAGTTGG CAAAAAAACA AGCAGTTGAC GCAATGCTGA TGACTGGGGG ACAGTTACGA      660

CTGCGGAAAG AAAATGGGTT ATATGCAAGC GTTTGTGAAG TATGGGCTGC GTAACCTGAA      720

AGAAGGGGCG AAGTTCCGTA AAGGGATTGA GAAGCTGTTA AGCGAATAAT GAAATCTGAC      780

CGGATGTAAC GGTTGATAAG AAAATTATAA CGGCAGTGAA GATTCGTGGC GAAAGTAATT      840

TGTTGCGAAT ATTCCTGCCG TTGTTTTATA TAAACAATCA GAATAACAAC GAGTTAGCAA      900

TAGGATTTTA GTCAAAGTTT TCCAGGATTT TCCTTGTTTC CAGAGCGGAT TGGTAAGACA      960

ATTAGCGTTT GAGTTTTTCG AGTTAAGCGC GAGTGGGTAA CGCTCGTCAC ATCGTAGGCA     1020

TGCATGCAGT GCTCTGGTAG CTGTAAAGCC AGGGGCGGTA GCGTGCATTA ATACCTCTAT     1080

                                                            orf1起始

TAATCAACCT AAGAGCCGCT TATTTCACAG CATGCTCTGA AGTAATATGG AATAATAAAG   1140

TGAAGATACT TGTTACTGGT GGTGCAGGAT TTATTGGTTC TGCTGTAGTT CGTCACATTA    1200

TAAATAATAC GCAAGATAGT GTTGTTAATG TCGATAAATT AACGTACGCC GGAAACCTGG     1260

AATCACTTGC TGATGTTTCT GATTCTGAAC GCTATGTTTT TGAACATGCG GATATTTGCG     1320

ATGCAGCTGC AATGGCACGG ATTTTTGCTC AGCATCAGCC AGATGCAGTA ATGCACCTGG     1380

CTGCTGAAAG CCATGTTGAC CGTTCAATTA CAGGTCCTGC GGCATTTATT GAAACCAATA     1440

TTGTTGGTAC ATATGTCCTT TTGGAAGCCG CTCGCAATTA CTGGTCTGCT CTTGATAGCG     1500

ACAAGAAAAC TAGCTTCCGT TTTCATCATA TTTCTACTGA CGAAGTCTAT GGTGATTTGC     1560

CTCATCCAGA TGAAGTAAAT AATAACGAAG AATTACCCTT ATTTACTGAG ACGACAGCTT     1620

ACGCGCCAAG CAGTCCTTAT TCCGCATCAA AAGCATCCAG CGATCATTTA GTTCGCGCGT     1680

GGAAACGTAC CTATGGTTTA CCGACCATTG TGACTAACTG TTCGAATAAC TACGGTCCTT     1740

ATCACTTTCC GGAAAAATTG ATTCCACTAG TAATTCTTAA TGCTCTGGAA GGTAAGGCAT     1800

TACCTATTTA TGGTAAAGGG GATCAAATTC GTGACTGGCT GTATGTTGAA GATCATGCGC     1860

GTGCGTTATA TACCGTCGTA ACCGAAGGTA AAGCGGGTGA AACTTATAAC ATTGGTGGAC     1920

ACAACGAAAA GAAAAACATC GATGTAGTGC TCACTATTTG TGATTTGTTG GATGAGATTG     1980

TCCCGAAAGA GAAATCTTAC CGCGAGCAAA TTACTTATGT TACCGATCGT CCGGGACACG     2040

ATCGCCGTTA TGCGATTGAT GCTGAGAAGA TTGGTCGCGA ATTGGGTTGG AAACCACAGG     2100

AAACGTTTGA GAGCGGGATT CGGAAGACAG TGGAATGGTA CCTGTCCAAT ACAAAATGGG     2160

TTGATAATGT GAAAAGTGGT GCCTATCAAT CGTGGATTGA ACAGAACTAT GAGGGCCGCC     2220

orf1终止orf2起始

AGTAATGAAT ATCCTCCTTT TCGGCAAAAC AGGGCAGGTA GGTTGGGAAC TACAGCGTGC   2280

GCTGGCACCT TTGGGTAATT TGATTGCTCT TGATGTTCAC TCTACTGATT ATTGTGGTGA     2340

TTTTAGTAAC CCAGAAGGTG TGGCTGAAAC CGTCAAAAAA ATTCGTCCTG ACGTTATTGT     2400

TAATGCTGCT GCTCATACCG CGGTAGATAA GGCTGAGTCA GAACCCGAAT TTGCACAATT     2460

ACTCAATGCG ACAAGTGTTG AAGCGATTGC AAAAGCGGCT AATGAAGTTG GGGCTTGGGT     2520

AATTCATTAC TCAACTGACT ACGTATTCCC TGGAAATGGC GACACGCCAT GGCTGGAGAC     2580

GGATGCAACC GCACCGCTAA ATGTTTACGG TGAAACCAAG TTAGCCGGAG AAAAAGCGTT     2640

ACAGGAACAT TGCGCGAAGC ATCTTATTTT CCGGACCAGC TGGGTATATG CAGGTAAAGG     2700

AAACAATTTT GCCAAGACAA TGTTACGTCT GGCAAAAGAG CGCGAAGAAT TAGCTGTCAT     2760

TAACGATCAG TTTGGTGCAC CAACAGGTGC TGAACTGCTG GCTGATTGTA CGGCACATGC     2820

AATTCGTATG GCACTGAATA AACCAGAAGT CGCAGGCTTG TACCATCTGG TAGCCACTGG     2880

TACCACAACC TGGCACGATT ATGCTGCGCT GGTTTTTGAA GAGGCACGAA AAGCAGGTAT     2940

TCCCCTTGCA CTCAACAAGC TCAACGCAGT ACCAACAACA GCCTATCCAA CACCAGCTCG     3000

TCGTCCACAT AACTCTCGCC TTAATACAGA AAAATTTCAG CAAAATTTTG CGCTTGTTTT     3060

GCCTGACTGG CAGGTTGGCG TGAAACGAAT GCTCAACGAA TTATTTACGA CTACAGCAAT     3120

  orf2终止

TTAATAGTTT TTGCATCTTG TTCGTGATGA TGGAGCAAGA TGAATTAAAA GGAATGATGA   3180

  orf3起始

AATGAAAACG CGTAAAGGTA TTATTTTAGC GGGTGGTTCT GGTACTCGTC TTTATCCTGT   3240

GACTATGGCA GTCAGTAAAC AGCTGTTACC TATTTATGAT AAACCGATGA TCTATTACCC     3300

GCTTTCTACA CTGATGTTAG CGGGTATTCG CGATATTCTG ATTATCAGTA CACCACAGGA     3360

TACTCCTCGT TTTCAACAAC TGCTGGGTGA CGGGAGCCAG TGGGGGCTAA ATCTTCAGTA     3420

CAAAGTGCAA CCGACTCCAG ATGGACTTGC GCAGGCGTTT ATTATCGGTG AAGAGTTTAT     3480

TGGTGGTGAT GATTGCGCTT TGGTTCTTGG TGATAATATC TTCTACGGCC ACGATCTGCC     3540

GAAGTTAATG GACACAGCAG TTAATAAAGA AAGTGGCGCA ACGGTATTTG CCTATCACGT     3600

TAATGATCCT GAACGCTACG GTGTCGTTGA GTTTGATAAA AACGGTACGG CAATAAGCCT     3660

GGAAGAAAAA CCGCTACAAC CAAAAAGTAA TTATGCGGTA ACCGGGCTTT ATTTCTATGA     3720

TAACGACGTT GTCGAAATGG CGAAAAACCT TAAGCCTTCT GCCCGTGGTG AACTGGAAAT     3780

TACCGATATT AACCGTATTT ATATGGAACA GGGGCGTTTA TCCGTTGCCA TGATGGGGCG     3840

TGGTTATGCG TGGCTGGACA CGGGGACACA TCAAAGCCTG ATTGAGGCAA GCAACTTCAT     3900

TGCTACTATT GAAGAACGTC AGGGGCTGAA AGTCTCCTGC CCGGAAGAAA TTGCTTACCG     3960

TAAAGGGTTT GTTGATGCTG AGCAGGTGAA AGTATTAGCT GAACCTCTGA AAAAAAATGC     4020

                                         orf3终止 orf4起始

TTATGGTCAG TATCTGCTGA AAATGATTAA AGGTTATTCA TAAAATGAAC GTAATTAAAA 4080

CAGAAATTCC TGATGTACTG ATTTTTGAAC CGAAAGTTTT TGGTGATGAG CGTGGTTTCT     4140

TTTTTGAGAG CTTTAACCAA AAGATTTTTG AGGAAGCTGT AGGCCGCAAA GTTGAATTTG     4200

TCCAGGATAA CCATTCGAAG TCCACGAAAG GTGTTTTACG CGGACTGCAT TATCAGTTAG     4260

AACCTTATGC GCAAGGGAAA TTGGTGCGCT GCGTTGTTGG TGAGGTTTAT GATGTTGCGG     4320

TTGATATTCG TAAATCGTCA CCTACTTTTG GCAAGTGGGT TGGGGTGAAT TTATCTGCTG     4380

AGAATAAGCG CCAGTTGTGG ATCCCTGAGG GATTTGCACA TGGTTTTTTG GTGCTGAGTG     4440

AGACGGCGGA ATTTGTTTAT AAGACGACGA ATTATTATCA TCCTGAGAGT GAAAGAGGAA     4500

TTATTTGGGA TGATAAAAAT ATAAATATCC ATTGGCCTAT AGTTGATATT CCTATATTGT     4560

                                   orf4终止

CAAAGAAAGA TCATAATAAC ACTTCATTAT TATGATTAGT AAATTTGGGA CATGATTTTT   4620

TAAATGCCGC CTTTTAAAAG GCGGTAAAAA ACTACTGACC GGATGCTTTA ATAGAAAATA     4680

TAAAAAAATA AATTTCATTT TACAAAATTT GAATGTCAAG TTAGAGAAAT AAAACTGTTA     4740

TATGTTAGAA ATACTGGTCA CAGCATGTAA ATTTTCTTGA GTCAGAATGA ATTATATGTG     4800

TACTATTTCT TAAAAACTAT TGACATTTTT TAGTTGGAAA TAAAGGTTAA AAATAAAAAA     4860

CTATTCATAT TGAGAGTTAA ATATTACGTA TGCTAAAAAT TTTCCTGTCA GAGGATACAT     4920

 orf5起始

TGTGAGTTTT ATTCATATCT TATTGCTAAT TATTTTATTT TATTTACCGT TTATTTTTTT   4980

AAAATTTGGT TTACGAAAGA AAATAACGCA TCCGCCAACT TTATTTTGTG CAATATTTTC     5040

ATTTGTACTA TCAATGGCTT ATATAGCTCA CATAACTTTG GGGTTTTATG AAATATCATA     5100

TGAAAGCTAT GCTATTTATG GATTAGGGAA TTTATCATTT ATTGCTGGGG GGATGATTAC     5160

TGATGCTTTA AATAGACGAA ACATAAAAAA CAGCACTCAA CTTGTTATTA ACAAGCAAGA     5220

AATAACCCTA CTAAAGATTC TTATTTTTAC GCTATTGTTA TATTTTCCAA TTGCATATAG     5280

CGAGTTTAAA CATGCGACAC CTGATATGCC TCTCGCGTTA AAAATATTAC GCATTCGTGA     5340

ACGAGGATTA GAAGAGCAGG TATATAGTAC CATAACAAAC AACATGATAA TATTGTCGTC     5400

GTGTTTAGTT ATGTATATGA CATTTATTTT CTCAATCAAA AAGATAAATG TTTATTATTA     5460

TTCTCTGACA TTTGTCCTCT TCTGTGCTTA TAATTTCATG ACTGGCACGA GGGCAGCAAT     5520

TATTCTTATT TCAATCGCGT GTATTTTTAT TTACTTACTA AATACCAATA AAAATAATAA     5580

AACCAGTAAG CTTTTTCTTT TATCGGTCGG GATGACTGCC ATAATTCTAG GTGCTCTAGT     5640

TGCGATTTTT ATGGGCAAAG ATGGAATGGA ACGTGATGAA AGTTTATTAG CTAATTTAAA     5700

TAAGGTTGTT GATAATTATT TTTCATATAC TGTTCAAGGG GTGATTTTAT TTGATAATTA     5760

TGTAATTGGA AGAGAAAAGA TTACTCCTAA TTGGGATATA TTATCAGGCT CAGCTGAAGT     5820

AATTAATAAA ATAACAAGCT CAAACATATT CAAAACTGAC TCGAAATTCA GTGAATTCAG     5880

TCATTTTGCA AAAGATAAAG ATGGTAATGT ATGTACAATT TATTTTGCTA TTTATCCATT     5940

ATATGGTTTA GTTGGAGTAA TATTGTTTTT TTTGTTATAT GGAACCGTAT GTACAATACT     6000

TTATAATCAT GGGCCTGGCA TTGTTTCCGT ATTAGTCGGA TATATTAACG CCACTCTATG     6060

TTTAAATATA TTTAATGAAC AAGTGTTCAT CAATATTATA TTCACAATTA AATTTATTTG     6120

                                 orf6起始 orf5终止

TTTTCTGCTA TTAATACGCT GTTTCGAGAG GATAAAATGA ACGTTGGTGT TGTGATTGTT   6180

TGGTATAACC CTACAAAGGC TCAGATAGAA AATGTTTATA GTCTCGCAAA TACTAGCGAG     6240

TTAAAAATAT GTATAGTGGA TAACTCAAAT GATGAGAATT TATTTGAAAA AAAAACGTTG     6300

AGCAGTAAAA ACATATCATA TATTCATAAT AGTAATAAAG GTGGCATCGC TGGAGCATTT     6360

AATAGAGGAA TAAATAAATT GTTCGCTGAG AGAACTATGA AACATATTTT TACAATGGAT     6420

CAGGACTCAG AGTTAAGCGA AGACTATTTC TTAAGTATGT GGAAGTTTGT TAGAGATAAT     6480

AATTGCGAAA TAGCTTGCCC AAATTTTTAT GACCGGAATT CAAAAACATA TGGTACGTTT     6540

ATTAATTTAA CTCCGTTTTT CTATAAGGCT GTAAATAATG GTACAACAAC ATTTTGTATT     6600

TCATCTGGTA TGATTTTTTC CCGAAAAGCA TGGGAGATAC TCGGGGATTT TGACGAAAGA     6660

CTTATAATTG ATCATGTCGA TACAGATTAT TGTTTAAAAG CTAATAATCA TAAAGTAACA     6720

ATATTGGTTA ATTATGAGCA GTGCTTAAAT CATGCTATTG GGGAACGAGA GAGTCATCGA     6780

ATTTTAGGGG TTACTCTTAA ACCAAACCAT CATAATTATA TCAGGAAATA TTATATTGTA     6840

AGAAATGGTA CATATTTGGC ATTAAAATAT TTTAAATTTT CGAAGGGATA CTTTAACCTC     6900

AATATTCTGC GCGTAATTCA TGAAACAGTA TGTGTGATTC TATATGAAAA TGATAAAATA     6960

                                                          orf7起始

AGAAAATTAT CGTATATGTT ACGTGGATTA CGGGATGGTA TTAAGGGGAA GTTAGGTGCC   7020

     orf6终止

ATTAAGTAAA AGTATTTATG CAATCTTAAG TATTTCATGT TTGCTGTTAG GATTATATAT   7080

TCAATTTCTC TTTGCGGAAT TTTATCAAGG AGATTTTTTA AATTTATTCT ATTTGGGGGT     7140

TAGTTTTTGT AGTGTTGTCA TAAGTATGTC TTCTGGGGGA TTAGGCGGCT TTTTAATTTC     7200

AAGATTTTCT AATCTTTCAG AAACATTACG CCTTGATATT GCAGTGTTTT CATTTACTAT     7260

TGTCTTTTCG ATAATAGGTG TGGGTGTTTT CTGTGCTCTT TCATATACTT CATTATTTGT     7320

GCTTAAAATG GCACTGCATC AGTCATTAAT TATTGCTTTT TTATTTTTTT TATATCTTTT     7380

ATCTCTTGCT TTAAATCTAA TTTTTCAATC ATACTCCTAC TCGAAAAAAG GGATTTCAGG     7440

GCCAATATTT TATGAGTTTT GTAGCCTTAT ATCTTATATT CTGGTTGCAT TTCTTCTTGT     7500

GATTAATAAA GAAGATTATA TTATTTGCTG CATATTGTTT TGTGTGCGTG GTTATTTTCA     7560

ACTGATTTTG TACTATATTT TTTGCAAGGA TAAAATAGCT TGCAGGCTAA TTAACGGCGA     7620

CGAAGTTAAA TCTTTTTTTA ATGAAATTAA ATACTTAATG AGTGGTAGTG CATATTATAA     7680

ATCAGAGCCA TTAATTGATA GGTTTTTTCT TGTTGCCAGT TCTCATAATT TAGCAGCATA     7740

TCACTTAATT AGCCAAATTT ATAATGCAGC CCTTGGTCTC TGGTTTAAAA TTTCTGTATC     7800

ACCTTTAGTT AATAAACTGA CTCAAAATAC AACAAATACC ATTGTATTTA TGAAATTATT     7860

CCGTCGCGGT TTATTAAGTC AATGCATAAT CTCTATAGTA TCTGCTATAA TCCTTTTTTT     7920

TACACCAACA CTTCACTATT TAGAATCGAT AAATATATTT CGCCCCATCG CTCAAAATGC     7980

TGATGTTGTC TATTTACTTT TCATTTTTTT TGTTGCGTCT CTTTTGGGGC AAGTAGTTTC     8040

TAATGCATAC TATAGTATTG GACACCATAA AACACCGGTT ATAGTTTCTT GTATAACATA     8100

TACCCTGTTT CTACCAGCAA AATATTATCT TGTCAAAAGA TACGGGGTCT CTGGACTGTG     8160

TATTCTAGTT TCTTTATATC ACACGGTTAA TTTTATTATT CTGTGGTTAA TGTTTAGAGT     8220

    orf8起始  orf7终止

TAAAGATGAA AGTTAATAAT ATCGTAAGAA TTATGGCGGT TACCTCCGGA ATTAAAACGC  8280

CATCAAGCAG ATTTAGAATT CGTCAACATA TTGAACAATT AAGGAAGTAT AATTTATATG      8340

TAGATGAAAT AATCCCTCCT ATTGATAAAA ATAAGTCTGT GCCATTTCTA TCAAAAATTA      8400

GCCCTAAATA TTATATCCCT TTATATATAC CTTGGCAGAT AATAAAAATT CTACAGCGTC      8460

TCCCTGTTCT TCTTAAGCAA ACGAGGTATA AATATATATG GTTAAATAGA GAGCTGCTTA      8520

CTGGAATACC AACATTAGAA GTATTTTTCT GCAAGAAAAT TATACTTGAT GTTGATGATG      8580

CTATCTGGAA AAATCCCCCT ATGGGAGAGA TAACAGCGAG ATTTTTAGCA AAGAAGGCAT      8640

ATAAAATAAT ATGTGGGAAT AATTACCTTG CCGAATGGTT TAGAAGATAT AATAATAATG      8700

TTTATGTGAT CCCTACAGCA GTGGATGTGC ATAAATTTAT ACCTAGATGT AATAAGAGGA      8760

AAGATATAGT TTTGGGATGG ATTGGAACAC ATGGTAATTT AAAATACCTT GAAAAGATTT      8820

ATCCAACTTT GTTAAAAATT CTGAATAGCA ATCGTAATGT ATATTTGAAT ATTGTTTCAG      8880

ACAAAAGACC CGAGTTTTGT ATTGATAACT CACGTGCAAA TTACATTGAG TGGTCAGCGG      8940

AAGATGAAGT ACAAAACTTC CAATCAATAG ATATTGGACT TATGCCTCTT GATGATAATG      9000

AATGGACGAG AGGTAAATGT AGCTATAAAT TGTTACAGCA TATGGCCTGT GGTTCATTAG      9060

TTGTTGGATC GCCGGTTGGT ATGAATAAGG AAATTCTGTT AGAGGATAAT GGTGCGTATC      9120

CGGCAAATAC TGAAAACGAG TGGATGGATA CGTTATCGTA CTTAATATCG AATTTTGAAG      9180

AAATTTATTG CATTCAGTCT AAAAAAGCAA GACGTTTCAT TGAGTGTGAA TATTCCGCAG      9240

                                     orf9起始    orf8终止

ATACAATTAG GGAAAAATTG GCAAGGGTAA TGATTGATGA CTAAGGTTAT AATGGTGTTA  9300

CCAAGGTATT TACCCATCAT TGGTGGGGCT GAAGTTCAAT GTAGCCGCCT CATCCGCGAA      9360

TTTAATAAAA CTGGTAAAGT TAACATAGTG AGCATTGTTA CAAGAAGAGT AAGCAATACC      9420

TTGGAAAAAA AAGAATACAT TGATAATATA CCTGTAACGA GAATCCCACC AAGCGGAACT      9480

GGAATGCTCG TTGAATACAT TTTTTGCTTA TTATTGATAT TCTATCTTTT GCTTAATCAT      9540

AAGAAGTATG ATGTAATTCA TTGCCACGCT TCCTCTATTT TTGGTCTTTC TTGTTCCTTA      9600

GTTGGATTTC TACTCAAAAA GAAAGTGATT ATTAAGATCT CTACTAATGG TGAAATTGGC      9660

TCAATGCAGA GTTCGTCTAT AAAAAGATGT ATTTCACGGT TTCTATCAAA ATATTGTACC      9720

TATATAGCGT TAAATTCTGA GGGCTATTCT GAAGTAAATT GTTATTTATC TAAAGCTCAT      9780

AAATGTATTA TTCCCAATGG AATTGATTTC AATATCAACC ATGAAAAAAA TTTGGAATTG      9840

GCCACTGTGA TTAGAAAAAA ATTACATAAT ATGTATGGGG AAGATATATA CATATGTGTT      9900

TTTGTCGGTC GTTTTGTTAC AAGAAAAGGG ATAAGGGAAA TATATGAATG TGGTGCAGAC      9960

CTGACTGCTA ATGGTAAAAA AATCATATTC GTGTTAATTG GTGATTCGGA ATTACAACGT     10020

GATGCTATCA ATTTCGAATA TGATCATCTT CATAATTTCT ATATCGCTGG TAGGAAAAAA     10080

AATGTGTTCC CCTATTTGAT TGCTGGAGAT TTATTCATTT CACCATCACA CAAAGAAGGT     10140

TTGCCAAACA CTGTCCTTGA AGCTCTTTCC GTTGGCAAGG TTTGTATTCT TTCAGATATA     10200

CTTCCACATC AAGAGATTGC TTATGAACAT CCTAAAAACG TCATACTTTT TAAAACAGGA     10260

GACGCTCAGG AGTTGAAGCA AACTATAATA AATTATCTGG AATTAAATCC TCATAAATCA     10320

AGTTTGCATA GTTATGTGCA GATTGAGGAC AATGTCTTAT TAGACAAATA TTCTATCAGT     10380

                                             orf10起始  orf9终止

TGTATAGCGG AACAATATTG TCTACTTTAC AAGGACAAGT CTAATGCCTC GTGATGATTA 10440

TAAAATATAT ATATCTATAG TTTCCCATAA TCACGGTGAG TTAATAAAGA ATTTAGATTG     10500

TATTAAGAAT TTATCTCAAG AGTTCATAGT GGTTATTAAG AATAACTGTT ATGATGAAGT     10560

ATTATTGGAC TATTTAAAAG ATAGCAATGC CTATCTCATC AATGAAGAAT ATAATAAAGG     10620

ATTTGGCTAT AATAATAATG TCGTTTTTAG TTATTGTCGT TTGCAACTAA ATATGCAACC     10680

TTCCGATTAT TTTATAGTAC TTAATCCAGA TTTGGTCATC AAAAACTCGT CTATCAAAGA     10740

GTTGGTTAAC AAAATGCATT GCAGCAATGT CAAAGCTGCA ACTATTAACC TTTACCTAGA     10800

TGATAAACTT CATGACTATG ATTATTCTGT GAGGCATTTT CCCCGCTTAT ATGACTTTAT     10860

TTTATCTTTA GTATTAGGTA AGAATAAAAC TAAAATAGAC AAATCAATAA TTACCAATCC    10920

AACAGAAGTA GATTGGTGTG CAGGTTCTTT TATGGCTTTA AGTAGTCATG TTTATCAATC    10980

CATTCAAGGA TTTGATACAG GGTTATTTTA TGTATTGCGA GGATATCGAT CTTTGTTTTC    11040

                                       orf10终止

GTTTAAAGAA AAAAAATATT GGAATAATTT ATTATCCTGA GATTACAGGC ATTCACAAAG  11100

CTCAGCATAA AAATAGAAGT TTTTTTCGAA ACATTTTATT TGGCATGTTA AAAGTGTATT    11160

CAGATTTATG TTTGCTAAAA ACGGGTTAAT TAGGAATAAG TCCAATATTT GTCACTAAAG    11220

ATTGATTTGT GCTTAGAAAG AAAAATTAAA CCAGAGTCTT TTAGATATCT TTTAAAGCAG    11280

TATATGCTCT ATCCCCCCCT GACAGGAGTA AACAATGTCA AAGCAACAGA TCGGCGTCGT    11340

CGGTATGGCA GTGATGGGGC GCAACCTTGC GCTCAATATC GAAAGCCGTG GTTATACCGT    11400

CTCTATTTTC AACCGTTCCC GTGAGAAAAC GGAAGAAGTG ATTGCCGAAA ATCCGGGCAA    11460

GAAACTGGTT CCTTACTATA CGGTGAAAGA ATTTGTTGAA TCTCTGGAAA CGCCTCGTCG    11520

CATCCTGTTA ATGGTGAAAG CAGGTGCAGG CACGGATGCT GCTATTGATT CTCTCAAGCC    11580

ATACCTCGAT AAAGGTGACA TCATCATTGA TGGCGGTAAC ACCTTCTTCC AGGATACTAT    11640

CCGTCGTAAC CGTGAGCTTT CTGCCGAAGG CTTTAACTTC ATTGGTACCG GTGTCTCCGG    11700

TGGTGAAGAA GGCGCGCTGA AAGGTCCTTC CATTATGCCT GGTGGGCAGA AAGAAGCCTA    11760

TGAACTGGTT GCACCGATCC TGACCAAAAT CGCCGCAGTA GCTGAAGACG GTGAGCCATG    11820

CGTTACCTAT ATTGGTGCCG ATGGCGCAGG TCACTATGTG AAGATGGTTC ACAACGGTAT    11880

TGAATACGGC GATATGCAGC TGATTGCTGA AGCCTATTCT CTGCTTAAAG GTGGCCTGAA    11940

TCTTTCCAAC GAAGAACTGG CGCAGACGTT TACCGAGTGG AATAACGGTG AACTGAGCAG    12000

CTACCTGATC GACATCACCA AAGATATCTT CACCAAAAAA GATGAAGACG GTAACTACCT    12060

GGTTGATGTG ATTCTGGATG AAGCAGCAAA CAAAGGTACG GGCAAATGGA CCAGCCAGAG    12120

CGCGCTGGAT CTCGGAGAAC CGCTGTCGCT GATTACCGAG TCTGTGTTTG CACGTTATAT    12180

CTCTTCTCTG AAAGATCAGC GCGTTGCCGC ATCTAAAGTT CTCTCTGGTC CGCAAGCTCA    12240

GTCAGCAGGC GACAAGGCTG AGTTCATCGA AAAAGTTCGC CGTGCGCTGT ATCTGGGCAA    12300

AATCGTTTCT TACGCTCAGG GCTTCTCTCA GCTGCGTGCT GCGTCTGAAG AATACAACTG    12360

GGATCTGAAC TACGGCGAAA TCGCGAAGAT TTTCCGTGCT GGCTGCATTA TCCGTGCGCA    12420

GTTCCTGCAG AAAATCACCG ATGCATATGC CGAAAATCCG CAGATCGCTA ACCTGCTGCT    12480

GGCTCCGTAC TTCAAGCAAA TTGCCGATGA CTATCAGCAG GCGCTGCGCG ATGTCGTCGC    12540

TTACGCAGTA CAGAACGGTA TCCCGGTTCC GACCTTCGCC GCTGCGGTTG CCTATTATGA    12600

CAGCTACCGT GCCGCTGTTC TGCCTGCGAA CCTGATCCAG GCCCAGCGTG ACTA          12654

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。