植物细胞培养生产有用代谢产物的固液两步培养法

摘要

植物细胞培养生产有用代谢产物的固液两步培养法，属于植物细胞培养生产次生代谢产物的技术领域。为了解决植物细胞生长与其代谢产物合成具有相互抑制作用的矛盾，本发明将细胞生长和产物合成分为两步培养，包括以下步骤：1)配制基本培养基；2)配制固体培养基，将筛选出的快速生长的细胞株系接种在所述固体培养基上，在20～25℃避光或照光条件下培养，获得植物愈伤组织；3)取所述基本培养基，向其中添加促进目标产物合成的前体物质或诱导子，调整pH值，配成液体培养基；4)将植物愈伤组织接种在液体培养基上，在20～25℃避光或照光条件下，催化合成目标代谢产物；5)收取细胞团和培养液，并通过分离纯化获得目标代谢产物。

说明书

技术领域

本专利是一种植物细胞培养生产次生代谢产物的新方法，适用于各种植物细胞培养，特别对于具有抑制细胞分裂功能的代谢产物的生产更有效。

背景技术

在植物细胞培养生产次生代谢产物的技术领域，长期以来困扰或阻碍其产业化的最大障碍是因植物细胞增殖速度缓慢、代谢产物合成时间长以及有效成分含量低等因素造成的生产成本过高。总结以往的研究结果会发现，植物细胞在固体培养基中的增殖量可以达到5～20倍/30天，而在液体培养基中的增殖量一般为2～4倍/30天。虽然在固体培养中细胞的增殖速度较快，但是由于其培养基传质不良而又不利于其次生代谢产物的合成。在很多植物细胞培养中，由于其次生代谢产物在细胞中积累以后会抑制DNA的合成或细胞分裂，所以其细胞增殖与代谢产物合成相互矛盾。以往的植物细胞培养方法主要与微生物细胞培养法一样，采取细胞连续培养或悬浮培养，也就是在培养前期促进细胞增殖，在后期改变培养条件促进产物合成，这样做由于细胞的增殖量较少，所以对于后期的产物合成量也有限。

发明内容

本发明的目的是解决现有植物细胞培养生产次生代谢产物技术中，植物细胞生长与其代谢产物合成具有相互抑制作用的矛盾，促进细胞快速增殖，实现目标代谢产物高产。

本发明的技术方案如下：植物细胞培养生产有用代谢产物的固液两步培养法，其特征在于该方法包括如下步骤：

1)在植物组织与细胞培养基中，按每升培养液加入0.1～4mg生长素、0.1～4mg细胞分裂素，以及20～60g蔗糖或葡萄糖，调pH值在5.5～7，作为基本培养基；

2)取所述基本培养基，向其中按每升培养液加入7～10g琼脂或2g高效凝固剂制成固体培养基；将筛选出的快速生长的细胞株系接种在所述固体培养基上，在20～25℃避光或照光条件下培养，获得植物愈伤组织；

3)取所述基本培养基，向其中添加促进目标产物合成的前体物质或诱导子，将培养液pH值调整到5.5～7，经灭菌消毒后配成液体培养基；

4)将步骤2)中获得的植物愈伤组织用一定孔径的不锈钢网进行筛分(不同种植物的愈伤组织对孔径的要求不同)，然后将筛分后的一定大小的植物愈伤组织颗粒接种在所述液体培养基上，在20～25℃避光或照光条件下，催化合成目标代谢产物；

5)收取细胞团和培养液，并通过分离纯化获得目标代谢产物。

本发明所述植物组织与细胞培养基为Murashige & Skoog培养基、Miller培养基、Gamborg培养基、White培养基、Heller培养基、Linsmaier & Skoog培养基或sss培养基。

本发明所述生长素优选为吲哚乙酸、α-萘乙酸或2，4二氯苯氧乙酸。

本发明所述细胞分裂素优选为6-苄氨基嘌呤或激动素。

本发明所述促进目标产物合成的前体物质或诱导子为苯丙氨酸、酪氨酸、甲基茉莉酮酸或咖啡酸。

在步骤2)中，将筛选出的快速生长的细胞株系接种在所述固体培养基上，在20～25℃避光或照光条件下培养15～25天获得植物愈伤组织。

所述植物愈伤组织接种在装有所述液体培养基的旋转培养装置或生物反应器中，在20～25℃避光或照光条件下，培养2-10天合成目标产物。

本发明的一种改进为：利用两种不同的植物组织与细胞培养基，按照步骤1)中所述方法配制出两种基本培养基，在步骤2)和步骤3)中各选取一种基本培养基，用来配制固体培养基和液体培养基。

采取固液两步培养法可以在固体培养步骤将植物细胞的生物量在一个培养周期内增长到5～20倍(4周)，在液体培养步骤在2～10天内将目标代谢产物的含量提高到种子细胞的数倍～数十倍。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

(1)在Murashige & Skoog(MS)改良培养基中，按每升培养液加入0.1～4mg的α-萘乙酸(NAA)，0.1～4mg的激动素(kinetin)，以及30～50g蔗糖；用酸或碱将pH值调整到5.5～7，作为基本培养基。

(2)取所述基本培养基，向其中按每升培养液加入2g高效凝固剂(Gellan gum)，经过加温溶解后，分装在培养器皿中，经过125℃高温，0.1Mpa压力下消毒后经冷却为固体培养基；将筛选出的肉苁蓉愈伤组织高产株系接种在所述固体培养基上，在25℃避光条件下培养20～25天，获得植物愈伤组织。

(3)取所述基本培养基，向其中按每升培养液添加促进目标产物合成的前体物质苯丙氨酸50～500mg和酪氨酸50～400mg，将培养液pH值调整到5.5～7，然后分装到培养器或生物反应器中，经125℃高温，0.1Mpa压力下消毒后进行冷却处理，配成液体培养基。

(4)将在步骤(2)中获得的愈伤组织，用孔径为0.5～1mm的不锈钢网将愈伤组织筛分，然后接种在步骤(3)配制的液体培养基中，在旋转培养装置或生物反应器中于25℃，避光或照光条件下催化合成目标产物，5～10天后完成合成反应过程；

(5)收获细胞和培养液提取和分离其有效成分，获得目标代谢产物。

实施例2：

(1)在Gamborg(B5)改良培养基中，按每升培养液加入0.1～4mg的2，4二氯苯氧乙酸，0.1～4mg的6-苄氨基嘌呤(BA)，以及30～50g蔗糖；用酸或碱将pH值调整到5.5～7，作为基本培养基。

(2)取所述基本培养基，向其中按每升培养液加入7～10g琼脂，经过加温溶解后，分装在培养器皿中，经过125℃高温，0.1Mpa压力下消毒后经冷却为固体培养基；将筛选出的紫杉愈伤组织高产株系接种在所述固体培养基上，在25℃避光条件下培养20～25天，获得植物愈伤组织。

(3)取所述基本培养基，向其中按每升培养液添加促进目标产物合成的前体物质苯丙氨酸50～500mg以及诱导子甲基茉莉酮酸100mg，将培养液pH值调整到5.5～7，然后分装到培养器或生物反应器中，经125℃高温，0.1Mpa压力下消毒后进行冷却处理，配成液体培养基。

(4)将在步骤(2)中获得的愈伤组织，用孔径为0.5～1mm的不锈钢网将愈伤组织筛分，然后接种在步骤(3)配制的液体培养基中，在旋转培养装置或生物反应器中于25℃，避光或照光条件下催化合成目标产物，2～7天后完成合成反应过程；

(5)收获细胞和培养液提取和分离其有效成分，获得目标代谢产物。

实施例3：

(1)在Murashige & Skoog(MS)改良培养基中，按每升培养液加入0.1～4mg的吲哚乙酸(IAA)，0.1～4mg的6-苄氨基嘌呤(BA)，以及30～50g蔗糖；用酸或碱将pH值调整到5.5～7，作为第一种基本培养基。

在Miller改良培养基中，按每升培养液加入0.1～4mg的吲哚乙酸(IAA)，0.1～4mg的6-苄氨基嘌呤(BA)，以及20～50g蔗糖；用酸或碱将pH值调整到5.5～7，作为第二种基本培养基。

(2)取所述第一种基本培养基，向其中按每升培养液加入7～10g琼脂，经过加温溶解后，分装在培养器皿中，经过125℃高温，0.1Mpa压力下消毒后经冷却为固体培养基；将筛选出的肉苁蓉愈伤组织高产株系接种在所述固体培养基上，在25℃避光条件下培养20～25天，获得植物愈伤组织。

(3)取所述第二种基本培养基，向其中按每升培养液添加促进目标产物合成的前体物质咖啡酸，将培养液pH值调整到5.5～7，然后分装到培养器或生物反应器中，经125℃高温，0.1Mpa压力下消毒后进行冷却处理，配成液体培养基。

(4)将在步骤(2)中获得的愈伤组织，用孔径为0.5～1mm的不锈钢网将愈伤组织筛分，然后接种在步骤(3)配制的液体培养基中，在旋转培养装置或生物反应器中于25℃，避光或照光条件下催化合成目标产物，5～10天后完成合成反应过程；

(5)收获细胞和培养液提取和分离其有效成分，获得目标代谢产物。