识别对虾白斑综合症病毒单链抗体A1的胶体金标记方法

摘要

本发明公开了一种识别对虾白斑综合症病毒单链抗体的胶体金标记方法，涉及分子生物学技术应用于水产养殖业，该方法将对虾白斑综合症病毒单链抗体经纯化、透析、调配pH值、确定胶体金溶液与单链抗体混和的最佳稳定量、把胶体金溶液与单链抗体混和、离心、去上清液，即得到胶体金标记的单链抗体Al。该方法可简化检测对虾白斑综合症病毒的操作步骤，使得检测时间和成本大大降低。胶体金标记的单链抗体可用于对虾白斑综合症病毒的检测，用于胶体金免疫电镜法，可研究单链抗体Al的抗原决定簇在病毒结构上的定位，以及示踪病毒的感染过程。

说明书

技术领域：

本发明涉及分子生物学技术应用于水产养殖业，更具体涉及用胶体金标记单链抗体。

背景技术：

1993年以来，我国虾病爆发性流行，引起养殖对虾大面积死亡，经济损失惨重。研究表明，其主要是由一种新的DNA双链病毒一对虾白斑综合症病毒(WSSV)所致。该病毒可以感染我国所有人工海水养殖的对虾种类，且感染性强，发病快，死亡率高，给对虾养殖业带来极大的危害；据报道，其它国家和地区也有类似情况。目前，对虾病毒病尚无有效的治疗方法，避免与病毒病原接触被认为是最有效的预防措施，而这主要依赖于早期的快速诊断。目前较可靠和快速的诊断方法主要是PCR，核酸探针技术和酶联免疫吸附技术。但是PCR和核酸探针技术只能依赖于实验室，技术条件要求较高，广大虾农掌握此技术存在很大的困难。酶联免疫吸附技术虽有望发展成为可在养虾场应用的诊断技术，但是由于此法所需的多克隆抗体和单克隆抗体的制备非常麻烦和费用昂贵，大大限制了该技术在诊断对虾病毒病方面的应用和发展。再由于常规的免疫印记法还需要二抗，不可避免的增加了检测时间和成本。

“一种识别对虾白斑杆状病毒的单链抗体A1及其用途”，专利申请号：00131231.6，申请日：2000年12月8日，申请人：中国科学院水生生物研究所。该申请详细介绍了识别对虾白斑杆状病毒的单链抗体A1的DNA序列、制备方法及其用途。由于该申请所述的“对虾白斑杆状病毒”以前有不同的命名，该命名国内现已统一命名为“对虾白斑综合症病毒”。

胶体金标记技术已被广泛应用于医学和细胞生物学研究领域，是目前免疫组织化学技术中常用的敏感方法之一。胶体金是氯金酸的水溶胶，具有高电子密度，并能与多种生物大分子结合，是免疫标记技术中常用的一种非放射性示踪剂。近年来，抗体IgG的胶体金标记应用最为广泛，其技术条件具有通用性。而单链抗体仅是抗体的可变部分，只有完整抗体1/6的分子量，因此单链抗体的标记完全不能参照IgG的条件，必须重新摸索条件。

发明内容：

本发明的目的是提供一种识别对虾白斑综合症病毒单链抗体A1的胶体金标记方法，该方法将对虾白斑综合症病毒单链抗体经纯化、透析、调配pH值、确定胶体金溶液与单链抗体混和的最佳稳定量、把胶体金溶液与单链抗体混和、离心、去上清液，即得到胶体金标记的单链抗体A1。该方法可简化检测对虾白斑综合症病毒的操作步骤，使得检测时间和成本大大降低。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种识别对虾白斑综合症病毒单链抗体A1的胶体金标记方法，按下列步骤顺序进行：

1、取识别对虾白斑综合症病毒单链抗体A1(该单链抗体即为申请号：00131231.6，申请日：2000年12月8日，申请人：中国科学院水生生物研究所，发明名称为“一种识别对虾白斑杆状病毒的单链抗体A1及其用途”中所述的“识别对虾白斑杆状病毒的单链抗体A1”)，用亲和层析法纯化单链抗体A1，并在0.005mol/L NaCl pH7.0的溶液中透析；

2、用柠檬酸钠还原法制备20-30nm的胶体金溶液，用凝胶电泳法测定单链抗体A1的等电点是pH 5.8，将胶体金溶液的pH调至6.2，使胶体金溶液的pH高于单链抗体A1等电点0.5 pH单位；

3、用1毫升胶体金溶液与0.1毫升含0.1-0.5毫克不同蛋白浓度的单链抗体A1混和，5分钟后，加入0.1毫升10％的NaCl溶液，放置1-2小时，观察溶液的颜色变化，将红色中蛋白浓度最低的确定为抗体的最佳稳定量；

4、按步骤3确定的最佳稳定量，将单链抗体A1用5分钟时间均匀加入到胶体金溶液中，室温搅拌30分钟；

5、用12000转/分离心60分钟，去上清液，沉淀物即为胶体金标记的单链抗体A1。

6、将沉淀物溶于步骤4所用胶体金溶液1/10体积的保存液中，在摄氏4度中保存；

其中：保存液的配方为每升含：四硼酸钠0.4克、牛血清白蛋白1.0克、叠氮钠0.1克、余者为超纯水，用6当量的盐酸调pH至7.4。

本发明与现有技术相比具有以下优点与效果：

1、用于对虾白斑综合症病毒的检测：将待测样品5μl点到NC膜上，用1％BSA/PBS包被5分钟，然后放入胶体金-A1溶液中5-10分钟取出，用水洗，观察斑点颜色，有棕红色斑点的为样品中含有对虾白斑综合症病毒。

2、用于胶体金免疫电镜法：可将对虾白斑综合症病毒感染的病虾组织包埋、切片后，与胶体金-A1保温，洗去未结合胶体金，然后用电镜观察，可研究单链抗体A1的抗原决定簇在病毒结构上的定位，以及示踪病毒的感染过程。

3、噬菌体抗体展示技术不仅避免了在制备多克隆抗体过程中由个体引起的效价及专一性的差异，也避免了在制备单克隆抗体过程中繁杂的杂交瘤技术，并且操作简单、经济，筛选范围广，使大量制备抗体或工厂化生产抗体成为可能。单链抗体A1可通过细菌的培养而获得大量的抗对虾白斑综合症病毒的抗体，使得抗体制备的成本大大降低。单链抗体A1胶体金标记的成功，使得对虾白斑综合症病毒检测的成本进一步降低，也可免去二抗，使检测程序得到很大的简化。

具体实施方式：

一种识别对虾白斑综合症病毒单链抗体A1的胶体金标记方法，按下列步骤顺序进行：

1、取识别对虾白斑综合症病毒单链抗体A1(该单链抗体即为申请号：00131231.6，申请日：2000年12月8日，申请人：中国科学院水生生物研究所，发明名称为“一种识别对虾白斑杆状病毒的单链抗体A1及其用途”中所述的“识别对虾白斑杆状病毒的单链抗体A1”)，用亲和层析法纯化单链抗体A1，并在0.005mol/L NaCl pH7.0的溶液中透析；

2、用柠檬酸钠还原法制备20-30nm的胶体金溶液，用凝胶电泳法测定单链抗体A1的等电点是pH 5.8，将胶体金溶液的pH调至6.2，使胶体金溶液的pH高于单链抗体A1等电点0.5pH单位；

3、用1毫升胶体金溶液与0.1毫升含0.1-0.5毫克不同蛋白浓度的单链抗体A1混和，5分钟后，加入0.1毫升10％的NaCl溶液，放置1-2小时，观察溶液的颜色变化，将红色中蛋白浓度最低的确定为抗体的最佳稳定量；

4、按步骤3确定的最佳稳定量，将单链抗体A1用5分钟时间均匀加入到胶体金溶液中，室温搅拌30分钟；

5、用12000转/分离心60分钟，去上清液，沉淀物即为胶体金标记的单链抗体A1；

6、对识别对虾白斑综合症病毒其它的单链抗体的胶体金标记方法，同样按照步骤1-5的方法进行。

7、将沉淀物溶于步骤4所用胶体金溶液1/10体积的保存液中，在摄氏4度中保存；

其中：保存液的配方为每升含：四硼酸钠0.4克、牛血清白蛋白1.0克、叠氮钠0.1克、余者为重蒸水，用6当量的盐酸调pH至7.4。