一种受水稻系统获得性抗性诱导剂诱导的启动子及其应用

摘要

本发明属植物分子生物学和基因工程技术领域，具体涉及一种分离和利用核酸的启动子片段，该启动子来源于水稻等植物中对PBZ及其相关化合物诱导响应的一些基因。将编码所希望的目标产物基因的核酸序列和一个上述启动子片段融合得到重组DNA，用这种重组DNA转化植物，将得到新的转基因植物。在新的植物中该重组DNA中的目标基因的表达受PBZ的化学诱导调控。

说明书

技术领域

本发明属于植物分子生物学和基因工程技术领域。具体涉及一种受水稻系统获得性抗性诱导剂诱导的启动子及其应用。该启动子来源于水稻中对烯丙异噻唑(PBZ，Probenazole，3-烯丙氧基-2-苯丙异噻唑-1，1-二氧化物)及其相关活性产物诱导响应基因的上游非转录区域序列。这一启动子片段在单子叶和双子叶植物中能够借助于诱导物PBZ起始和驱动下游附近基因的表达。用这种启动子片段构建重组表达载体转化植物，可获得新型转基因植物。在这些新型转基因植物中，PBZ及其相关活性产物(BIT)可以随意地诱导目标基因的表达和调控。

背景技术

在过去十多年中，人们已经获得了上百个在作物遗传改良中有重要应用价值的功能基因。随着功能基因组研究的进展，人们还会批量地克隆出有广泛应用价值的功能基因。这些多样性的基因资源将会被用来大规模地改良作物和其它重要植物，以便满足人口增长导致对粮食日益增长的需求，缓解环境治理和保护的巨大压力，以及为城镇居民提供丰富的生活必需品和高质量的生活环境。这些多样性的功能基因资源需要在不同类型启动子的调控下才能恰到好处地发挥作用。

一般来说，启动子是位于基因编码区上游的一段DNA，包含转录起始区。启动子区域同时包含多种调控基因表达的元件，如大约位于转录起始位点上游30bp(-30)位置的TATA box，以及位于上游75bp位置的CAAT box。植物启动子中还包含可以感应其他外界因素的调控元件，诸如光、化学物质、营养条件、热、缺氧、重金属等环境因子，进而对相关基因进行表达调控。启动子内的另外一些DNA序列与发育的时序或基因表达的组织特异性有关。真核体系中还存在增强子序列，可以大大提高附近基因的表达水平；这些增强效应与其所处的位置和方向没有多大关系。

近年来，植物基因工程技术在作物品种的遗传改良方面，特别是在抗病虫特性和抗除草剂特性，以及谷物籽粒品质改良上取得了令人瞩目的成就和进展，而且在许多其它方面也愈来愈显示出了其巨大的应用潜力，如植物生物反应器的构建等。然而，在取得这些突破性进展的同时，关于转基因植物的生态安全和食品安全问题也引起了公众越来越多的关注、争论甚至抗议。这中间除了非理性和非科学因素外，现行的选择性基因和目标功能基因的表达体系也的确存在其内在的局限性。自然状态下，生物体内基因的表达都受到严格的调控。调控因子可能是发育进程相关的，表现为基因的程序化表达，包括时空表达；也可能是环境因子诱导的，表现为基因的应急式表达。然而，目前植物基因工程中所用的启动子多为组成型的，这些组成型的启动子驱使选择性标记基因和目标功能基因持续高效表达，为转基因技术和转基因植物的安全性问题埋下了隐患。事实上，选择性标记基因只需要在筛选转化体时表达；抗病虫、抗除草剂及生物反应器中的目标功能基因也只是在生长发育特定的阶段需要表达，许多时候甚至仅仅是短暂的表达。对植物而言，外源基因的无效持续表达不仅是物质和能量不必要的消耗，而且还干扰植物细胞的正常生理活动，影响收获器官的产量和品质，甚至还会引起性状丧失等后果。最近在Bt(Bacillus thuringiensis)毒性蛋白转基因棉花上已发现，体内毒性蛋白基因长时间的表达，易导致棉铃虫对毒性蛋白产生抗性(Mcaughey et al.，Nature biotechnol.16：144-146.1998)。以植物作为生物反应器也存在类似的问题。对于生态环境而言，持续表达的外源基因可能会通过花粉或其它途径在近缘物种间转移，导致有潜在危害的部分选择性基因或功能基因及其控制的性状逃逸，进而对整个食物链和生物多样性造成难以预料的后果。

为了克服组成型启动子在植物基因工程中的这些缺点，人们已经考虑开发利用诱导型启动子，组织特异性/发育阶段特异性启动子。诱导型启动子应用于植物基因工程有许多突出的优势，主要体现在：1、目标功能基因可以根据需要诱导表达；2、基因的表达水平可以通过调节诱导剂/因子的强度而得到调节；3、通过使用不同的诱导剂/因子组合可以调节相关功能基因的协同表达。

在植物上，创伤诱导表达系统是较早被研究的、试图用于抗病虫基因工程的一种诱导型表达系统(Lorberth et al.，Plant J.2：477-86.1992)。但是由于这类启动子是借助于病虫侵害引起的创伤来诱导目标功能基因表达，所诱导的抗病虫基因表达的速度和强度不足以产生及时有效的抗性，因而不能产生理想的抗性效果。此外，其它机械损伤，如暴风雨等，也能引起抗病虫基因不必要的表达。

其次，缺氧诱导的玉米乙醇脱氢酶Adh I基因的启动子可能是研究得最为详尽的诱导型启动子之一。

通过电穿孔的方法，将缺氧诱导的玉米乙醇脱氢酶Adh I基因转化源于悬浮培养的玉米原生质体。转化后的原生质体置于低氧含量处，并于20小时后分析Adh I的表达。为便于测量缺氧诱导的Adh I表达，将天然Adh I基因5’调控片段(1096bp)与CAT相连。他们的结果显示，在源于同源的培养细胞的原生质体中，标准的缺氧条件可以调控单子叶植物玉米的Adh I启动子/CAT基因。同时，他们又发现，在玉米原生质体中，Adh I的启动子片段本身就足以响应缺氧条件的诱导，进而调控外源基因的表达，无需编码区和3’区的存在(Howard，et al.，Planta，170：535-450.1987)。

其他研究者进一步确定了玉米Adh I基因与缺氧诱导相关的DNA片段。这些研究者在玉米原生质体中转入包含CAT编码序列和Adh I启动子的重组基因，24小时后检测CAT活性。通过改变启动子片段的长度，Lee等人确定从转录起始位点上游146bp的启动子顺序足以在缺氧状态下启动CAT的表达。然而启动子序列向5’端继续延伸到266或955bp后，CAT表达量上升了5或8倍(Lee et al.，Plant Physiology 85：327-330，1987)。

Walker等人继续用瞬间表达方法研究玉米Adh I基因上游受缺氧诱导启动基因表达的序列。他们确定了启动子中与缺氧诱导的基因表达相关的2段序列：-133--124和-113--99(转录起始位点上游)。这2段序列对于诱导是必须的。在无亲缘关系的病毒启动子前添加这段40bp的元件后可以获得缺氧诱导性能(Walker et al.，proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：6624-6628，1987)。

另外有人发现在稳定转化的烟草细胞内，如果用玉米Adh I基因-1094-+106这一段调控CAT基因，在合适的缺氧条件下，有非常低的CAT基因表达。事实上，只检测到CAT的mRNA。然而，将octopine合成酶基因或花椰菜镶嵌病毒(CaMV)的启动子元件接在Adh I启动子的5’端，可刺激CAT的表达，并在缺氧诱导后检测到CAT。包含与Adh I基因转录起始位点5’相邻序列247bp的片段，足以将CAT基因的表达置于缺氧调控之下。因此，即使在有组成型的octopine合成酶或CaMV 35S启动子片段存在的条件下，这段247bp的顺序的存在仍使基因的表达受缺氧调控(Ellis et al.，EMBO Journal 6：11-16，1987)。Howard、Lee以及Walker等人通过瞬间表达分析获得的受缺氧诱导调控的Adh I启动子区域与Ellis等人通过稳定转化植物所获得的一致或类似。

由于Adh I基因的启动子诱导响应因子为缺氧状态，因而在转基因作物上的应用没有现实的可操作性。

在众多诱导型启动子中，化学诱导型启动子在调控外源基因的表达上有许多突出的优点，其中最主要的优点是可控性强。高效、专一的化学诱导启动子理论上可以用于各种类型功能基因的安全表达，最理想的可能是用于抗病虫的植物基因工程和生物反应器植物的构建。

在细菌和动物系统中已有不少能调控外源基因表达的诱导物/启动子组合。许多细菌内的诱导体系是基于能够响应代谢物或其类似物的启动子。用包含相关启动子的目标基因转化细菌后，在其培养基中加入合适的诱导物，便可以引起目标产物的表达。成熟的诱导物/启动子组合包括3-β-吲哚乙酸/色氨酸启动子，IPTG/lac启动子，磷酸盐/磷酸盐饥饿诱导启动子，以及L-阿拉伯糖/ara B启动子等。类似地，重金属/metallothionine启动子，热/热休克等启动子已应用于动物细胞的培养系统中，调控外源基因的表达。

在植物上，除草剂安全剂诱导启动子是一类研究得比较深入的实用型化学诱导启动子，但由于其诱导特异性等方面尚存在一些问题，目前尚未得到广泛的应用(Hershey et al.，Plant Mol Biol 17：679-690，1991)。美国曾批准一个除草剂安全剂诱导的启动子的专利(美国专利号：5364780)，研究者以第一个“适用于大田生产的化学物质诱导而在转基因植物中调控目标基因表达的启动子”得到了专利(1991年)。在进一步的应用中，他们将In2-2启动子与报告基因GUS相连，转化拟南芥植物，通过组织化学的方法分析发现，对于不同类型的除草剂安全剂，GUS分别表达于根、苗等不同组织中(De Veylder L et al.，Plant CellPhysiology，38(5)：568-577，1997)。

其它报道的化学诱导型启动子有水杨酸、葡聚糖受体、Cu2+、醇类、四环素、雌性激素、生长素，细胞激动素，赤霉酸，乙烯和脱落酸等诱导启动子(Davies，P.(Ed.)PlantHormones and Their roles in Plant Growth and Development，Martinus Nijhoff Publ.1987；Ebel et al.，1984)。这些启动子主要用于理论研究，不具备实际应用价值。

本发明所使用的化学诱导物质——PBZ，是生产上使用多年的植物系统获得性抗性的诱导剂，具有许多优越性。首先，该药剂对植物的正常生长发育无明显不利影响，对病原菌也没有直接毒性，不易引起抗药性，其诱导抗病机理主要是通过在转录水平上调控体内一系列相关基因的表达而实现的(Sakamoto et al.，Plant Mol Biol.40：847-855，1999；Yoshioka et al.，Plant J.25(2)：149-157，2001；丁德荣，复旦大学博士后出站报告，2001)。其次，它是一种防治稻瘟病的高效抗病性诱导剂，可以减轻由稻瘟病造成产量损失的80-90％，且效果稳定，已经成为东南亚稻区防治稻瘟病使用面积最大的抗病诱导剂(Zeigler，Leogler and Teng(Ed.)Strategies for the discovery of rice blast fungicides.in：Rice Blast Disease，CAB International Press.1994)。最后，烯丙异噻唑在植物体内具有内吸输导性，克服了水杨酸等诱导剂在植物体内不能输导、易引起植物毒害的缺点(Kessmann，et al.，Annu Rev Phytopathol.32：439-459，1994)。

综上所述，烯丙异噻唑在农业生产上的应用具有很大的可操作性，因而最有可能被应用于调控大田转基因植物中目的基因的表达。据报道，烯丙异噻唑可以诱导水稻中一些抗病相关基因的增强表达，如RRl基因。该基因的编码产物含有亮氨酸富集重复区(LRR)和核甘酸结合位点(NBS)，这些是许多已知抗病基因所共有的特征。RPRl基因的表达还可以被常用的植物系统获得性抗病性(SAR)诱导剂BTH和SA，以及病原菌的诱导(Sakamoto et al.，Plant Mol Bill.40：847-855，1999)。在拟南芥上的研究发现，PBZ或其活性代谢产物BIT也能诱导系统获得性抗性(SAR)。与常用的化学诱导剂BTH和INA不同，PBZ是通过激活SA上游成分来激活SA/NPRl介导的防御信号途径，进而诱导SAR，而前者似乎是作为SA的类似物而发挥作用的(Yoshioka et al.，Plant J.25(2)：149-157，2001)。

然而至今为止，对PBZ诱导增强表达相关基因的启动子的研究尚未见报道，也无在转基因植物体内通过PBZ调控相应启动子和结构基因组合的可诱导体系的报道。

本发明运用差减抑制杂交技术，并借助于生物信息学的途径，从水稻中分离受PBZ诱导上调的基因的启动子，鉴定它们对PBZ诱导响应水平。这些启动子片段可被用于建立一套基因诱导表达系统，在转基因植物中调控外源基因的表达。

发明内容

本发明的目的在于提供一种受植物系统获得性抗性诱导剂诱导的启动子及其应用，以便应用化学物质控制转基因植物和植物组织中基因的选择性表达。

本发明提供的受植物系统获得性抗性诱导剂诱导的启动子，是源于水稻对PBZ诱导响应的核酸启动子片段。这些核酸启动子片段已构建到含有非植物来源基因的重组载体中，转化植物后发现结构基因的表达水平受PBZ的诱导调控。因此在用PBZ诱导后，转基因植物中与该启动子片段连接的目标基因的表达水平将会上升。

上述所说的核酸启动子可从多数作物中获得，单子叶植物如水稻、玉米、燕麦、小麦、草、大麦、高粱、洋葱、和甘蔗；双子叶植物如拟南芥、苜蓿、大豆、矮牵牛花、棉花、甜菜、黄瓜、番茄、烟草、豌豆等。最主要的是从水稻中获得的核酸启动子。

上述所说的包括一组核酸启动子片段，是水稻OsPIG-1(Oryza sativa Probenazoleinducible gene-1)基因(SEQ ID No.1)5’上游启动子区域的核苷酸序列。带有所述启动子片段的转基因植物在用PBZ处理后会引起连接在所述启动子3’末端的目标基因的表达升高。在水稻中，该基因5’上游启动子区域的核苷酸序列可以为SEQ ID No.3或SEQ IDNo.4等。这些序列包含受PBZ诱导的调控元件和不同的组织特异性表达元件等。所述核苷酸序列能在中度严紧条件下与固定在固体支撑膜上的SEQ ID No.2的核苷酸杂交，经0.1XSSC，0.1％SDS于50℃～65℃洗脱后，在-80℃对X-光片曝光24小时后可获得放射自显影信号。

本发明的另一方面是与一重组DNA载体相关。该载体含有上述核苷酸序列作为启动子。该载体可转化植物，包含本发明中的一个核酸启动子片段、与该启动子相连的编码特定目标基因的DNA序列及合适的3’下游序列，使转化该重组载体后的植物在有化合物PBZ的作用下，特定目标基因的转录产物水平上升。本发明中目标基因有编码GUS基因，编码抗白叶枯病、稻瘟病等抗性基因，编码抗昆虫的基因，编码蛋白酶抑制剂基因，编码Bacillusthuringenesis昆虫内毒素的基因，编码植物乙烯生物合成酶的基因，编码植物激素生物合成酶的基因，编码雄性不育/育性表型的基因，编码钙调素的基因，编码各种疫苗的基因，以及编码各种药用或食用成分的基因等。

本发明的另一方面是包括用本发明的重组DNA序列转化的植物，这种转基因植物用化合物PBZ处理诱导目标基因表达量增高，该基因序列经操作连接在所述启动子片段的3’端。这样的转基因植物的种子同样认定为该发明的体现。

本发明的最后一方面包括在植物中引起目的基因表达增高的方法，它有几个步骤组成：a)用上述的重组DNA结构转化植物；b)用化合物PBZ处理转基因植物；c)使转基因植物在期望的发育时期增加目标基因产物的含量。

具体实施方式

1、水稻培养、PBZ处理、材料收集与抗病性鉴定

取适量稻种，用自来水浸泡片刻，去除瘪谷。再用3％的过氧化氢溶液消毒30min，之后弃去双氧水，用无菌自来水洗涤数次并在30℃下用无菌自来水浸种3天。待种子露白后，均匀地铺在衬有4层无菌纱布的搪瓷盘上，27℃下，光照16h/黑暗8h周期下培养7天。之后用100ppm烯丙异噻唑分别在第1-9天处理水稻，处理方式是根部溶液浸泡。处理后全部进行接种稻瘟菌，接种方法为：置接种箱内，在26℃下、相对湿度为85％以上的条件下进行喷雾接种，接种液浓度为1×10⁵孢子/毫升，接种后保湿24hr，取出置荫棚中喷雾保湿，7d后调查病情。

按接种处理后第1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，12天的时间梯度收集水稻的根、叶组织，液氮速冻，置于-70℃保存。

2、水稻总RNA的抽提

抽RNA所用的一切器皿均用0.1％的DEPC水处理或200℃烘烤，以去除RNA酶。

(1)热酚法抽提水稻总RNA

取水稻材料2g，置于研钵中，加液氮充分研磨至细粉状，立即转移到10ml离心管中，加预热至90℃的抽提缓冲液4ml，剧烈振荡混匀，3min后加入2ml氯仿，摇动混匀15-20min，12,000g离心15min，吸上清，加入1/3V的8M LiCl，混匀，4℃下放置16hr，离心收集沉淀，分别用2M LiCl和80％乙醇洗涤2次，室温晾干，沉淀溶于100ulDEPC水中。

(2)Trizol法抽提水稻总RNA

分装1ml trizol试剂，作标记。将适量水稻组织从冰箱中取出，迅速于液氮中研磨成细粉。把粉末放入加有1ml TRIzol试剂的1.5ml离心管中，用力摇匀后室温静置5min(然后可暂放4℃下)；加0.2ml氯仿并摇匀，室温放置3min，4℃下13,000g离心15min，取上层水相转移至一个新的离心管。水相中加0.5ml异丙醇，室温沉淀10min，4℃下13,000g离心15min，去上清。加1ml 75％的乙醇洗涤沉淀，13,000g离心5min，去尽上清。沉淀于室温干燥5min以彻底去除乙醇。加20μl无菌DEPC水溶解RNA，取1μl以1∶1000稀释，测定O.D.₂₆₀与O.D.₂₈₀的紫外吸收值，另取1μl RNA进行电泳，确定RNA的浓度与纯度。

3、mRNA分离纯化

mRNA分离纯化按mRNA Purification Kit说明进行。

4、抑制消减杂交(SSH)

具体操作按Clontech试剂盒说明书进行。

5、差减cDNA文库的构建(T/A克隆法)

从PCR扩增后的正向和反向差减cDNA群体(共25ul)中取出3ul，1μl pGEM-TEasy Vector(50ng)，1U T4 DNA连接酶加入到1×T4连接酶缓冲液中混匀，4℃下连接过夜。连接反应完成后，将反应液加入到100μl大肠杆菌JM109感受态细胞中，冰浴30min，42℃下热激90s，迅速转移至冰上放置3-5min，加入37℃预热的液体LB培养基300μl，再置于37℃摇床中，150rpm培养60min。将培养好的菌液200μl与40μl X-gal溶液(10mg/ml)、4μl IPTG溶液(10mg/ml)混合后涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上。37℃下倒置培养15h。于X-gal/IPTG琼脂平板上挑取白色克隆，点种于盛有液体LB的96孔板中，培养过夜，加15％甘油，液氮速冻，-80℃保种备用。

将保种质粒分别接种于装有2ml含100μg/ml氨苄青霉素的液体LB的试管中，置于摇床内37℃下，240rpm培养过夜。次日碱法抽提质粒。首先将菌液转移到1.5ml离心管中，13,000g离心1min，去上清，加入100μl冰预冷的溶液I，振荡将菌体细胞打匀；再加入200μl新配置的溶液II，室温放置3min；加150μl冰预冷的溶液III，冰上放置5min；然后13,000g离心10min，收集上清，加2倍体积乙醇，室温沉淀2min；13,000g离心10min，去上清并加入70％乙醇洗涤一次，再以13,000g离心2min，去尽上清并于室温下开盖晾干5min。最后加40μl无菌水溶解质粒。

6、差示筛选差减cDNA文库

第一轮差示筛选

(1)质粒样品点膜

挑取200个重组子编号，分别抽提质粒，于每个小孔中加入1ul质粒(200ng)/9ulH₂O/10ul0.6N NaOH，混匀。(制备cDNA文库的两套重复拷贝膜)，做好记录。室温晾干30min，尼龙膜含DNA的一面朝上，漂浮置于0.5M Tris-HCl(pH7.5)中和液2-4min，于无菌水中漂洗，晾干，紫外照射固定。

(2)差示探针制备

分别取正向差减杂交cDNA(以PBZ处理作Tester，非处理作Driver)和反向差减杂交cDNA(以非处理为Tester，以PBZ处理为Driver)的PCR扩增产物40ul(～400-1600ng)，PCR产物纯化试剂盒回收PCR产物。先后用RsaI(15units，37℃，1hr，SmaI(10units，R.T，1hr)，EaeI(10units，37℃，1hr)酶切消化以充分去除cDNA分子两端的接头。酶切产物同样用PCR产物纯化试剂盒回收，即为差异筛选探针。探针标记采用随机引物DNA标记系统。

(3)点杂交

分别取约200ng正向差减cDNA和反向差减cDNA群体标记探针，两种探针分别用来杂交同一cDNA文库的两套重复拷贝膜。点杂交采用68℃条件(6xSSC/5xDenhardt’s/0.1％SDS/100ug/ml鲑精DNA)。洗膜条件为(2xSSC/0.5％SDS，68℃，4×20min；0.2xSSC/0.5％SDS，68℃，4×20min)。

第二轮差示筛选

取初筛的cDNA重组子质粒，以pGEM-T的一对通用引物T7/SP6扩增外源插入片断。PCR体系为：20ng质粒模板/0.5uM SP6/1 unit Tag/200uM dNTPs/2ul 10xPCR反应缓冲液。PCR反应程序为：94℃ 5min，60℃ 2min，72℃，2min，1个循环；95℃ 30s，60℃ 100s，72℃ 2min，30个循环；72℃延长7min。取3ulPCR产物，点样于2％Agarose/EB/1xTAE，5V/cm电泳，转膜(注：制备两套重复拷贝膜)。

分别取约100ng正向/反向差减cDNA群体制备放射性探针。两种探针分别用来杂交PCR产物的两套重复拷贝膜，杂交，洗膜条件同上。

7、Northern杂交分析

(1)制备Northern杂交膜

称取一定量的琼脂糖(在胶中的终浓度为1％)，加入适量水，加热使琼脂糖溶解，稍作冷却后加入甲醛(终浓度2.2mol/L)和MOPS缓冲液(终浓度为1×)。在胶凝固期间处理RNA。每种RNA样品取40μg，加入甲醛(终浓度2.2mol/L)、甲酰胺(终浓度为50％)，MOPS电泳缓冲液(终浓度0.5×)，混匀，置于65℃水浴15min，取出后迅速放在冰上静置3min。样品在加入上样缓冲液后，上样于甲醛变性胶，在4℃下1×MOPS缓冲液中按3-4V/cm的电压走电泳。电泳留出一个泳道作EB染色，检测电泳质量并确定条带位置。电泳进行约7h后结束。将胶取出，用DEPC水淋洗数次，放入20×SSC溶液中浸泡2次共45min去除甲醛。将凝胶中的RNA吸印转移至Hybond-N尼龙膜，转移约14h后结束。在膜上标记上样孔位置后与凝胶剥离，放入6×SSC溶液中漂洗，晾干。然后在紫外交联仪中使RNA交联固定。

(2)Northern杂交

探针取自随机挑取复筛的cDNA重组子，T7/SP6扩增出插入子片段，玻璃粉法回收各片段，放射性同位素标记探针进行Northern杂交。选用的杂交与洗膜温度为65℃。杂交后放射自显影7天，洗片观察。洗片后用煮沸的0.1％SDS溶液漂洗杂交膜1-3次，直至探针被完全洗下(通过测膜的放射性来验证)。然后将膜与18 S rRNA探针于68℃下杂交，最后洗膜时洗到0.1×SSC，放射自显影2天。

(3)PCR扩增产物的电泳分离、胶回收与探针制备

将PCR反应产物与1/6体积的6×上样缓冲液混合，上样于1％的琼脂糖凝胶，1×TAE缓冲液中90V电泳35分钟。溴化乙锭(EB)染色后，于UV 312nm下将含有目的片段的凝胶割下置于1.5ml eppendorf，加3倍于凝胶体积的6mol/L NaI溶液，55℃水浴保温3-5min使胶溶解。然后加入5μl玻璃粉悬浊液，振荡混匀，于冰上放置5min。13,000g离心1min，去上清；加洗涤缓冲液200μl重悬玻璃粉，13,000g离心1min，去上清；如此重复洗涤2-3次后，去尽上清，55℃水浴保温5min使残留液体挥发。加15μl无菌水，振荡混匀，静置10min，13,000g离心1min，取上清即得所需DNA片段。

Northern杂交采用42℃条件下(5xSSC/5xDenhardt’s/1％SDS/100ug/ml鲑精DNA/50％(V/V)甲酰胺)，预杂交4hr，然后加入放射性标记探针，杂交16-24hr，洗膜条件：2xSSC/0.5％SDS，室温，2×5min；0.2xSSC/0.1％SDS，室温，2×5min；0.2xSSC/0.1％SDS，42℃，2×15min；0.1xSSC/0.1％SDS，68℃，2×15min。

8、cDNA片段测序与BLAST分析

PCR扩增产物的自动测序

测序前按照Plasmid Purification Kit的操作手册抽提纯化质粒。细菌接种及培养方法同上。收集4ml菌液中所含的细胞于一个1.5ml离心管中。室温下，每管加入250μl已包含RNA酶的溶液1，振荡混匀菌体细胞，再加入250μl溶液2，快速混匀，室温放置3min。之后加入350μl冰预冷的溶液3，颠倒离心管数次，冰上静置5min。然后13,000g离心10min，将上清转移至套有微型滤柱的另一离心管中。13,000g离心1min，此时质粒附着于滤柱上。弃去套管中的液体；向滤柱内加500μl溶液4，再以13,000g离心1min，弃去套管中的液体；向滤柱内加700μl溶液5，13,000g离心1min，弃去套管中的液体；再离心一次使滤柱甩干。换一个干净套管，往滤柱内加100μl无菌水，13,000g离心1min，收集套管中的溶液，即得纯化的质粒。电泳鉴定质粒的纯度与浓度。

取300ng质粒和测序引物(T7或SP6)加入到3μl Big Dye反应混合物中，补水至总体积为7.5μl，短暂离心后放入PCR仪，按以下程序进行测序反应：96℃变性10s；再按96℃ 5s，50℃ 10s，60℃ 4min进行25个循环.反应结束后加入95％的乙醇30μl，振荡混匀，置于冰上30min，4℃下以13,000g离心20min，去上清；加70％的乙醇100μl洗涤，4℃下以13,000g离心10min，去尽上清。4℃下开盖晾干2h以上，加2μl上样缓冲液溶解沉淀。上样前先95℃变性2min，然后用ABI Prism 377 DNA自动测序仪进行核苷酸顺序测定。

9、全长cDNA的分离鉴定

(1)cDNA文库杂交膜的制备

接种大肠杆菌XL1-Blue MRF’于含有50μg/ml四环素的LB液体培养基中，37℃下，240rpm培养过夜。次日将菌液以1∶100的比例接种于不含抗生素的50ml液体LB中，37℃下，300rpm培养至菌液O.D.₆₀₀＝0.5，1000g离心，去上清，加入8ml 10mmol/L的硫酸镁溶液重悬细胞。

取制备好的受体菌液5ml与包含至少一个根cDNA文库量(2.7×10⁵个噬菌体)的λZAP Express混合，37℃保温15min使噬菌体充分吸附。取混合液0.7ml与48℃预热的0.8％顶层琼脂9ml混匀，迅速铺在一块37℃预热的15cm LB平板上。一共铺板7块。待顶层琼脂凝固后，将平板倒置于37℃培养过夜。

等噬菌斑长满平板后把平板取出，4℃下放置2h以上使平板表面变硬。取一张略小于平板的Hybond-N+尼龙膜覆盖于平板表面，1min后揭下。将膜依次放入变性液(1.5MNaCl，0.5M NaOH)、中和液(1.5M NaCl，0.5M pH7.4的Tris-Cl)和2×SSC溶液中处理3min，5min，1min后，置于干净滤纸上晾干。再放入紫外交联仪(Bio-Rad公司产品)以C3程序进行紫外交联。

(2)cDNA克隆的筛选

将制备好的杂交膜放入预杂交液(含有6×SSC，5×Denhart’s，0.5％SDS，100μg/ml变性小牛胸腺DNA)中，68℃预杂交1-2h，同时进行探针的放射性标记。

取实验中制备的带有PCR扩增片段的质粒为模板，限制性酶切、胶电泳，并回收片段用于探针标记。取200ng回收片段，沸水浴中变性3min后迅速插在冰上冷却。将变性过的DNA加入到含有下列成分的50μl体系中：dCTP、dGTP、dTTP(终浓度各为20μmol/L)，[α-³²P]dATP(终浓度333nmol/L，放射强度50μ Ci)，牛血清白蛋白(终浓度400mg/L)，Klenow酶(终浓度10⁵U/L)。混匀后稍作离心，室温下反应1-2h。标记反应完成后，加少许蓝色葡聚糖，混匀。同时用滴管做一根简易的Sephadex G-50层析柱。将反应液过柱，收集蓝色组分。再将收集的液体沸水浴变性5min，迅速置于冰上冷却，即得杂交探针。

预杂交结束后，将标好的探针加入到预杂交液中，68℃下杂交14h。完成后将杂交液倒出保存以便于下一轮筛库使用。杂交膜依次用2×SSC，1×SSC，0.5×SSC(均含有0.1％的SDS)溶液于60℃漂洗。将膜取出，用纸巾吸去多余液体，再将膜用保鲜膜包好，测定放射强度。-70℃下放射自显影，根据放射性的强弱，压片时间在24小时至一星期不等。

洗片后，根据X光片上的黑色斑点，在平板上找出相应位置的噬菌斑，用无菌的滴管挖下，并放到含有1ml SM溶液和40μl氯仿的1.5ml的离心管中。振荡打散后于4℃保存。取适量噬菌体悬液，按前文所述方法再进行两轮筛选，直至得到纯的噬菌体克隆。

(3)cDNA克隆pBK-CMV质粒的切离

接种大肠杆菌XLOLR于含有50μg/ml四环素的LB液体培养基中，37℃，240rpm培养过夜。次日将菌液以1∶100的比例接种于不含抗生素的50ml液体LB中，37℃，300rpm培养至菌液O.D.₆₀₀＝1.0，备用。

将250-500μl筛选到的单噬斑悬液及1μl ExAssist辅助噬菌体加入到200μlXL1-Blue MRF’(O.D.₆₀₀＝2.0)中，37℃保温15min.加3ml LB液体培养基，摇床中37℃，240rpm培养2-2.5h，取出，置于70℃水浴15min，然后4000g离心5min，留上清。

将100μl上清液与新制备的XLOLR受体菌混合，37℃保温15min。再加入300μl液体LB，摇床中37℃，240rpm培养45min。取出，涂布于含有50μg/ml卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜。能够在抗性平板上长出的菌落即含有pBK-CMV质粒(带有cDNA插入片段)。

(4)cDNA阳性克隆的鉴定与测序

碱法抽提pBK-CMV质粒，T3/T7引物作PCR鉴定插入片段大小。将插入片段插入到pBlueScript II SK+质粒，利用位于pBlueScript II SK+质粒多克隆位点两侧的T3/T7引物序列进行自动测序。

10、基因组文库的筛选

除噬菌体和受体菌分别换成了λEMBL 3和E.coli p2392外，从基因文库中筛选到基因克隆的方法与筛选cDNA文库的方法基本相同。

11、OsPIG-1基因的分离

用上述方法筛选获得11个OsPIG基因克隆。其中，噬菌体和受体菌分别为λEMBL 3和E.coli p2392，筛选到的阳性克隆不需作质粒切离。

将分离获得的阳性克隆进行扩增，以得到足够的噬菌体。按上述的方法制备受体菌p2392的感受态。取10⁵pfu的阳性λ EMBL 3噬菌体与0.1ml受体菌混合，37℃吸附15min，加入3ml 0.7％顶层琼脂并混匀后，倒入一块新鲜的LB平板。37℃培养6-8h至噬菌斑长满平板，加入5ml SM溶液，置于4℃数小时，间歇摇动，使噬菌体浸出。吸出SM，往平板上再加入1ml SM；平板斜放15min，将吸出的SM与第一次的合并。在收集的噬菌体液中加入0.1ml氯仿，轻微振荡，4℃中以4000g离心10min，回收上清，加40μl氯仿，4℃保存。

以低复数感染法扩增噬菌体，经甘油梯度离心纯化后制备噬菌体DNA。先接种受体菌p2392的单菌落于50ml液体LB中，37℃、240rpm培养过夜。次日根据菌液的OD₆₀₀值，按1 OD＝8×10⁸个细胞计算细菌浓度。取2份菌液，每份含有10¹⁰个细菌，4000g离心10min，去上清，加3ml SM重悬沉淀。两份样品中分别加入5×10⁷和5×10⁸pfu的重组噬菌体，37℃保温20min，间或振荡。再将每份样品加入到250ml经37℃预热的液体LB中，37℃、300rpm培养8-12h，直至细菌培养物接近完全裂解。再往菌液中加入5ml氯仿，继续培养10min后将培养物取出。

培养物冷却至室温后，加入胰DNase I与胰RNase酶(终浓度均为1μg/ml)，室温下消化30min。加入固体氯化钠和固体聚乙二醇(PEG 6000)至终浓度分别为1mol/L和10％。待固体溶解后，冰浴1.5h使噬菌体沉淀。4℃下以11000g离心10min，弃上清，将噬菌体沉淀重悬于10ml TM溶液中(50mmol/L pH7.8 Tris-Cl，10mmol/L MgSO₄。)。向悬浮液中加入等体积氯仿，振荡30s，4℃下以3000g离心15min，回收含噬菌体的水相。按下列步骤制备甘油分级梯度：

i)将3ml含40％甘油的TM溶液加入超离心管底部。

ii)在40％甘油-TM溶液上小心地铺上4ml含有5％甘油的TM溶液。

iii)将噬菌体悬液小心地铺在5％甘油-TM溶液的上面。

iv)将离心管的剩余空间用TM溶液加满。

4℃下，35000rpm超离心60min。弃上清，加入1ml TM溶液重悬沉淀。即得纯化的重组噬菌体。

在噬菌体悬液中加入5μg胰DNA酶，1μg胰RNA酶，37℃消化30min。再加入0.5mol/LpH8.0的EDTA溶液40μl、蛋白酶K50μg、10％SDS溶液50μl，混匀后于56℃保温1h。消化液冷却至室温后，加入等体积的平衡酚(pH8.0)，翻转数次混匀。3000g离心5min，回收上层水相；再分别用等体积的1∶1的酚∶氯仿和24∶1的氯仿∶异戊醇抽提水相各一次。然后加入1/10体积的3mol/L pH7.0的乙酸钠溶液，2倍体积的无水乙醇，室温放置30min。4℃下以13000g离心10min，弃上清并加入1ml 70％乙醇洗涤沉淀；再于4℃下以13000g离心2min，去尽上清。DNA沉淀室温干燥后，加100μl pH7.5的TE缓冲液溶解。

用Sal I等多种限制酶对重组λDNA作酶切分析，构建插入片段的物理图谱。同时将电泳胶中的DNA酶切片段转移至Hybond-N⁺膜，以文库筛选所用的探针作Southern blot分析，确定OsPIG-1基因在插入片段中的位置。将各酶切片段插入到pBlueScript II SK+质粒，构建亚克隆。以T3/T7引物进行测序，并将各亚克隆的核苷酸顺序进行拼接，得到OsPIG-1cDNA(SEQ ID No.1)。

12、OsPIG-1基因5’上游调控序列的获得

根据水稻基因组数据库的序列，设计出了两对引物(SEQ ID No.5，SEQ ID No.6，SEQID No.7)，扩增出OsPIG-1基因的启动子序列(SEQ ID No.3，SEQ ID No.4)。

ATG上游2205bp片段的扩增：

F：5’GTTTCAAGTAAAGCATGTAGGG 3’

R：5’TGTGGAAGCAAGAGGTATTTAC3’

PCR反应条件：

   94℃，        5min

    94℃          46sec

    52℃          46sec

    72℃          1min30sec

   循环30次

    延伸72℃      10min

将扩增出的片段回收，克隆(T-Vector)，转化LB/Amp酶切鉴定，测序表明从两头测的结果与Genbank数据一致。

ATG上游1137bp片段的扩增：

F：5’GTTTCAAGTAAAGCATGTAGGG3’

R：5’CCACCTGTCATACACATACTGC3’

PCR反应条件：

   94℃，    5min

    94℃      46sec

    52℃      46sec

    72℃      1min30sec

   循环30次

    延伸72℃     10min

回收、克隆、转化、测序同上。

13、带OsPIG-1启动子的植物转基因载体的构建与转基因研究

比较带有OsPIG-1基因上游序列T载体和双元转基因载体pCAMBIA 1301(含GUS报告基因)上的酶切位点。分别挑选出合适的双酶切组合，使载体上原有的CaMV 35S启动子能被完全切除，且使酶切后的目的片段与载体片段有相同的粘性末端。分别使用NcoI、EcoRI双酶切，可以获得长度约2.2kb、1.1kb的OsPIG-1基因的上游调控顺序(SEQ IDNo.3、4)。

酶切产物经胶电泳回收后4℃b下连接过夜。次日将连接反应产物转化大肠杆菌TOP 10感受态细胞，涂布于带有合适抗生素(卡那霉素或氨苄青霉素)的LB平板上，37℃下培养14h。从平板上挑单菌落接种，37℃下培养过夜，碱法抽提质粒，即得重组后的转基因载体，分别包含两种长度的OsPIG-1基因上游调控序列。

选取新鲜的洋葱，于超净台中选取靠近核心部分的瓣片，用镊子撕下瓣片的内表皮，光滑面向下平铺于含1.5％琼脂的MS培养基平板上，其中诱导的实验组，培养基中加入100mg/L的烯丙异噻唑(PBZ)或含有200mg/L的水杨酸(SA)。生长近1月的Col野生型拟南芥叶片，打基因枪前从营养钵中的苗上剪下、蒸溜水洗净，用作瞬间表达试验。水稻成熟胚用作基因瞬间表达试验材料时，先将种子用0.1％的升汞消毒4min；用无菌水洗去残留升汞，去壳后，用手术刀将胚剥下，再将水稻胚于液体MS培养基中浸泡2天。

称取100mg金粉或钨粉(颗粒直径1.5-3.0μm)放入1.5ml离心管，加1ml无水乙醇，充分振荡混匀；13000g离心1min，去上清。以1ml无菌水重悬沉淀，超声处理1min，再以13000g离心1min，去上清。沉淀用无水乙醇洗涤数次后，重悬于1ml无水乙醇中。将金粉或钨粉悬液振荡混匀，吸取30μl，加入转基因载体(浓度为1μg/μl)60μl和2.5mol/L氯化钙溶液75μl，振荡混匀。再加入0.1mol/L亚精胺30μl，振荡混匀。冰浴20min，期间不时取出振荡。13000g离心1min，弃上清；沉淀用乙醇洗涤两次，重悬于30μl无水乙醇中。

在使用基因枪转化前先用75％乙醇对基因枪(Bio-Rad公司产品)进行消毒。按Bio-Rad公司提供的操作规程，将带有转基因载体的金粉或钨粉(每皿10μl金粉悬液)打入植物组织中。选用的氦气压力为1100kPa。

转化后的洋葱表皮、拟南芥叶片和水稻成熟胚在25℃下、白光中培养1天后，置于培养皿中，加入X-Gluc染色液，37℃下染色约5小时后观察显色结果，经3％的甲醛溶液固定，在显微镜下拍照。

37℃下染色约5小时后，含上述OsPIG-1上游序列且经PBZ诱导的实验组均可以由肉眼观察到蓝色的斑点，为诱导表达的GUS蛋白与其底物作用的结果；而未诱导组没有观察到任何细胞内蓝色反应产物。该组结果说明，OsPIG-1基因的上游2.2kb、1.1kb的调控顺序均可以诱导调控外源基因表达。

稳定转化后，在拟南芥叶片和根中也观察到上述诱导表达效果。水稻中的诱导表达效果与上述类似。

本发明涉及的序列

SEQ ID No：1的信息

    长度：1749碱基

    类型：核酸

    链性：单链

    拓扑结构：线性

    分子类型：cDNA

    序列描述：SEQ ID No：1

   1 atggagccgc cgaccagcca cgtcaccaac gcgttctccg actcggacag cgcgtccgtg

  61 gaggaggggg gcgccgacgc ggacgccgac gtggaggcgc tccgccgcct ctccgacaac

 121 ctcgccgcgg cgttccgctc gcccgaggac ttcgcgttcc tcgccgacgc gcgcatcgcc

 181 gtcccgggcg gcggcggcgg cggcggcgac ctgctggtgc accgctgcgt gctctccgcg

 241 cggagcccct tcctgcgcgg cgtcttcgcg cgccgcgccg ccgccgccgc aggcggcggc

 301 ggcgaggatg gcggcgagag gctggagctc cgggaactcc tcggcggcgg cggcgaggag

 361 gtggaggtcg ggtacgaggc gctgcggctg gtgctcgact acctctacag cggccgcgtc

 421 ggcgacctgc ccaaggcggc gtgcctctgc gtcgacgagg actgcgccca cgtcgggtgc

 481 caccccgccg tcgcgttcat ggcgcaggtc ctcttcgccg cctccacctt ccaggtcgcc

 541 gagctcacca acctcttcca gcggcgtctc cttgatgtcc ttgataaggt tgaggtagat

 601 aaccttctat tgatcttatc tgttgccaac ttatgcaaca aatcttgcat gaaactgctt

 661 gaaagatgcc ttgatatggt agtccggtca aaccttgaca tgattactct tgagaagtca

 721 ttgcctccag atgttatcaa gcagattatt gatgcacgcc taagcctcgg attaatttca

 781 ccagaaaaca agggatttcc taacaaacat gtgaggagga tacacagagc ccttgactct

 841 gacgatgtag agctagtcag gatgctgctc actgaaggac agacaaatct tgatgatgcg

 901 tttgcactgc actacgccgt cgaacattgt gactccaaaa ttacaaccga gcttttggat

 961 ctcgcacttg cagatgttaa tcatagaaac ccaagaggtt atactgttct tcacattgct

1021 gcgaggcgaa gagagcctaa aatcattgtc tcccttttaa ccaagggggc tcggccagca

1081 gatgttacat tcgatgggag aaaagcggtt caaatctcaa aaagactaac aaaacaaggg

1141 gattactttg gggttaccga agaaggaaaa ccttctccaa aagataggtt atgtattgaa

1201 atactggagc aagctgaaag aagggaccca caactcggag aagcatcagt ttctcttgca

1261 atggcaggtg agagtctacg aggaaggttg ctgtatcttg aaaaccgagt tgctttggcg

1321 aggattatgt ttccgatgga ggcaagagta gcaatggata ttgctcaagt ggatggaact

1381 ttggaattta acctgggttc tggtgcaaat ccacctcctg aaagacaacg gacaactgtt

1441 gatctaaatg aaagtccttt cataatgaaa gaagaacact tagctcggat gacggcactc

1501 tccaaaacag tggagctcgg gaaacgcttt ttcccgcgat gttcgaacgt gctcgacaag

1561 atcatggatg atgaaactga tccggtttcc ctcggaagag acacgtccgc ggagaagagg

1621 aagaggtttc atgacctgca ggatgttctt cagaaggcat tccacgagga caaggaggag

1681 aatgacaggt cggggctctc gtcgtcgtcg tcatcgacat cgatcggggc cattcgacca

1741 aggagatga

SEQ ID No：2的信息

长度：2502碱基

类型：核酸

链性：单链

拓扑结构：线性

分子类型：基因组DNA

序列描述：SEQ ID No：2

CAGGATGGCCTTGTTTCAAGTAAAGCATGTAGGGGACATTGTATTATGTGAAATGAATTAGTTTAGT

ATAGTTTAGCTAAGGACTGGGCCTCACACATGCCACTCCCTTCCAACTCCGTGCAAAGTTTGGAGC

AATGACAAGTGGATCCAACTGGTAGAGTCCATAGCCAAACACAATAAAATTATGGGTACACATCCA

AGGCGAAAAAGCAAGTCATTAATCTTTCTTCACATCGACGTGTAGATGTGATCTCTTCTTTGTCAAT

CTTTGTTTTTTCACTTTCTTTAATACGGGCAGCTTCGTTTTGCAATTTGGTCCTTTCAGTTCCTGGAA

AATATAGAGTAAACACTCCTGCGTGTGGTGAACTGGTGACAAGTGACAACTCCTTTTATCTCTTCTT

TAATTGGAGCTGTTTATTACTTTATTGTAAAACTAATATAAGTTAACTACTCCCACTATTTCATAATAT

AAAACATGGTCAAATTTGGTACAATCTCCAACACTAATGTTTAGCTTATAATTTCTCATATAAGGTTT

GTAGCAATCAAATTATAGACATATGAAAGTAAATTTAAATCTCAAACTAATGATATAATTCTTAGCAA

ATAAAATTCATTTCATATTATACTAAGTGTTGGTCAAATGTTTTAAATGTTGATTCTTGAAATACGTG

AGTATAATCTTGTATGAAAAGGATAGAGGAAGAAAATTAAGAAATGTTAACTCTTATGTACTGAGCT

AACTGTATATTCCATTCTTTAGTTTTTCTAAAAGTGTAAGTCCTATTTGTAGTCAATAAGTGCTAAATT

AAATTGTTAATTGGAACCCAAGAAGCCATTCTATTACTTCGTTGTATGTTCATTGGTTTTGGAGTATC

ACACAGTGAATAAATTAATTGCTTCTTAGTCTTGGTGAAAAGAAATAGATTTTAGACTTTTGGAAGG

AGGCAGTTCATGCTTCAAGGTAAATATATTAATTACATAGGTGAGAGGAAAAGAGAAAAATAATTA

GATGCACCCTCAGAGTAAGTTTAATAGTATAGCTTACTACTAACTCCAATTCATTTATAGCCAATCTA

GTAGTCAATTTATACAATAGTTGCCTACTATACTATTAATATATGGTCCCACCTGTCATACACATACTG

CGTCTTGTAGTCCGTACTGCAGCTAGCTACAAATCTGTAGCCCGCTGGTCTTCTCTCTTATCTTTTAT

CTAATTAAAATATACTTATAGCTGGCTAATAGTCTGCTATTGTACTTGCTCTCATAGCTAATATATTATA

TATGTTCGTATTAATACTACTTTATGATTGATTTGTAATTATTTTACTACTAGTATTAAATTTGCTCTTA

CTCCAGTTCATACTACTTCCTCTGTCCACCAATGCAAGAGATTTAAACTAAAAATTATCCATAAACA

TGTTTAGAGTGTATACAGCTTCACCGACCCACTGGTAGTTTAGTCATTTGGCTTTTCAGTAAGCACT

TGATTAATTAATTATTAATTACTATAAATTTGAAGATAAATTTATTTAATATTGTGAAACCTTTTATTTA

GAAAAACTAAAACACACTATTTAGATGTTTTGGAGTTTGTTAATAAAAACGAGGGAGTTATCATCCT

AATATGCAAAAATAAACTAAGCCTTAGGGGCATAACTTCAACCTTAAACTTTGCTAATAGCCTACTC

CTTTCATTATAAAATATACTAGTAGGTCTTTACTACAAAACAAACATATGATAAAAACATATTTAATG

TTAGATTTAATAAAACTAATTTAATATTTTAAATAGTACTAAATTATTCTATAAATTTGGTCAAACTTA

ACAAGTTTGACAAAAGAAAAGTTAAACGACTCATAATATGAAACATAGGAGTATAGGTTATTACAG

TTGAGAAGAAAATATCTGGGTGTCACATGAGAACTTGTTGAGGTGAGAGGCTAGGGTAAGATAAA

AAGAAATTTAAAAAGTGGATGAGGGAGGCTAGAGTATAACACATAGTATTATGTATTATGAATACTC

CTTCCATCCTAAAAAAGCTGACCTAGTTAGGGATAGAAGATAACATAGTACGATGAATATTCATGTC

TAGACTTGCTACGTTAGGTTGTGTTCCATCCTTATTTTATTTTTTTTATGAAGGGAATAATTTCTCG

GAAGAGAGGAGGTGTGTAAGCCATTATTTGTGTGGAAGCAAGAGGTATTTACGTTTGTTGGCTTTC

ACGAGGCACCACCAATTGTGCATTGTCAGTTACTCCAGTCTGGTCAACGAAGGAATGACCTTGTAA

AATCCCTAAATCTACAGGTGCAATGTGCAAAATTGCGGTTTGCACCTCACTCCTCGTTTTACTACTC

CATCCCTTTCGCCTTCGACTTCCTCGCGCCTTCCCACCAGCTCGGGCGGGAGGCCTCCTCCTCGCC

TCGCCTCGCCACGCCGCGCCGCGACGCGACGCGCCGTGGTCAGCTGGTCGCCGGTGCGGGTGCG

GGTGCGCA

SEQ ID No：3的信息

长度：2205碱基

类型：核酸

链性：单链

拓扑结构：线性

分子类型：基因组DNA

序列描述：SEQ ID No：3

GTTTCAAGTAAAGCATGTAGGGGACATTGTATTATGTGAAATGAATTAGTTTAGTATAGTTTAGCTAA

GGACTGGGCCTCACACATGCCACTCCCTTCCAACTTGATTCTTGAAATACGTGAGTATAATCTTGTA

TGAAAAGGATAGAGGAAGAAAATTAAGAATCCGTGCAAAGTTTGGAGCAATGACAAGTGGATCCA

ACTGGTAGAGTCCATAGCCAAACACAATAAAATTATGGGTACACATCCAAGGCGAAAAAGCAAGT

CATTAATCTTTCTTCACATCGACGTGTAGATGTGATCTCTTCTTTGTCAATCTTTGTTTTTTCACTTTC

TTTAATACGGGCAGCTTCGTTTTGCAATTTGGTCCTTTCAGTTCCTGGAAAATATAGAGTAAACACT

CCTGCGTGTGGTGAACTGGTGACAAGTGACAACTCCTTTTATCTCTTCTTTAATTGGAGCTGTTTAT

TACTTTATTGTAAAACTAATATAAGTTAACTACTCCCACTATTTCATAATATAAAACATGGTCAAATTT

GGTACAATCTCCAACACTAATGTTTAGCTTATAATTTCTCATATAAGGTTTGTAGCAATCAAATTATA

GACATATGAAAGTAAATTTAAATCTCAAACTAATGATATAATTCTTAGCAAATAAAATTCATTTCATA

TTATACTAAGTGTTGGTCAAATGTTTTAAATGATGTTAACTCTTATGTACTGAGCTAACTGTATATTCC

ATTCTTTAGTTTTTCTAAAAGTGTAAGTCCTATTTGTAGTCAATAAGTGCTAAATTAAATTGTTAATT

GGAACCCAAGAAGCCATTCTATTACTTCGTTGTATGTTCATTGGTTTTGGAGTATCACACAGTGAAT

AAATTAATTGCTTCTTAGTCTTGGTGAAAAGAAATAGATTTTAGACTTTTGGAAGGAGGCAGTTCAT

GCTTCAAGGTAAATATATTAATTACATAGGTGAGAGGAAAAGAGAAAAATAATTAGATGCACCCTC

AGAGTAAGTTTAATAGTATAGCTTACTACTAACTCCAATTCATTTATAGCCAATCTAGTAGTCAATTTA

TACAATAGTTGCCTACTATACTATTAATATATGGTCCCACCTGTCATACACATACTGCGTCTTGTAGTC

CGTACTGCAGCTAGCTACAAATCTGTAGCCCGCTGGTCTTCTCTCTTATCTTTTATCTAATTAAAATAT

ACTTATAGCTGGCTAATAGTCTGCTATTGTACTTGCTCTCATAGCTAATATATTATATATGTTCGTATTA

ATACTACTTTATGATTGATTTGTAATTATTTTACTACTAGTATTAAATTTGCTCTTACTCCAGTTCATAC

TACTTCCTCTGTCCACCAATGCAAGAGATTTAAACTAAAAATTATCCATAAACATGTTTAGAGTGTAT

ACAGCTTCACCGACCCACTGGTAGTTTAGTCATTTGGCTTTTCAGTAAGCACTTGATTAATTAATTAT

TAATTACTATAAATTTGAAGATAAATTTATTTAATATTGTGAAACCTTTTATTTAGAAAAACTAAAAC

ACACTATTTAGATGTTTTGGAGTTTGTTAATAAAAACGAGGGAGTTATCATCCTAATATGCAAAAAT

AAACTAAGCCTTAGGGGCATAACTTCAACCTTAAACTTTGCTAATAGCCTACTCCTTTCATTATAAA

ATATACTAGTAGGTCTTTACTACAAAACAAACATATGATAAAAACATATTTAATGTTAGATTTAATAA

AACTAATTTAATATTTTAAATAGTACTAAATTATTCTATAAATTTGGTCAAACTTAACAAGTTTGACA

AAAGAAAAGTTAAACGACTCATAATATGAAACATAGGAGTATAGGTTATTACAGTTGAGAAGAAAA

TATCTGGGTGTCACATGAGAACTTGTTGAGGTGAGAGGCTAGGGTAAGATAAAAAGAAATTTAAA

AAGTGGATGAGGGAGGCTAGAGTATAACACATAGTATTATGTATTATGAATACTCCTTCCATCCTAAA

AAAGCTGACCTAGTTAGGGATAGAAGATAACATAGTACGATGAATATTCATGTCTAGACTTGCTACG

TTAGGTTGTGTTCCATCCTTATTTTATTTTTTTTATGAAGGGAATAATTTCTCTCGGAAGAGAGGAGG

TGTGTAAGCCATTATTTGTGTGGAAGCAAGAGGTATTTAC

SEQ ID No：4的信息

长度：1137碱基

类型：核酸

链性：单链

拓扑结构：线性

分子类型：基因组DNA

序列描述：SEQ ID No：4

    GTTTCAAGTAAAGCATGTAGGGGACATTGTATTATGTGAAATGAATTAGTTTAGTATAGTTTAGC

TAAGGACTGGGCCTCACACATGCCACTCCCTTCCAACTTGATTCTTGAAATACGTGAGTATAATCTT

GTATGAAAAGGATAGAGGAAGAAAATTAAGAATCCGTGCAAAGTTTGGAGCAATGACAAGTGGAT

CCAACTGGTAGAGTCCATAGCCAAACACAATAAAATTATGGGTACACATCCAAGGCGAAAAAGCA

AGTCATTAATCTTTCTTCACATCGACGTGTAGATGTGATCTCTTCTTTGTCAATCTTTGTTTTTTCAC

TTTCTTTAATACGGGCAGCTTCGTTTTGCAATTTGGTCCTTTCAGTTCCTGGAAAATATAGAGTAAA

CACTCCTGCGTGTGGTGAACTGGTGACAAGTGACAACTCCTTTTATCTCTTCTTTAATTGGAGCTGT

TTATTACTTTATTGTAAAACTAATATAAGTTAACTACTCCCACTATTTCATAATATAAAACATGGTCAA

ATTTGGTACAATCTCCAACACTAATGTTTAGCTTATAATTTCTCATATAAGGTTTGTAGCAATCAAATT

ATAGACATATGAAAGTAAATTTAAATCTCAAACTAATGATATAATTCTTAGCAAATAAAATTCATTTC

ATATTATACTAAGTGTTGGTCAAATGTTTTAAATGATGTTAACTCTTATGTACTGAGCTAACTGTATAT

TCCATTCTTTAGTTTTTCTAAAAGTGTAAGTCCTATTTGTAGTCAATAAGTGCTAAATTAAATTGTTA

ATTGGAACCCAAGAAGCCATTCTATTACTTCGTTGTATGTTCATTGGTTTTGGAGTATCACACAGTG

AATAAATTAATTGCTTCTTAGTCTTGGTGAAAAGAAATAGATTTTAGACTTTTGGAAGGAGGCAGTT

CATGCTTCAAGGTAAATATATTAATTACATAGGTGAGAGGAAAAGAGAAAAATAATTAGATGCACCC

TCAGAGTAAGTTTAATAGTATAGCTTACTACTAACTCCAATTCATTTATAGCCAATCTAGTAGTCAAT

TTATACAATAGTTGCCTACTATACTATTAATATATGGTCCCACCTGTCATACACATACTGC

SEQ ID No：5的信息

长度：22碱基

类型：核酸

链性：单链

拓扑结构：线性

分子类型：寡核苷酸

序列描述：SEQ ID No：5

F：5′GTTTCAAGTAAAGCATGTAGGG 3′

SEQ ID No：6的信息

长度：22碱基

类型：核酸

链性：单链

拓扑结构：线性

分子类型：寡核苷酸

序列描述：SEQ ID No：6

R：5’TGTGGAAGCAAGAGGTATTTAC3’

SEQ ID No：7的信息

长度：22碱基

类型：核酸

链性：单链

拓扑结构：线性

分子类型：寡核苷酸

序列描述：SEQ ID No：7

R：5’CCACCTGTCATACACATACTGC3’