重组昆虫杆状病毒和制备方法及其作为杀虫剂的应用

摘要

本发明公开了一种重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒，制备该重组多角体病毒的方法及重组多角体病毒单独或以组合物方式作杀虫剂的应用。本发明提供的重组多角体病毒，由于含有截短的苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因crylA(c)基因序列以及多角体外膜基因pe－缺失，杀虫谱扩大，而且病毒能迅速地在昆虫的中肠里碱解，产生快速的杀死昆虫的作用。

说明书

技术领域：

本发明属于基因工程领域，具体地说，本发明涉及一种重组的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒、制备方法及作为杀虫剂的应用。

背景技术：

从1975年第一个野生型杆状病毒杀虫剂(HzNPV-棉铃虫核型多角体病毒)在美国批准注册以来，先后有30多种商品化或实验性质的野生型杆状病毒杀虫剂被开发出来。其中以苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)杀虫剂应用最广。但野生型杆状病毒的缺点是杀虫谱单一，杀虫速度慢，施用后7～14天才表现出杀虫活性。因此，近年来应用基因工程手段改造野生型杆状病毒成为克服其上述缺点的重要途径，目前大多数都是改造AcNPV，如O’Reilly和Miller认为，通过鉴定并修饰或者缺失AcNPV基因组中某种非必需基因有可能提高杆状病毒的杀虫效果，在1991年他们首先构建出缺失的最早发现于苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)中的蜕皮激素UDP葡萄糖基转移酶基因(ecdysterioid UDPglucosferase gene，egt)AcNPV病毒，发现这种重组病毒感染草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)幼虫的死亡速度比野生型快30％，但速度仍较慢，且杀虫谱没有扩大。在1989年Maeda将烟蚜夜蛾(Heliothis virescens)的利尿素基因插入到家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori NPV，BmNPV)中并在多角体启动子的控制之下。注射感染家蚕，杀虫速度有所改善。此后陆续有在AcNPV病毒中插入昆虫基因促前胸腺激素(PTTH)、保幼激素脂酶(JHE)、几丁质酶等昆虫基因，插入北非蝎AalT、Bt内毒素等昆虫特异性毒素基因和在AcNPV病毒中表达反义RNA等方面的报道。这些方法产生的重组病毒的杀虫速度与野生型杆状病毒相比最高提高了28％，并有效地减少了宿主的进食损失。但还是存在着杀虫速度不能适应农业生产的快速致害虫死亡的要求，而且杀虫谱单一的问题也没有解决。

苏云金杆菌(BT)作为杀虫剂在国内外农业生产中得到了很好的应用(喻子牛，1993，苏云金芽孢杆菌制剂的生产和应用，p1-11)，杆状病毒作为昆虫致病因子在害虫生物防治上也显示出良好的前景，因此，人们一直希望能将苏云金杆菌中某些在杀虫中起主导作用的基因克隆到昆虫杆状病毒基因组中，并使其得到表达，从而将苏云金芽孢杆菌和昆虫杆状病毒的各自优势整合到一起。众多学者对此进行了研究，但由于外源效应基因的选择、启动子的强弱、基因的插入位点、选择性标记及重组病毒能否口服感染等在分子水平上的差异和操作的困难，研究结果与农业生产要求的杀虫速度快、杀虫谱广，还存在着较大差距。如国外Mcrrycoeather等(1990)曾将全长的Bt kurstaki亚种的cry1A(c)基因插入到AcNPV的p10启动子下游、Martens等(1990)将全长的cry1A(b)基因插入到AcNPV的多角体蛋白基因编码区构建重组病毒，但杀虫效果均未明显增强；国内庞义等(1992)将全长和截短的cryIVD插入到AcNPV的多角体蛋白基因启动子下游构建重组病毒，杀虫效果有所改善，黄永秀等(1992)构建了含全长cry1A(c)基因、多角体缺失的重组AcNPV病毒，以注射方式对粉纹夜蛾的杀虫效果比野生型病毒有较大提高。杨远征等(1995)构建了携带全长和截短cry1A(c)基因、多角体缺失的两种重组病毒，王福山等(科学通报，1995，40(20)：1896-1900)构建了多角体完整、表达截短cry1A(b)基因的重组病毒，以上重组病毒在实验室测定中，通过注射或口服，杀虫毒力都有不同程度的改进。中国专利CN95117749通过一系列基因工程操作手段，在含有AcNPV的多角体基因ph的5’端插入P10启动子和3’端部份截短的苏云金杆菌σ-内毒素cry1A(b)构建成多角体完整、多角体外膜缺失的重组病毒，得到的重组病毒虽然杀虫谱扩大了一些，但由于cry1A(b)基因的毒力较弱、杀虫速度较慢，仍不能很好地满足农业生产要求。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒，该病毒杀虫谱大，可在昆虫中肠中迅速释放，快速致有害昆虫死亡。

本发明的另一个目的是提供一种制备重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的方法。

本发明的再一个目的是提供一种重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒作为杀虫剂防治甜菜夜蛾、粉纹夜蛾、小菜蛾和菜青虫的应用。

本发明的再一个目的是提供重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒杀虫剂，悬浮性能好，稳定性强，提高了杀虫效果。

一种重组的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒AcNPV，含有野生型苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒多角体基因ph，其多角体外膜基因被“苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒极早期反式调控基因启动子/新霉素抗性基因”表达盒插入失活，其特征是该重组多角体病毒还含有截短的苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种(BTK)HD-73菌株杀虫晶体蛋白基因cry1A(c)基因序列，在苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因cry1A(c)基因序列的上游是多角体基因启动子Pph序列，该重组杆状病毒是携带有苏云金芽孢杆菌(Bt)截短杀虫晶体蛋白基因cry1A(c)、多角体蛋白基因完整(ph⁺)、多角体外膜基因缺失(pe^-)的重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒vAcPhBcPE^-。

在本发明的一个优选方案中，该重组多角体病毒还含有庆大霉素(Gm)和卡那霉素(Kan)抗性标记基因序列，该重组病毒在苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因cry1A(c)基因序列上游的多角体基因启动子序列前含有庆大霉素抗性标记基因序列；在庆大霉素抗性标记基因序列前是卡那霉素抗性基因序列。

在本发明的一个更优选方案中，截短的苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因cry1A(c)基因序列是SEQ ID NO：1所示序列：

aggtacctga tagtgtgacg taattttctt taaatacgtc atcccctcct tggatggtaa

tccctgtact tccgccccac ccacgttctg gttgcctatt aatgtctttc aaatttgaat

cttggagtaa attgcgttca tcactgagtc gcttcgcatg tttgactttc tcggacaatt

ctcgcttttc atccagacaa aattcatccg ataaatacgt aactaaattg gacacttgat

caatatgata atccgttaca tttgttttta gccctagttg gtttgtagac gtaaacagcg

cattcaccgc cttctgcgct ctttccagat tatattcagc ctcgagtgtt gcagtaactg

gaataaattc aaatctgtct attatcactc ctgcagtccc actaaaattt ctaacaccta

ctatattacc taatgaagat gtaaaagcat tggcactttc aaaataacca aaatcacttg

attgtagatt atctaatgac gtagctgtag ctggtactgt attggaaaaa atggatgaat

taccccaatt aacgttgagg tgaatcgggg ttacagaagc ataccgtaca cgaactcgat

atctggtaga tgtcgatggg aagtgaattg gaacttcaat ataccctcta ttctgaatgt

tatttccact actatttaat ctaactaagt ccccaccagt aaatcctggt cctgaaatta

cagaaccatt aaaaagaaag tttcccttca ctgcagggat ttgagtaata ctatccgatg

caattatatt attaaattca gcactacgat gtatccaaga gaacatagga gctcttatta

tacttacact actattacta aagcctgaac gaaacattga aacatggctt aatcgatgac

taaatccttg cctaggtggc acgttgttat tctgtggcgg tatttcatcc agcgaatcta

ccgttccgct ttttctgtat acagcggatg gcaaatttga ggaggttcca taagcaaatt

ctgtcccgtc aagaacagat agttgttgat tatttatccc tatattaaaa ggtcttctat

ataaagtgga cgataatgtt ctatacacgc cctgacctag ttgagcaaca atacgttgtt

gtggagctgc atttcccatg gttccatata gcggaaacgt gaattctggc cccgaaaaac

cgacaggaga agccattatt tgatgccctg accaataata ataaccccta tgagcatccg

tatagatggt tatactgtta agtatatcca tcaaatgtgg actcctaata cttctttcta

tgccctgagc cgagcctcga aaactaccat caaaattttc taatactggg tttgtataaa

tttctcttgt taattgggaa actgttcgaa ttggatatct tctactatca taattcggga

acagagcaac gatatctaat acagttagtg ttaattctct tctaaattga ttatacctta

cccaatctct agaatccggt ccccatacac gttctaatcc cgtattgtac cagcgtacag

cataatctgt atagttgcca ataagcctag ttaaatcatt ataacgacta ttgatagtcg

cggcatcaaa tccccacctt tgtccaaaca ctgaaacatc tctcaaaact gataaatgta

aatttgcagc ttgaacatat actgataaaa gaggaacttg ataattttga actgcaaaaa

gaggaatagc ggttgtaagg gcactgttca tgtcattgaa ttgaatacgc atctcttctc

ttaatgctgg attagtagga tctgcttccc actctctaaa agattctgcg taaatttgat

aaagattgct tagtccttct aatctagaaa tggcttggtt cctagcgaat tcttctattc

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ttccccatat tatatcaact agtcctaaca caaatccagc accgggaaca aattcactca

aaagaaattg cgttagcgac aaggaaatat cgattggggt gtaaccagtt tctattcttt

ctccacctaa tacttctact tcagggttac ttaaacaatt ataaggaatg cattcattga

tgttcggatt gttatccata gta

在本发明的一个具体实施例中，构建的重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒vAcPhBcPE^-，Autographa californica multiplenucleocapsid nuclearpolyhedrosis virus，于2002年9月10日在国家知识产权局指定并认可的中国典型培养物保藏中心作申请专利目的的保藏，保藏号为：CCTCC V200205.

在本发明的另一个方面，本发明还提供了一种制备重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的方法，该方法包括下列步骤：

A)    将苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种HD-73菌株的杀虫晶体蛋白基因

      cry1A(c)从3’端截短，得到完全保留5’端启动区和5’端毒性

      编码区的2.32kb片段，构建成穿梭载体pHTY2；

B)    从克隆有完整多角体基因(ph)的载体pBluescriptSK(+)上以

      Pst I/Sal I双酶切并回收完整ph基因，插入到同样用Pst I/Sal

      I双酶切的转座载体pFastBacl中，构建成重组转座载体pFPh；

C)    以人工合成的DNA序列gcgtcgactatggataacaatccgaacatc和

      gcgtcgacttaaggtacctgatagtgtgacg作引物，以穿梭载体pHTY2为

      模板，通过PCR扩增出截短的cry1A(c)基因，并在其两端引入新

      的酶切位点Sal I，同时在cry1A(c)基因3’端引入终止密码子

      taa；用Sal I酶切cry1A(c)两端，插入到同样用Sal I酶切的转

      座载体pFPh上多角体基因启动子(Pph)下游、新插入多角体基

      因上游的多克隆位点(MCS)中，筛选正确的插入方向，构建新的

      转座载体pFPhBc；

D)    以转座载体pFPhBc DNA转化含有以AcNPV全基因组为基础构建的

      穿梭质粒Bacmid及助手质粒的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，得

      到重组Bacmid。

E)    在庆大霉素、卡那霉素和四环素以及IPTG/Xgal存在的三抗平板

      上挑取白色菌落即为阳性重组子。

F)    以重组Bacmid DNA转染Sf-9细胞获得具ph⁺表型、插入有截短的

      cry1A(c)基因的重组病毒vAcPhBc。

G)    将重组病毒vAcPhBc DNA与克隆有插入失活的多角体外膜蛋白基

      因pe的转移载体pAc34DZ2共转染Sf-9细胞，获得含截短的

      cry1A(c)基因、多角体蛋白基因完整(ph⁺)、多角体外膜基因缺

      失(pe^-)的重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒vAcPhBcPE^-

本重组杆状病毒是利用基因工程技术对野生型苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(wt-AcNPV)基因组进行遗传改造构建而成。构建过程包括：将苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种HD-73菌株的杀虫晶体蛋白基因cry1A(c)从3’端截短，得到完全保留5’端启动区和5’端毒性编码区的2.32kb片段，构建成穿梭载体pHTY2；从克隆有完整多角体基因(ph)的载体pBluescriptSK(+)上以Pst I/Sal I双酶切并回收完整ph基因，插入到同样用Pst I/Sal I双酶切的转座载体pFastBacl中，构建成重组转座载体pFPh；以人工合成的DNA序列gcgtcgactatggataacaatccgaacatc和gcgtcgacttaaggtacctgatagtgtgacg作引物，以穿梭载体pHTY2为模板，通过PCR扩增出截短的cry1A(c)基因，并在其两端引入新的酶切位点Sal I，同时在cry1A(c)基因3’端引入终止密码子taa；用Sal I酶切该扩增出的cry1A(c)两端，插入到同样用Sal I酶切的转座载体pFPh上多角体基因启动子(Pph)下游、新插入多角体基因上游的多克隆位点(MCS)中，筛选正确的插入方向，构建新的转座载体pFPhBc；以转座载体pFPhBc DNA转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞(含以AcNPV全基因组为基础构建的穿梭质粒Bacmid及助手质粒)，在助手质粒产生的反式作用因子作用下，pFPhBc上的Gm^r/Pph/cry1A(c)/ph/SV40polyA表达盒被其3’、5’两侧的Tn7左右侧翼序列转座到Bacmid的mini-att位点(Tn7转座接触位点)，得到重组Bacmid，由于重组Bacmid的LacZ(半乳糖苷酶基因，可分解半乳糖及其类似物)被插入失活，因此在庆大霉素、卡那霉素和四环素以及IPTG/Xgal(IPTG：异丙醇β-硫代半乳糖苷，诱导LacZ合成；Xgal：5-溴，4-氯，3-吲哚β-D-半乳糖苷，被LacZ降解释放出蓝色的吲哚衍生物)存在的三抗平板上挑取白色大肠杆菌DH10Bac菌落即为阳性重组子。从阳性大肠杆菌DH10Bac中提取重组Bacmid DNA并转染Sf-9细胞(草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda细胞)，即可获得具ph⁺表型、插入有截短的Bt cry1A(c)基因的重组病毒vAcPhBc。以Sf-9细胞中多角体的产生鉴别重组病毒含有多角体基因，提取重组病毒DNA作模板，以人工合成的DNA序列GCGTCGACTATGGATAACAATCCGAACATC                      和GCGTCGACTTAAGGTACCTGATAGTGTGACG作引物，进行PCR鉴别重组病毒含有cry1A(c)。

为了促进毒粒更快地从多角体中释放，提高杀虫速度，将重组病毒vAcPhBc DNA与转移载体pAc34DZ2(克隆有插入失活的多角体外膜蛋白基因pe)共转染Sf-9细胞，经过同源重组，获得含截短的cry1A(c)基因、多角体蛋白基因完整(ph⁺)、多角体外膜基因缺失(pe^-)的重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒vAcPhBcPE^-，由于有neo抗性基因(插入在多角体外膜基因中使其失活)的表达，以抗菌素G418富集、筛选与纯化阳性重组病毒，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，vAcPhBcPE^-可在昆虫细胞中表达80KD的截短cry1A(c)毒蛋白，但不表达34KD的多角体外膜蛋白，电镜观察vAcPhBcPE^-无多角体外膜，碱解时病毒粒子释放的速度快于vAcPhBc。

在本发明的另一个方面，本发明所提供的重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒可作为杀虫剂防治甜菜夜蛾、粉纹夜蛾、小菜蛾、菜青虫等。

在本发明中还提供了一种重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒杀虫剂，由下列组份构成：

  白碳黑                            1.0-10.0％

  拉开粉                            4.0-10.0％

  茶皂素                            4.0-10.0％

  荧光素钠                          0.5-5.0％

  苯甲酸钠                          0.1-2.0％

  甘油                              5.0-20％

  水溶性氮酮                        1.0-10.0％

  重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒    1.0-10.0×10⁹PIB/ml

  余量为水。

该重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒杀虫剂可有效地防治甜菜夜蛾、粉纹夜蛾、小菜蛾、菜青虫等害虫。

在本发明的一个优选方案中，重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒杀虫剂含有下列组份：

  白碳黑                          1.0-5.0％

  拉开粉                          5.0-8.0％

  茶皂素                          5.0-8.0％

  荧光素钠                        0.5-2.0％

  苯甲酸钠                        0.1-0.5％

  甘油                            5.0-15％

  水溶性氮酮                      1.0-5.0％

  重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒  1.0-5.0×10⁹PIB/ml

  余量为水。

在本发明的一个具体实施例中，优选的重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒杀虫剂含有下列组份：

  白碳黑                           3.0％

  拉开粉                           7.0％

  茶皂素                           6.0％

  荧光素钠                         1.0％

  苯甲酸钠                         0.4％

  甘油                             10％

  水溶性氮酮                       2.0％

  重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒       2×10⁹PIB/ml

  余量为水。

本重组病毒与其它重组核型多角体病毒、野生型核型多角体病毒及其它杀虫微生物相比，具有如下特点：

1、杀虫谱扩大：由于病毒基因组中克隆有截短的Bt杀虫晶体蛋白基因cry1A(c)，因此除了病毒自身的宿主甜菜夜蛾和粉纹夜蛾外，其主要杀虫对象扩大到小菜蛾、菜青虫等。

2、与以前多角体缺失的重组病毒相比，本重组病毒的多角体完整，有利于通过口服感染害虫。

3、多角体外膜蛋白缺失有利于病毒粒子的释放，加快杀虫速度。

4、多角体基因超强启动子(Pph)能增加cry1A(c)基因的表达，提高杀虫毒力。

5、cry1A(c)与cry1A(b)比较，杀虫毒力更强，将其截短，表达成为可溶性杀虫毒素，有利于尽快在昆虫中肠中发挥作用。经室内生物测定，含cry1A(c)的重组病毒vAcPhBcPE^-的LC₅₀为2.06×10³PIB/g，比含cry1A(b)的重组病毒vAcPhBtTPE^-的LC₅₀(为3.67×10³PIB/g)低43.9％；感染剂量为2×10⁴PIB/g时，vAcPhBcPE^-的LT₅₀为5.6天，比vAcPhBtTPE^-(为7.3天)少1.7天；田间小区试验表明，至施用后第9天，vAcPhBcPE^-的防治效果达83％，比vAcPhBtTPE^-高6.3个百分点。

本重组病毒杀虫剂的特点：

1、杀虫制剂中加入了光保护剂荧光素钠，可防紫外线对其造成的杀伤作用，保护其活性。

2、杀虫制剂中加入的荧光素钠还起增效剂作用，提高了杀虫效果。

3、杀虫剂为水悬浮制剂，悬浮性能好，稳定性强，细度达95％过200目筛，悬浮率≥70％。

重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒：vAcPhBcPE^-，保藏日：2002年9月10日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC V200205

附图说明：

图1vAcPhBcPE^-的构建过程，其中S：Sma I；E：EcoR I；H：HindIII；P：Pst I；ph：AcNPV多角体基因；Pph：ph启动子；SV40polyA：腺病毒SV40聚腺苷酸尾；Tn7R，L：Tn7转座子左右臂；Tcry1Ac：截短cry1Ac基因；MiniF ori：噬菌体F复制子；LacZ：半乳糖苷酶基因；Pie1：AcNPV极早期反式调控基因IE1启动子；neo：新霉素基因；Pe：多角体外膜基因。

图2BTKHD-73质粒与HindIII酶切，其中1：HD-73质粒；2-5：HD-73质粒/

 HindIII；M：Lamda DNA/HindIII。

图3Bt cry1Ac基因的克隆筛选，其中A：以cry1Ab基因作探针对HD-73质粒基因文库的原位杂交筛选；B：杂交阳性的两种重组子的酶切1：LamadaDNA/HindIII；2：pYZA4/HindIII；3：pYZB2/HindIII；C：重组子的Southern杂交结果。

图4cry1Ac基因5’端6.5kb的酶切分析，其中1：pYZA4/HincII；2：pYZA5/Hinc II；3：pYZA6/Hinc II；4：pYZA8/Hinc II；6-9：BamH I+Xho I酶切pYZA4，5，6，8；11：pYZA4/HindIII；5，10：Lamda DNA/HindIII。

图5cry1Ac基因3’端片段的方向性选择，其中1：Lamda DNA/HindIII+EcoRI；2；pYZB2/Cla I+HindIII；3：pYZB2/Cla I；4：回收4.3kb/ClaI；5：pYZB3/Cla I；6，8：Lamda DNA/HindIII；7：pYZB2/HindIII；9：pYZB6/Cla I；10：pYZB5/Cla I；11：pYZB3/Cla I；12：pYZB2/Cla I

图6cry1Ac基因5’端片段的修饰和亚克隆，其中1：Lamda DNA/HindIII 2：pYZC1/Sma I；3，6：pYZC1/Hinc II+Sma I；4：pYZCR14/BamH I+HindIII；5：pYZCR14/ BamH I。

图7cry1Ac基因3’端片段的亚克隆修饰，其中1：pYZD4/BamH I+HindIII；2：pYZD4/Hinc II+EcoR V；3：pYZDR2/BamH I+Hind III；4：pYZDR2/BamH I；5：Lamda DNA/HindIII+EcoR I。

图8全长cry1Ac基因片段的克隆，其中1：pYZCR14/BamH I+HindIII；2：pYZDR2/ BamH I+HindIII；3：pYZT3/ BamH；4：pYZT3/ BamH I+HindIII；5：pYZT3/ Sma I；6：Lamda DNA/ HindIII+EcoR I。

图9pHTY1和pHYT2的构建，其中1：Lamda DNA/HindIII；2：pYZT3；3.：pHTY1/Sma I；4：pHTY1/Kpn I；5：pHTY2/Kpn I；6：pHTY2/Kpn I+SmaI。

图10 转座载体pFPh的酶切电泳鉴定，其中1-2，4-7：pFPh/Pst I+Sal I；3：Lamda DNA/HindIII。

图11 转座载体pFPhBc的酶切电泳鉴定，其中1-3：pFPhBc/Pst I+Sal I；4：Lamda DNA/HindIII；5-7：pFPhBc/Sal I。

图12重组病毒vAcPhBc的鉴定，PCR鉴定克隆的cry1Ac基因。

图13重组质粒pAc34DZ2的酶切电泳鉴定图，其中1：pAc34DZ1/Sac I；2：pAc34DZ2/Sma I；3：λDNA/HindIII；4：pAcIEneo/Sma I。

图14重组病毒vAcPhBcPE^-的SDS-PAGE鉴定，其中1：vAcPhBcPE^-；2，3：正常细胞；4.wt-AcNPV；5：ph^-AcNPV；6：蛋白质分子量标记；箭头所指为34KD多角体外膜蛋白。

图15多角体外膜缺失电镜观察，其中，上：无多角体外膜的vAcPhBcPE^-；下：有多角体外膜的vAcPhBc。

图16多角体碱解过程电镜观察，其中，碱解0，2，3，5分钟后多角体形态，其中1，3，5，7为有多角体外膜的vAcPhBc；2，4，6，8为无多角体外膜的vAcPhBcPE^-。

图17动物解剖图，其中从上至下依次为鼠、兔、鸽、鱼；左为喂食重组病毒的处理，右为空白对照处理。

图18叶样PCR结果，其中+：阳性对照，模板为重组病毒DNA；-：阴性对照，模板为水。

图19虫样PCR结果，其中+：阳性对照，模板为重组病毒DNA；-：阴性对照，模板为清水。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第二版)；D.L.斯佩克特等，科学出版社，2001，细胞实验指南；吕鸿声，科学出版社，1982，昆虫病毒与昆虫病毒病等书中所述的条件，或接照制造厂商所建议的条件。

实施例1  苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种HD-73截短cry1A(c)基因的克隆

苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种(BTK)HD-73菌株、质粒载体pXI93(含cry1Ab基因)及pHT3101为中国典型培养物保藏中心提供，质粒载体pBluescriptSK(+)购自Stratagene公司，限制型内切酶，随机引物标记试剂盒购自Promega公司，T4DNA连接酶购自GIBCO-BRL公司，α-³²PdATP购自北京福瑞公司。

BTK HD-73质粒基因文库的构建：苏云金芽孢杆菌(Bt)杀虫晶体蛋白基因cry1A(c)定位在其最大的47Mda质粒上，为了克隆全长的cry1A(c)基因，用HindIII完全消化苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种(BTK)HD-73的所有质粒，用pBluescriptSK(+)作载体进行克隆，构建了BTK HD-73的质粒基因文库(图2)  。

cry1A(c)基因片段的定位与筛选：用BamH I/Pst I完全酶切质粒pXI93DNA回收包含cry1A(b)基因全序列的4.32kb片段，用随机引物法标记作为探针，与BTK HD-73质粒基因文库作原位杂交，从强杂交阳性的菌落中提取纯化质粒，发现阳性克隆的外源片段有两种，一种大小为6.5kb，一种大小为4.3kb，Southern转移杂交证明这两种片段确实与cry1A(b)基因同源(图3)，根据Adang等(1985)的报导，这两个片段分别包含了cry1A(c)基因的5’端编码区和3’端编码区。用HincII完全消化携带6.5kb外源片段的质粒，筛选到所需方向的克隆pYZA4(图4)，用Cla I完全消化携带4.3kb外源片段的质粒，筛选到所需方向的克隆pYZB2(图5)。

cry1A(c)全长基因的克隆：将pYZA4用Hinc II完全消化后自身环化，得到携带有3.0kb cry1A(c)基因片段的pYZC1，用Sma I/Hinc II完全消化pYZC1后重连，取反向插入克隆，得到克隆pYZCR14(图6)；将pYZB2用Cla I完全消化后自身环化，得到携带有0.9kb cry1A(c)基因片段的pYZD4，用EcoRV/Hinc II完全消化pYZD4后重连，取反向插入克隆，得到克隆pYZDR2(图7)。用BamH I/HindIII完全消化pYZCR14，回收3.0kb片段，用BamH I/HindIII完全消化pYZDR2，回收0.9kb片段；用BamH I消化pBluescriptSK(+)DNA并脱磷，将以上回收的两个片段与脱磷载体共连接筛选所需方向克隆，这样就得到了包括cry1A(c)5’端启动区152bp，3’端198bp大部分终止区和全部cry1A(c)基因编码区的3.92kb全长基因，命名为pYZT3(图8)。

cry1A(c)全长基因的截短：分别用Sma I对pHT3101和pYZT3完全酶切，回收pYZT3的3.92kb cry1A(c)全长基因片段，亚克隆于pHT3101的Sma I位点，筛选所需方向的克隆，得到携带全长cry1A(c)基因的穿梭载体pHTY1，用Kpn I完全消化pHTY1，自身环化重连，得到带有3’端截短的cry1A(c)基因的穿梭载体pHTY2(图9)。用Kpn I截短，基本上截去了其3’端非毒性区，完全保留了5’端启动区和5’毒性编码区。通过酶切及DNA电泳来鉴定所克隆的基因。

实施例2  转座载体pFPhBc的构建

质粒载体pBluePh为中国典型培养物保藏中心提供，转座载体pFastBacl购自GIBCO/BRL公司。pFastBacl具有mini-Tn7转座子，在其左右臂之间插入了一个由Gm^r基因、AcNPV多角体启动子，多克隆位点和SV40 poly(A)终止结构共同组成的表达盒。

克隆多角体蛋白基因(ph)至pFastBacl：从克隆有完整多角体蛋白基因(ph)的载体pBluePh上以Pst I/Sal I双酶切并回收完整ph基因，插入到同样用Pst I/Sal I双酶切的转座载体pFastBacl，构建转座载体pFPh。以Pst I/Sal I双酶切pFPh释放出1.3kb的ph片段来鉴定阳性克隆(图10)。

截短cry1A(c)基因克隆至pFPh：以人工合成的DNA序列GCGTCGACTATGGATAACAATCCGAACATC                        和GCGTCGACTTAAGGTACCTGATAGTGTGACG作引物，以穿梭载体pHTY2为模板，通过PCR(聚合酶链式反应)扩增出截短的cry1A(c)基因，并在其两端引入新的酶切位点Sal I，同时在cry1A(c)基因3’端引入终止密码子taa；用Sal I酶切cry1A(c)两端，插入到同样用Sal I酶切的转座载体pFPh上多角体基因启动子(Pph)下游的多克隆位点(MCS)中，筛选正确的插入方向构建新的转座载体pFPhBc。分别以Pst I/Sal I双酶切和Sal I单酶切pFPhBc来鉴定阳性克隆(图11)。

实施例3  重组Bacmid的构建及重组病毒vAcPhBc的获得：

大肠杆菌DH10Bac(含以苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒AcNPV全基因组为基础构建的穿梭质粒Bacmid及助手质粒)购自GIBCO/BRL公司，Sf-9细胞(草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda细胞)为中国典型培养物保藏中心提供。

提取转座载体pFPhBc DNA，转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，在助手质粒产生的反式作用因子作用下，pFPhBc上的Gm^r/Pph/cry1A(c)/ph/SV40polyA表达盒被其3’、5’两侧的Tn7左右侧翼序列转座到Bacmid的mini-att位点(Tn7转座接触位点)，得到重组Bacmid，由于重组Bacmid的LacZ(半乳糖苷酶基因，可分解半乳糖及其类似物)被插入失活，因此在庆大霉素、卡那霉素和四环素以及IPTG/Xgal(IPTG：异丙醇β-硫代半乳糖苷，诱导LacZ合成；Xgal：5-溴，4-氯，3-吲哚β-D-半乳糖苷，被LacZ降解释放出蓝色的吲哚衍生物)存在的三抗平板上挑取大肠杆菌DH10Bac白色菌落即为阳性重组子。

提取重组Bacmid DNA，转染Sf-9细胞，即可获得具ph⁺表型、插入有截短的Bt cry1A(c)基因的重组病毒vAcPhBc。以Sf-9细胞中多角体的产生鉴别重组病毒含有多角体基因，提取重组病毒DNA作模板，以人工合成的DNA序列GCGTCGACTATGGATAACAATCCGAACATC                        和GCGTCGACTTAAGGTACCTGATAGTGTGACG作引物，进行PCR鉴别重组病毒含有cry1A(c)(图12)。

实施例4  转移载体pAc34DZ2的构建

带有AcNPV多角体外膜基因(pe)的质粒pAc34DZ1、携带Pie1/neo表达盒的质粒pAcIEneo以及Sf-9细胞为中国典型培养物保藏中心提供；Grace培养基、胎牛血清、Lipofectin Reagent等购自GIBCO/BRL公司；限制性核酸酶、T4DNA连接酶、随机引物标记试剂盒均购于Promega公司。

用Sac I酶切质粒pAc34DZ1，并用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段补平5’端，用Sma I酶切质粒pAcIEneo，并回收1.8kb的Pie1/neo表达盒，与补平5’端的pAc34DZ1连接，得到12.7kb的转移载体pAc34DZ2。经酶切证明，重组质粒pAc34DZ2比pAc34DZ1长1.8kb(图13)。

实施例5  重组病毒vAcPhBcPE^-的构建

提取重组病毒vAcPhBc DNA，与转移载体pAc34DZ2 DNA(克隆有以neo抗性基因及IE1启动子插入失活的多角体外膜蛋白基因pe)共转染Sf-9细胞，由于转移载体pAc34DZ2 DNA上插入失活的pe基因与重组病毒vAcPhBc基因组上的pe基因同源，经过同源重组，pAc34DZ2上的Pie1/neo表达盒整合到vAcPhBc基因组的pe基因位相，使pe基因插入失活，获得含截短的cry1A(c)基因、多角体蛋白基因完整(ph⁺)、多角体外膜基因缺失(pe^-)的重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒vAcPhBcPE^-，由于有neo抗性基因(插入在多角体外膜基因中使其失活)的表达，以抗菌素G418富集、筛选与纯化阳性重组病毒，经SDS-PAGE分析，vAcPhBcPE^-可在昆虫细胞中表达80KD的Bt截短毒蛋白，29KD的多角体蛋白和29KD的neo基因表达产物(两条带重叠)，但不表达34KD的多角体外膜蛋白(图14)，电镜观察vAcPhBcPE^-无多角体外膜(图15)，碱解时病毒粒子释放的速度快于vAcPhBc(图16)。

此病毒的整个构建过程见图1。此病毒保藏在国家知识产权局指定并认可的中国典型培养物保藏中心作申请专利目的的保藏：

保藏号：CCTCC V200205

保藏日：2002年9月10日

病毒名称：重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒：vAcPhBcPE^-

实施例6.1  重组病毒及重组病毒杀虫剂室内生物测定

供试病毒为实施例5构建的重组病毒vAcPhBcPE^-及vAcPhBtTPE^-(对照)；重组病毒杀虫剂以重组病毒vAcPhBcPE^-加如下辅料配制而成(简称杀虫剂I)：1.0％白碳黑、10.0％拉开粉、4.0％茶皂素、5.0％荧光素钠、2.0％苯甲酸钠、20％甘油、1.0％水溶性氮酮、1.0×10⁹PIB/ml重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒，余量为水(以上为重量百分比，下同)；供试昆虫为本项目组人工饲养的3龄甜菜夜蛾。

实验温度为25～28℃，湿度为70～80％，添食法感染，重组病毒悬液和重组病毒杀虫剂水悬浮液均配制成5.7×10⁸PIB/ml的病毒悬液进行感染，感染剂量为40ul。每试验组40头幼虫。

试验结果是：

重组病毒vAcPhBcPE^-和vAcPhBtTPE^-的毒力生物测定见表1，根据表1进行关于不同浓度与不同病毒杀虫剂下死亡数的双因素方差分析，结果表明不仅不同浓度间存在极显著差异，而且不同病毒间亦具有显著性差异(p＝0.05)。

根据表1数据计算重组病毒vAcPhBcPE^-和vAcPhBtTPE^-LC₅₀如表2，含cry1A(c)的重组病毒vAcPhBcPE^-的LC₅₀为2.06×10³PIB/g，含cry1A(b)的重组病毒vAcPhBtTPE^-的LC₅₀为3.67×10³PIB/g，前者比后者低43.9％。

当感染剂量为2×10⁴ PIB/g时，重组病毒vAcPhBcPE^-和vAcPhBtTPE^-的死亡历程见表3。根据表3进行关于不同日期与不同病毒下死亡数的双因素的方差分析，其结果也表明不同病毒间有显著性差异(p＝0.05)。

表1  重组病毒vAcPhBcPE^-和vAcPhBtTPE^-毒力的生物测定

  浓度(PIB/g)            幼虫数         死亡率(％)    校正死亡率(％)

cry1Ac    cry1Ab    cry1Ac   cry1Ab   cry1Ac  cry1Ab  cry1Ac  cry1Ab

2×10⁵   2×10⁵     60       60      86.4    85.0    86.0    84.5

2×10⁴   2×10⁴     60       60      67.4    59.0    64.3    57.7

2×10³   2×10³     60       60      51.7    49.8    50.2    48.3

2×10²   2×10²     60       60      32.0    24.3    29.9    25.1

2×10     2×10        60       60      18.9    14.7    16.4    12.9

0                      80               3.0

注：cry1Ac和cry1Ab分别代表克隆有截短cry1Ac和截短cry1Ab的重组病毒vAcPhBcPE^-和vAcPhBtTPE^-

表2重组病毒vAcPhBcPE^-和vAcPhBtTPE^-LC₅₀测定

重组病毒        直线回归方程    相关系数       LC₅₀      95％置信范围

vAcPhBcPE^-    y＝3.34+0.50x     r＝0.99    2055 PIB/g   982～4302 PIB/g

vAcPhBtTPE^-   y＝3.13+0.52x     r＝0.99    3673 PIB/g  1817～7440 PIB/g

表3  2×10⁴ PIB/g感染时幼虫的死亡率(％)

     日  期      3     4     5     6     7     8     9

  vAcPhBcPE^-  21.7  38.3  51.7  53.5  58.3  63.3  67.4

  vAcPhBtTPE^-  0.0  10.0  25.0  45.7  51.7  53.3  59.0

表4重组病毒vAcPhBcPE^-和vAcPhBtTPE^-LT₅₀测定

   重组病毒      直线回归方程    相关系数    LT₅₀   95％置信范围

  vAcPhBcPE^-    y＝3.19+2.42x    r＝0.98    5.6d     4.9～6.4d

  vAcPhBtTPE^-   y＝1.34+4.25x    r＝0.95    7.3d     7.0～7.6d

据表3计算重组病毒vAcPhBcPE^-和vAcPhBtTPE^-LT₅₀如表4，vAcPhBcPE^-的LT₅₀为5.6天，vAcPhBtTPE^-为7.3天，前者比后者少1.7天。

因此，重组病毒vAcPhBcPE^-由于截短cry1Ac基因表达可溶性毒蛋白和pe基因的失活，其对甜菜夜蛾幼虫的毒力比vAcPhBtTPE^-明显提高，杀虫速度明显加快。

表5重组病毒杀虫剂(vAcPhBcPE^-)的室内毒力测定

杀虫剂种类    回归直线方程    LC₅₀(PIB/mL) 相关系数(r)

 杀虫剂I      Y＝3.50+0.46x    1.93×10³      0.90

 杀虫剂II     Y＝2.80+0.68x    1.71×10³      0.97

 杀虫剂III    Y＝2.91+0.65x    1.59×10³      0.96

杀虫剂I的室内毒力测定见表5，从表5可看出，重组病毒杀虫剂的LC₅₀为1.93×10³PIB/mL，远低于野生型苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒杀虫剂，从而证明以本项目组构建的重组病毒生产病毒杀虫剂确能达到提高毒力、缩短杀虫时间的目的。此外，这一结果亦可作为重组病毒杀虫剂的质量控制指标，用以指导杀虫剂的生产与质量控制。

感染浓度为2×10⁴PIB/mL时，杀虫剂I的LT₅₀测定见表6。根据我们多次田间应用试验所得数据，并综合生产成本、农民可承受的价格、在大田环境中紫外线、热及雨水对病毒活性的影响等因素考虑，我们选用600×10⁸PIB/亩作为病毒杀虫剂的使用剂量。

表6重组病毒杀虫剂(vAcPhBcPE^-)的LT₅₀测定

杀虫剂种类     回归直线方程     LT₅₀(天)    相关系数(r)

 杀虫剂I       Y＝3.81+1.74x      4.84         0.90

 杀虫剂II      Y＝3.19+2.69x      4.71         0.94

 杀虫剂III     Y＝2.72+3.53x      4.43         0.93

实施例6.2  重组病毒杀虫剂室内生物测定

供试重组病毒杀虫剂以重组病毒vAcPhBcPE^-加入如下辅料配制而成(简称杀虫剂II)：5.0％白碳黑、5.0％拉开粉、8.0％茶皂素、0.5％荧光素钠、0.1％苯甲酸钠、5％甘油、5.0％水溶性氮酮、5.0×10⁹PIB/ml重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒，余量为水。对照为按实施例6.1制成的重组病毒杀虫剂I。供试昆虫为本项目组人工饲养的3龄甜菜夜蛾。

实验温度为25～28℃，湿度为70～80％，添食法感染，重组病毒杀虫剂水悬浮液配制成5.7×10⁸PIB/ml的病毒悬液进行感染，感染剂量为40ul。每试验组40头幼虫。

试验结果是：从表5可以看出，杀虫剂II的LC₅₀为1.71×10³PIB/mL，比杀虫剂I的低11％；从表6可以看出，感染浓度为2×10⁴PIB/mL时，杀虫剂II的LT₅₀为4.71天，比杀虫剂I低。

实施例6.3  重组病毒杀虫剂室内生物测定

供试重组病毒杀虫剂以重组病毒vAcPhBcPE^-加入如下辅料配制而成(简称杀虫剂III)：3.0％白碳黑、7.0％拉开粉、6.0％茶皂素、1.0％荧光素钠、0.4％苯甲酸钠、10％甘油、2.0％水溶性氮酮、2.0×10⁹PIB/ml重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒，余量为水。对照为按实施例6.2制成的重组病毒杀虫剂II。供试昆虫为本项目组人工饲养的3龄甜菜夜蛾。

实验温度为25～28℃，湿度为70～80％，添食法感染，重组病毒杀虫剂水悬浮液配制成5.7×10⁸PIB/ml的病毒悬液进行感染，感染剂量为40ul。每试验组40头幼虫。

试验结果是：从表5可以看出，杀虫剂m的LC₅₀为1.59×10³PIB/mL，比杀虫剂II的低7％，比杀虫剂I低17.6％；从表6可以看出，感染浓度为2×10⁴PIB/mL时，杀虫剂III的LT₅₀为4.43天，比杀虫剂II和杀虫剂I都要低。

实施例7重组病毒vAcPhBcPE^-毒理学试验

重组病毒毒理学试验委托湖北省卫生防疫站进行。

供试病毒为实施例5构建的重组病毒vAcPhBcPE^-，无色透明液体，病毒浓度为2×10⁹PIB/g；实验动物Wistar大鼠、封闭群白色豚鼠以及大耳白兔，由湖北省医学实验动物中心提供，实验前经一周健康观察，符合动物实验要求。

根据农业部《农药登记资料要求》和《农药登记毒理学试验方法》(GB15670-1995)，并参照国内外关于生物杀虫剂类安全性检测及评价方法，进行了急性经口LD₅₀、急性经皮LD₅₀、眼刺激试验、皮肤刺激试验、变态反应(皮肤致敏)试验以及30天致病性试验。

实验结果是：

急性经口LD₅₀：该受试样品对雌雄大鼠急性经口LD₅₀＞5000mg/kg。

急性经皮LD₅₀：该受试样品对雌雄大鼠急性经皮LD₅₀＞2000mg/kg。

眼刺激试验：动物滴眼后经观察，72小时无明显眼刺激症状，I.A.O.I.积分为0；M.I.O.I值48小时后为0，眼刺激强度分级为无刺激性。

皮肤刺激试验：该受试样品对家兔皮肤刺激积分均值为0分，强度分级属无刺激性。

皮肤致敏试验：受试样品组和阴性对照组经2次激发未见明显致敏反应，致敏率为0。致敏强度I级，属弱致敏物类。  

致病性试验：动物经灌胃和腹腔注射2种途径染毒后连续观察，动物饮食、精神状态和大小便等均正常，无明显中毒症状，肉眼观察肝、脾、肺、肾、胃等脏器，未见明显病理改变；病理组织切片做了肝、脾、肾、胸腺、肠系膜淋巴结，经与同一染毒途径对照组相比，镜检显示腹腔注射样品组动物肠系膜淋巴结巨噬细胞增生，其余无明显差别，无特异性病理改变。

实施例8重组病毒杀虫剂毒理学试验

重组病毒杀虫剂毒理学试验委托湖北省卫生防疫站进行。

受试物重组病毒杀虫剂来源于本发明实施例16；实验动物Wistar大鼠、大耳白兔由湖北省医学实验动物中心提供，实验前经一周健康观察，符合动物实验要求。

根据农业部《农药登记资料要求》和《农药登记毒理学试验方法》(GB15670-1995)，并参照国内外关于生物杀虫剂类安全性检测及评价方法，进行了急性经口LD₅₀、急性经皮LD₅₀、眼刺激试验和皮肤刺激试验。

试验结果是：

急性经口LD₅₀：该受试样品对雌雄大鼠急性经口LD₅₀＞5000mg/kg。

急性经皮LD₅₀：该受试样品对雌雄大鼠急性经皮LD₅₀＞2000mg/kg。

眼刺激试验：大耳白兔经滴眼后经观察，24小时后结膜充血水肿，有浓性分泌物，7天后仍有反应。I.A.O.I.积分为14分；M.I.O.I值为7天后小于20(13分)。属中等刺激性。

皮肤刺激试验：该受试样品涂于大耳白兔去毛皮肤上，有轻度红斑水肿，积分均值为1.5，属轻度刺激性。

实施例9重组病毒的安全性

重组病毒对动物的安全试验。

供试病毒为实施例5构建的重组病毒vAcPhBcPE^-，供试动物包括家兔、小白鼠、非洲鲫鱼、家鸽，由湖北省医学实验动物中心提供，以上动物目测均体态正常，身体健康，并在病毒感染前经7～10天室内饲养观察，同时设置对照组动物。

试验方法：所有感染试验均采取核型多角体病毒的自然感染途径，即口服感染。根据动物体重确定病毒感染剂量，按照《U.S Enviromental ProtectionAgency Baculoviruses for Insect Pest Control：Safety Consideration》所提出的感染剂量标准，即按70kg人体重，采用10英亩(1英亩＝6.07亩)的病毒用量，推导每kg动物体重病毒用量为重组病毒在感染动物前均经甜菜夜蛾感染试验证明具有感染性。感染水生动物时，将病毒投入水中进行感染，连续5天，对其余动物则将病毒喷撒于饲料中感染，连续三天。

自感染后10～100日内逐日观察动物健康状况，测定体重，定期进行解剖，观察脏器变化，并采样制片电镜观察。

试验结果是：所有供试动物经重组病毒感染后体重均有增加，体态特征、

表7重组病毒感染家兔体重变化记录

家兔编号试验前体重健康状况感染病毒后体重变化(g)^*20天40天60天 2 1.47健康+170-- 5 1.36健康+120+240- 8 2.04健康+80+210+390 11 1.91健康+170+380+150对照 1.57健康+100+220+470

注：*：体重变化均为累加值，-：已解剖

活动与反应能力均表现正常，未出现任何疾病症状。取样活体解剖观察其心、肺、肝、胆、肾、胃、脾及肠道等脏器，其质地，色泽均为正常，无任何病变表现(表7和图17)。所有脏器经分别取样匀浆，电镜负染色观察未发现有病毒的毒粒、多角体颗粒或其他病毒样颗粒存在。

重组病毒对体外培养细胞的安全试验

供试病毒为实施例5构建的重组病毒vAcPhBcPE^-，HE6细胞(人胚肺细胞)、293细胞(人胚肾细胞)、家兔肾细胞、鸡胚细胞、Vero(猴肾细胞)、HeLa(人宫颈癌细胞)和3T3(鼠成纤维细胞)等细胞购于中国典型培养物保藏中心，按常规方法制备并培养成单层。

选择生长良好的单层细胞、Pocks液漂洗，然后分别定量接种不同稀释度(10⁰、10^-1、10^-2)的病毒液，同时设置正常细胞对照，37℃吸附1hr，换维持液35～37℃培养，逐日显微镜检，记录结果。

分别于24、48、72、96小时观察的结果表明，所有处理组细胞生长正常、均无细胞病变发生，细胞形态、生长状况与对照组无明显差异。经盲传后仍无任何细胞病变发生。

处理细胞超薄切片电镜观察亦未发现有病毒毒粒或多角体颗粒。

实施例10重组病毒的遗传稳定性

重组病毒在细胞中连续传代的遗传稳定性。

供试病毒为实施例5构建的重组病毒vAcPhBcPE^-，经碱解、获得重组病毒毒粒。

供试细胞为Sf-9细胞，传代培养至长成致密单层。

接种重组病毒于Sf-9单层细胞，待细胞发生病变后，收获重组病毒。

以人工合成的DNA序列GCGTCGACTATGGATAACAATCCGAACATC和GCGTCGACTTAAGGTACCTGATAGTGTGACG作引物，以PCR方法检测Bt cry1A(c)基因。

试验结果是：

重组病毒在Sf-9传代细胞中已传至69代，均能检测出外源毒素基因存在，结果表明重组病毒在细胞中传代遗传特性稳定。

重组病毒在虫体中连续传代的遗传稳定性

供试病毒为实施例5构建的重组病毒vAcPhBcPE^-；供试幼虫为甜菜夜蛾幼虫，饲养至3龄。

以重组病毒添食感染甜菜夜蛾3龄幼虫，感染3～5日后，收集感染致死的虫尸，分离、纯化重组病毒多角体。

以人工合成的DNA序列GCGTCGACTATGGATAACAATCCGAACATC和GCGTCGACTTAAGGTACCTGATAGTGTGACG作引物，以PCR方法检测Bt cry1A(c)基因。

试验结果是：

重组病毒在人工饲养的甜菜夜蛾幼虫中已传至47代，均能检测到靶标基因存在，结果表明重组病毒在甜菜夜蛾中遗传特性稳定。

重组病毒在自然环境中的遗传稳定性

受试物重组病毒杀虫剂来源于本发明实施例18；供试用幼虫为自然环境中的甜菜夜蛾、小菜蛾幼虫。

分别于1999年、2000年和2001年进行的重组病毒杀虫剂中间试验、环境释放试验后，收集试验区内菜地中病毒感染致死的虫尸，分离、纯化重组病毒多角体。

以人工合成的DNA序列GCGTCGACTATGGATAACAATCCGAACATC和GCGTCGACTTAAGGTACCTGATAGTGTGACG作引物，以PCR方法检测Bt cry1A(c)基因。

试验结果是：

1999年进行的重组病毒杀虫剂中间试验菜地、2000年和2001年分别进行的环境释放试验菜地所收集病毒感染致死虫尸分离的重组病毒中、均能检测到靶标基因存在。结果表明重组病毒在自然环境中遗传特性稳定。

实施例11  重组病毒杀虫剂的持效性

受试物重组病毒杀虫剂来源于本发明实施例16。

用常规施用浓度(10⁶PIB/mL)的重组病毒杀虫剂水悬浮液喷施在田间甘蓝作物上，设清水喷洒为对照，施药后当天、3天、6天、9天、12天分别取叶片在室内用2龄甜菜夜蛾幼虫进行生物测定，比较喷施后不同时间重组病毒杀虫剂的后效毒力。

通过室内生物测定，施用后当天、3天、6天、9天、12天后的叶片上的重组病毒，其对甜菜夜蛾的防治效果分别为89％、74％、58％、26％、7％。施用重组病毒杀虫剂后6天后，其防治效果还较好，说明它对外界环境(包括紫外线、雨露及风力等)有一定的抵抗能力(表8)。

表8外界环境对重组病毒杀虫剂防治效果的影响

施用后取叶样时间供试活虫数  (头)处理样死虫数  (头)对照样死虫数  (头)校正防效  (％)当天100 89 1 89 3天100 75 3 74 6天100 59 2 58 9天100 28 3 26 12天100 11 4 7

实施例12重组病毒小区试验

受试物重组病毒来源于本发明实施例5。

1998年8月本项目组向农业部农业生物基因工程安全委员会提出重组病毒杀虫剂中间试验申请，1998年12月12日获准在湖北省潜江市园林办事处袁桥村进行(农基安审字98B-02-02)。

试验时间：1999年7月20日-8月20日

试验地点：湖北省潜江市园林办事处袁桥村蔬菜科技示范园

供试作物：甘蓝

试验区面积：7.3亩，

处理设置：设重组病毒vAcPhBcPE^-(含cry1Ac)、重组病毒vAcPhBtTPE^-(含cry1Ab)、Bt、氯氰菊酯和清水对照五个处理。

施药方法：重组病毒杀虫剂按每亩用量稀释于45～50kg水中，搅拌均匀后用喷雾器喷施于叶片正反面至滴水为止。

统计方法：施药前调查害虫(甜菜夜蛾、小菜蛾)虫口基数，施药后第二天开始调查杀虫剂杀虫效果，按棋盘法5点取样，同时调查试验区与对照区的百株虫口密度。

试验结果是：至第九天，重组病毒vAcPhBcPE^-试验区百株虫口密度由315头降至58头，虫口降低率为83.0％，至相同时间，重组病毒vAcPhBtTPE^-试验区虫口降低率为76.7％，施Bt(浓度15000IU/mg、使用量为30g/亩)，虫口降低率为38.0％，施化学农药氯氰菊酯(常规用量)，虫口降低率为55％，水对照为0(表9)。

表9 7.3亩中间试验结果

vAcPhBcPE^-vAcPhBtTPE^-Bt氯氰菊酯水百株虫口基数315 373 230 140 250施药后 3天百株虫口数209 265 230 27 255虫口降低率(％)35.5 29.5 0 81 0 6天百株虫口数126 174 130 49 260虫口降低率(％)60.5 53.4 35.7 35 0 9天百株虫口数58 87 128 63 256虫口降低率(％)83.0 76.7 38.0 55 0

试验结果表明：施用重组病毒vAcPhBcPE^-的菜地害虫虫口密度低于施用重组病毒vAcPhBtTPE^-和施用苏云金杆菌(Bt)的菜地。与施化学农药氯氰菊酯菜地比较，杀虫速度虽不及氯氰菊酯，但是其长效性更好。

实施例13  重组病毒杀虫剂田间中试

受试物重组病毒杀虫剂来源于本发明实施例16。

根据本项目组承担的国家“863”中试项目“重组昆虫病毒杀虫剂中试研究”项目合同书工作进度安排，2000年元月向农业部农业生物基因工程安全委员会申请进行200亩的环境释放试验，2000年5月获得批准(农基安审字2000A-02-07)。2000年8月-9月，在湖北省潜江市园林办事处进行了重组病毒杀虫剂中试。

供试作物：甘蓝

试验区面积：200亩，

处理设置：设重组病毒vAcPhBcPE^-(含cry1Ac)杀虫剂和对照两个处理。

施药方法：重组病毒杀虫剂按每亩用量稀释于45～50kg水中，搅拌均匀后用喷雾器喷施于叶片正反面至滴水为止。

统计方法：施药前调查害虫(甜菜夜蛾、小菜蛾)虫口基数，施药后第二天开始调查杀虫剂杀虫效果，按棋盘法5点取样，同时调查试验区与对照区的百株虫口密度。

试验结果是(表10)：

表10潜江袁桥村蔬菜科技示范园200亩环境释放试验结果

重组病毒用  量施药后时间  (天)试验区对照区百株幼虫数虫口降低率百株幼虫数虫口增长率  (％)   600×10⁸ PIB/亩 0 3 4 5 6  7 8 9 10 168 61 47 31 24  15 10 8 6  63.7 72.0 81.5 85.7  91.0 94.0 96.4 95.0 162 412 419 426 434  443 449 467 469  254.3 258.6 263.0 268.0  273.5 277.2 288.3 299.5

(1)、使用了重组病毒杀虫剂的试验区施药后第3天虫口降低率达63.7％，第7天达91％，第9天达96.4％，而对照区虫口密度相应分别增长254.3％，273.5％，288.3％。由此可见本项目组所研制的重组病毒杀虫剂能有效地控制十字花科蔬菜的主要害虫甜菜夜蛾和小菜蛾的虫口密度，防治其对蔬菜的危害。

(2)、根据参与组织本次试验的协作单位潜江市人民政府蔬菜办公室统计，施用重组病毒杀虫剂的夏光甘蓝菜地共92.3亩，平均每亩2053.1kg，对照菜地13.2亩，平均亩产1644.5kg。施用重组病毒杀虫剂的菜地较对照地平均每亩增产24.8％。因使用病毒杀虫剂后蔬菜产量大幅度提高，从而产生较大的经济效益。

(3)、施用重组病毒杀虫剂的试验区蔬菜收获后已全部出售，未见任何消费者投诉，试验区蔬菜收获后种植的后茬作物生长良好，未见任何有害影响。

(4)、据田间观察，施用重组病毒杀虫剂的试验区内害虫天敌，如草蛉、瓢虫、蟾蜍、青蛙等数量较对照地要高，但因其密度较低，结果不具有统计学意义，故未予统计。

实施例14重组病毒杀虫剂的环境释放试验

受试物重组病毒杀虫剂来源于本发明实施例16。

经农业部农业生物基因工程安全委员会批准(农基安审字2001A-02-04)，2001年8月1日-10月15日本项目组在湖北省潜江市园林办事处的蔬菜基地进行了1000亩环境释放试验。

重组病毒杀虫剂对田间昆虫群落的影响：

选豇豆田和花菜田作为两种生态环境，各设三个处理：施用重组病毒杀虫剂、施化学农药、不施任何杀虫制剂。每处理按梅花型五点取样调查，每点调查20株，每处理共计调查100株。施药后第1天开始调查。豇豆：每7天调查一次，从初花期到终花期，共调查4次；花菜：每5天调查一次，共调查6次。调查记载蔬菜上害虫及天敌数量。

根据调查数据，计算比较不同处理下昆虫群落的特征：

①.群落多样性指数：表明群落的稳定性在受到扰动情况下的缓冲能力，即恢复到原有平衡状态的能力，值越大，越稳定，以此可判断施用重组病毒杀虫剂后，是否可以促进昆虫群落的稳定。

Shannon-wiener多样性指数H’＝-∑PiLnPi

Pi为群落中第i个物种的个体数占群落总个体数的比率。

②.群落丰富度：用群落的种类数S表示：LnS

③.群落均匀度：E＝H’/LnS

   均匀度越高、群落越稳定

④.群落相似系数：C＝2W/(a+b)

W＝两群落共同种的两个相对值中低值的总和，a＝第一群落中所有值的总和，b＝第二群落中所有值的总和，0≤C≤1，C值为0，表示两群落没有共同种，值为1表示两群落种群结构和数量都相同。以此比较分析两种处理后形成的群落的差异。

试验结果是：

豇豆田：调查结果见表11，施用重组病毒杀虫剂之后，田间昆虫群落多样性指数在逐渐提高(8月5日的第一次调查结果除外)，表明其结构和稳定性

表11昆虫群落多样性、丰富度、均匀度比较

地点作物日期处理S H’Ln(S)E莫市村豇豆 8/5 NPV9 0.9514 2.1972 0.433不施药12 1.9375 2.4849 0.7797化防9 1.9651 2.1972 0.8944 8/12 NPV6 0.6622 1.7918 0.3696不施药10 1.6723 2.3026 0.7263化防5 0.6401 1.6094 0.3977 8/19 NPV6 0.7704 1.7918 0.43不施药7 0.4884 1.9459 0.251化防5 1.2919 1.6094 0.8027 8/26 NPV5 1.2812 1.6094 0.7961不施药6 1.1986 1.7918 0.6689化防6 1.5087 1.7918 0.842袁桥村花菜 8/22 NPV6 1.5292 1.7918 0.8534不施药5 1.4811 1.6094 0.9203化防5 0.9905 1.6094 0.6154 8/27 NPV4 0.9254 1.3863 0.6675不施药6 1.381 1.7918 0.7707化防3 0.6316 1.0986 0.5749 9/1 NPV8 1.2007 2.0794 0.5774不施药6 0.9156 1.7918 0.511化防4 0.8349 1.3863 0.6023 9/6NPV6 1.485 1.7918 0.8288不施药6 1.2788 1.7918 0.7137化防4 1.0986 1.3863 0.7925 9/11NPV6 1.4322 1.7918 0.7993不施药5 1.374 1.6094 0.8537化防6 1.5487 1.7918 0.8643 9/16 NPV4 1.3387 1.3863 0.9657不施药4 1.3209 1.3863 0.9528化防3 1.0549 1.0986 0.9602在增强。但在四次的调查结果中，施重组病毒杀虫剂处理的H’值较其它两处理要低，其原因可能是：化学农药在杀死害虫的同时，也杀死了天敌，因此，计算出来的H’值较大；而施用重组病毒杀虫剂后，有利天敌种群增长，天敌较多，因此，H’较小。

施用重组病毒杀虫剂后，昆虫群落均匀度在逐渐提高(第一次调查除外)，但其每次的均匀度均低于其它两处理，这也是因为其天敌和中性昆虫较多，降低了均匀度。

前两次调查数据(表12)表明：施用重组病毒杀虫剂处理与不施药处理的昆虫群落相似性低于化学防治处理与不施药处理的相似性，这说明重组病毒杀虫剂处理前期，昆虫群落结构还没达到稳定。后两次调查结果表明，重组病毒杀虫剂处理与不施药处理的昆虫群落相似性高于化学防治处理与不施药处理的相似性，说明昆虫群落结构在逐步达到稳定。

花菜田：表11所示的六次调查中，重组病毒杀虫剂处理的H’比较稳定，而且重组病毒杀虫剂处理和不施药处理的H’较化学防治高，说明此两处理昆虫群落结构和稳定性较化学农药要强。与豇豆相比，花菜上的天敌种群比较均匀，没有明显的优势种群，因此，H’较高。

每次调查中，重组病毒杀虫剂处理和不施药处理的均匀度指数均大于化学防治处理，说明其昆虫种群分布较均匀，结构较稳定；化学防治处理虽杀死害虫，但天敌损伤更大，而害虫种群仍维持一定数量，因此，均匀性差。

表12所示的六次调查中，重组病毒杀虫剂处理与不施药处理的群落相似性总体上高于化学防治与不施药处理，但最后一次调查结果是前者低于后者，说明施药后期重组病毒杀虫剂对昆虫群落的控制效果在下降。

表12昆虫群落相似性比较

地点作物时间群落相似系数npv/no spray Chemical/no spray莫市村豇豆 8/5 0.31 0.55 8/12 0.30 0.48 8/19 0.54 0.11 8/26 0.34 0.26哀桥村花菜 8/22 0.69 0.40 8/27 0.63 0.65 9/1 0.38 0.15 9/6 0.60 0.72 9/11 0.70 0.53 9/17 0.59 0.77

重组病毒杀虫剂生态扩散研究：

时间扩散：试验期间，处理区只施用一次重组病毒杀虫剂，重组病毒杀虫剂用量为600×10⁸PIB/亩，使用时按每亩用量稀释于50kg水中，用喷雾器喷施叶片正反面至始滴水止。施用重组病毒杀虫剂前、后1天及此后每4天，在上述处理区内取叶样、虫样、土样和水样，以人工合成的DNA序列GCGTCGACTATGGATAACAATCCGAACATC                         和GCGTCGACTTAAGGTACCTGATAGTGTGACG作引物，用PCR检验样品是否带有重组病毒。

空间扩散：施用重组病毒杀虫剂后第8天和第22天，在上述处理区相邻田块，取叶样、虫样、土样和水样，以人工合成的DNA序列GCGTCGACTATGGATAACAATCCGAACATC                        和GCGTCGACTTAAGGTACCTGATAGTGTGACG作引物，用PCR检测是否带有重组病毒。

试验结果是：

在使用重组病毒杀虫剂之前1天，不能从任何样品中扩增出大小约2.92kb的靶标基因，使用重组病毒一天后能从叶样中扩增出该基因，说明本试验区环境中没有能影响PCR结果的杆状病毒存在。

叶样的PCR结果：在施重组病毒杀虫剂第1天、5天、9天的样品一直能扩增出靶标基因，但此后的样品不能扩增出靶标基因(图18)，说明重组病毒在叶片上可至少保留9天，由于是在野外自然环境，病毒停留的时间长短受天气、紫外线等各种因素的影响较大，一次施药能够保留9天已足可达到长久杀虫的目的。

虫样的PCR结果：在施重组病毒杀虫剂的第5天，虫样中已能在活虫体内扩增出靶标基因，说明病毒已在虫体内复制，并一直持续到第17天(图19)，说明使用一次病毒杀虫剂理论上可保持15天的杀虫效果，与叶样结果基本一致，这为施药的频率提供了参考。

土样和水样的PCR结果：在这两种样品中均未检测到靶标基因的存在。究其原因是因为叶面、土壤的吸收能力特别强，能吸附住本来就很微量的重组病毒，从而使得PCR很难检测到土壤中的病毒。同样，水源一般离菜地较远，即使有少量病毒扩散到周围的水环境中，由于水塘面积之大，亦很难检测出。因此，使用一次病毒杀虫剂尚不足以大量扩散到周围的水和土壤环境中。

重组病毒杀虫剂对蔬菜的增产效果

试验区面积1000亩，其中种植黄瓜129.6亩、豇豆71.4亩，甘蓝289.4亩、花菜398.9亩，同时设置不施重组病毒杀虫剂的对照地分别为6.0亩、7.2亩、5.6亩、4.2亩，对照地由农户自行进行害虫防治。试验区重组病毒杀虫剂按600×10⁸PIB/亩，用量稀释于50kg水中，喷雾器喷施蔬菜叶片正反面至始滴水止。第一次施药后每10天施药一次，共施药4次至蔬菜收获期。

试验结果是：

试验结果统计：试验区黄瓜总产量263919.1kg，平均单产2036.4kg/亩，较对照地1650kg/亩，增长23.4％；豇豆总产量141298.2kg，平均单产1981.7kg/亩，较对照地1730kg/亩，增长14.6％；甘蓝总产量469057.6kg，平均亩产1624.8kg/亩，较对照地1286.0kg/亩增长26.4％；花菜总产量392185.7kg，平均单产983.2kg/亩，较对照地862kg/亩增长14.1％。

从统计报告可看出，使用重组病毒杀虫剂的蔬菜每亩生产成本与对照地相差无几，但因其对害虫的危害有较好的保护效果，与对照地比较，蔬菜产量有较大幅度提高，达到增产增收的目的。

重组病毒杀虫剂对蔬菜品质的影响

试验在甘蓝地实施，设喷施重组病毒和喷施清水对照两个处理，蔬菜收获前，于两处理区内各取1份甘蓝菜样送农业部食品质量监督检验测试中心(武汉)检测。检测指标包括：碳水化合物、矿物质(Ca)、维生素(Vc)、氨基酸及蛋白质含量等。

试验结果是：

经检测分析，施重组病毒杀虫剂的试验区与施清水的对照区的两份甘蓝样品品质没有明显差异，前者的蛋白质、氨基酸和钙含量略高于后者，分别为1.72％和1.49％；1.07％和0.90％；422mg/kg和388mg/kg；而碳水化合物和维生素C含量略低于后者，分别为4.76％和5.10％；183.6mg/kg和231.9mg/kg。以上结果表明，施用重组病毒杀虫剂并不影响蔬菜品质。

实施例15重组病毒大规模生产工艺

生产条件与环境消毒：

生产条件基本与幼虫饲养条件一致，环境消毒采用福尔马林熏蒸，其他器具用高压蒸汽灭菌或碱浸泡。病毒生产的环境温度控制在24～28℃之间，湿度于70～80％。此外，病毒生产的光周期应与昆虫人工饲养的光周期保持一致，甜菜夜蛾的光周期为：光照16小时，黑暗8小时。重组病毒感染车间与幼虫养虫车间保持一定的距离，以避免养虫车间被病毒污染。

重组病毒感染液的制备与保藏：

选健康3～4龄甜菜夜蛾幼虫，置养虫盘中饥饿4～6小时，然后采用滴加法进行感染。于养虫盘的每孔中置1克左右的方形人工饲料，每块饲料上滴加0.2mL浓度为1×10⁶PIB/mL的病毒感染原液，待饲料稍干后放入饥饿的甜菜夜蛾幼虫，中途不再更换饲料，除非饲料发霉或被吃完。3天后开始收获感染死亡症状典型的虫尸，至第7天将所有具有感染死亡症状的虫尸收获完毕。将收获的虫尸加适量无菌水研磨成浆，4层纱布过滤。滤液经无菌水适当稀释后，500rpm离心10分钟，去除沉淀。取上清3000rpm离心10分钟，弃上清。沉淀稀释后再经2轮差速离心后即可得较纯净的重组病毒多角体。用无菌水稀释成合适的浓度(1×10⁹PIB/mL)，并加入适量抗菌素(50ug/mL)，即得到重组病毒感染原液，置4℃保存备用。

大规模感染与病毒的收获：

在饲料室中用饲料分装机在养虫盘的每孔中注加2克左右的人工饲料，使其恰好平铺于孔的底面。待饲料冷却后送入感染车间使用病毒滴加装置往每孔中滴加浓度为1×10⁶PIB/mL重组病毒原液5滴(约0.1mL)。待重组病毒液被饲料充分吸收后再在每孔中加入2头3～4龄甜菜夜蛾幼虫(不需饥饿，且因甜菜夜蛾可以群养，实践证明这样利用率最高，生产效益最好)。7～8天后收获所有的虫尸，并随机挑选100头虫尸，分离纯化病毒多角体，计算单头虫的重组病毒产量。试验测得单头虫重组病毒平均产量为11.4×10⁸PIB，如果按每孔2头虫产量计算，可以达到22.8×10⁸PIB/孔，产量已符合大规模生产的成本核算要求。收获的虫尸可进一步加工成重组病毒杀虫剂粉剂和乳剂。

实施例16重组病毒杀虫剂生产工艺

可湿性粉剂生产

收集的感染死虫虫尸磨浆后过80目筛。

过筛后的虫尸匀浆与填充剂云母粉混合吸水。

上述制备物再经自然干燥或冷冻真空干燥。

干燥后的制备物经气流粉碎机粉碎。

进振动筛过325目筛。

过筛后的多角体干粉，按重量百分比，加入3％的十二烷基苯磺酸钠、1％荧光素钠、10％的木质素磺酸钠在混合器中充分混匀，调整病毒多角体量为10⁹PIB/克。

称量分装、每包30克，含多角体300亿，即0.5亩地防治一次的用量。

水悬浮剂生产

收集的感染死虫虫尸加蒸馏水(1∶3)在高速匀浆机中匀浆3～5分钟。

按重量百分比，于匀浆中加入3％的白炭黑、1％的荧光素钠、0.4％苯甲酸钠、2％水溶性氮酮、6％茶皂素，经砂磨机研磨后过200目筛。

加入7％的拉开粉搅匀。

最后加入10％的甘油，用电动搅拌机搅拌20分钟。

分装，每包装5mL，内含多角体100亿，封口。

实施例17 重组病毒杀虫剂水悬浮剂质量控制标准及检测方法

产品有效成份：转苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因的重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒

产品生物活性：可在虫体或昆虫细胞内繁殖，有特异性的杀虫活性，是一种病毒杀虫剂。

产品理化性质：原药含有重组病毒多角体20亿PIB/mL、灰乳白色，略带粘性液体、无腐臭异味、不分层。

产品稳定性：在pH6～8低温条件下很稳定，50℃以下稳定。

1、范围

本标准规定了重组病毒杀虫剂水悬浮剂的质量要求、试验方法、检验规则以及标志、标签、包装、贮运。

本标准适用于以人工饲养甜菜夜蛾增殖转苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因的重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒，经离心提纯，加工配制而成重组病毒杀虫剂水悬浮剂。

2、引用标准

下列标准所包含的条文、通过在本标准中引用的条文所示版本均为有效，所有标准都会改订，使用本标准的各方面都应探讨使用下列标准最新版本的可能性。

GB/T 1250-89                  极限数值的表示方法和判定方法

GB/T 1601-93                  农药pH值测定

GB/T 1604-95                  商品农药验收规则

GB/T 1605-79(89)              商品农药采样方法

GB/T 3796-83                  农药包装通则

GB/T 14825-93                 农药可湿性粉剂悬浮率测定方法

GB/T 16150-93                 农药可湿性粉剂细度测定方法

3、要求

外观：灰乳白色、略带粘性液体；无腐臭异味、不分层。

重组多角体病毒杀虫剂水悬浮剂应符合表13要求。

表13重组病毒杀虫剂水悬浮剂控制项目指标

项目指标重组病毒PIB/mL          ≥20×10⁸pH值范围                ≥6.0～8.0悬浮率％                ≥80筛析(通过75μm试验筛)％ ≥95注：无沙门氏菌、志贺氏菌及霍乱孤菌不用抽检

4、试验方法

(1)抽样：按照GB/T1605中“乳油和液体状态的采样”方法进行，用随机数表法确定抽样的包装件，最终抽样数量一般应不少于250mL。

(2)鉴别试验：鉴别试验与定量测定同时进行。

(3)重组病毒的定量测定：重组病毒多角体经染色后，可与其他大小和形态相似的物质区分开来，因而可以很方便地对之进行鉴别并检测重组病毒杀虫剂中的多角体的数量。

试剂和溶液：无水乙醇；乙醇；冰乙醇；磷酸二氢钾(KH₂PO₄)；磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)；磷酸缓冲溶液：取磷酸二氢钾溶液72.0mL加磷酸氢二钠溶液28.0mL混合；Giemsa粉；Giemsa染色原液：480mL磷酸缓冲液加入20mL 95％乙醇，再加入0.4g Giemsa粉7％Giemsa染色液：取7mL Giemsa染色液加蒸馏水至100mL。

仪器：台式离心机：3000r/min；显微镜：2×A；分析天平：TG328A。

取100mL重组病毒杀虫剂水悬浮剂，加40mL蒸馏水混合均匀，3000r/min离心半小时，弃上清液。再加入40mL磷酸缓冲液悬浮沉淀，500r/min离心5分钟，除掉沉淀，再加入磷酸缓冲液，3000r/min离心半小时弃上清。最后加2mL磷酸缓冲液悬浮沉淀。

取0.5mL上述待测液，加入1mL 7％Giemsa染液混匀，染色30～40分钟，在血球计数板中置显微镜下观察多角体形态和大小，计算多角体包涵体(PIB)数目，数4角的4个大方格(每个大方格有16个小方格)，按下式计算：

允许差：二次平行测定结果平均最大相对偏差为2.33％。

(4)重组病毒的生物活性测定

试剂和溶液：磷酸缓冲液；苯甲酸钠；苯甲酸；琼脂；冰乙酸；甲醛。

仪器：搅拌器(0～1000rpm/min)；光照培养箱。

待测定的重组病毒杀虫剂样品与标准样品分别稀释为1×10⁴；1×10⁵；1×10⁶ 1×10⁷；1×10⁸五个浓度，另设一组蒸馏水对照。

人工饲料配方：大豆粉10g、大麦粉50g、醇母粉4g、Vc 0.5g、苯甲酸0.1g、苯甲酸钠0.3g、琼脂1.5g、酵母粉4g、蔗糖1g、冰乙酸1.3mL、加水至100mL。

重组病毒杀虫剂感染幼虫：首先将琼脂加65mL沸水溶化，除Vc外、其余者加36mL水拌匀，然后迅速将以上二者混合，再加Vc混合，均匀后趁热装入养虫杯中，每杯1g，每个浓度100杯。每杯于饲料表面加50uL重组病毒杀虫剂稀释液，放入3～4龄幼虫1头，置光照培养箱中，保持27±1℃，每天检查病毒感染死虫数，10天结束，计算各处理组死亡率及校正死亡率。

计算浓度对数数值—死亡率值回归方程，经显著性检验后，计算待测样品和标准样品LD₅₀。LD₅₀按常规数理统计方法计算，使宿主幼虫死亡50％所需的重组病毒杀虫剂产品剂量(LD₅₀)为一个活性单位，差异较大可重复一次。

允许差：二次平行测定结果相对偏差在20％之内。

(5)光稳定测定

精确量取重组病毒杀虫剂样品0.2mL，稀释成0.05亿PIB/mL悬液，取3mL悬液涂于直径9cm的培养皿中，依次采用0h、4h、16h、24h、40h自然日光曝晒，然后各培养皿中加入无菌水15mL洗涤至0.01亿PIB/mL处理悬液，按4.4方法进行生物测定，每个盛饲料养虫杯滴50μL杀虫剂悬液于饲料表面，放2～3龄幼虫一头。每个处理100杯，每天检查感染死虫数，至10天结束。设空白对照校正死亡率。

以不受阳光曝晒(0小时)的杀虫剂悬液生测结果代表杀虫剂的原始活性，用原活性残留率表示杀虫剂制剂的光稳定性(或持久性)。

二次平行相对误差不得大于10％。

(6)pH值测定：

按GB/T1601/93进行。

(7)悬浮率测定

仪器和试剂：量筒：25mL，带塞，0和250刻度间距离为20cm～25.1cm，25mL刻度与塞子底部之间的距离为4cm～6cm；吸液管：长30cm～40cm，内径0.5cm，末端内径为0.3cm，将其弯成U形，U形部分高为0.5cm～1.01cm，管口向上；秒表；恒温水浴锅；标准硬水：以碳酸钙计具有342ppm硬度，其配制方法按GB5451中标准硬水配制方法进行。

将重组病毒杀虫剂样品充分摇匀后，取100mL转移到250mL带塞量筒中，用标准硬水加到250mL。

将量筒放入30℃±1℃恒温水浴锅中，当悬浮液温度达到30℃时，将量筒盖好，拿起量筒先轻轻摇起沉淀物，然后有规律地以量筒中部为中心上下颠倒15个来回(约30s)，使呈均匀的悬浮液，量筒仍放入恒温水浴中，打开盖子，静置30min后，用吸液管以抽气法将量筒上部9/10的悬浮液抽出(在15s～30s内完成)。抽液过程中吸液管应依附筒壁随液面下降而下降，勿使下部沉淀搅动，量筒内剩下1/10部分，按4.3方法测定病毒多角体含量。根据下式计算病毒悬浮率(X)：

$>>X>>(>\%>)>>=>>>11.1>>(>10>C>->Q>)>>>C>>>s>$

式中：C---样品的病毒多角体含量：

      Q---留在量筒的25mL悬浮液的病毒多角体含量。

5、检验规则

应符合GB1604的有关规定，极限数值处理采用GB/T1250中规定方法。

6、标志、标签、包装、贮运

重组病毒杀虫剂水悬浮剂的标志、标签和包装应符合GB3796中的有关规定，并应有农药生产批准证书号和商标。

重组病毒杀虫剂水悬浮剂用塑料容器包装，每包装30mL。

根据用户要求或订货协议，可以采用其它形式的包装，但要符合GB3796中有关规定。

重组病毒杀虫剂水悬浮剂必须于避光干燥处保存，该产品不得与碱性农药混用，可与低毒化学农药混合使用。

贮运时严防潮湿和高温日晒。

安全：使用该产品时要戴上防护口罩和手套，注意安全。

有效期：在规定的贮运条件下，水悬浮剂从生产日起有效期≥18个月，生物活性在有效期内下降率应不大于12％。

SEQUENCE LISTING

<110>武汉大学

<120>重组核型多角体病毒及其制备方法和重组核型多角体病毒杀虫剂及其应用

<130>重组核型多角体病毒及其制备方法和重组核型多角体病毒杀虫剂及其应用

<160>3

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>2183

<212>DNA

<213>Bacillus thuringiensis

<400>1

 aggtacctga tagtgtgacg taattttctt taaatacgtc atcccctcct tggatggtaa

60

 tccctgtact tccgccccac ccacgttctg gttgcctatt aatgtctttc aaatttgaat

120

 cttggagtaa attgcgttca tcactgagtc gcttcgcatg tttgactttc tcggacaatt

180

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240

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300

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360

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480

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540

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720

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780

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840

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900 

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960

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1020

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1080

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1200

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1260

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1320

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1380

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1440

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1500

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1560

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1620

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1680

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1740

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1800

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1860

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1920

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1980

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2040

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2100

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2160

tgttcggatt gttatccata gta                             2183

<210>2

<211>30

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

gcgtcgacta tggataacaa tccgaacatc                              30

<210>3

<211>31

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

gcgtcgactt aaggtacctg atagtgtgac g                              31