法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2008-01-30
专利权的终止(未缴年费专利权终止)
专利权的终止(未缴年费专利权终止)
2006-04-19
授权
授权
2005-01-26
实质审查的生效
实质审查的生效
2004-11-17
公开
公开
技术领域
本发明属于基因工程技术领域,具体地说涉及D-型乳酸脱氢酶基因、含有该基因的重组载体,及用该载体转化的宿主细胞。
背景技术
乳酸广泛存在于人体、动物、植物和微生物中。乳酸依其旋光性不同可分为D-乳酸、L-乳酸、D,L-乳酸三种。其中,L-乳酸及其衍生物,广泛应用于食品、医药、饲料和化工等领域。在医药领域,L-乳酸、L-乳酸钠与葡萄糖、氨基酸等配制成的复合制剂,可以缓解酸中毒患者及治疗高血钾症。另外,L-乳酸铁、L-乳酸钠、L-乳酸钙是补充体内所缺乏的金属元素的药品。在化工领域,L-乳酸是可降解塑料聚L-乳酸(简称聚乳酸)的原料,它的应用可极大地缓解难降解的废弃塑料制品对环境造成的污染,因此,随着世界各国对降解塑料研究开发的重视,使完全可降解塑料聚L-乳酸成为大工业生产的主流。
在动物或微生物体中,乳酸脱氢酶(简称“LDH”)是以NADH为辅酶,将丙酮酸经过生化反应生成乳酸,因此乳酸脱氢酶是乳酸菌乳酸发酵的关键酶。自然界中存在L和D两种依赖NADH的乳酸脱氢酶,分别催化丙酮酸生成L-乳酸和D-乳酸。在同时具有D-乳酸脱氢酶和L-乳酸脱氢酶的乳酸菌中,如果将D-乳酸脱氢酶缺失,就可以得到理论上光学纯度为100%的L-乳酸。目前已经有相关方面的报道(Thlerry Ferain et al.1994.Lactobacillusplantarum ldhL Gene:Overexpression and Deletion.J.Bacteriol.176(3):596-601和KARI KYL-NIKKILet al.2000.Metabolic Engineering of Lactobacillus hilveticusCNRZ32 for Production of Pure L(+)-Lactic Acid.Appl.Environ.Microbiol.66(9):3835-3841)。D-乳酸脱氢酶广泛存在于微生物中,但目前只有少数乳杆菌属的D-乳酸脱氢酶基因被克隆和测序(Thlerry Ferain et al.1994.Lactobacillus plantarum ldhL Gene:Overexpression and Deletion.J.Bacteriol.176(3)596-601;Nathalie Bernard et al.1991.Cloning of a Lactate Dehydrogenase Gene from Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus by complementation in Escherichia coli.FEBS Letters.61-64)。
乳杆菌MD-1具有以下特性:①最佳生长和发酵生产乳酸的温度为48℃;②在其基因组中具有D和L两种乳酸脱氢酶基因,在生长过程中合成D和L两种乳酸脱氢酶;③乳酸类型为DL-乳酸;④可以在发酵培养基中含200g/L葡萄糖条件下快速生长和生产乳酸;⑤72小时可以产酸140g/L以上;⑥营养要求简单,可以用大米或玉米糖化液作为发酵培养基进行发酵生产乳酸。
如果缺失D-乳酸脱氢酶基因,乳杆菌MD-1可以发酵生产高光学纯度的L-乳酸,理论上光学纯度可达到100%,72小时发酵液中可积累140g/L以上的L-乳酸,从而可以大大降低L-乳酸的生产成本,具有很大的应用潜力。
明确乳酸菌D-乳酸脱氢酶基因的多核苷酸序列,是研究D-乳酸脱氢酶基因缺失的前题,它对构建生产L-乳酸的工程菌具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是地克服现有技术中的不足,提供一种D-乳酸脱氢酶基因。
本发明的第二个目的是提供一种由D-乳酸脱氢酶基因编码的多肽。
本发明的第三个目的是提供一种包括有D-乳酸脱氢酶基因的重组载体。
本发明的最后一个目的是提供一种利用D-乳酸脱氢酶基因的重组载体转化的重组微生物。
本发明的技术方案概述如下:
一种D-乳酸脱氢酶基因,它具有序列表中SEQ ID No.5所述的核苷酸序列。此核苷酸序列包含在SEQ ID No.1所述的核苷酸序列中。
一种由D-乳酸脱氢酶基因编码的多肽,它具有序列表中SEQ ID No.6所述的氨基酸序列。
一种包括具有序列表中SEQ ID No.5所述的核苷酸序列基因的重组载体,它是以序列表SEQ ID No.3、SEQ ID No.4为PCR引物扩增出的D-乳酸脱氢酶的开放阅读框架,回收得到1000bpDNA片段,分别与pGEM-T Easy或pET-28a(+)加入T4连接酶,进行连接反应,前者制成pLZD3082,构建策略见图6,后者制成pLOD3081,构建策略见图10。
一种包括具有序列表中SEQ ID No.1所述的核苷酸序列基因的重组载体,它是将乳杆菌MD-1的DNA用BamHI消化的片段与pJDC9载体,加入T4连接酶,进行连接反应,制成pLZD3081,构建策略见图7。
一种含有D-乳酸脱氢酶基因的转化宿主细胞,它是将含有D-乳酸脱氢酶基因的重组载体导入到宿主。所述宿主为大肠杆菌FMJ144/pLZD3081、大肠杆菌DH5α/pLZD3082、大肠杆菌DE3/pLOD3081之一。
本发明中乳杆菌MD-1的D-乳酸脱氢酶的特点在于和其它已经报道的乳杆菌D-乳酸脱氢酶的多核苷酸序列相似性较低,最高达到49.33%;其编码的氨基酸序列的相同性最高为39%。
在本发明完成的基础上,可以进一步研究D-乳酸脱氢酶基因的缺失,那么,缺失D-乳酸脱氢酶基因的乳杆菌MD-1将可以发酵生产高光学纯度的L乳酸,从而可以大大降低L-乳酸的生产成本
附图说明
图1显示了1409bp的DNA片段的核苷酸序列(SEQ ID No.1);
图2是根据核苷酸序列(SEQ ID No.1)推测的D-乳酸脱氢酶蛋白的氨基酸序列(SEQ IDNo.2);
图3显示了35bp的DNA片段的核苷酸序列(SEQ ID No.3);
图4显示了29bp的DNA片段的核苷酸序列(SEQ ID No.4);
图5显示了996bp的DNA片段的核苷酸序列(SEQ ID No.5);
图6为一种含有D-乳酸脱氢酶基因的重组(克隆)载体的构建策略图;
图7由乳杆菌MD-1基因组DNA的随机基因文库筛选到的一种含有D-乳酸脱氢酶基因的重组(克隆)载体的构建策略图;
图8为阳性克隆的乳酸脱氢酶比活力
图9为pLZD3081的酶切分析
图10为一种含有D-乳酸脱氢酶基因的重组表达载体的构建策略图;
图11为全细胞蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱;
图12为高效液相色谱法测定乳酸浓度图。
具体实施方式
制备本发明的一种D-乳酸脱氢酶基因、重组载体及其宿主细胞的方法包括如下步骤:
1.从乳杆菌MD-1中提取基因组DNA,经限制性内切酶部分水解,得到DNA片段,连接到pJDC9载体(南开大学生命科学学院提供)上并转化到大肠杆菌FMJ144(南开大学生命科学学院提供),构建出乳杆菌MD-1的随机基因文库。
2.将有重组质粒的大肠杆菌FMJ144菌株在厌氧条件下培养,获得含D-乳酸脱氢酶基因的重组质粒pLZD3081及重组大肠杆菌FMJ144/pLZD3081。
在可使D-乳酸脱氢酶基因表达的条件下培养该重组菌,用丙酮酸做底物,NADH为辅酶,用紫外分光光度计测定D-乳酸脱氢酶的酶活性,证明该重组质粒具有乳酸脱氢酶活性;用SBA-40C酶膜分析仪分析以上生化反应的乳酸产物的光学特性,没有检测到L-乳酸,表明反应液中只存在D-乳酸,证明含有该重组质粒的大肠杆菌FMJ144产生的乳酸脱氢酶属于D型。
乳杆菌MD-1的D-乳酸脱氢酶基因核苷酸序列SEQ ID No.1(见图1)。D-乳酸脱氢酶基因全长1409bp;144位点的GTG为起始密码子,以1138位点的TAA为终止密码子。起始密码子上游有推测的典型核糖体结合位点(RBS):GGAGGAA,位于起始密码子上游的第7个碱基;该区域的中心AGGA到翻译起始位点的距离是8个碱基,与E.coli和Bacillus subtilis中已证实的最适距离7-9bp相一致(参见Thlerry Ferain et al.1994.Lactobacillusplantarum ldhL Gene:Overexpression and Deletion.J.Bacteriol.596-601;NathalieBernard et al.1991.Cloning of a Lactate Dehydrogenase Gene from Lactobacillusdelbrueckii subsp.bulgaricus by complementation in Escherichia coli.FEBS Letters.61-64)。ldhD推测的SD框TATAGTA和Lactobacillus plantarum 16srRNA(EMBL序列号,M58827)3’端的3’-UUCCUC-5’碱基严格互补。从而也可以说明Lactobacillus sp.MD-1和Lactobacillus plantarum在系统发育中亲缘关系较近(参见Dominique Garmyn et al.1995.Cloning,Nucleotide Sequence,and Transcriptional Analysis of the Pediococcusacidilactici L-(+)-Lactate Dehydrogenase Gene.266-272)。在5’端非编码区中还有一个推测的-35区和推测的-10区相距16nt,共同构成了D-乳酸脱氢酶基因的启动子。在D-乳酸脱氢酶基因的3’端非编码区中存在典型的回文结构形成了D-乳酸脱氢酶基因的典型的终止子。乳杆菌MD-1的D-乳酸脱氢酶基因与其他已报道的D-乳酸脱氢酶基因的核苷酸序列相比,相似性小于50%。
根据核苷酸序列SEQ ID No.1,推测乳杆菌MD-1的D-乳酸脱氢酶蛋白的氨基酸序列见SEQ ID No.2。该D-乳酸脱氢酶的氨基酸序列由331个氨基酸组成,分子量为36600Da,pI值为5.12。通过对本发明涉及的D-乳酸脱氢酶基因推导的氨基酸序列与其他乳杆菌的D-乳酸脱氢酶氨基酸序列进行比对分析,结果表明D-LDH有两个保守的区域,即R77-E107区:RNVGTDNIDIQAAKANNVKITNVPAY SPESIAE和V147-D176区:VGVMGTGHIGQVAIKLFKGFGAKVIAYD。其中V147-D176是辅酶NADH的结合域,此保守序列中有典型的GXGXXG结构,典型结构后面还有17-20个保守的氨基酸残基。‘D176’天冬氨酸残基决定了辅酶是NADH而不是NADPH(参见Nathalie Bernard et al.1991.Cloning of a Lactate Dehydrogenase Gene fromLactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus by complementation in Escherichia coli.FEBS Letters.61-64;Nathalie Bernard et al.D175 Discriminates between NADH andNADPH in the Coenzyme Binding Site of Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricusD-Lactate Dehydrogenase.Biochemical and Biophysical Research Communication.1995,208(3):895-900.)。据报道R77-E107区是酶的催化活性部位(参见NestléResearch Center etal.Envolutionary Relationship of NAD+-Dependent D-Lactate Dehydrogenase:Comparison of Primary Structure of 2-Hydroxy Acid Dehydrogenase.Biochemical andBiophysical Research Communication.1992,184(1):60-66.)。通过分析证明克隆的D-乳酸脱氢酶属于依赖NADH的脱氢酶家族的一员,与其他已报道的D-乳酸脱氢酶的氨基酸序列相比,其相同性小于50%。
下面通过实施例对本发明进行进一步详细说明。应该理解的是,所述的实施例仅仅是用于说明而不是限制本发明。
实施例1 乳杆菌MD-1基因组DNA的提取
采用高温高产乳酸的乳杆菌MD-1(南开大学生命科学学院提供),接种乳杆菌MD-1在200mLMRS培养基中,48℃培养24小时。离心收集菌体,用TE缓冲液(Tris-HCl 10mmol/L,EDTA 1mmol/L,pH8.0)洗涤2次,然后悬浮在24mLTE缓冲液中加入溶菌酶,使其工作浓度为5mg/mL,混匀后于37℃放置2小时;之后加入2.5mL溶液A(Tris-HCl 50mmol/L,EDTA0.25mmol/L,pH8.0),同时加入1.5mL溶液B(十二烷基磺酸钠(SDS)10%,Tris-HCl50mmol/L,EDTA 20mmol/L)以及150μL浓度为10mg/mL的蛋白酶K,混匀后于55℃保温1小时;该溶液分别用等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提两次,然后再用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提一次,取上清液用0.6倍的异丙醇沉淀,收DNA,用70%乙醇洗涤2次,沉淀溶于3mLTE缓冲液中;加入10mg/mL Rnase18μL,37℃保温1小时,分别用等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)、氯仿∶异戊醇(24∶1)各抽提一次,上清液加入2倍体积无水乙醇,回收DNA,分别用70%的乙醇和无水乙醇洗涤,干燥,用去离子水溶解。DNA溶液的紫外分光光度计测定结果为A260/280=1.98,A260/A230=2.18。
实施例2基因文库的构建
取实施例1所提取的基因组DNA10μL(约50μgDNA),用限制性内切酶BamHI不完全消化,经琼脂糖凝胶电泳,用大连宝生物的胶回收试剂盒回收,得到约2-6kb的部分消化片段。用限制性内切酶BamHI酶切pJDC9,经琼脂糖凝胶电泳,用凝胶回收试剂盒(大连宝生物)回收pJDC9;取2μL pJDC9回收产物,与5μL回收的基因组DNA片段,在10μL连接体系进行连接反应,总共做20支10μL连接体系的连接反应,其中含1μL的10倍连接缓冲液,1μLT4DNA连接酶,1μL水。连接体系在16℃条件下过夜反应,取10μL连接产物电转化到E.coli(大肠杆菌)FMJ144中,涂布在M9培养基平板上,得到乳杆菌MD-1基因组DNA的随机基因文库(见图7)。
实施例3在厌氧条件下进行互补筛选
将电转化的大肠杆菌FMJ144细胞涂布在含有工作浓度为250μg/mL红霉素的M9培养基平板上,厌氧条件下37℃培养144h筛选获得有乳酸脱氢酶活性的含有重组质粒的菌株,即阳性克隆;对阳性克隆菌落用碱法提取重组质粒,采用实施例2中相同的电转化手段,将重组质粒电转化到E.coli(大肠杆菌)FMJ144中进一步进行筛选;在厌氧条件下37℃培养144h筛选验证含有乳酸脱氢酶活性的含有重组质粒的菌株。
实施例4 乳酸脱氢酶酶活性分析
将阳性克隆接种到10mLM9液体培养基中,37℃静置培养48小时,离心收集菌体,用0.5M的磷酸缓冲液悬浮菌体,超声波破碎细胞,14,000r/min离心30分钟,取其上清液,即蛋白粗提物;用福林酚法测定蛋白质浓度。用紫外分光光度计测定乳酸脱氢酶活性,具体方法为:在2790μL 0.5M的磷酸缓冲液中加入100μL2.5mg/mL丙酮酸、100μL3.5mg/mL的NADH和10μL酶液,在25℃条件下用紫外分光光度计用340nm波长测定3分钟反应液的吸光值变化量,即ΔA340nm。分析结果表明筛选出的8株含有重组质粒的阳性克隆均存在很高的酶活(见图8),选取酶活性最高的H菌株进行进一步分析。该阳性克隆的重组质粒称为pLZD3081(见图7中的质粒),含有此重组质粒pLZD3081的重组大肠杆菌称为大肠杆菌FMJ144/pLZD3081。
酶活单位(U):在25℃,pH7.0的条件下,1分钟氧化1μmolNADH的酶量为1单位。实施例5鉴定乳酸脱氢酶类型
在700μL 0.5M的磷酸缓冲液中加入100μL10mg/mL丙酮酸、100μL42mg/mL的NADH和100μL上述酶液,在25℃条件下反应2小时;用SBA-40C酶膜分析仪分析酶反应液中乳酸类型,分析结果表明在反应液中没有L-乳酸,证明了在反应液中只含有D-乳酸,酶液中乳酸脱氢酶属于D-乳酸脱氢酶。
实施例6 pLZD3081酶切分析
挑出阳性克隆接入含有250μg/mL红霉素和50μg/mL氯霉素的LB液体培养基中,37℃、200r/min条件下振荡培养16小时;用碱法提取质粒,用BamH I酶切分析,琼脂糖凝胶电泳中呈约3kb的带(见图9)。
实施例7序列测定与分析
DNA序列测定由TaKaRa公司完成。DNA序列分析采用Artemis v5,蛋白质序列分析采用Dnaman4.0和ClustalX1.8以及NCBI相关数据库和软件。分析得到DNA序列:SEQ ID No.1(图1)和SEQ ID No.5。(图5)
实施例8 D-乳酸脱氢酶ORF的PCR扩增和测序
以SEQ ID No.1的核苷酸序列作参照,设计并合成PCR引物:
上游引物为5’-AAAGCTAGCGTGAAATTAATTGTTTATAATGTTCG-3’
NheI
下游引物为5’-AAAAAGCTTTTAGTCAACTAGATCGGCTG-3’
HindIII
反应体系:
Taq premix version 25μL
模板DNA 1μL
引物1(20pmol/μL) 1μL
引物2(20pmol/μL) 1μL
水 23μL
50μL
扩增条件:
94℃ 5min
72℃ 10min
4℃ 1h
PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后,用回收试剂盒回收约1kb的DNA片段,对该DNA片段用Sanger链终止法测定其核苷酸序列,以检测PCR片段是否和D-乳酸脱氢酶的ORF一致,测序结果见SEQ ID No.5。结果表明PCR片段与D-乳酸脱氢酶的ORF一致。
实施例9构建D-乳酸脱氢酶克隆载体
取5μL回收的D-乳酸脱氢酶基因ORF的PCR片段与0.5μLpGEM-T Easy载体(promega出售)在10μL连接体系进行连接反应,其中含1μL的10×连接缓冲液,1μLT4DNA连接酶,2.5μL水。连接体系在16℃条件下过夜反应,连接产物用于转化大肠杆菌。实施例10克隆载体转化到大肠杆菌DH5α
加入100μL解冻的用CaCl2法制备的感受态细胞大肠杆菌DHα(市售)和10μL连接液至Eppendorf管中,冰上30分钟,42℃热激90s,冰上2分钟,加入LB培养基900μL37℃100r/min振荡培养1小时。取100μL涂布在LB培养基平板(100μg/mL氨苄青霉素、1mmol 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷(X-gal)(大连宝生物)、1mmol异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(大连宝生物)上,37℃条件下培养16小时;挑出白色菌落接入含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中,37℃、200r/min条件下振荡培养16小时;用碱法提取质粒,用PCR检测,琼脂糖凝胶电泳中呈约1kb的带。含有该DNA片段的重组质粒称为pLZD3082(见图6),含有此重组质粒pLZD3082的重组大肠杆菌称为大肠杆菌DHα/pLZD3082。
实施例11 D-乳酸脱氢酶与表达载体pET-28a(+)(novagen出售)的重组
D-乳酸脱氢酶和表达载体pET-28a(+)分别用HindIII和NheI双酶切。酶切条件如下:
EppendorfA EppendorfA
HindIII 1μL HindIII 1μL
NheI 1μL NheI 1μL
10×M缓冲液 5μL 10×M缓冲液 5μL
pLZD3082 30μL pET-28a(+) 30μL
H2O 13μL H2O 13μL
50μL 50μL
37℃酶切2小时,电泳后分别回收两个目的片段,用T4 DNA连接酶连接,连接条件如下:
EppendorfA
T4DNA连接酶 1μL
10×连接缓冲液 1μL
pET-28a(+) 2μL
酶切片段 3μL
H2O 3μL
10μL
20μL
连接体系在16℃条件下过夜反应,连接产物用于转化大肠杆菌。
实施例12表达载体转化到大肠杆菌DE3(novagen出售)
加入60μL解冻的用用CaCl法制备的感受态细胞大肠杆菌DE3和10μL连接液至Eppendorf管中,冰上30分钟,42℃热激90s,冰上2分钟,加入LB培养基930μL37℃100r/min振荡培养1小时。取100μL涂布在LB培养基平板(60μg/mL卡拉霉素)上,37℃条件下培养16小时;挑出菌落接入含有60μg/mL卡拉霉素的LB液体培养基中,37℃、200r/min条件下振荡培养16小时;用碱法提取质粒,用PCR检测,琼脂糖凝胶电泳中呈约1kb的带。含有该DNA片段的重组质粒称为pLOD3081(见图10),含有此重组质粒pLOD3081的重组大肠杆菌称为大肠杆菌DE3/pLOD3081。
实施例13 D-乳酸脱氢酶在大肠杆菌DE3中的表达
将带有D-乳酸脱氢酶的pET-28a(+)重组载体pLOD3081的大肠杆菌DE3接入含有60μg/mL卡拉霉素的LB液体培养基中,37℃、200r/min条件下振荡培养16小时,取培养物50μL接入5mL含有60μg/mL卡拉霉素的LB液体培养基中,37℃、200r/min条件下振荡培养,直到OD值为0.3-0.4,加入1mmol IPTG诱导D-乳酸脱氢酶表达,25℃诱导2小时后,离心收集细胞,用0.5MpH7.0的磷酸缓冲液洗涤两次,然后悬浮在1mL相同的磷酸缓冲液中;用超声波细胞破碎仪破碎细胞,12000r/min离心30分钟,得到上清液,即粗酶液。按照实施例4、实施例5测定D-乳酸脱氢酶活性(见表1)。
表1
大肠杆菌DE3/ 大肠杆菌DE3/pLOD3081
菌株
pET-28a(+)
比活性(U.mg-1.) 0.0027 0.0463
实施例14 含有重组表达载体pLOD3081的大肠杆菌DE3全蛋白聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电
泳
将带有D-乳酸脱氢酶的pET-28a(+)重组载体pLOD3081的大肠杆菌DE3接入含有60μg/mL卡拉霉素的LB液体培养基中,37℃、200r/min条件下振荡培养16小时,取培养物50μL接入5mL含有60μg/mL卡拉霉素的LB液体培养基中,37℃、200r/min条件下振荡培养,直到OD值为0.3-0.4,加入1mMIPTG诱导D-乳酸脱氢酶表达,25℃诱导2小时后,取1mL菌液离心收集细胞,加入100μL水和100μL2×SDS-PAGE上样缓冲液,沸水煮5分钟,用浓度为15%的凝胶进行SDS-PAGE凝胶电泳2小时,用考马斯亮蓝染液染色1小时,再用脱色液脱色4小时,得到电泳图谱(见图11)全细胞蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱:图中,A,含有重组质粒pLOD3081的大肠杆菌DE3的全细胞蛋白;B,含有载体质粒pET-28(+)的大肠杆菌DE3的全细胞蛋白C,蛋白质标准)。电泳结果证实有蛋白质大量表达,分子量约为36600道尔顿(除去组氨酸标签,其分子量约为3000道尔顿)。
实施例15 实施例1的反应液中乳酸含量的测定
在700μL 0.5M的磷酸缓冲液中加入100μL 10mg/mL丙酮酸、100μL 42mg/mL的NADH和100μL上述酶液,在25℃条件下反应2小时;反应液用高效液相色谱法测定乳酸浓度(见图11),色谱条件如下:
分析仪器:Waters 600E HPLC 996PDA
色谱柱:Xterra RP18 5m 150×3.9mm
流动相:0.05mol/LKH2PO3,pH2.0
流速:1ml/min
检测波长:210nm
根据色谱分析,证明反应液中存在乳酸,经过SBA-40C酶膜分析仪分析,证明不存在L-乳酸,说明反应液中只存在D-乳酸,因此在大肠杆菌DE3中表达的乳酸脱氢酶是D-乳酸脱氢酶。
机译: 多核苷酸,重组载体的制备方法,重组载体,重组宿主细胞,宿主细胞的制备方法,多肽,多肽,抗体,反义核酸分子的制备方法,转基因植物,植物细胞或植物组织的制备方法,植物细胞,转基因植物或植物组织,调节宿主细胞中乙酰辅酶A合成和植物,植物组织或植物细胞中乙酰辅酶A合成的方法,转基因植物转基因植物繁殖材料的可收获部分,生产脂肪酸的方法,类胡萝卜素,(多)糖类,维生素,类异戊二烯,脂质,蜡状酯和/或多羟基链烷酸酯,pno活性激动剂或拮抗剂的鉴定方法,化合物,抗体,多核苷酸,载体,多肽,抗体,化合物以及使用的反义核酸酸分子,药物组合物,试剂盒和制备药物组合物的方法
机译: 分离的分子polinucleotide;重组载体,宿主细胞,具有步骤的基因产物,产生,产生同源基因产物的步骤。基因替换载体,重组载体,宿主细胞识别链霉菌,用于
机译: 核酸分子,重组载体,多肽,真核氨基酸消旋酶,抗体,宿主细胞,生产多肽,检测寄生虫和真核蛋白质,筛选活性分子,检测和定量序列存在或不存在的方法,抑制真核蛋白,产生真核和d-氨基酸重组氨基酸消旋酶并预防或抑制感染,质粒,免疫复合物,检测寄生虫,多核苷酸片段,真核蛋白的试剂盒,制备纯化的真核生物的方法蛋白质,以检测感染和感染,并筛选分子,免疫组合物,疫苗组合物,基因或基因片段的任何分子修饰,消旋酶酶活性的任何分子或生化修饰,以及,任何分子或组成