Nα－脱乙酰化人胸腺素α1单体的表达载体、工程菌及其制备方法

摘要

本发明公开了一种表达重组Nα－脱乙酰化人胸腺素α1(Nα－desacetyl thymosin α1)单体的分泌型表达载体，用该分泌型表达载体转化的工程菌宿主细胞，以及利用具有上述表达载体的工程菌发酵表达并纯化Nα－脱乙酰化人胸腺素α1单体的方法。本发明提供的方法制备的产品纯度高(98％以上)，可以作为药物用于临床；工艺简便有效，生产收率高；整个制备过程不会对环境造成污染；产品的成本低，适合于大规模的生产。

说明书

技术领域  本发明公开了一种表达重组N^α-脱乙酰化人胸腺素α1(N^α-desacetyl thymosin α1)单体的分泌型表达载体，用该分泌型表达载体转化的工程菌宿主细胞，以及利用具有上述表达载体的工程菌发酵表达并纯化N^α-脱乙酰化人胸腺素α1单体的方法。

背景技术  胸腺素α1(Thymosin α1)是一种从胸腺组分5(TF5)中分离纯化得到的一种具有多种生物活性的多肽。人们对胸腺中活性分子的研究最早开始于1964年J.J.Klein，A.L.Goldstein等对小鼠胸腺提取物的研究，此后A.L.Goldstein从小牛胸腺中提取出一类更加稳定的多肽混合物，将之命名为胸腺组分5(A.L.Goldstein，et al，Pro.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1996，56，1010)。胸腺组分5中含有30-40种激素样多肽，分子量从1000-15000Da不等。随着进一步的研究，人们发现TF5中有一种多肽具有促进淋巴细胞成熟的功能，命名为胸腺素α1。天然胸腺素α1是由28个氨基酸(SDAAV DTSSE ITTKDLKEKK EVVEE AEN)组成的酸性多肽，等电点为4.2，分子量为3108Da，并且N-末端氨基酸被乙酰化。而且有报道指出，N端缺少乙酰化修饰的胸腺素α1活性基本不受影响(Wetzel R.，et al，Biochemistry1980，19(26)：6096-104；Xiu ZY，et al，Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao，2002，18(5)：541-5)。

胸腺素α1对胸腺依赖的淋巴细胞的发育有重要作用。它是一种对T淋巴系统的免疫增强剂，可以促使T细胞成熟和分化，促使成熟的T细胞、NK细胞分泌各种淋巴因子，如白介素-2和γ-干扰素，同时促进白介素-2受体(IL-2R)的生成。胸腺素α1作为一种免疫增强剂，主要用于免疫缺陷和免疫受抑制的疾病，其临床应用主要体现在以下几方面：

①慢性肝炎的治疗。胸腺素α1对病毒性肝炎如乙型肝炎、丙型肝炎等有效。病毒性乙型肝炎和丙型肝炎是困扰全球的疾病，它们可能导致肝癌和肝硬化的发生进而引起死亡。胸腺素α1和干扰素联用治疗乙型肝炎是极其有效的。这是目前用于治疗该疾病的最有效方法。在中国肝病协会指导下，进行的一项多中心临床实验表明，胸腺素α1治疗慢性乙型肝炎出现很明显阳性反应率(47％)，如果采用胸腺素α1和干扰素联合给药，阳性反应率可达61％以上。

②用作疫苗佐剂。当病人的免疫力下降时(如老年人或长期接受血透析的病人)对其接种疫苗就可能无法得到足够的抗体效价，这时便可以使用胸腺素α1来增强流感疫苗和乙肝疫苗的有效性。

③HIV的治疗。患者感染HIV一段时间后，免疫系统会遭受毁灭性的打击，病人往往死于一些对正常人来说微不足到的感染。胸腺素α1一方面可以提高抗病毒药物的疗效，另一方面可逐渐恢复病人的免疫能力，以抵抗致命的其它感染。

④癌症的治疗。胸腺素α1被证实对恶性黑色素瘤、肺癌、红白血病鳞状上皮细胞癌、直肠结肠癌有疗效。且对恶性黑色素瘤的治疗已进入临床试验阶段。

⑤用于放疗和化疗病人的免疫系统恢复。

胸腺素α1具有极好的安全记录。迄今为止，在进行过的临床和非临床试验中，在包括成年人、老人、孩子在内的2000多受试者身上(无论他们是患有乙肝、丙肝、原发性免疫疾病还是癌症)，没有发现与药物相关的明显毒副作用。而且，当与其它药物如干扰素或化疗药物联用时胸腺素α1不会增加其他药物的副作用。副反应是轻微和少见的，主要为给药部位的不适，极少数量患者会出现红斑、暂时性肌萎缩、关节痛以及出疹。

由于胸腺素α1对于感染性疾病具有确切、独特的疗效，使其具有潜在的商业价值，一时间成为科研人员和商家关注的热点。进口药品价格昂贵(目前日达仙零售价为1813.00元/2支/盒)，国内大多数患者无法负担；并且Tα1疗效确切，国内肝病患者众多(据推算，我国约6.9亿人已感染过HBV，其中1.2亿人携带HbsAg，慢性乙型肝炎患者约3000千万；3.8亿人已感染过HCV)，市场前景广阔；国内的药厂以及科研部门从保护人民健康的大局和自己的切身利益出发，纷纷开展该药物的研究工作。

到目前为止，胸腺素α1及其相关产品的制备主要有以下几类方法：

1.动物(如牛、猪)的胸腺中提取。

此类方法的主要产品为胸腺肽，它是一种混合物，缺点是纯度低，生物相容性差，很容易产生毒副作用。并且原材料受动物数量的限制，工艺复杂。

2.化学方法合成。

此类方法可以用于合成天然和脱乙酰化两种胸腺素α1形式。其缺点是技术要求高，工艺复杂，收率低，所得到的产品成本高，大规模产生难度较大；合成过程中用到许多有毒物质，其产品中也就不可避免的会有有毒物质的残留；化学合成本身也会对环境造成污染。

3.用基因工程方法表达后纯化。

此类方法多以原核生物(如大肠杆菌)为宿主细胞，通过带有胸腺素α1基因的载体转化后，进行过量表达。由于原核生物遗传方面的特性，缺乏表达之后的修饰系统，因此表达的蛋白质或肽不能进一步被加工和修饰。所以基因工程方法生产的胸腺素α1，除了N端缺少乙酰化修饰外，与天然胸腺素α1氨基酸组成相同，有科学研究表明这种修饰的缺乏不对其活性造成影响。而且，用基因工程方法制备会克服以上两类方法的不足。

目前利用大肠杆菌表达N-α脱乙酰化人胸腺素α1方法的研究，都是其本身与其它蛋白质以融合蛋白的形式进行共表达，在纯化过程中先分离融合蛋白，然后用特定的酶或溴化氰将两者分开，进一步分离纯化得到目的产物。Xiu ZY等将其与GST蛋白质共表达，然后用凝血酶或溴化氰切割融合蛋白，分离纯化后获得单体(Sheng Wu GongCheng Xue Bao，2002，18(5)：541-5)；Wetzel R等将其与β-牛乳糖蛋白共表达，然后用溴化氰切割融合蛋白，分离纯化后获得单体(WetzelR，et al，Biochemistry，1980，19(26)：6096-104)；Korobko VG等将其与TNF蛋白质共表达，然后用溴化氰切割融合蛋白，分离纯化后获得单体(Korobko VG，et al，Bioorg Khim，1992，18(5)：646-59)。上述方法的缺点是由于加入了二次裂解的步骤，给待分离的样品增加了新的污染，难免在最终的产品存留杂质。同时工艺本身也比较复杂，收率低，造成人力和物力的浪费。

所以本发明提供N^α-脱乙酰化人胸腺素α1单体的表达载体、工程菌及其制备方法克服了上述制备方法的不足，通过构建分泌型表达载体(pTα1)，并转化入大肠杆菌(E.coli W3110)使之成为工程菌(pTα1/W3110)，然后进行高密度发酵培养，使N^α-脱乙酰化人胸腺素α1以单体的形式直接分泌到大肠杆菌的细胞间质中。经过裂解、酸沉、超滤、层析几个简单纯化步骤，即可获得纯度高达98％以上的单体蛋白，可以直接作为药物应用于临床。使用本发明的方法生产N^α-脱乙酰化人胸腺素α1，最突出的特点在于生产工艺简单，便于大规模生产；整个制备条件温和，最大程度保持其生物活性；制备过程中所用的原辅料不会对环境造成污染；成本大大降低，减轻患者的经济负担。

发明内容  本发明提供一种重组N^α-脱乙酰化人胸腺素α1(N^α-desacetyl thymosin α1)单体的分泌型表达载体(p ST II/Tα1)，该载体含有：重组的编码人胸腺素α1基因序列、与人胸腺素α1编码序列相连的大肠杆菌热稳定肠毒素II信号肽(ST II)序列、和大肠杆菌碱性磷酸酶启动子(phoA promoter)、翻译增强子序列、Shine-Dalgano序列、Amp及Tet抗性基因、复制起点。并且该载体含有ST II基因的核糖体结合位点，以及该人胸腺素α1编码序列为人工合成的产物。

本发明提供一种分泌型表达重组N^α-脱乙酰化人胸腺素α1单体的工程菌(pTα1/w3110)，其宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)W3110，基因型：F-mcrA mcrB IN(rrnD-rrnE)lamda-，并且被上述的载体所转化。

本发明提供一种制备N^α-脱乙酰化人胸腺素α1单体的方法。该方法依次包括下列步骤：a.将上述的工程菌接种到发酵培养基中进行分泌型表达，其表达产物N^α-脱乙酰化人胸腺素α1单体被分泌到胞周质；b.低温离心收集菌体并于-70℃冻存；c.分离纯化表达产物。分离纯化方法主要包括下列步骤：

①采用低温、低渗法裂解菌体。

②采用酸沉进行粗提

③采用CM-sephrose-F.F阳离子交换层析进行粗提。

④采用DEAE-Sepharose-F.F阴离子交换层析法进行纯化。

⑤采用超滤法浓缩样品。

⑥采用Sephacryl S-100HR凝胶过滤层析法进行纯化。

附图说明

图1.Tα₁ cDNA及对应的氨基酸序列。

图2.根据Tα₁ cDNA合成的寡核苷酸的序列。

图3.基因工程表达载体PST II/Tα₁的构建示意图。

图4.基因工程表达载体PST II/Tα₁的酶切图谱。

    第1道：DL2000 DNA+DL15000 DNA Marker。

    第2道：pST II/Tα₁质粒用内切酶Mlu I消化。

    第3道：pST II/Tα₁质粒用内切酶BamH I。

    第4道：pST II/Tα₁质粒用内切酶Mlu I+BamH I。

    第5道：pST II/Tα₁质粒用内切酶Bgl II

    第6道：pST II/Tα₁质粒DNA(未酶切)

图5.不同发酵时间对目的蛋白表达量的影响(SDS-PAGE)。

    第1道：蛋白质分子量标准(美国生命技术公司)

    第2道：发酵4h pTα₁/W3110全菌体蛋白

    第3道：发酵8h pTα₁/W3110全菌体蛋白

    第4道：发酵12h pTα₁/W3110全菌体蛋白

    第5道：发酵16h pTα₁/W3110全菌体蛋白

    第6道：发酵20h pTα₁/W3110全菌体蛋白

    第7道：发酵24h pTα₁/W3110全菌体蛋白

    第8道：发酵28h pTα₁/W3110全菌体蛋白

    第9道：工作参考品

图6.高密度发酵时各参数随时间变化的情况。

图7.低渗裂解时，离心上清液的纯度情况(SDS-PAGE)。

    第1道：蛋白质分子量标准(美国生命技术公司)

    第2道：裂解液上清

    第3道：裂解液沉淀

    第4道：工作参考品

图8.CM-sephrose-FF离子交换层析图谱。

图9.DEAE-Sephrose-FF离子交换层析图谱。

图10.Sephacryl S-100HR凝胶过滤层析图谱。

图11.纯化各步获得蛋白的纯度情况(SDS-PAGE)。

    第1道：蛋白质分子量标准

    第2道：裂解液上清

    第3道：CM-sephrose-FF离子交换层析收集样品

    第4道：DEAE-Sephrose-FF离子交换层析收集样品

    第5道：超滤浓缩收集样品

    第6道：Sephacryl S-100HR凝胶过滤层析收集样品

    第7道：工作参考品

具体实施方式  实施例1 N^α-脱乙酰化人胸腺素α1的cDNA合成

根据Tα₁氨基酸序列以及大肠杆菌常用密码子设计Tα₁ cDNA(图1)。按照上述Tα₁ cDNA序列合成两两互补的四个寡核苷酸片段(图2)，互补配对后，两端分别形成MluI和BamHI核酸内切酶位点的粘性末端。

实施例2 分泌型N^α-脱乙酰化人胸腺素α1表达载体的构建

用于构建表达质粒的起始质粒为pST II，其结构包括碱性磷酸酶启动子(PhoA promoter)，翻译增强子序列，Shine-Dalgano序列，STII序列，Amp及Tet抗性基因，复制起点。

将起始质粒pST II用Mlu I和BamH I进行双酶切回收后，线性质粒粘性末端恰好与上述合成片段互补。

将线性质粒与合成的互补配对目的片段在T4连接酶(T4 Ligase)指导下进行连接、转化细菌、筛选后，即可获得带有目的基因片段的重组质粒，详细的过程见图3。

实施例3 分泌型N^α-脱乙酰化人胸腺素α1表达载体的鉴定

由于PTα₁质粒插入的目的基因片段内有一个Bgl II酶切位点，而原质粒上没有Bgl II酶切位点，可以很可靠地验证外源基因的插入，结果见图4。

实施例4 分泌型N^α-脱乙酰化人胸腺素α1工程菌的建立

表达用菌株为E.coli W3110，基因型：F-mcrA mcrB IN(rrnD-rrnE)lamda-，购自ATCC。按《Molecular Cloing》(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniatis，T.1989)中的方法，用氯化钙制备新鲜的大肠杆菌(W3110)感受态细胞，将鉴定正确的基因重组质粒转化感受态W3110菌中，涂板(TET+LB琼脂板)，挑菌，提质粒，进行酶切鉴定。原始菌种用脱脂奶粉冻干保存于-70℃，每支1.0ml。为检查工程菌的稳定性，每传20代作一次酶切图谱分析，结果与原始菌种一致，证明本发明中的工程菌是很稳定的。

实施例5 分泌型N^α-脱乙酰化人胸腺素α1工程菌的高密度发酵种子液培养：

挑取工程菌单克隆，接种于10ml含TET(5μg/ml)LB培养基中，于37℃摇床中过夜培养，转速200rpm。然后按1∶50转接于含TET的LB中放大培养，摇床转数200rpm，37℃培养过夜，待OD₆₀₀光吸收值达到2.5左右时上罐。

发酵罐培养：

发酵培养基成分

    NaH₂PO₄·2H₂O      17g

    MgSO₄·7H₂O         24g

    K₂HPO₄·3H₂O       44.6g

    (NH₄)₂SO₄          90g

    葡萄糖                 20g

    酵母粉                 100g

    微量元素液             10ml

其中微量元素液的成分：

    FeCl₃·6H₂O          1.7g

    NaMoO₄·2H₂O         0.7g

    ZnSO₄·7H₂O          0.8g

    H₃BO₅                0.2g

    CuSO₄·5H₂O            0.8g

    CoCl₃·6H₂O            0.7g

    MnSO₄·H₂O             0.5g

    1MHCl                    10ml

    定容至                   100ml

将培养基按比例加入40L发酵罐中，加水至20L，121℃高压灭菌。使用前加入TET(5μg/ml)。

将发酵种子液按1∶20(V/V)接种于40L发酵罐中，37℃培养。调整转数200-800rpm，通气量0-80％，保证罐压不高于0.3bar，PH值7.0(通过流加氨水或硫酸来调节)，通过调节转数及通气量维持溶氧量不低于20％，持续4-5小时。当罐中糖消耗后，补糖速度由0.25g/L/h逐步升至8.0g/L/h，持续18-20小时，以后保持5g/L/h至放罐，并且加入消泡剂消泡。在发酵过程中于不同的时间间隔取样，进行SDS-PAGE分析，结果见图5。发酵终止后，将发酵罐温度降至20℃以下，发酵液用连续流离心机16000rpm离心，将收集的菌体压成片状，放置-70℃冷冻。N^α-脱乙酰化人胸腺素α1高密度发酵时各参数随时间变化的详细结果见图6。用SDS-PAGE法进行菌体总蛋白电泳，经扫描仪扫描目的蛋白含量占菌体总蛋白量的10％以上。

实施例6 分泌型N^α-脱乙酰化人胸腺素α1的纯化分离

1.裂解菌体

通过以上方法获得的N^α-脱乙酰化人胸腺素α1主要分泌在大肠杆菌的细胞间质中，因此采用低温、低渗裂解法能有效地抽提出分泌出的N^α-脱乙酰化人胸腺素α1而又不破坏细胞内膜。低渗缓冲溶液为10mMTris-HCl，1mMEDTA，PH值为8.0。从-70℃取出菌体，按照每克湿菌体加入8ml上述低渗缓冲溶液，悬浮细菌，裂解温度为4-8℃，同时缓慢搅拌1.5h裂解完全(结果见图7)。

2.酸沉和阳离子交换层析

用1N HCl将上述裂解混合液的PH值调节到4.0，10分钟后于4℃、10000rpm离心20min，离心收集上清液。

采用Φ10×50cm柱，CM-Sephrose-F.F阳离子层析介质，平衡缓冲液10mM HAc-NaAc，PH4.0，平衡体积为柱床体积5倍以上。将裂解液上清液流穿，流速为240cm/h，收集穿液。电泳检测纯度可达80％(层析图谱见图8)。

3.阴离子交换层析

用1N NaOH将上一步流穿液的PH值调节到7.0。

采用Φ10×50cm柱，DEAE-Sepharose-F.F阴离子交换介质，平衡缓冲液10mM Tris-HCl，1mM EDTA，PH7.0，平衡5个柱床体积。将调节过PH值的流穿液上样。上样、平衡流速为240cm/h，洗脱速度为120cm/h。先用含0.02MNaCl的平衡缓冲液洗脱部分杂蛋白后，改用含0.05M NaCl、0.08M NaCl的平衡缓冲液洗脱出胸腺素峰，分段收集，电泳检测后合样，纯度可达95％以上。(层析图谱见图9)

4.超滤浓缩

采用Millipore-PALC-C05，膜包截留分量为1KD。平衡缓冲液为10mM磷酸盐缓冲液(PH为7.0)，超滤浓缩至1L左右。

5.凝胶过滤层析。

柱型Index-200，Sephacryl S-100凝胶过滤介质，平衡缓冲液10mM磷酸盐缓冲液(PH7.0)。上样体积为柱床体积的5％，流速12cm/h，可除去存在的热原，聚合体等，分段接收主峰，液相检测后合样，纯度达98％以上(层析图谱见图10)。

(以上各层析步骤收集样品的情况见图11)

6.检定。

将上述纯化所得的样品进行如下检定：

1)用SDS-PAGE纯度检定，考马斯亮蓝染色，无可见杂带。

2)用RP-HPLC法进行纯度检定，样品纯度大于98％。

3)用E-玫花法进行体外活性检定，样品活性大于10％。

我们确定了利用pTα₁/W3110工种菌制备N^α-脱乙酰化人胸腺素α1的最佳发酵条件，能够稳定、高效地表达目的蛋白。表达量达菌体总蛋白的15％以上，达胞周质蛋白的30％以上。同时我们确定了纯化工艺流程为最终纯度可达98％以上。按照已确定的发酵工艺和纯化工艺，我们使用150L发酵罐，连续三批发酵，菌体平均重量为9.5Kg，平均每次发酵可获得纯化的N^α-脱乙酰化人胸腺素α1蛋白13.6g，批间没有显著差异，重现性好。发酵、纯化过程中所使用的试剂及各种处理条件都很温和，对蛋白质活性无不良影响，而且纯化工艺简单，完全适合大规模生产的要求。