具有一氧化氮合酶抑制剂作用的蝶啶衍生物

摘要

本发明涉及通式(I)所表述的蝶啶衍生物，为NO合成酶，特别是诱导型NO合成酶的抑制剂，用以制备预防和治疗体内由于NO水平升高而介导疾病的药物。

说明书

技术领域

本发明涉及到设计与合成具有控制体内一氧化氮自由基(NO·，简写为NO)过多产生的蝶啶衍生物，尤其是具有诱导型NO合成酶抑制剂作用的蝶啶衍生物，用以制备预防和治疗体内因NO水平升高而介导疾病的药物。

本项发明研究工作得到国家自然科学基金的资助(项目编号39870822)。

发明背景

NO是一个低分子量和具有疏水性质的生物活性分子，可以自由穿过细胞膜，作用于细胞内的靶分子，理论上NO可以到达细胞和组织内任何部位，故能在体内调控多种细胞功能和产生广泛的生物效应。NO是通过内源性的一氧化氮合酶(NO Synthase，简写为NOS)产生的，NOS以L-精氨酸(L-Arginine，简写为L-Arg)和分子氧为底物，催化L-Arg中的两个等价胍基氮之一，经氧化反应而生成NO和L-瓜氨酸(L-Citrulline，简写为L-Cit)。

至今三种结构独特的NOS异构酶已被分离、克隆和确定(参见：Foerstermann U，GathI，et al，Biochem Pharmacol，1995，50：1321-1332)，根据这三种NOS亚型来源于细胞或组织的不同和其表达方式而分别给予不同的命名，如集中于血管内皮细胞中的亚型称为内皮型NOS(endothelial NOS，eNOS或NOS-III)，它涉及到调节血管的紧张程度和抗血栓作用；存在于神经组织中的称为神经元型NOS(neuronal NOS，nNOS或NOS-I)，它涉及到神经调节等；这两种异构酶在细胞处于生理状态下即有表达，一般来说，它们是通过机体对Ca²⁺水平的控制而维持在低水平的持续表达状态，使含这两种酶的部位NO保持在低浓度下而发挥生理功能，故常又将eNOS和nNOS合称为结构型NOS(constitutive NOS，cNOS)。第三种异构酶即所谓的诱导型NOS(inducible NOS，iNOS或NOS-II)，它在巨噬细胞和许多暴露在细胞素下的细胞中表达，并且在对细胞毒素物质产生的早期免疫应答方面起到关键作用。一般认为iNOS在生理状态下不表达，不依赖于体内的Ca²⁺水平和调钙蛋白，重要的是它通过诱导后被合成，如败血症休克，感染性、免疫性疾病，以及细胞因子、内毒素等许多因素均诱导iNOS大量合成，一旦合成即大量地产生NO，导致NO在体内泛滥成灾，产生广泛的损害，故应用选择性NOS抑制剂来预防和抑制iNOS的合成，是具有重大的治疗前景。

至今，NOS抑制剂的研究已有近十年的历史，初期的NOS抑制剂主要是内源性底物L-Arg的类似物，结构修饰了的L-Arg。另外在生物化学水平上NOS的一些辅因子已经鉴明，它们包括：还原性尼克酰胺腺苷二核苷酸磷酸(NADPH)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、黄素单核苷酸(FMN)、血红素和四氢生物蝶呤(BH₄)。故除以上L-Arg型的NOS抑制剂外，NOS其它的结合位置也可被作为药理学上的靶点，如考虑干扰NOS还原酶区黄素辅酶的结合位点，有人开发了二亚苯基碘鎓(DPI)(参见以上Griffith OW，Gross SS的文章)和一些喹唑啉化合物(Fujisawa Pharm Co Ltd.，WO 970225，1997)；在NOS氧化酶区内，Griffith和Gross合成出不同类型的吲唑和咪唑作为配体结合到血红素辅基上，来达到抑制NOS的目的。

以上所述及的抑制剂，缺乏相当明显的对NOS异构酶的抑制选择性。

发明内容

BH₄虽是第一个被鉴定的NOS重要辅酶，它在NOS中的作用仍没完全阐明，但研究已表明：BH₄对NOS的稳定性有关，促进NOS达到最大催化活性，因此，BH₄与其NOS的结合区可作为理想的用于选择性的药理干预靶点。基于此思想，我们合成具有与BH₄相同母核(蝶啶)的一大批化合物，化合物的结构式可用分子式I表示，在蝶啶的4-和6-位用多种其它基团进行修饰，以这类化合物和BH₄竞争，结合到NOS的BH₄结合区中，改变NOS结构或电学性质，达到干扰或抑制NOS的活性目的。这些合成的化合物经用iNOS进行生物活性测试，发现这类蝶啶衍生物具有抑制NO产生的作用，可以用作处理NO体内升高而引发的疾病的治疗药物。

下述通式(I)表示的蝶啶化合物或其药学上可接受的盐：

R代表氢；羟基取代或无取代基的C₁-C₈直链或支链的烷基；C₁-C₈直链或支链的烷氧基；C₁-C₅直链或支链的烷基或烷氧基取代或无取代基的芳基；C₁-C₅直链或支链的烷基或烷氧基取代或无取代基的胺基；-NHC₆H₄COOR⁵或-N(CH₃)C₆H₄COOR⁵，R⁵为C₁-C₄直链或支链烷基；-NHC₆H₄COGlu或-N(CH₃)C₆H₄COGlu，Glu代表-NHCH(COOR⁷)CH₂CH₂COOR⁸，R⁷与R⁸相同或不同，各自独立地表示H、甲基或乙基；-NHC₆H₄COR⁶或-N(CH₃)C₆H₄COR⁶，R⁶为N^ω-取代精氨酸基、瓜氨酸基；

R¹代表H；苯基、C₁-C₅直链或支链的烷基；C₁-C₅直链或支链的烷氧基；羟基；氨基或C₁-C₂烷基取代氨基；

R²和R³相同或不同，各自独立地表示C₁-C₆直链或支链的烷基；苄基；R²和R³不同时为H；

R²为H或甲基时，R³代表三元～六元环烷基；-C₆H₄COGlu、-C₆H₄CH₂COGlu、-C₆H₄COGlu、-C₆H₄CH₂COGlu，Glu代表-NHCH(COOR⁷)CH₂CH₂COOR⁸，R⁷与R⁸相同或不同，各自独立地表示H、甲基或乙基；-C₆H₄COOR⁹R¹⁰、-C₆H₄CH₂COOR⁹R¹⁰、-C₆H₄COOR⁹R¹⁰、-C₆H₄CH₂COOR⁹R¹⁰，R⁹和R¹⁰相同或不同，各自独立地表示H、甲基、乙基；

或者NR²R³代表哌啶基、哌嗪基、甲基哌嗪或三元～五元脂肪环单或二胺基；

通式(I)不包括当NR²R³为N(CH₂CH₃)₂或六氢吡啶基时，R为C₆H₅或p-H₃COC₆H₄的化合物。

前述蝶啶化合物或其药学上可接受的盐，其中较好的是：

R代表氢、羟基单取代或无取代基的C₁-C₅直链或支链的烷基；苯基、对甲基苯基；对甲氧基苯基；-CH₂OH；(C₁-C₅)烷氧基；胺基；-NHC₆H₄COOR⁵或-N(CH₃)C₆H₄COOR⁵，R⁵为甲基、乙基、异丙基；-NHC₆H₄COGlu或-N(CH₃)C₆H₄COGlu，Glu代表-NHCH(COOR⁷)CH₂CH₂COOR⁸，R⁷与R⁸相同或不同，各自独立地表示H、甲基或乙基；NHC₆H₄COR⁶或N(CH₃)C₆H₄COR⁶，R⁶为N^ω-取代精氨酸基、瓜氨酸基；

R¹代表氢，甲基，乙基、羟基，甲氧基，氨基；

R²与R³相同，为甲基、乙基、丙基、苄基；R²代表H时，R³为乙基、异丙基、环丙基、-C₆H₄CO-谷氨酸二甲(或乙)酯，-C₆H₄CH₂CO-谷氨酸二甲(或乙)酯，-C₆H₄COOMe/Et，C₆H₄CH₂COOMe/Et；R²为甲基时，R³代表乙基、C₆H₄COGluMe₂/Et₂、C₆H₄CH₂COGluMe₂/Et₂、C₆H₄COOMe/Et、C₆H₄CH₂COOMe/Et；

或者NR²R³代表环丙胺基、环丁胺基、1，2-环丁二胺基。

前述蝶啶化合物或其药学上可接受的盐，其中更为合适的：R代表乙基、丙基、苯基、对甲基苯基、对甲氧基苯基、C₂-C₄烷氧基、NHCHCOOR⁵，R⁵为甲基、乙基；R¹代表氢、甲基、羟基。

由下述通式(II)表示的蝶啶化合物或其药学上可接受的盐在制备抑制诱导性一氧化氮合成酶药物中的应用，

R代表氢；羟基取代或无取代基的C₁-C₈直链或支链的烷基；C₁-C₈直链或支链的烷氧基；C₁-C₅直链或支链的烷基或烷氧基取代或无取代基的芳基；C₁-C₅直链或支链的烷基或烷氧基取代或无取代基的胺基；-NHC₆H₄COOR⁵或-N(CH₃)C₆H₄COOR⁵，R⁵为C₁-C₄直链或支链烷基；-NHC₆H₄COGlu或-N(CH₃)C₆H₄COGlu，Glu代表-NHCH(COOR⁷)CH₂CH₂COOR⁸，R⁷与R⁸相同或不同，各自独立地表示H、甲基或乙基；NHC₆H₄COR⁶或N(CH₃)C₆H₄COR⁶，R⁶为N^ω-取代精氨酸基、瓜氨酸基；

R¹代表H；C₁-C₅直链或支链的烷基；C₁-C₅直链或支链的烷氧基；羟基；氨基或C₁-C₂烷基取代氨基；

R²和R³相同或不同，各自独立地表示H；C₁-C₆直链或支链的烷基；苄基；

R²为H或甲基时，R³代表三元～六元环烷基；-C₆H₄COGlu、-C₆H₄CH₂COGlu、-C₆H₄COGlu、-C₆H₄CH₂COGlu，Glu代表-NHCH(COOR⁷)CH₂CH₂COOR⁸，R⁷与R⁸相同或不同，各自独立地表示H、甲基或乙基；-C₆H₄COOR⁹R¹⁰、-C₆H₄CH₂COOR⁹R¹⁰、-C₆H₄COOR⁹R¹⁰、-C₆H₄CH₂COOR⁹R¹⁰，R⁹和R¹⁰₃相同或不同，各自独立地表示H、甲基、乙基；

或者NR²R³代表哌啶基、哌嗪基、甲基哌嗪或三元～五元脂肪环单或双胺基。

所述通式(II)表示的蝶啶化合物或其药学上可接受的盐在制备抑制诱导性一氧化氮合成酶药物中的应用，是制备在败血性和/或出血性休克或用细胞毒素进行肿瘤化学治疗和肝硬化或肝萎缩和/或肝功能衰退时所引起的血压下降或/和止血障碍药物。更具体的应用，是制备预防和治疗炎症疾病药物；是制备预防和治疗异体器官和组织移植的排斥反应药物以及胰岛素依赖型糖尿病药物；是制备预防和治疗细胞毒素进行肿瘤的化学治疗、化学物质或药物以及慢性肝炎引发的多种肝损伤、肝功能衰退以及预防和治疗心肌梗塞损伤、病毒性心肌炎药物。所述的应用，是制备预防和治疗病毒性神经退化、变化疾病及痛觉过敏、癫痫、偏头痛药物。

药物组合物，其中含有治疗有效量的通式(I)表示的蝶啶化合物或其药学上可接受的盐，并含有常规药用载体。

              四氢生物蝶呤(BH₄)             蝶啶

本发明具有抑制iNOS的蝶啶化合物以通式II所表示：

其中，4-位为氨基或者是多种型式的胺基，取代胺基；

所述通式(II)化合物，其特征在于：

R＝H；烷基(如甲基，乙基，丙基等C₁-C₅的正烷基和异构烷基)；芳基(包括苯基、对甲基苯基、对甲氧基苯基等)；CH₂R⁴，这里R⁴＝H；OH；(C₁-C₅)烷氧基；有机胺基；NHC₆H₄COOR⁵或N(CH₃)C₆H₄COOR⁵，其中R⁵＝C₁-C₄烷基等；NHC₆H₄COGlu[注：Glu＝NHCH(COOH)CH₂CH₂COOH(谷氨酸)，这里羧酸中的H可被Me、Et取代，可分别表示为GluMe₂和GluEt₂]，N(CH₃)C₆H₄COGlu(Glu中的羧酸H可被Me、Et取代)；NHC₆H₄COR⁶或N(CH₃)C₆H₄COR⁶，这里R⁶为N^ω-取代精氨酸基、瓜氨酸基等氨基酸基。

R¹＝H，甲基，羟基，甲氧基，苯基，氨基等。

R²R³：(1)R²＝R³＝H，甲基，乙基，丙基，苄基等；

      (2)R²＝H，R³＝乙基，异丙基，环丙基等C₂-C₆直链、支链或环状烷基，

      C₆H₄COGluMe₂[或Et₂，GluMe₂或Et₂即为谷氨酸二甲(或乙)酯]，

      C₆H₄CH₂COGluMe₂/Et₂，C₆H₄COOMe/Et，C₆H₄CH₂COOMe/Et。

      (3)R²＝CH₃，R³＝乙基，C₆H₄COGluMe₂/Et₂，C₆H₄CH₂COGluMe₂/Et₂，

      C₆H₄COOMe/Et，C₆H₄CH₂COOMe/Et等。

或NR²R³：哌啶基，哌嗪基，甲基哌嗪等脂肪环胺；

所述通式(II)化合物，其特征在于：

以上所述及的烷基、烷氧基和胺基中的烷基可以是直链烷基，或是有侧链的烷基，或是环状烷基。在分子式中如果出现有立体异构体和互变异构体，则本发明中的化合物包括这些全部的互变异构体和立体异构体。

所述通式(II)化合物，其特征还在于：

对于R所代表的基团和原子，较优的有乙基、丙基，芳基中较优的有对甲基苯基、对甲氧基苯基，CH₂R⁴中R⁴优先代表(C₂-C₄)烷氧基、NHC₆H₄COOR⁵，R⁵优先基团为甲基、乙基。

对于R¹优先代表H、甲基、羟基。

本发明所用的通式II表示的化合物可以它们的中性形式，也可以和无机酸或有机酸加成形成相应的盐使用，对药物中所能用的酸包括有如：盐酸、溴化氢、萘二磺酸(1，5)、磷酸、硝酸、硫酸、草酸、酒石酸、乳酸、水杨酸、苯甲酸、甲酸、乙酸、丙酸、戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、丙二酸、丁二酸、庚二酸、己二酸、马来酸、苹果酸、氨基磺酸、苯丙酸、葡糖酸、抗坏血酸、异烟酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸，以及氨基酸等。通式I表示的化合物可和多摩尔的酸加成形成盐，这些多摩尔的酸可以是单一的也可以是组合的，这主要根据需要用相应的溶剂或稀释剂的情况来决定。这些加成的盐可通过阴离子交换而去除。对于通式II中含有酸性组分的化合物，也可和相应的无机或有机碱、或碱性氨基酸组成相应的盐，例如对于这些盐有碱金属的盐，特别有效的是钠、钾和铵盐，以及与有机胺和碱性氨基酸等组成相应的盐。

本发明所涉及的蝶啶衍生物和它们相应的盐类可和适合辅料(包括相应的医药上准许应用的赋形剂、粘合剂、缓释剂、稳定剂、香料、调味剂、色素等)做成片剂或胶囊口服，也可做成相应的针剂用于临床。

对本发明中的通式II型的化合物抑制iNOS活性的测定，根据已知的测定方法(参见：钟慈声，孙安阳主编：一氧化氮的生物医学，上海：上海医科大学出版社，1997，p.361-363，381-385)

因NO水平升高而引起的疾病和病症，主要包括病理性血压下降，例如败血症或出血性休克；用细胞毒素进行肿瘤的化学治疗、化学物质或药物以及慢性肝炎引发的多种肝损伤(即化学性，病毒性和免疫性肝损伤)，肝硬化或肝萎缩，和肝功能衰退；也包括进行性炎症，如类风湿性关节炎和溃疡性结肠炎，以及胰岛素依赖型糖尿病和器官移植排斥反应，以上这些疾病和病症可用本发明如通式I表示的化合物进行治疗和预防。

另外，下列一些疾病也与诱导产生的NO水平升高有关，可用本发明的通式I的化合物来预防和治疗，在心血管循环方面，如心肌梗塞损伤、病毒性感染引起的心肌炎；在神经和中枢神经方面，如病毒性神经退化(变性)疾病，以及痛觉过敏、癫痫、偏头痛等。总之，过量NO产生与许多疾病有关，iNOS的激活产生过多NO是重要的致病因素，研制iNOS选择抑制剂是十分必要的。

各种蝶啶衍生物广泛地存在生物体内，在生物体中起着多种功能，有代表性的如叶酸和生物蝶呤，它们在生物体中均以各自的四氢还原型而起作用，如四氢叶酸是体内一碳单位的供体，参与DNA和RNA的合成，对细胞分裂有促进作用；四氢生物蝶呤(BH₄)已发现它既是芳香氨基酸羟化酶的辅酶，对神经系统的细胞生长，神经递质的传导和相应疾病均有预防和治疗作用，BH₄又是被发现的第一个NOS辅酶，BH₄的这两种辅酶作用是完全不一致的。经iNOS和BH₄共结晶的X光衍射晶体结构分析，可以看到在iNOS的氧化酶区有一个带有血红素、L-Arg和Phe⁴⁷⁰、Ser¹¹²、Trp⁴⁵⁷等氨基酸所形成供嵌入BH₄的iNOS的蝶啶结合区，在这里BH₄分子中的N-3、O⁴、N-5、C₆侧链和血红素上的丙酸基、Arg³⁷⁵、Phe⁴⁷⁰、Ser¹¹²等有亲水或/和亲酯的相互作用(参见：Crane BR，et al，Science，1998，279：2121-2126)，BH₄的辅助作用主要是在iNOS发生催化作用的第一步，即L-Arg转变为N^ω-羟基-L-Arg(NHA)时，向血红素的丙酰基提供一个电子和BH₄的3，4-酰胺上的一个氢质子(参见：Crane BR，et al，Biochemistry，2000，39：4608-4621)。以BH₄为靶点，合成iNOS的抑制剂必须满足以下的可能性：(1)抑制剂应是蝶啶类衍生物，和BH₄是同类物，这样才有可能适应NOS中的蝶啶结合区的结构上的需求；(2)所合成的蝶啶衍生物可以是非还原型的蝶啶衍生物，并且在的蝶啶的4位和6位有较多的修饰取代基的变化，其作用与(1)一致，以发生与BH₄竞争和NOS结合，并且由于其无BH₄的辅助作用，以及它们的结构和电性变化，而使NOS失活。根据这两点一般通式为I的蝶啶衍生物都是在4位上为氨基衍生物的取代基，氧化还原或/和质子化作用不同于BH₄，故能成为iNOS抑制剂。

更进一步的机理在于，在细胞中BH₄的水平越高，iNOS的表达和作用越易发生(参见：Gross SS，Levi RJ，Biol Chem，1992，267：25722)。在生物体内有从头合成和补救两条途径来合成BH₄，而BH₄的从头合成的首要酶GTPCH1(GTP环水解酶1)和iNOS一样，其表达也受到内毒素或细胞因子的诱导，从而会增加细胞中的BH₄产生和水平升高；另外，iNOS二聚体的装配依赖于BH₄的作用，这进一步说明选择BH₄为靶点对抑制iNOS的重要性。

本发明通式I所表示的化合物是本次发明新合成的化合物，新合成的化合物均经过各种物理方法进行了结构鉴定，包括¹H-NMR、MS和元素分析。所有化合物都是按照或者参照已发表的方法进行合成。所有蝶啶化合物的合成方法包括有Gabriel-Isay或Taylor方法(参见：Brown DJ，ed：Fused Pyrimidine，Part III，Pteridine.；John Wiley Sons，NewYork，1988)，Taghari-Pfleiderer方法(参见：Taghari MS，Pfleiderder W，Tetrahedron Lett，1997，38：6835-6838)，少量化合物按照Traub方法(参见：Traub HM，Pfleiderder W，J Med Chem，1987，30：40-45)。

通式II化合物的合成有以下步骤：

1、2，5，6-三氨基-4-取代胺嘧啶(A)的合成

式中：NR²R³＝NH₂；N(CH₂CH₃)₂；HN(CH₂)₅；N(CH₂C₆H₅)₂；HNCH(CH₃)₂；

          N(CH₃)C₆H₄COOCH₃；HNC₆H₄COOC₂H₅；

          HNC₆H₄CONHCH(COOCH₃)CH₂CH₂COOCH₃；

          HNC₆H₄CONHCH(COOC₂H₅)CH₂CH₂COOC₂H₅；

          N(CH₃)C₆H₄CONHCH(COOC₂H₅)CH₂CH₂COOC₂H₅等。

首先将对氯苯胺重氮化，然后和2，6-二氨基-4-氯嘧啶结合生成2，6-二氨基-4-氯-5-对氯苯偶氮嘧啶，接着用胺取代氯，所得到的化合物用锌粉在酸性条件下还原偶氮基得化合物

(A)(嘧啶衍生物的合成方法参考：Froehlich L，Kotsonis P，Traub H，et al，J Med Chem，1999，42：4108-4121)。

2、取代酮肟的合成

2.1肟基丙酮(B)的合成

乙酰乙酸乙酯先在氢氧化钾的水溶液中水解脱去酯基，然后在活泼亚甲基上发生亚硝化反应，经脱二氧化碳，重排，得肟基丙酮(B)。

2.2 2-肟基苯乙酮(C)的合成

式中：R”＝H；CH₃；CH₃O等。

相应的取代苯乙酮在二氧六环和水的混合溶液中用二氧化硒氧化α-甲基得二羰基化合物，接着和丙酮肟反应，可选择性地得到化合物(C)。

3、对甲氨基苯甲酰谷氨酸二甲(或乙)酯(D)的合成

式中：R＝Me，Et。

化合物(D)的合成参考了肽类物质的合成，先用碳酸二叔丁酯保护对甲胺基苯甲酸的甲胺基，将谷氨酸的羧基成酯保护后，用DCC缩合到对甲胺基苯甲酸上，再以三氟醋酸酸解除去Boc基，可得化合物(D)，D用于部分A化合物的合成。

4、目的化合物的合成 

4.1.化合物5、9、14、30-32的合成

4.2.化合物4、6-8、10-13、15-28的合成

在4.1.和4.2.中，将2，5，6-三氨基-4-取代胺嘧啶(A)分别和取代肟B、C于甲醇中回流，可以区域选择性地得到6位取代的蝶啶化合物，因为嘧啶中间体A极易在空气中氧化，所以此反应需在氮气保护条件下进行。

实施例

1、化合物制备

2-氨基-4-[N-(对氨基苯甲酸乙酯)-基]-6-苯基蝶啶(6)

将0.68g(1.65mmol)化合物A(式中：NR²R³＝HNC₆H₄COOC₂H₅)加入到无水甲醇15mL中使之完全溶解，在氮气保护、搅拌、油浴回流条件下，滴加由苯肟(C，R”＝H)0.37g(2.48mmol)和6mL甲醇组成的溶液，回流反应4h，停止加热，冷却至室温后以氨水调pH值为7-8，有固体析出，放人冰箱过夜后过滤得粗品，经乙醚和乙醇混合液重结晶得0.22g橙黄色固体6，产率：34.6％，m.p.275～277℃.¹H-NMRδ：9.32(s，1H，7-H)，9.23(s，1H，4-NH)，8.13-7.97(m，6H，Ph-H)，7.55(m，3H，Ph-H)，6.06(bs，2H，2-NH₂)，4.39(q，J＝6.9Hz，2H，CH₂)，1.41(t，J＝6.9Hz，3H，CH₃).ESI-MS：387.2[M+H]⁺.Anal.Calcd for C₂₁H₁₈N₆O₂*H₂O(404.4)：C62.37，H4.98，N20.78；Found：C62.07，H5.20，N20.75.

2-氨基-4-[N-(对氨基苯甲酸乙酯)-基]-6-对甲基苯基蝶啶(7)

按照制备化合物6的方法，投入0.68g(1.65mmol)化合物A(式中：NR²R³＝HNC₆H₄COOC₂H₅)，对甲基苯肟(C，R”＝CH₃)0.40g(2.45mmol)，反应完毕，得0.21g黄色固体7，产率：31.7％，m.p.262～264℃.¹H-NMRδ：9.16(s，1H，7-H)，8.99(bs，1H，4-NH)，8.00(d，J＝7.3Hz，2H，Ph-H)，7.87(d，J＝4.6Hz，2H，Ph-H)，7.84(d，J＝7.3Hz，2H，Ph-H)，7.26(d，J＝4.6Hz，2H，Ph-H)，5.96(bs，2H，2-NH₂)，4.34(q，J＝7.0Hz，2H，CH₂)，2.94(s，3H，Ph-CH₃)1.38(t，J＝7.0Hz，3H，CH₃).ESI-MS：401.1[M+H]⁺.Anal.Calcd for C₂₂H₂₀N₆O₂*0.5HCl*0.5H₂O(427.68)：C61.78，H5.07，N19.65；Found：C61.29，H4.97，N19.83

2-氨基-4-[N-(对氨基苯甲酸乙酯)-基]-6-对甲氧基苯基蝶啶(8)

按照制备化合物6的方法，投入0.68g(1.65mmol)化合物A(式中：NR²R³＝HNC₆H₄COOC₂H₅)，对甲氧基苯肟(C，R”＝CH₃O)0.44g(2.45mmol)，反应完毕，得0.23g黄色固体8，产率：33.5％，m.p.263～265℃.¹H-NMRδ：9.24(s，1H，7-H)，9.11(bs，1H，4-NH)，8.07(m，2H，Ph-H)，7.98(m，4H，Ph-H)，7.05(m，2H，Ph-H)，5.60(bs，2H，2-NH₂)，4.37(q，J＝7.0Hz，2H，CH₂)，3.89(s，3H，Ph-CH₃)1.40(t，J＝7.0Hz，3H，CH₃).ESI-MS：417.3[M+H]⁺.Anal.Calcd for C₂₂H₂₀N₆O₃*0.5HCl(434.69)：C60.83，H4.75，N19.33；Found：C60.43，H4.60，N19.43.

2-氨基-4-[N-(对甲氨基苯甲酸甲酯)-基]-6-甲基蝶啶(9)

按照制备化合物6的方法，投入0.71g(1.73mmol)化合物A(式中：NR²R³＝N(CH₃)C₆H₄COOCH₃)，甲肟(B)0.23g(2.67mmol)，回流反应5h，蒸去甲醇，残留物经硅胶柱层析[氯仿∶甲醇＝20∶1]得粗品，经乙醚和乙醇混合液重结晶得0.20g浅黄色固体9，产率：35.6％，m.p.264～266℃.¹H-NMRδ：8.45(s，1H，7-H)，8.20(d，J＝8.6Hz，2H，Ph-H)，7.21(d，J＝8.6Hz，2H，Ph-H)，5.65(bs，2H，2-NH₂)，3.93(s，3H，O-CH₃)，3.67(s，3H，N-CH₃)，2.09(s，3H，CH₃).ESI-MS：325.1[M+H]⁺.Anal.Calcd for C₁₆H₁₆N₆O₂(324.3)：C59.25，H4.97，N25.91；Found：C58.93，H4.75，N25.94.

2-氨基-4-[N-(对甲氨基苯甲酸甲酯)-基]-6-苯基蝶啶(10)

按照制备化合物6的方法，投入0.71g(1.73mmol)化合物A(式中：NR²R³＝N(CH₃)C₆H₄COOCH₃)，苯肟(C，R”＝H)0.40g(2.67mmol)，反应完毕，蒸去甲醇，残留物经硅胶柱层析[氯仿∶甲醇＝20∶1]得粗品，经乙醚和乙醇混合液重结晶得0.25g浅黄色固体10，产率：37.4％，m.p.268～270℃.¹H-NMRδ：9.10(s，1H，7-H)，8.11(d，J＝8.0Hz，2H，Ph-H)，7.56～7.16(m，7H，Ph-H)，5.36(bs，2H，2-NH₂)，3.96(s，3H，O-CH₃)，3.68(s，3H，N-CH₃)。ESI-MS：387.2[M+H]⁺。Anal.Calcd for C₂₁H₁₈N₆O₂(386.41)：C65.27，H4.69，N21.75；Found：C65.17，H4.51，N22.12.

2-氨基-4-[N-(对甲氨基苯甲酸甲酯)-基]-6-对甲基苯基蝶啶(11)

按照制备化合物6的方法，投入0.71g(1.73mmol)化合物A(式中：NR²R³＝N(CH₃)C₆H₄COOCH₃)，对甲基苯肟(C，R”＝CH₃)0.44g(2.67mmol)，反应完毕，得0.35g褐黄色固体11，产率：50.4％，m.p.273～275℃.¹H-NMRδ：9.08(s，1H，7-H)，8.11(d，J＝8.0Hz，2H，Ph-H)，8.03(d，J＝7.5Hz，2H，Ph-H)，7.37(d，J＝7.5Hz，2H，Ph-H)，7.23(d，J＝8.0Hz，2H，Ph-H)，5.41(bs，2H，2-NH₂)，3.97(s，3H，O-CH₃)3.68(s，3H，N-CH₃)2.45(s，3H，CH₃).ESI-MS：401.2[M+H]⁺.Anal.Calcd for C₂₂H₂₀N₆O₂(400.40)：C65.99，H5.03，N21.01；Found：C65.54，H4.74，N21.29.

2-氨基-4-[N-(对甲氨基苯甲酸甲酯)-基]-6-对甲氧基苯基蝶啶(12)

按照制备化合物6的方法，投入0.44(1.06mmol)化合物A(式中：NR²R³＝N(CH₃)C₆H₄COOCH₃)，对甲氧基苯肟(C，R”＝CH₃O)2.00g(1.12mmol)，反应完毕，得0.15g黄色固体12，产率：33.9％，m.p.240～242℃.¹H-NMRδ：9.06(s，1H，7-H)，8.12(d，J＝8.4Hz，2H，Ph-H)，7.31(d，J＝7.5Hz，2H，Ph-H)，7.16(d，J＝8.4Hz，2H，Ph-H)，6.75(d，J＝7.5Hz，2H，Ph-H)，5.66(bs，2H，2-NH₂)，3.96(s，3H，O-CH₃)，3.87(s，3H，O-CH₃)3.70(s，3H，N-CH₃).ESI-MS：417.1[M+H]⁺，439.1[M+Na]⁺.Anal.Calcd forC₂₂H₂₀N₆O₃(416.41)：C63.45，H4.87，N20.18；Found：C63.53，H4.44，N20.13.

2-氨基-4-[N-(对甲氨基苯甲酰谷氨酸酸二乙酯)-基]-6-对甲氧基苯基蝶啶(13)

按照制备化合物6的方法，加入0.93g(1.6mmol)化合物A(式中：NR²R³＝N(CH₃)C₆H₄CONHCH(COOEt)CH₂CH₂COOEt)和0.47g甲氧基苯肟(C，R”＝CH₃O，2.6mmol)，反应毕，所得粗品用硅胶柱层析[氯仿∶甲醇＝19∶1]，得0.42g纯产品13，产率：44.7％，m.p.193～195℃.¹H-NMR δ：8.99(s，1H，7-H)，8.02(d，J＝6.5Hz，2H，Ph-H)，7.56(bs，2H，2-NH₂)，7.32(d，J＝7.3Hz，2H，Ph-H)，7.01(d，J＝6.5Hz，2H，Ph-H)，6.92(d，J＝7.3Hz，2H，Ph-H)，6.71(bm，1H，NH-Glu)，4.79(m，1H，CH-Glu)，4.20～4.40(m，4H，2CH₂)，3.68(s，3H，O-CH₃)，3.65(s，3H，N-CH₃)，2.53(m，2H，CH₂-Glu)，2.35-2.31(m，2H，CH₂-Glu)，1.28(t，J＝7.0Hz，3H，CH₃)，1.20(t，J＝7.0Hz，3H，CH₃).ESI-MS：588.2[M+H]⁺，586.3[M-H]⁺.Anal.Calcd for C₃₀H₃₃N₇O₆(587.3)：C61.30，H5.66，N16.69；Found：C61.20，H5.40，N16.79

2-氨基-4-[N-(对氨基苯甲酰谷氨酸酸二甲酯)-基]-6-甲基蝶啶(14)

按照制备化合物6的方法，加入1.42g(2.35mmol)化合物A(式中：NR²R³＝HNC₆H₄CONHCH(COOCH₃)CH₂CH₂COOCH₃)和0.42g甲基肟(B，4.83mmol)，反应毕，所得粗品用硅胶柱层析[氯仿∶甲醇＝19∶1]，得0.24g纯产品14，产率：22,5％，m.p.200～202℃.¹H-NMR δ：9.02(s，1H，7-H)，8.67(s，1H，4-NH)，7.93(d，J＝8,4Hz，2H，Ph-H)，7.84(d，J＝8,4Hz，2H，Ph-H)，7.19(bs，1H，NH-Glu)，5.71(bs，2H，2-NH₂)，4.81(m，1H，CH-Glu)，3.79(s，3H，O-CH₃)，3.66(s，3H，O-CH₃)，2.67(s，3H，Ph-CH₃)，2.57(m，2H，CH₂-Glu)，2.19(m，2H，CH₂-Glu).ESI-MS：454.1[M+H]⁺.Anal.Calcd for C₂₁H₂₃N₇O₅(453.5)：C55.62，H5.11，N21.62；Found：C55.61，H5.08，N21.40.2-氨基-4-[N-(对氨基苯甲酰谷氨酸酸二乙酯)-基]-6-对甲基苯基蝶啶(15)

按照制备化合物6的方法，加入1.12g(1.85mmol)化合物A(式中：NR²R³＝HNC₆H₄CONHCH(COOEt)CH₂CH₂COOEt)和0.31g甲基苯肟(C，R”＝CH₃，1.90mmol)，反应毕，所得粗品用硅胶柱层析[氯仿∶甲醇＝19∶1]，得0.31g纯产品.15，产率：30％，m.p.235～237℃.¹H-NMRδ：9.19(s，1H，7-H)，9.05(bs，1H，4-NH)，7.90(m，6H，Ph-H)，7.30(m，3H，Ph-H，NH-Glu)，5.88(bs，2H，2-NH₂)，4.79(m，1H，CH-Glu)，4.25(q，J＝7.0Hz，2H，CH₂)，4.12(q，J＝7.0Hz，2H，CH₂)，2.53(m，2H，CH₂-Glu)，2.41(s，3H，Ph-CH₃)，2.20-2.15(m，2H，CH₂-Glu)，1.31(t，J＝7.0Hz，3H，CH₃)，1.23(t，J＝7.0Hz，3H，CH₃).ESI-MS：558.3[M+H]⁺.Anal.Calcd for C₂₉H₃₁N₇O₅(557.6)：C62.46，H5.60，N17.58；Found：C62.06，H5.59，N17.52.

2-氨基-4-[N-(对氨基苯甲酰谷氨酸酸二乙酯)-基]-6-对甲基苯基蝶啶(16)

按照制备化合物6的方法，加入1.12g(1.85mmol)化合物A(式中：NR²R³＝HNC₆H₄CONHCH(COOEt)CH₂CH₂COOEt)和0.34g甲氧基苯肟(C，R”＝CH₃O，1.90mmol)，反应毕，所得粗品用硅胶柱层析[氯仿∶甲醇＝19∶1]，得0.42g纯产品16，产率：39.6％，m.p.237～239℃.¹H-NMR δ：9.12(s，1H，7-H)，9.79(bs，1H，4-NH)，7.94(m，6H，Ph-H)，7.45(m，2H，Ph-H)，7.21(bm，1H，NH-Glu)，6.50(bs，2H，2-NH₂)，4.73(m，1H，CH-Glu)，4.24(q，J＝7.0Hz，2H，CH₂)，4.12(q，J＝7.0Hz，2H，CH₂)，3.71(s，3H，Ph-CH₃)，2.48(m，2H，CH₂-Glu)，2.20-2.15(m，2H，CH₂-Glu)，1.30(t，J＝7.0Hz，3H，CH₃)，1.23(t，J＝7.0Hz，3H，CH₃).ESI-MS：574.2[M+H]⁺.Anal.Calcdfor C₂₉H₃₁N₇O₆(573.6)：C60.72，H5.45，N17.09；Found：C60.53，H5.51，N17.27.

2-氨基-4-二乙胺基-6-甲基蝶啶(30)

将3.1mmol化合物A[式中：NR²R³＝N(CH₂CH₃)₂]加入到无水甲醇15mL中，使之完全溶解，在氮气保护、搅拌、油浴回流条件下，滴加以6mL甲醇和0.41g甲基肟(B，4.7mmol)组成的溶液，回流5h，反应完毕，蒸去甲醇，用硅胶柱层析[氯仿∶甲醇＝19∶1]，得到0.2g黄色固体30，产率：27.8％，m.p.211～213℃.¹H-NMRδ：8.51(s，1H，7-H)，5.11(bs，2H，2-NH₂)，3.95(q，J＝6.9Hz，4H，2CH₂)2.54(s，1H，6-CH₃)，1.27(t，J＝6.9Hz，6H，2CH₃).ESI-MS：233.2[M+H]⁺.Anal.Calcd for C₁₁H₁₆N₆(232.29)：C56.88，H6.94，N36.18；Found：C56.94，H7.01，N36.14.

2-氨基-4-二乙胺基-6-苯基蝶啶(17)

按照制备化合物30的方法，投入3.13mmol化合物A[式中：NR²R³＝N(CH₂CH₃)₂]和0.69g(4.66mmol)苯肟(C，R”＝H)，得0.53g黄色固体17，产率：57.8％，m.p.209～211℃，熔点与其它物理数据和文献：Froehlich L，Kotsonis P，Traub H，et al，J Med Chem，1999，42：4108-4121中一致。

2-氨基-4-二乙胺基-6-对甲基苯基蝶啶(18)

按照制备化合物30的方法，投入3.13mmol化合物A[式中：NR²R³＝N(CH₂CH₃)₂]和0.76g(4.66mmol)对甲基苯肟(C，R”＝CH₃)，得0.41g黄色固体18，产率：42.5％，m.p.236～238℃.¹H-NMRδ：9.11(s，1H，7-H)，7.84(d，J＝8.4Hz，2H，Ph-H)，7.29(d，J＝8.4Hz，2H，Ph-H)，5.19(bs，2H，2-NH₂)，4.00(m，4H，2CH₂)，2.40(s，3H，Ph-CH₃)，1.36(m，6H，2CH₃).ESI-MS：639.2[2M+Na]⁺，331.1[M+Na]⁺.Anal.Calcd for C₁₇H₂₀N₆(308.38)：C66.21，H6.54，N27.25；Found：C66.17，H6.55，N27.51.

2-氨基-4-二乙胺基-6-对甲氧基苯基蝶啶(19)

按照制备化合物30的方法，投入3.13mmol化合物A[式中：NR²R³＝N(CH₂CH₃)₂]和0.84g(4.66mmol)对甲氧基苯肟(C，R”＝CH₃O)，得0.57g黄色固体19，产率：56.4％，m.p.220～222℃，熔点与其它物理数据和文献：Froehlich L，Kotsonis P，Traub H，et al，J Med Chem，1999，42：4108-4121中一致。

2-氨基-4-哌啶基-6-苯基蝶啶(20)

按照制备化合物30的方法，投入3mmol化合物A[式中：NR²R³＝HN(CH₂)₅]和0.67g(4.5mmol)苯肟(C，R”＝H)，得到0.42g黄色固体20，产率：45.9％，m.p.210～212℃，熔点与其它物理数据和文献：Froehlich L，Kotsonis P，Traub H，et al，J Med Chem，1999，42：4108-4121中一致。

2-氨基-4-哌啶基-6-对甲基苯基蝶啶(21)

按照制备化合物30的方法，投入2.3mmol化合物A[式中：NR²R³＝HN(CH₂)₅]和0.56g(3.45mmol)对甲基苯肟(C，R”＝CH₃)，得到0.58g黄色固体21，产率：78.8％，m.p.210～212℃。¹H-NMRδ：9.13(s，1H，7-H)，7.88(d，J＝8.1Hz，2H，Ph-H)，7.29(d，J＝8.1Hz，2H，Ph-H)，5.09(bs，2H，2-NH₂)，4.35(m，4H，2CH₂)，2.42(s，3H，CH₃)，1.79(s，6H，3CH₂).ESI-MS：663.3[2M+Na]⁺，343.1[M+Na]⁺.Anal.Calcd for C₁₈H₂₀N₆(320.40)：C67.48，H6.29，N26.23；Found：C67.15，H6.27，N26.56.

2-氨基-4-哌啶基-6-对甲氧基苯基蝶啶(22)

按照制备化合物30的方法，投入2.3mmol化合物A[式中：NR²R³＝HN(CH₂)₅]和0.61g(3.45mmol)对甲氧基苯肟(C，R”＝CH₃O)，得到0.32g黄色固体22，产率：41.6％，m.p.211～213℃，熔点与其它物理数据和文献：Froehlich L，Kotsonis P，Traub H，et al，J Med Chem，1999，42：4108-4121中一致。

2-氨基-4-二苄胺基-6-甲基蝶啶(31)

按照制备化合物30的方法，投入2.25mmol化合物A[式中：NR²R³＝N(CH₂C₆H₅)₂]和0.3g(3.37mmol)甲基肟(B)，反应完毕，蒸去甲醇，用硅胶柱层析[氯仿∶甲醇＝19∶1]，得到0.12g黄色固体31，产率：15.0％，m.p.216～218℃。¹H-NMRδ：8.51(s，1H，7-H)，7.34-7.27(m，10H，2Ph-H)，5.62(s，2H，CH₂)，5.26(bs，2H，2-NH₂)，5.11(s，2H，CH₂)，2.36(s，3H，6-CH₃).ESI-MS：357.2[M+H]⁺.Anal.Calcd for C₂₁H₂₀N₆(356.43)：C70.77，H5.66，N23.58；Found：C70.44，H5.61，N23.76.

2-氨基-4-二苄胺基-6-苯基蝶啶(23)

按照制备化合物30的方法，投入2.25mmol化合物A[式中：NR²R³＝N(CH₂C₆H₅)₂]和0.5g(3.37mmol)苯肟(C，R”＝H)，得0.47g黄色固体23，产率：49.9％，m.p.225～227℃，熔点与其它物理数据和文献：Froehlich L，Kotsonis P，Traub H，et al，J Med Chem，1999，42：4108-4121中一致。

2-氨基-4-二苄胺基-6-对甲基苯基蝶啶(24)

按照制备化合物30的方法，投入2.25mmol化合物A[式中：NR²R³＝N(CH₂C₆H₅)₂]和0.55g(3.37mmol)对甲基苯肟(C，R”＝CH₃)，得0.80g黄色固体24，产率：82.3％，m.p.284～286℃.¹H-NMR(DMSO-d₆)δ：9.11(s，1H，7-H)，7.54-7.31(m，14H，3Ph-H)，7.07(bs，2H，2-NH₂)，5.68(s，2H，CH₂)，4.79(s，2H，CH₂)，2.31(s，3H，Ph-CH₃).ESI-MS：433.3[M+H]⁺.Anal Calcd for C₂₇H₂₄N₆.1.5HCl(487.22)：C66.56，H5.28，N17.25；Found：C66.47，H5.18，N17.11.

2-氨基-4-二苄胺基-6-对甲氧基苯基蝶啶(25)

按照制备化合物30的方法，投入2.25mmol化合物A[式中：NR²R³＝N(CH₂C₆H₅)₂]和0.6g(3.37mmol)对甲氧基苯肟(C，R”＝CH₃O)，得0.31g黄色固体25，产率：30.8％，m.p.245～247℃，熔点与其它物理数据和文献：Froehlich L，Kotsonis P，Traub H，et al，JMed Chem，1999，42：4108-4121中一致。

2-氨基-4-异丙胺基-6-甲基蝶啶(33)

按照制备化合物30的方法，投入3.5mmol化合物A[式中：NR²R³＝HNCH(CH₃)₂]和0.46g(4.50mmol)甲基肟(B)，反应完毕，蒸去甲醇，用硅胶柱层析[氯仿∶甲醇＝19∶1]，得到0.30g黄色固体32，产率：39.3％，m.p.220～222℃.¹H-NMRδ：8.59(s，1H，7-H)，6.78(bm，1H，4-NH)，5.35(bs，2H，2-NH₂)，4.38(m，1H，CH)，2.57(s，3H，6-CH₃)，1.31(m，6H，2CH₃).ESI-MS：219.1[M+H]⁺，C₁₀H₁₄N₆.(MW：218.1).Anal.Calcd forC₁₀H₁₄N₆·1/4CH₃OH(226.27)：C54.44，H6.68，N37.14；Found：C54.93，H6.64，N37.13.

2-氨基-4-异丙胺基-6-苯基蝶啶(26)

将3mmol化合物A[式中：NR²R³＝HNCH(CH₃)₂]加入到无水甲醇15mL中，使之完全溶解，在氮气保护、搅拌、油浴回流条件下，滴加由6mL甲醇和0.67g(4.5mmol)苯肟(C，R”＝H)组成的溶液，回流反应5h，停止加热，有黄色固体析出，以调节pH至9，在冰箱中放置过夜，过滤，用乙醇重结晶，得0.42g黄色固体26，产率：62.3％，m.p.＞300℃(dec.).¹H-NMRδ：9.23(s，1H，7-H)，8.02(m，2H，Ph-H)，7.59(m，3H，Ph-H)，7.52(m，1H，4-NH)，6.22(bs，2H，2-NH₂)，4.56(m，1H，CH)，1.42(d，J＝6.5Hz，6H，2CH₃).ESI-MS：281.1[M+H]⁺，C₁₅H₁₆N₆.(MW：280.3).Anal.Calcd for C₁₅H₁₆N₆·1/4C₂H₅OH·2H₂O(327.88)：C56.80，H6.60，N25.63；Found：C57.26，H6.20，N25.33.

2-氨基-4-异丙胺基-6-对甲基苯基蝶啶(27)

按照制备化合物26的方法，投入3mmol化合物A[式中：NR²R³＝HNCH(CH₃)₂]和0.73g(4.50mmol)对甲基苯肟(C，R”＝CH₃)，得0.55g黄色固体27，产率：62.4％，m.p.318～320℃(dec.).¹H-NMRδ：9.19(s，1H，7-H)，7.91(d，J＝8.1Hz，2H，Ph-H)，7.51(bm，1H，4-NH)，7.39(d，J＝8.1Hz，2H，Ph-H)，5.91(bs，2H，2-NH₂)，4.55(m，1H，CH)，4.01(s，3H，Ph-CH₃)，1.42(d，J＝6.5Hz，6H，2CH₃).ESI-MS：295.1[M+H]⁺，C₁₆H₁₈N₆.(MW：294.4).Anal.Calcd for C₁₆H₁₈N₆·H₂O(312.37)：C61.52，H6.45，N26.90；Found：C61.07，H6.09，N27.15.

2-氨基-4-异丙胺基-6-对甲氧基苯基蝶啶(28)

按照制备化合物26的方法，投入3mmol化合物A[式中：NR²R³＝HNCH(CH₃)₂]和0.80g(4.50mmol)对甲氧基苯肟(C，R”＝CH₃O)，得0.31g黄色固体28，产率：33.3％，m.p.298～300℃.¹H-NMR δ：9.17(s，1H，7-H)，7.97(d，J＝8.8Hz，2H，Ph-H)，7.48(bm，1H，4-NH)，7.39(d，J＝8.8Hz，2H，Ph-H)，5.91(bs，2H，2-NH₂)，4.55(m，1H，CH)，3.91(s，3H，O-CH₃)，1.42(d，J＝6.5Hz，6H，2CH₃).ESI-MS：311.1[M+H]⁺，C₁₆H₁₈N₆O.(MW：310.3).Anal.Calcd for C₁₆H₁₈N₆O.HCl.1/2CH₃OH(362.84)：C54.62，H5.97，N23.16；Found：C54.18，H5.98，N22.78.

2、生物活性测定

(1)蝶啶衍生物抑制诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的抑制百分率和相应的ID₅₀测定

a、测定原理与基本方法：利用诱导型一氧化氮合酶催化NO生成时必需辅助因子四氢生物蝶呤(BH₄)的原理，在体外固定了反应中iNOS和BH₄的浓度，加入不同的药物(即蝶啶衍生物)，测定一氧化氮(NO)的生成量，算出抑制百分率。用同样的方法测定不同药物浓度对反应的抑制率，用回归方法计算出ID₅₀。

合成的通式I部分蝶啶衍生物，以及由浙江台州康多利药业公司提供的MTX(1)和AMT(氨基蝶呤，29)计29个，临用前用双蒸水溶解，部分药物溶解度低时，加入0.1M HCl溶解后，用1M NaOH调至pH值为7左右备用。

诱导型一氧化氮合酶 Inducible Nitric Oxide Synthase；Recombinant enzymeexpressed in E.Coli；130KDa/subunit.homodimer；100,000xg supematant由Cayman chemical

公司提供

四氢生物蝶呤 MW＝314.2，纯度＞99％由Cayman chemical公司提供

一氧化氮合酶试剂盒  由南京建成生物工程研究所提供

药物体外抑制诱导型一氧化氮合酶百分率的测定(参见：钟慈声，孙安阳主编：一氧化氮的生物医学，上海医科大学出版社，1997，p.28-30.361-363，381-385)

在一氧化氮合酶试剂盒的1号试剂中不加入四氢生物蝶呤(BH₄)，按试剂盒方法分别在其它试管中加入试剂1、试剂2、试剂3、iNOS样品、BH₄、受试药物后混匀，37℃水浴准确反应20分钟，加入试剂4终止反应，再加入终止液后混匀，530nm处，1cm光径，蒸馏水调零，比色测定吸光值。

测定BH₄的饱和浓度  按照试剂盒方法按步骤加入试剂，各试管中分别加入不同浓度的BH₄，测定各管吸光值，并计算其饱和浓度(为1.2μM)。

测定化合物的抑制百分率根据文献，配置药物浓度为BH₄饱和浓度的48倍，同样按试剂盒方法测定吸光值，并计算出抑制百分率。

抑制百分率＝(标准管吸光值-空白管吸光值)/(测定管吸光值-空白管吸光值)×100％

蝶啶衍生物半数抑制浓度(IC50)的测定

根据前一次试验BH4饱和浓度测定结果，以及药物的抑制百分率达100％的药物浓度，向下推几个药物剂量，分别为：32倍、24倍、18倍、13.5倍(剂量比为1；0.75)。实验中每个试管中加入的诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和BH₄的浓度是固定的。测得各管在530nm处的吸光度，用直线回归的方法计算出各自的半数抑制浓度。

所测定的29个蝶啶衍生物的分子结构与它们对iNOS的抑制率、ID₅₀列于下表1，其中绝大多数化合物均为未见文献报道的首次合成的新化合物。带有^*号的三个化合物为新化合物，它们用于第二、第三部分的动物细胞、动物体内以及动物疾病模型的研究。其中化合物1-5、17、19、20、22、23、29为已知化合物，其余均为本发明合成的新化合物。蝶啶衍生物用于测定抑制iNOS活性，未见文献报道；同样，以下带有*号的三个蝶啶化合物用于动物细胞、动物体内以及动物疾病模型的研究，也未见文献报道，均为首次测定研究。

                    表1  蝶啶类衍生物对iNOS的抑制活性

编号  R                       R¹     NR²R³    抑制率(％)    ID₅₀(μM)

  1   CH₂N(CH₃)C₆H₄COGlu H       NH₂        100           20.48

  2   H                       H       NH₂        100           26.81

  3   C₆H₅                 C₆H₅  NH₂        0             ND

  4   p-H₃CC₆H₅           H       NH₂        100           33.61

5   CH₃                H      NH₂                 0          ND

6   C₆H₅              H      HNC₆H₄COOEt       67         ND

7   p-H₃CC₆H₄       H      HNC₆H₄COOEt        29         ND

8   p-H₃COC₆H₄      H      HNC₆H₄COOEt        100        27.61

9   CH₃                H      H₃CNC₆H₄COOCH₃  100        31.57

10  C₆H₅             H      H₃CNC₆H₄COOCH₃   100        33.62

11* p-H₃CC₆H₄       H      H₃CNC₆H₄COOCH₃   100        27.62

12  p-H₃COC₆H₄      H      H₃CNC₆H₄COOCH₃ 0            ND

13  p-H₃COC₆H₄      H      H₃CNC₆H₄COGluEt₂ 100        ND

14  CH₃                H      HNC₆H₄COGluMe₂    100        31.58

15  p-H₃CC₆H₄       H      HNC₆H₄COGluEt₂    100        31.01

16  p-H₃COC₆H₄      H      HNC₆H₄COGluEt₂    100        28.14

17  C₆H₅             H      N(CH₂CH₃)₂        100        ND

18* p-H₃CC₆H₄       H      N(CH₂CH₃)₂        100        14.85

19  p-H₃COC₆H₄      H      N(CH₂CH₃)₂        100        14.45

20  C₆H₅             H      N(CH₂)₅            100        16.02

21  p-H₃CC₆H₄       H      N(CH₂)₅            100        23.02

22  p-H₃COC₆H₄      H      N(CH₂)₅            100        15.22

23  C₆H                H      N(CH₂C₆H₅)₂     67         13.77

24  p-H₃CC₆H₄       H      N(CH₂C₆H₅)₂     90         ND

25  p-H₃COC₆H₄      H      N(CH₂C₆H₅)₂     100        12.39

26  C₆H₅             H      HNCH(CH₃)₂         100        ND

27  p-H₃CC₆H₄       H      HNCH(CH₃)₂         100        ND

28* p-H₃COC₆H₄      H      HNCH(CH₃)₂         100        16.92

29  CH₂NHC₆H₄COGlu  H      NH₂                 100        16.46

注：(1)表中化合物1-29的结构如下图，图中R、R¹、NR²R³见表头；

(2)符号说明：ND-没测定；GluMe₂或GluEt₂分别为：谷氨酸二甲酯基或谷氨酸二乙酯基；

(3)化合物1为甲氨蝶呤(MTX)，化合物29为氨基蝶呤(AMT)。

表1结果表明，仅有3个通式II蝶啶类化合物对iNOS没有抑制作用，绝大多数通式II蝶啶类化合物对iNOS有抑制效果，其中23个化合物在一定浓度下可完全抑制iNOS的活性。

(2)蝶啶类衍生物对败血症性休克大鼠升压作用的研究

a、利用盲肠结扎穿刺后的大鼠败血症模型，观察通式I蝶啶类衍生物对败血症性休克大鼠的升高血压的作用(金惠铭  盲肠结扎穿刺后的大鼠败血症模型  中国病理生理杂志1990；6(2)：126)。

b、材料和方法

1.1三个通式I蝶啶类衍生物(为表1中带*号者)

1.2氨基胍(下简称AG)常州市华隆化工有限公司

1.3肝素  上海绿岛科技有限公司

实验动物：SD大鼠，雌雄兼备，体重150-300g，由江宁区青龙山动物繁殖场合格证号

SXCK(苏)2002-0018

药物对大鼠败血症性休克升压作用实验

4.1大鼠败血症性休克模型制备

采用盲肠结扎穿孔的方法制备该模型(参见：杨军珂，吴赛珠等，新型一氧化氮合酶抑制剂对败血性休克大鼠升压作用的研究，广州医药，1999，30(4)：1～3；金惠铭，盲肠结扎穿刺后的大鼠败血症模型，中国病理生理杂志，1990，6(2)：126；蒋建新，汪江淮等，败血症大鼠肝、肾、心、肺线粒体功能的变化，中国病理生理杂志，1993，9(2)：183～186)。健康大鼠体重150-300g，实验前一周饲养于实验室，实验当天清晨开始对大鼠禁食。当天下午开始手术，乙醚麻醉，常规消毒腹部，切口长约2cm，打开腹腔后小心分离盲肠。然后用3～0号丝线环形结扎盲肠，在与肠系膜相对的盲肠肠壁浆膜面用9号针头穿刺数次，第一个针孔距盲肠盲端约3mm。轻轻将肠子放回原处，关闭腹腔，逐层缝合。术后即刻皮下注射生理盐水，补充手术过程中体液的丢失，剂量为5ml/100g体重。回笼自然喂养。

4.2测定败血症性休克模型大鼠的血压

盲肠结扎穿孔术后18小时，把存活动物随机分为生理盐水组、氨基胍组、19号药物组、22号药物组和29号药物组，共5组。在戊巴比妥钠(35mg/kg)麻醉下，常规消毒颈部皮肤，切开颈部皮肤，小心分离右侧颈静脉及左侧颈动脉，各插入导管并保留，肝素生理盐水溶液(50μ/ml)抗凝，将颈动脉导管连接到传感器，接到多道生理记录仪上，待血压稳定后，从颈静脉导管分别注入生理盐水、氨基胍、11号药物、18号药物、28号药物，药物浓度均为50mg/kg。描记给药前及给药后5、10、20、30、40、50、60分钟的血压值，包括收缩压、舒张压，并计算平均动脉压。

平均动脉压＝舒张压+1/3(收缩压-舒张压)统计学处理：实验数据表示X±SD，计量资料用student’st检验比较差异的统计学意义。实验结果体征改变：造模12小时后病变逐渐明显，如活动减少，不再合群取暖，嗜睡，竖毛，不饮水，有时出现呼吸急促、脓尿、腹泻、眼角出现渗出物等，并有少部分动物死亡。各组平均动脉压的改变：各组血压在给药前无明显差异，给药后可见各组血压逐渐上升，5分钟开始就有变化，10分钟后可见各组血压与生理盐水组相比均有显著性差异，P＜0.01，具体测定数据见表2。

             表2用药前和用药后不同时间间隔的血压(n＝8，X±SmmHg)

                                  MAP(mmHg)

         组

                  0min         5min          10min         20min

       对照组  70.41±9.22  73.83±8.63   73.13±9.17   72.79±7.79

               73.75±              85.79±               91.46±                96.17±

         AG

               10.63        11.86^*       10.39^**      9.17^**

                                          89.50±                95.58±

        No11   67.33±5.27  83.99±6.25^*

                                          3.99^**       4.01^**

                                          87.04±                91.58±

        No18   68.46±3.78  81.04±6.36

                                          5.88^**       5.17^**

                            88.75±                91.17±               98.83±

        No28   70.25±5.62

                            7.89^**       8.49^**       4.69^**

               30min        40min         50min         60min

       对照组  74.58±8.62  74.08±6.82   77.71±7.26   72.17±7.48

               100.29±            102.33±             102.71±              104.34±

         AG

               7.52^**      9.18^**       5.64^**       7.27^**

               99.88±              100.71±             104.21±              102.29±

        No11

               2.14^**      3.03^**       2.45^**       2.83^**

               92.63±              97.38±               99.42±               100.29±

        No18

               5.01^**      3.72^**       3.09^**       3.21^**

               98.46±              104.62±              102.71±              103.04±

        No28

               4.47^**      5.36^**       4.55^**       4.08^**

^*P＜0.05vs对照组group

^**P＜0.01vs对照组group

给药前(0min)各组动物颈动脉平均血压较低，这种持续低血压的一个主要原因正是在腹腔感染的基础上iNOS被激活产生大量NO所致。经给予不同药物处理后，发现通式I蝶啶类衍生物(11、18、28)和阳性对照药(AG)的效能相似，有明显升高大鼠平均动脉压的作用，而给予生理盐水的大鼠(对照组)由于病程还在继续，血压有继续下降的趋势。(3)通式I蝶啶类衍生物对小鼠免疫型肝损伤的作用研究

a、原理与方法：给小鼠注射短小棒状杆菌或卡介苗可使多核中性粒细胞或巨噬细胞聚集于肝脏，继后再用低剂量大肠肝菌脂多糖攻击注射，可激发这些细胞释放对肝细胞有毒性作用的可溶性因子，造成免疫性肝损伤(参见：T.R.Billiar，R.D.Curran，D.J.Stuegr，et al，Inducible cytosolic enzyme for the production of nitric oxides from L-arginine in hepatocytes，Biochemical and biophysical research communications，1990，168(3)：1034～1040；HarbrechtBG，Billiar TR，Stadler J，et al，Nitric oxide synthesis serves to reduce hepatic damage duringacute murine endotoxemia，Crit Care Med，1992，20：1568～1574；Curran RD，Ferrari FK，Kispert PH，et al，Nitric oxide and nitric oxide-generating compounds inhibit hepatocyte proteinsynthesis，FASEB J，1991，5：2085～2092)。实验可见血中谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)以及一氧化氮(NO)浓度显著升高(参见：AndreasAK，Silvio MD，LiuZZ，Furthercharateriaztion and comparison of inducible nitric oxide synthase in mouse rat and humanhepatocytes，Hepatology，1995，21：1552～1560；Geller DA，Lowenstein CJ，Shapiro RA，et al.Molecular cloning and expression of inducible nitric oxide synthase from human hepatocytes，Proc Natl Acad Sci USA，1993，90：3491～3495)。通过与正常对照组相比较，如果给药组动物血清中升高的转氨酶显著降低，肝脏病理损伤明显减轻，指标显示有显著性差异，则可判断此种药物有效(参见：徐淑云，卞如濂等，药理实验方法学，北京人民卫生出版社，1993：1400)。

三个通式I蝶啶类衍生物(为表1中带*号者)和氨基胍(AG)。

短小棒状杆菌(CP)  由常州药业延申生物技术有限公司提供

细菌脂多糖(LPS)   南京生兴生物技术有限公司  进口分装

谷丙转氨酶试剂盒、谷草转氨酶试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供昆明种小鼠，雄性，体重18-22g由江宁区青龙山动物繁殖场提供合格证号SXCK(苏)2002-0027

小鼠免疫性肝损伤模型的制备

小鼠随机分组每组10只，分为模型组、环磷酰胺(CY)组、氨基胍组、11号药物组、18号药物组、28号药物组、生理盐水组。

正常对照组和模型组都给予等体积的溶剂。由尾静脉注射短小棒状杆菌(LP)0.5mg/只一次，于给药后第5、7、9天分别腹腔注射各组药物，剂量都为30mg/kg。并于给短小棒状杆菌的第10天给予细菌脂多糖(LPS)10μg/只一次，12小时后处死小鼠，取血清测定谷丙转氨酶活性、谷草转氨酶活性、及一氧化氮浓度。

实验数据表示成X±SD，计量资料用student′st检验比较差异的统计学意义。

实验结果：经尾静脉注射短小棒状杆菌5-7天后，各组小鼠出现攻击性增强，激惹易怒，相互撕打、啮咬，全身皮肤粘膜红肿，多处溃疡，尤以足跖部及尾部明显。从给CP后第5天开始给各组药物，给药组症状有所减轻。在给予LPS后模型组部分小鼠出现死亡。

与正常对照组相比，模型组NO、GPT、GOT都有显著性差异P＜0.01；与模型组相比，各给药组的NO、GPT、GOT都有明显差异P＜0.01(见Tab 3.1、3.2、3.3)。

                表3.1 NO浓度(n＝8，X±S 10^-5mol/L)

                  组别              NO(1E-5mol/L)

                 对照组             1.819±0.179

                 模型组             5.003±0.893^##

                   CY               1.542±0.452^**

                   AG               2.075±0.168^**

                  No11              2.749±0.293^**

                  No18              3.157±0.351^**

                  No28              3.032±0.327^**

              ##P＜0.01vs对照组group

             ^**P＜0.01vs模型组group

               表3.2 GPT的活性(n＝8，X±Su/ml)

                  组别            GPT(u/ml)

                 对照组         25.895±9.875

                 模型组       136.812±16.139^##

CY             33.299±7.212^**

AG             49.129±6.542^**

No11           52.271±5.122^**

No18           53.473±2.220^**

No28           53.669±4.339^**

##P＜0.01vs对照组group

^**P＜0.01vs模型组group

      表.3 GOT的活性(n＝8，X±Su/ml)

组别                      GOT(u/ml)

对照组               27.908±12.506

模型组               140.583±9.632^##

CY                   49.735±13.563^**

AG                   71.006±4.166^**

No11                 70.338±10.334^**

No18                 68.215±14.159^**

No28                 73.379±6.692^**

##P＜0.01vs对照组group

**P＜0.01vs模型组group

以上结果显示，通式II蝶啶类衍生物和氨基胍的作用一致，能明显减轻小鼠免疫性肝损伤的程度，降低血清中一氧化氮浓度、谷丙转氨酶活性和谷草转氨酶活性。