公开/公告号CN1531601A
专利类型发明专利
公开/公告日2004-09-22
原文格式PDF
申请/专利权人 孟山都技术有限公司;
申请/专利号CN02812586.X
申请日2002-04-23
分类号C12Q1/68;C12P19/34;C12N1/00;
代理机构72001 中国专利代理(香港)有限公司;
代理人温宏艳;孟凡宏
地址 美国密苏里州
入库时间 2023-12-17 15:30:37
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2008-06-25
专利权的终止(未缴年费专利权终止)
专利权的终止(未缴年费专利权终止)
2006-08-09
授权
授权
2004-12-01
实质审查的生效
实质审查的生效
2004-09-22
公开
公开
发明领域
本发明涉及在用于废水的生物处理系统中对微生物的基于PCR的监测。特别地，本发明涉及指示/效应基因或者基因组合的丰度和表达的测定，其中“效应”基因的表达相关于某种特定的微生物样品的降解活性，“指示”基因的丰度相关于微生物的丰度。效应基因的表达通过定量RT-PCR进行测定，而指示基因丰度通过定量PCR进行测定。该指示和效应基因可以是相同或者不同的基因。
尽管草甘膦氧化还原酶(gox)基因(US5463175，US577760)在基于活性污泥的系统中的表达被用于例示这样的基于PCR的监测，本发明的实施方案可以被广泛地通过任意的指示/效应基因组合并且在任意的系统中进行应用，该系统利用微生物的分解代谢活性进行废水的生物处理。本发明还涉及一些方法，这些方法用于废水处理系统的主动控制，该控制基于来自于所述基于PCR的监测所产生的信息而进行。
发明背景
有机废物的生物处理被用作为一种修饰生态系统的手段已有几个世纪。例如，自农业产生伊始，堆肥就被用于从有机废物中产生土壤改善物质并且增强营养物的循环。在本世纪中，废水的生物处理已经被用作为一种清除有机物质的方法(US5540840)，该方法还可以辅助通过其它多种方法进行的废物回收(US5792650)。
多数现存的废水处理厂建立于数十年前，那时候的水质量标准(例如，基于生物氧需求(BOD)和化学氧需求(COD)的标准)较不严格。进一步，这些废水处理厂通常依赖于活性污泥的加工过程，该过程作为废水生物处理的核心组成。尽管已经存在仅仅使用物理化学方法来进行水回收的处理系统(US4851131)，基于活性污泥的系统仍是标准，特别是对于需氧的废水处理系统(Hallas，Laurence E.and MichaelA.Heikamp，1995.″Microbiological treatment of chemicalprocess wastewater.″In：Young，Lily Y.and Carl E.Cerniglia(eds)Microbial Iransformation and Degradation of ToxicOrganic Chemical，New York：Wiley-Liss，pp.349-387)。
尽管在废水处理系统的成分单位加工(component unitprocess)上已经有所进展，但是将这些进展转化成为与之一致的高质量的流出物的实现仍受阻于对监测过程的依赖的需求，该监测过程在控制过程中仅允许缓慢的或者被动的调整。然而，对于某些狭隘限定的情形，监测技术已经发展到对废水生物处理系统中的单位加工进行近于实时的控制。例如，NADH荧光和pH信号可被用于对碳营养物质向无氧反应器中的填入速率进行最优化(US6106718)，或者，另一个例子中，报道细菌表达某种编码生物发光报道蛋白的基因的水平可就其同杀菌毒性在废水处理流中的存在与否的关联进行光学监测(US6110661)。
用于监测调节废水处理流中的目标成分的微生物降解的蛋白的编码基因的丰度和表达的技术总体上是缺乏的。用于通过该监测所产生的信息来对废水生物处理系统进行知情的主动控制的方法也是缺乏的。本发明克服了现有技术中的这些以及其它的缺陷，并且满足了对关键性微生物基因的丰度和表达进行监测的技术的长期需求，从而允许了废水生物控制系统的主动控制。
无论是对于生活废水或者工业废水，废水处理一般作为一组处理而进行，该组可被分为三个常规水平：初级、次级和三级。初级处理在典型情况下涉及大量悬浮固体从废水样品中的清除。用于初级处理的主要技术为沉淀。在沉淀期间，可沉降的固体从未处理废水中被除去。对于具有低至中等悬浮固体成分的有机工业排放物，如果该废水的有机物质含量或者水流速率随时间发生明显变化就可能会需要通过一种平衡池。
次级处理通常可被视为在性质上为生物除污处理。次级处理通常由对在初级处理后存留的有机固体进行的生物氧化组成。在对初级处理的流出物进行的次级处理中常用的技术依赖于悬浮生长的生物处理，并且特别依赖于活性污泥法。尽管次级处理系统及它们的成分单位操作和方法近几十年来已经成为关键技术进展之所在，在监测方法上的限制通常阻碍了主动控制方法在许多次级处理系统中的实施。
典型情况下需氧次级处理和通常情况下的三级处理在生物反应器系统中进行。这些系统分为两大类——需氧悬浮生长和附着生长系统。在两种情况下的原理是相同的：使微生物物质接触于(i)作为能源的有机化合物，(ii)电子受体(例如氧或者硝酸盐)，以及(iii)用于微生物生长的适当营养物。当有机成分被降解时必须提供一种用于从增长中的生物物质中分离被处理的液体的设备。
在需氧系统中，连续流动活性污泥技术已经成为了次级处理的主要技术。在连续流动活性污泥系统中，如图1所示，废水首先在通气池50中同微生物混合并且通气一段限定的时间。第二个池，即净化池60，为水从沉降入活性污泥垫65的生物物质分离(即，净化)提供了显著降低的有机物(某些情况下为无机物)含量。
尽管通过了充分测试的次级处理过程，但是次级处理系统中的水排出物还可能达不到水质标准。在这些水排出物中的悬浮固体、营养物或者特别调节的化合物水平可能是无法接受的。在这样的情况下需要三级处理。三级处理选项包括额外的化学处理(例如，活性碳过滤、臭氧化作用、凝聚、气提以及离子交换法)和/或生物处理(例如，以活性碳或者藻酸盐中的微生物对成分进行高纯度水处理(polish))。
正如预料，连续流动活性污泥方法在机制上已被熟知。关键性的操作变量被用于对系统进行成功的设计和操作。例如，在初始废水鉴定之后进行反应器取样，以便于限定操作系统的有机加载物(食物/微生物或者F/M比例)。另外，通气和输氧的速率被确定并且经调整以获得所需的废水处理水平。最后还进行了对净化速率以及微生物(以及随后的生物物质废料)生长速率的类似确定和调整。成分单位加工的多种扩充也可被用于改善连续流动活性污泥系统。例如，向通气池内加入活性碳已经在对稀释但可变的废水的处理中提供了一种成功的改变。
在废水生物处理系统中需要监测方法对处理流的参数进行检测并且将其维持在最优范围之内，或者至少阻止这些系统操作中的巨大干扰并且避免超过水质限制。除微生物的多样性外，废水生物处理系统中所测量的过程控制参数还有恒定的固体水平、F/M比例、平均细胞存留时间(MCRT)、沉积速率和污泥体积指数，以及摄氧速率(OUR)和特异性摄氧速率。
这种类型的信息有助于决定需要进行什么样的调整，例如，引导返回的活性污泥流以及废活性污泥流(分别见于图1的67和69；又见于Wastewater Engineering：Treatment，Disposal，andReuse(McGraw-Hill Series in Water Resources and EnvironmentalEngineering，1991)，George Tchobanoglous，Franklin L.Bruton，and Metcalf & Eddy，Inc.Staff)。
生物氧需求(BOD)是在一升水中的所有有机物质被微生物所氧化的情况下将消耗的氧的量。在测定5天BOD(BOD5)的基本方法中，从一个测试池中取出等体积的两份水并将每一份以已知体积的蒸馏水进行稀释，该水进行彻底地振荡以确保氧饱和。随后使用氧测量计测定一份水中的氧浓度，而剩下的那一份被密封并且置于完全的黑暗中。5天之后，使用氧测量计测定在第二份中的氧含量。BOD5通过从第一次测定值中减去第二次的值而确定。
需氧化的有机物质的相对量越高，在废水生物处理系统中的微生物用于氧化该量的有机物所需的氧气的相对量就越多。进一步，该微生物来源和样品微生物对被用作为BOD5测定的底物的废物成分的适应程度显著影响BOD5。作为这些相关关系的结果，BOD5可被用于测定对于特定物质的废水生物处理效率。例如，在特定类型的废水中的甲醛可被多种活性污泥进行生物氧化并且因此可用BOD5检测。但是，如果在活性污泥中没有表达gox的微生物，那么可能无法用BOD5对来自于相同的废水的草甘膦(即，N-膦酰甲基甘氨酸)以及N-膦酰甲基亚氨基二乙酸(PIA)的降解进行检测。
在替代的情况下，氧需求可以使用化学氧化剂进行测定。这称为化学氧需求(COD)。COD可以表示为对一升废水中的有机污染物进行化学氧化所需的氧毫克数。COD值通常高于BOD值。生活废水的典型的COD值为200到500mg/L。COD提供了理论氧需求的指数并且通常被用于代替BOD，特别是因为COD的测定可在仅仅数小时后完成，而标准的BOD5测定需要5天。
许多年以来已经将测定废水中的总有机碳(TOC)水平用作估计污染水平的方法。可以使用几种方法测量废水TOC，但所有方法一般都是测量水样品的有机碳含量。生活废水的典型TOC值为100-300mg/L。
平均细胞存留时间(MCRT)是微生物保持在处理过程(如连续流动活性污泥过程)中的平均时间长度，其中考虑了微生物的清除(如，通过污泥消耗)。MCRT也可以表达为固体存留时间或污泥年龄。例如，如果平均需要五天时间清除等于一般在系统中保持的污泥量，
污泥微生物将在该系统所含的污泥中平均存留五天。因此，用于该处理过程的污泥年龄将为五天。对于一个通过常规的活性污泥过程处理生活废水的处理厂，典型范围的MCRT应为五到十五天。对于处理工业废水的处理厂，典型的范围应为三十到一百天。
在处理系统中的微生物多样性特征随着环境条件而变化，该条件包括溶解的氧浓度和水力存留时间(HRT)。HRT指的是一个生物处理系统的水相或者液相在该系统中存留的平均时间。一些系统的MCRT和HRT可能差异明显，例如使用了固定化细菌技术的系统。完全混合活性污泥系统为MCRT和HRT的差异提供了另一个例子。应用了完全混合活性污泥系统的工业生物系统常常具有2-7天的HRT，但是其MCRT为30到80天。
但是，在多数系统中，随着HRT的提高，更多的底物有机物质被吸着(即，被吸收和吸附)，并且被微生物所生物降解。因此，底物有机物质与微生物生物物质的比值降低了，这可以显著改变该微生物群落的结构。
混合液中的挥发性悬浮固体(MLVSS)包括活体以及非活体有机物质，代表生物物质的量的粗略近似值。混合液中的悬浮固体(MLSS)还包括无机固体，并且由此是生物量的更为粗略的近似值。在典型的情况下□MLVSS为MLSS的70到80％。
F/M比例在维持生物处理系统中也是重要的。因为BOD(或者COD)乘以流入物(或者流出物)流速是分子F的估测值，MLVSS是分母F的估测值，BOD(或者COD)乘以每单位MLVSS的流入物(或者流出物)流速提供了F/M比例的一种估测值。
尽管这些参数已经被成功地用于监测生物废水处理系统，但是它们受到一些缺陷的困扰。特别地，MLVSS的测量仅仅是总生物含量的一个近似值并且该测定值还进一步包括了该活性污泥中的所有生物体。这些生物体通常多种多样，并且可能包括细菌、原生动物、轮虫、真菌和线虫，以及藻类和昆虫幼虫。另外，该MLVSS测定并不能将存活和非存活微生物加以区分。
对于给定的MLVSS值来监测微生物活性的主要方法是进行非特异摄氧速率(OUR)分析。但是，这样的分析反应了对废水样品中的多种成分的微生物降解活性而非对某种单一成分，例如对草甘膦的降解活性。摄氧速率还受到更易降解的成分是否存在于废水样品中的明显影响。
微生物群落结构的动态变化同废水生物处理系统的性能是紧密相关的。因此，精确测定负责特定生物学过程的微生物的有效方法在水再生中具有相当大的益处，这是因为它可进行对废水生物处理系统的更精细监测和控制。以一种不依赖于细胞培养方法的方式对细菌和其它微生物群落的结构进行监测是特别理想的，这种不依赖于细胞培养方法的方式目的在于不仅测定负责某种特别调节的化合物的降解的微生物类型，而且还测定这些微生物的丰度和活性。
基于PCR的方法(US4683202和引用它的US专利)已经可用于对来自参与异生素化合物降解的微生物的基因进行检测。例如，进行DNA提取后继之以PCR，已经被用于检测一些微生物的基因，这些微生物在对污染沉积物中的多氯化联苯基有机物的降解(Erb et al.，1993，Appl.Environ.Microbiol.59：4065-4073)和萘的降解(Herricket al.，1993，Appl.Environ.Microbiol.69：697-694)中很重要，被检测的其它基因还包括，在经石油烃污染的地下水中检测儿茶酚2，3-二加氧酶基因(Joshi and Walia，1996，FEMS Microbiol.Ecol.19：5-15)和变儿茶酚酶同源基因(Joshi and Walia，1996，J.Microbiol.Methods 27：121-128)。
基于PCR的方法已经被用于不仅检测，而且定量估测降解4-氯联苯基有机物的土壤细菌(Durocq et al.，1999，Appl.Soil.Ecol.12：15-27)以及未经培养的菌株(Lee et al.，1996，Appl.Environ.Microbiol.62：3787-3793)。定量PCR方法(qPCR)，尤其是竞争性qPCR(US5213961以及引用其的美国专利)已经被用于对在适应苯酚的活性污泥中的细菌群体多样性的波动进行跟踪(Watarabe et al.，1999，Appl.Environ.Microbiol.65：2813-2819)。Mesarch等人(2000，Appl.Environ.Microbiol.66：678-683)开发出特异于假单胞菌某些菌株的儿茶酚2，3-二加氧酶基因的引物，从而使竞争性qPCR可被用于直接的不基于培养的工艺，以进行土壤样品中微生物群的计数。
Watanable等人(2000，Appl.Environ.Microbiol.66：3905-3910)还使用基于qPCR的方法来估测存在于活性污泥中的Ralstonia eutropha E2细菌的密度。除使用qPCR，以pox基因特异性引物来估测存在于活性污泥中的Ralstonia eutropha E2细菌的密度之外，Watanable等人(2000)还使用逆转录PCR(RT-PCR)方法在活性污泥中检测这些细菌对该pox基因的表达，但并非对其进行定量。通过pox基因表达，Ralstonia eutropha E2细菌能够在含有苯酚作为全部碳源的培养基上生长。Watanable在qPCR和非定量的RT-PCR中设计并使用相同的pox基因特异性DNA引物。Dionisi等人(2002)近来使用基于qPCR的方法对来自于城市活性污泥和工业活性污泥的氨氧化和亚硝酸盐氧化性细菌进行计数(Dionisi，H.M.et al.，2000 Appl and Environ Microbiol，Vol.68(1)：245-253)。然而，未曾有过测定特异的硝化细菌群的活性的尝试。
尽管基于PCR的方法已被证明具有鉴定在废水生物处理系统的活性污泥中表达的基因的用途，但仍需要精准地对这些基因的相对丰度和相对表达水平这两者进行定量的监测方法。进一步，废水生物处理系统需要将来自于该监测方法的丰度和表达水平值转换成为最优控制参数的操作程序。换句话说，所需的是以接近于实时的方式对指示/效应基因组合的丰度和表达这两者进行精准监测的废水鉴定方法，以及使用这些丰度和表达测定值来主动地控制废水处理系统，从而达到最优水再生的方法。年复一年，对这样的方法(以及用于该方法的组合物)的需求变得更为显著。
发明概述
ABC-活性生物除污物含量(active bioremedial content)，直接正比于效应基因RT-PCR产物的水平。
AMC-活性微生物含量，直接正比于指示基因PCR产物的水平。
BOD-生物氧需求。
BOD5-五天生物氧需求
BODgly-对于草甘膦的生物氧需求。
cgox-在该情况下：一种在竞争性PCR方案中被用作为内部对照的截短的gox基因；也可为一种插入或者序列变体；其它内部对照亦可。
COD-化学氧需求。
竞争性定量PCR-DNA含量的一种定量测定，其中一种内部同源DNA标准被用于作为扩增效率的变异的对照。
竞争性定量RT-PCR-RNA含量的一种定量测定，其中一种内部同源RNA标准被用于作为逆转录和扩增效率的变异的对照。
经验确定的最优操作范围-指的是最优ABC、AMC和SBC值，这些值由操作者根据经验预先确定，以提供特定的废水成分的最有效降解。
效应基因-任何基因或其一部分，这些基因编码一种目的降解性酶，优选为一种特定的降解途径的限速酶。
F/M-食物与微生物的比例。
FBOD/M-食物与微生物的比例，其中F作为BOD测量。
GDA-草甘膦降解活性。
gox-草甘膦氧化还原酶基因。
HRT-水力存留时间。
指示基因-任何基因或其一部分，该基因通常对于目的微生物是唯一性的；该基因可与效应基因相同；该基因被用于测定目的微生物在微生物群中的丰度。
内部对照-在该情况下被例示为与指示和/或效应基因同源的基因，但内部对照具有小的变异。小的序列变异，例如改变的限制性核酸内切酶位点也是可能的。其它的内部对照也可被使用，但同源对照是优选的。
MCRT-平均细胞存留时间。
MLSS-混合液中的悬浮固体。
MLVSS-混合液中的挥发性悬浮固体。
OUR-摄氧速率。
PCR-聚合酶链反应。
qPCR-定量PCR-定量PCR在此例示为使用了一种内部同源对照的竞争性技术，该内部同源对照由于少量的插入或者缺失而有异于目标。但是，也可以使用非竞争性和动力学定量PCR。设计了实验以合并实时、动力学PCR检测和内部同源对照，该对照可以与靶序列一起同时检测。例如，BoiTechniques 26(1)：112-125(1999)提供了关于定量PCR，特别是RT-PCR的极好的讨论。
qRT-PCR-定量逆转录-聚合酶链反应，同样可被用于qRT-PCR的相关技术的描述可见于对qPCR的描述。
RT-PCR-逆转录-聚合酶链反应。
SBC-比生物除污物含量，SBC＝ABC/AMC。
TOC-总有机碳。
TMC-总微生物含量，可通过对遍在基因的PCR测定来测量。
总体来说，本发明为一种以任何有效手段从废水处理系统中进行废水取样并且从样品中收集固体(包括其中的微生物群)从而对废水处理系统进行监测的方法。从固体中分离出DNA和RNA并且进行定量扩增以测定特定微生物群的丰度以及特定降解性基因的表达水平。如果必要，可通过在扩增前进行寡聚dT杂交进一步纯化来自真核微生物的mRNA。
微生物丰度通过测量一种“指示”基因的水平进行评估，降解潜能通过测量一种“效应”基因的表达水平而进行评估。指示基因的丰度相关于所述的样品的活性微生物含量(AMC)，效应基因的表达水平相关于活性生物除污物含量(ABC)。比生物除污物含量(SBC)为ABC除以AMC。精确单位并不重要，而且可以根据方便而改动。
该废水处理系统通过诸如加入营养物而进行扰动，并且对该过程进行重复直至AMC和ABC以及/或者SBC处于根据经验而预定的最优操作范围。高ABC值显示了效应基因的高水平表达。很低的AMC值表明这些细胞已经死亡并且在检测点之上降解。高的SBC值表明细胞非常健康并且效应基因表达很强。
该方法可被用于实现对废水处理系统的实时监测，并且因此特别可用于对某一给定的系统进行最优化，这是因为可进行非常迅速的反应评估。进一步，该监测方法比现有的方法更为灵敏，并且还具有显著更高的特异性，这是因为被分析的是主动产生降解潜能的活细胞。
在一个实施方案中，该方法使用了竞争性定量PCR和竞争性定量RT-PCR来分别测量指示基因丰度和效应基因的表达。但是，还可以使用qPCR和qRT-PCR的非竞争性的，动力学以及组合方法。本发明以一种内部对照构建体进行例示，它产生了指示/效应基因PCR产物的一种大小上的变体。这在最大程度上降低了序列特异性的PCR伪迹，并且有助于确保定量的精确。竞争物经仔细测试以保证在被扩增片段大小上的微小改变并不会显著地影响PCR扩增的效率，但是测试显示大小上的微小改变(50bp)并不明显地影响循环效率。其它内部对照也是可能的。
gox基因在本发明中被用作指示和效应基因两者，但是其它的指示基因也是可能的，只需要该指示基因在基因组中稳定并且具有某些对于目的微生物是独特的序列。该效应基因可以是任何降解性基因，但是该基因优选编码在给定降解途径中的限速基因。其它的效应基因的例子包括nahAc、pox、ditAl、merP、merT、amoA和mntA基因。
本文的方法的例示为在经琼脂糖凝胶电泳分离后对染色的PCR产物的密度测定，但许多定量方法是可行的。一些没有完全实现的技术可能会在以后证明是可用的，这些技术包括基于NMR或者质谱的方法。但是，当前的标准为基于杂交的方法。基于杂交的定量方法相当灵敏并且通过使用DNA芯片或者微量滴定板扫描仪可很容易地进行自动化。例如，产物特异性引物可进行示差标记，以此而允许对两种产物进行检测。定量的方法有很多，广义形式下的本发明并不限于此方面的具体方法学。
本方法通过一种连续流动活性污泥系统进行例示，但可以应用以任何系统类型，其例子包括程序化分批测试反应器、填充床反应器系统、固定化细菌系统、流化床反应器系统、滴滤系统以及旋转生物接触器系统。
附图简述
图1.连续流动活性污泥系统的典型组件。
图2.单级测试反应器。
图3.反应器A的gox mRNA定量。在对gox和cgox的PCR产物进行电泳分离和密度测量定量后，对于每个内标浓度的cgox的PCR产物和gox的PCR产物之比例对加入至每个反应的已知cgox(pg)值进行作图。使用线性回归分析对数据进行分析。cgox∶gox之比等于1的点代表等值点。
图4.反应器B的gox mRNA的定量。详见图3。
图5.反应器溶解氧(DO)扰动实验。
图6.DO扰动实验期间的草甘膦透过(breakthrough)
图7.DO扰动实验期间的草甘膦DNA。
图8.DO扰动实验期间的草甘膦RNA。
本发明实施方案的详述
本发明通过gox基因进行例示，但是可以以任何在生物处理过程中很重要的基因进行实施，只要关于指示/效应基因组合的序列信息可用于产生特异性引物。在理想情况下，效应基因编码某种给定的降解性或者生物除污途径的限速酶，并且指示基因对于应用于该途径的微生物是独特的。因此，基因拷贝数和表达水平应同该生物处理过程良好地相关。
指示和效应基因可以是相同的基因。这简化了过程并且保证了两种测量同该系统的降解潜能相关。但是，在另一个实施方案中，指示基因和效应基因是分离的基因。指示基因可同效应基因(例如gox基因)紧密连接，从而使指示和效应基因并不分离。或者，该指示基因可以为任何具有独特序列的单拷贝基因，为存活必须对该基因进行维持，因此该基因的丰度精确地相关于目的微生物的丰度。该指示基因甚至可为一种常见的管家基因，只要用于扩增该指示基因的引物对于该目的微生物是独特的。通过这样的方法，基因的丰度精确地显示了具有降解潜能的微生物的丰度，并且其它的微生物未被定量。如果需要，也可通过分析遍在基因的水平而测量总微生物含量(TMC)。
尽管该系统在此通过参考gox基因进行例示，但是其它多种基因可被使用。例如，微生物已经被用于螯合、沉淀多种重金属离子或者改变其氧化状态(Pazirandeh et al.，1998，Appl.Environ.Microbiol.64：4068-4076)。镉或者汞的再生效率可以分别通过测定摄取基因mntA(Hao et al.，1999，Appl.Environ.Microbiol.65：4746-4752)或者merP(或merT)(Ravel et al.，2000，J.Bacteriol.，182：2345-2349)的丰度和表达来进行测定。表1列出了一些可能在本发明中有用的基因。
表1
底物和效应基因
本发明提供了基于PCR的方法以用于对给定的指示基因的DNA的量和效应基因的表达水平进行定量测量。这样的测量提供了存在于某种给定的生态系统中的特定的生物处理微生物的量的具体信息(例如，由指示基因水平所反映的AMC值)，还提供了生物处理活性水平的具体信息(即，由效应基因表达水平所反映的ABC值)。将该信息同目前所测量的废水处理系统参数相结合，不仅用以提供对这些系统进行监测的手段，而且用于改进对这些系统进行主动的，近于实时控制的方法。
本发明在本领域的应用在典型情况下涉及从用于处理含草甘膦的废水流的活性污泥进行取样，还涉及从该样品进行指示/效应基因组合的PCR扩增。近于实时的控制通过由这些基于PCR的方法提供的信息而实现。对草甘膦降解性微生物的丰度和这些微生物的gox表达介导的草甘膦降解活性水平的定量测量可允许在控制参数中进行知情的改变，从而完成更为有效的废水生物处理，例如，草甘膦降解。
例如，正如低活性微生物含量(AMC)所反映，当指示基因水平很低时，以额外的微生物对活性污泥进行重新补充可能是必需的。当由低活性生物除污物含量(ABC)所反映的效应基因表达值低，而AMC显示存在所需的微生物时，可能必须在开始该系统的大规模加载之前使样品进行适应。当ABC和AMC低于最优值时，ABC和AMC测量值可被用于对系统反应进行给定参数改变的快速校准，所述参数例如pH、氮水平、加载速率和流速。因此，ABC和AMC测量可以提供废水处理系统的近于实时的监测，并且由此而提供对该系统的迅速得多的优化。
在本发明的一个实施方案中，在避免草甘膦透过的同时所达到的废水加载增加的速率是以一种基本主动的方式进行测定，该方式特异于草甘膦降解活性(GDA)的主要机制——gox介导的分解代谢。草甘膦的透过在废水加载量超过设备的草甘膦处理系统的处理能力的情况下发生；如果未观察到草甘膦的透过，则加载量在某种程度上相当于或者低于处理能力。另一方面，常规的方式(例如，基于OUR的测量方法，结合以对废水流出物中的关键成分进行的分析)在避免草甘膦透过的同时，在最优的被动和非特异方式下仅仅提供了对废水加载增加的速率的粗略估计。
基于PCR的测量，特别是竞争性qPCR和竞争性qRT-PCR，在对草甘膦废水处理能力和比生物除污物活性的测定方面提供了迄今尚无先例的精确性。通过使用活性微生物含量(AMC)的测定而非粗略的MLVSS估测而完成了对gox基因拷贝的精确定量或者微生物计数，由此而提供了可被用于对生物处理系统的降解活性进行更精准预测的信息。进一步，通过对活性生物除污物含量(ABC)的测定以及比生物除污物含量(SBC)值(SBC＝ABC/AMC)的测定，可以获得一种系统的gox基因拷贝的相对表达或者活性的直接信息。ABC、AMC和SBC值亦可被用于估测一种系统对草甘膦加载量的变化作出迅速反应的能力。
在一个方面，本发明提供了改进的方法，该方法用于测定能够降解草甘膦的微生物生物物质的特定估计值。对这些估计值进行测定的常规方法依赖于F/M比例的测量，特别是依赖于FBOD/M比例，即，BOD(kg/天)/MLVSS(kg)。然而，可用于对BOD(特别是对于草甘膦特异性的BOD或者BODgly)和MLVSS的估计值进行测定的方法通常是冗长的并且不允许对草甘膦的降解进行主动的，近于实时的控制。
基于PCR的方法提供了AMC的测量以替代粗略的MLVSS测量。基于gox基因拷贝的精确定量的AMC估测值，即，AMCgox估测值，提供了可被用于对一种生物处理系统降解草甘膦的最大能力进行更精准预测的信息。进一步，基于PCR的方法还提供了对ABC的精确的功能特异的测量，以替代易出错的非特异性OUR测量。ABC测量提供gox基因表达的直接信息，即，ABCgox测量，并且可被进一步用于估测gox的SBC值，即SBCgox值，这是因为SBCgox是ABCgox/AMCgox之比。针对某种特定效应基因的基于PCR的SBC估测提供了一种生物处理系统降解某种废水成分的能力的近于即时的或者快速成像的快照。
本发明的方法(例如，用于估测微生物生物物质和活性)是用于评估过程性能的常规方法的重大突破。如上文指出，常规方法依赖于以BOD(kg/天)/MLVSS(kg)表示的对总体和特异性F/M值的估测，而本发明一个方面提供了对特异于草甘膦的F/M比值的估测，该估测部分地使用了与效应基因gox连锁的指示基因的拷贝数进行基于PCR的定量。例如，特异于草甘膦的F/M比值的估计值应等于草甘膦流入(kg/天)/AMCgox(kg)，其中AMCgox为具有一个拷贝的gox效应基因的活微生物的千克质量。再举一例，特异于草甘膦的一种潜在地更为有用的F/M比值估测应等于草甘膦流入(kg/天)/ABCgox(kg)，在本例中ABCgox为，被表达的gox的mRNA的量。
由于常规方法的F/M比值可被用于将生物处理过程的性能同总体废水加载量进行关联(但对废水中多种特异性成分具有困难)，本发明方法各方面所提供的F/M比值不仅可被用于将生物处理过程的性能同总体废水加载量进行关联，而且还可将该生物处理过程的性能同某种具体的废水成分，例如草甘膦的加载量进行关联。用于测定过程参数的常规方法不能提供这种信息，这是因为F/M比值的分母的估计值，即，MLVSS，(a)仅仅为生物物质的一个粗略估计并且不能分辨存活或者非存活细胞；(b)并不能对生物物质的具体关键成分加以辨别，例如对并不携带效应基因(如gox)的微生物同携带该基因的微生物进行辨别；以及(c)并不提供由mRNA水平所显示的有关特定的降解性活性的信息。
草甘膦流入(kg/天)/ABCgox(kg)的F/M比值并不具有上述的缺点。该分母ABCgox基于携带gox效应基因的活细胞所表达的mRNA水平。因此，在本发明的一个方面中提供了用于修饰废水生物处理中的有效GDA的控制参数的信息，该修饰通过基于PCR的监测所实现的测量而进行。
实施例1：基于PCR的测量
为进行活性污泥的分析，根据下文描述而获取3.0-4.5ml的样品并且将其转入灭菌的1.5ml微量离心管并且立即置于冰上。随后的全部操作在＜4℃，或在离液核酸稳定剂(BIO101TM，Vista，CA，目前是OBIOGENE，Carlsbad，CA)存在下完成。3.0ml活性污泥的样品含有大约150-200mg污泥固体(湿重)。目前对异养微生物群落的估计表明，所述3.0ml的样品含有大约2.1×108个细菌细胞。通过在15,300rpm下离心30秒而收集悬浮固体。
然后倾析活性污泥混合的液体，立即在-80℃下冷冻污泥沉淀物。样品在进行核酸提取之前必须在-80℃下保存，除非在倾析之后立即进行从污泥沉淀物的提取。-80℃的保存优选持续少于一周，并且不超过一个月。
活性污泥的冷冻沉淀物在冰上进行融化并且重悬浮于无菌水中。随后使用标准试剂盒(例如FASTDNA或者FASTRNA试剂盒(BIO101TM)，根据制造商的建议)迅速提取核酸(DNA或者RNA)。所提取的DNA在-20℃下保存。所提取的RNA在-80℃下保存并且在30天之内进行分析，尽管在必要的情况下RNA稳定剂可以延长RNA保存期。
或者，在必需更大量的RNA的情况下(例如，当gox表达水平低时)，可以使用经改动的热苯酚法(Fleming et al.，1993 Eviron.Sci.Technol.27：1068-74)来提取RNA。使用对该方法进行的改动而进行的RNA提取如下：将活性污泥沉淀物与500μl裂解缓冲液(0.05M乙酸钠(NaAc)，0.05M NaCl，0.003M EDTA，1.0％SDS，pH5.2)进行混合，在中等设置下涡旋，并在60℃下温育5分钟。加入500μl酸化苯酚(以NaAc进行缓冲，pH5.2，预加热至60℃)以及100μl氯仿∶异戊醇(24∶1)，并在中等设置下将该混合物涡旋10秒，随后在60℃下再进行5分钟的温育。随后在冰上温育该样品(4℃)5分钟并且在15,300rpm下离心15分钟。
随后将上清液转入一个干净的无RNA酶的微量离心管中，同一倍体积的100μl氯仿∶异戊醇(24∶1)进行混合，涡旋振荡10秒种(中速)，并且进行离心(15,300rpm)5分钟。随后将该水相(顶层)转入一个干净的无RNA酶的管中，同1/10体积的3M NaAc(经DEPC处理)和一倍体积的异丙醇相混合，颠倒该管以完全混合，并且在室温下温育5分钟。在15,300rpm下离心15分钟之后，弃去上清液并且以DEPC处理过的70％乙醇洗涤沉淀。在100μl经DEPC处理过的水中溶解RNA沉淀并且在-80℃下保存。
在进行竞争性qRT-PCR分析之前必需将污染DNA除去。将RNA样品与1/10体积的100mM MgCl2/10mM DTT以及100单位的DNA酶I(无RNA酶)进行混合。混匀该样品并在37℃下温育15分钟。随后将样品再度混匀并再温育15分钟。加入1/10体积的3M NaAc以及1体积的异丙醇并将该样品温育5分钟，并且离心15分钟。以70％的乙醇(经DEPC处理)洗涤沉淀一次。随后将RNA模板沉淀物溶解于DEPC处理过的水中(终浓度1μg/μl)。
gox引物和各种PCR产物示于表2。
表2A
序列鉴定
表2B
序列鉴定
INVITROGEN Carlsbad，CA
使用GA1/GA2引物组或者GA4/GA2引物组(关于gox PCR的更多信息见US5463175以及US5776760)产生了长为504bp(SEQ ID NO.：3)或者192bp(SEQ ID NO.：1)的gox PCR产物。使用PCR还产生了一种竞争物模板，该模板在504bp和192bp的gox PCR产物的3′-末端附近含有一个50bp的缺失。从该504bp gox PCR产物中缺失50bp以产生该cgox PCR产物的过程通过使用GA3引物而辅助进行，该GA3引物靶定于该gox基因的3′-末端和在该结合位点上游50bp的区域。引物的结合导致了50bp的gox DNA成环状脱离引物位点，并且因此而被排除于PCR延伸之外。这产生了一个454bp的DNA序列(SEQ IDNO.：4)；具体说来，504bp gox PCR产物中435位的胸腺嘧啶残基到484位的胸腺嘧啶残基所限定的50bp的序列缺失。这一竞争物gox(即，cgox)DNA片段被连接入一个PCRII-TOPO质粒载体(INVITROGENTM Carlesbad，CA)，该载体含有两个启动子位点(T7和SP6)，该载体允许进行直接的转录，该转录产生反义或者反义RNA链。
用于竞争性RT-PCR的cgox mRNA的常规制备如下进行：从细菌宿主中对质粒DNA进行提取(例如，根据制造商的指导使用Plasmid Midi试剂盒(目录号#12143，QIAGENTM，Valencia，CA)进行)。使用EcoRV和BspHI限制性内切酶剪切5μg的质粒DNA，消化物使用1.0％低熔点琼脂糖进行电泳。下一步，将含有该cgox DNA片段的1654bp的EcoRV-BspHI片段从凝胶中切出并进行纯化(例如，使用QIAGENTM的凝胶提取试剂盒)。随后对经纯化的DNA进行定量并随后进行转录(例如，AMBIONTM，Austin TX的MEGAscriptTM体外转录试剂盒)。SP6启动子的转录起始产生了cgox mRNA的有义链。随后对cgox mRNA进行DNA酶处理并且使用酸化苯酚和氯仿进行纯化，进行定量并保存于-80℃下直至使用。
使用DEPC处理的灭菌水，在0.2ml的PCR管中将0.1-5.0μg无DNA的RNA模板与25.2pmol的反义引物(GA2S或者GA2)和0.01-25pg的cgox mRNA混合，将反应体积调整至9.5μl。在70℃下加热该引物/模板混合物5分钟并且迅速冷却至4℃(在进行逆转录温育之前，反应混合物被维持于4℃)。向该混合物加入5.5μl主混合物，该混合物含有200单位的MMLV逆转录酶/反应，1×MMLV逆转录酶反应缓冲液(例如，目录号#M1701，PROMEGATM，Madison WI)以及1.0μl的10mM dNTP混合物(ROCHETM，Indianapolis，IN)。通过将完整的反应混合物在37℃下温育1小时而进行逆转录。随后进行5分钟的75℃(用以灭活逆转录)和0-4℃温育(短期保存)。通过逆转录而制备的DNA混合物可在-20℃下长期保存。
随后使用以下的PCR方案对通过逆转录而制备的DNA样品进行分析。两种主混合物被优选地使用以使产生非特异性扩增伪迹的可能性最小化。第一种主混合物为引物混合物，该混合物含有0.4-1.0μM的每种引物(GA1/GA2或者GA4/GA2)以及0.2mM的每种dNTP；使用无菌的PCR级水将该引物混合物的体积调节至24μl/引物混合物。在0-4℃下冷藏该引物混合物直至PCR。
第二种主混合物为Taq酶混合物，该混合物含有Taq DNA聚合酶(1-5单位/反应)以及1×PCR缓冲液(10mM Tris-HCl，pH9.0，50mMKCl，0.1％Triton X-100以及2.0mM MgCl2)；总体积被调至24μl酶混合物。在0-4℃下冷藏该引物混合物直至PCR。随后在0.2μl的PCR管中将2.0μl的通过逆转录而制备的cDNA同24μl引物混合物以及24μl Taq酶混合物进行混合。
在混合期间PCR管被保持于0-4℃下并且立即在PCR热循环仪中进行温育，温育根据以下方案进行：1)在95℃下进行5分钟的起始变性，继之以PCR循环，该循环使用92℃的变性温度15秒，在57.5℃下退火30秒并且在72℃下延伸30-45秒；以及2)在进行20-50个PCR循环之后，在72℃下进行7分钟的延长延伸。该PCR产物可在4℃下短期保存；长期保存在-20℃。
对于DNA分析，尽管用DNA样品替换了RNA样品，这一相同的PCR方案使用以下的改动而实施：1)根据所需循环数和DNA的来源而调节模板浓度(例如，染色体DNA的模板浓度应为0.1-1μg)；以及2)每个PCR反应的总体积为50μl。
PCR产物的定量通过琼脂糖凝胶电泳而进行，但其它方法亦可被使用，包括，基于杂交的方法，如DNA芯片定量。将PCR反应与5.5μl加载染料(例如，含有40％蔗糖溶液的被1∶10稀释的天然琼脂糖10×凝胶加载染料，AMBIONTM)进行混合。将50μl该混合物加载至含有0.4μg/ml的溴化乙锭的1.2-2.5％琼脂糖凝胶之中。随后在80-140伏下进行2-4小时的电泳。
使用凝胶记录系统(例如ALPHAIMAGERTM2200TM，ALPHA INNOTECHCORP.TM，San Leandro CA)对凝胶进行成像并且使用密度测量法测定DNA的量(例如，根据ALPHA INNOTECH CORPORATION.TM)。
在替代和优选的情况下，实时PCR监测被用于观察PCR产物。gox/cgox竞争性PCR和RT-PCR策略最适于进行实时PCR监测，该监测使用能够对多重PCR产物进行定量的PCR热循环仪进行。该PCR监测可在商业化的设备中完成，例如BIORADTM(Hercules，CA)ICYCLERIQTM、STRATAGENETM(La Jolla，CA)的MX4000TM或者ROCHETM的LIGHTCYCLERTM。
该实时PCR方法可使用cgox产物所固有的50bp缺失作为区分gox和cgox产物的机制。理论上，靶定于该50bp缺失区域的探针可被用于检测该gox产物(使用一种荧光波长，例如红色)并且第二种探针可被用于通过靶定另一种共有区域而检测所有的cgox和gox产物。(使用第二种荧光信号，蓝色)。在替代的情况下，按照LIGHTCYCLERTM，该扩增反应可使用一种非特异性的双链DNA结合染料，例如SYBRGREEN ITM(ROCHETM)进行监测，该监测结合于对cgox和gox产物的区分而进行，该区分基于这两种产物的特异的解链温度。
这些方法将会明显地减少分析时间，这是因为它们无需对扩增产物进行电泳分离并且无需随后通过密度测量而进行定量。实时PCR将完全对异双链体的形成进行校正，可以立即鉴别出失败的实验并且通过设置精确点(exact point)而允许提高灵敏度，在该精确点伪迹开始积累。
实施例2：对Fayetteville活性污泥进行的增强RNA提取
根据实施例1的详细描述，使用热苯酚法对Fayetteville活性污泥实施RNA提取，该活性污泥获自位于Fayetteville，North Carolina(即，Cedar Creek Road，Fayetteville，NC 28301)的Monsanto制造厂。使用RNA提取的热苯酚法增加了核酸收率，该方法同FASTRNATM方法相关。在典型的情况下，RNA提取的热苯酚法从每4.5ml的活性污泥中产生约20μg无DNA的RNA。该热苯酚法还可被扩大规模以从活性污泥固体中提取更大量的RNA，并且由此而更进一步提高了总体产量。然而，为了实施的便利，FASTRNATM方法对于常规的RNA提取仍然具有吸引力，特别是在通过常规方法可得足量的RNA产量的情况下。
实施例3：增强的gox竞争性定量RT-PCR
在该竞争性qRT-PCR过程中可实现多种额外的增强。这些增强包括，增强了含有gox或cgox mRNA标准的贮存溶液的稳定性(例如，使用1.0mM的柠檬酸钠)，降低了对于gox或cgox mRNA的检测限制，并且提高了对gox进行竞争性qRT-PCR过程的PCR步骤中逆转录/复制的保真度。
使用10mM的Tris缓冲H2O(对于cgox DNA标准)以及1.0mM的柠檬酸钠(对于cgox RNA标准)而制备竞争物gox内标梯度。对于cgox DNA，使用常规方法制备标准溶液，该溶液在每100μl mM Tris缓冲H2O中含有25pg到1.0pg的cgox-质粒载体DNA(例如25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.2以及0.1pg，即，分别为2.87、1.44、0.72、0.36、0.18、0.09、0.04、0.02以及0.01pg的实际cgox序列DNA，其中实际cgox序列DNA的质量等于载体DNA质量乘以gox插入片段大小与总载体长度的比值)。对于cgox RNA标准，使用常规方法制备在大约每100μl 1.0mM柠檬酸钠中含有10到0.01pg cgoxRNA(例如，10、5、2.2、1.25、0.63、0.31、0.16、0.08、0.04、0.02和0.1pg)的溶液。
在RT-PCR之前进行全面DNA酶处理很重要，在实施例1中已经详细描述。针对特异性逆转录方案而进行的实验显示，RNA的二级结构可显著地影响实验结果。通过加入一个预先的变性步骤，使用0.5到5.0μg分离自Fayetteville活性污泥的总RNA观察到了gox cDNA产量的线性提高。对于这些研究，提高的RNA加载量和缓冲mRNA标准的配合使用已经实现了对每1.0到5.0μg总RNA中的少至约9.08fg goxmRNA(即，1×10-15g gox mRNA)的检测。
根据在2.0％的琼脂糖凝胶电泳分离之后进行的cgox和gox产物的定量测定，gox竞争性qRT-PCR实验的结果显示了对cgox mRNA的线性扩增。在进行这样的电泳之后的阴性对照泳道中(即，不经逆转录步骤而制备的RNA样品)无带。对密度测定值进行的回归分析表明，如图3和4所示，这些数据在可接受限之内拟合为线性模型。
特别地，在对PCR产物水平进行密度测量之后，反应器A中的cgox浓度(见图3)经计算为3.77×104个拷贝的gox mRNA/μg总RNA，如下：
y＝mx+b，其中m＝斜率，b＝y轴截距
y＝0.071x-0.0275(通过对这些数据点的线性回归分析)
当x＝1时，即，cgox/gox＝1时，y＝0.0442pg cgox＝0.0442pg gox，但是使用了5.0μg总RNA，因此
0.0442pg cgox÷5.0μg总RNA＝0.0088pg cgox/μg总RNA
0.0088pg cgox/μg总RNA×4280249个拷贝的cgox/pgcgox＝3.77×104个拷贝的cgox/μg总RNA起始物质。因此同样有3.77×104个拷贝的gox RNA/μg总RNA起始物质。
类似地，在对PCR产物水平进行光密度测量之后，反应器B中的cgox浓度(见图4)经计算为1.24×105个拷贝的gox mRNA/μg总RNA，如下：
y＝mx+b，其中m＝斜率，b＝y轴截距
y＝0.068x+0.0044(通过对三个数据点的线性回归分析)
当x＝1，即，cgox/gox＝1时，y＝0.0724pg cgox＝0.00724pg gox
但是使用了2.5μg总RNA，因此
0.0724pg cgox÷2.5μg总RNA＝0.0290pg cgox/μg总RNA
0.0290pg cgox/μg总RNA×4280249个拷贝的cgox/pgcgox＝1.24×105个拷贝的cgox/μg总RNA起始物质。因此同样有1.24×105个拷贝的gox RNA/μg总RNA起始物质。
表3为对cgox和gox的集成光密度(IOD)，它被用于产生图3和图4的三个数据点，如表3所述。
表3
GOX RNA拷贝数估测值的集成光密度(IOD)
前述的实施例描述了gox mRNA的定量。为对gox DNA进行定量而使用了同样的方法，不同之处在于使用了仅仅0.1μg总DNA而不是5.0μg总RNA(对于反应器A)或者2.5μg总RNA(对于反应器B)。因此，pg cgox DNA值被除以0.1μg总DNA。进一步，该商值被乘以2140125拷贝cgox DNA/pg cgox的换算因子。
实施例4：废水处理的模拟
在该研究中使用Eckenfelder设计的两种连续流动反应器(Adams，C.E.，D.L.Ford，and W.W.Eckenfelder，1981，Developmentof Design and Operational Criteria for Wasterwater Treatment.Enviro Press Inc.，Nashville，TN.)。图2所示为一种单级测试反应器的通用设计。废液池(或反应器)71由混合器83进行混合。空气通过气管73提供并经气石75扩散。如果必要，包括阀门81，以用于在经废水流出管77排出液体之前使固体沉积在堰79附近。通过填料管85对池71进行填料。
进行了一些实验以测定用于使草甘膦在上述两个反应器中降解的最优操作参数。这些反应器的混合通过使用一种电子实验室混合器以及一个水池型气石而进行。混合的污泥溢过堰而进入置于该台阶下的净化器。流出物从该净化器流出(通过重力)而进入一个废水容器并且沉积的污泥使用一种速率可调节的蠕动泵(MASTERFLEXTM，COLE-PARMER INSTRUMENT CO.TM，Chicago IL.)而被泵回该反应器，该蠕动泵钩住一个间隔计时器(CONTROLTM，LINDBURG ENTERPRISES，INC.TM，San Diego CA)。空气(具有对池内气体的紧急转换系统)通过蒸馏水瓶而被泵入，该蒸馏水瓶被用于在泵入反应器之前进行加湿。反应器中的溶解氧水平维持于2.0到4.0mg/L。水池型加热器配以电子控制器而进行使用以维持混合液体的温度为19到23℃。
各个反应器均填入2.2L的活性污泥，该污泥收自位于Fayetteville，North Carolina的Monsanto制造厂。来自于Fayetteville制造厂的真实的流入废水被用作为实验室生物反应器的填料并且在维持于4℃下的冷室中保存直至使用。
用96.2％的硫酸调节反应器的流入pH以将混合液体pH维持为6.8到7.8。加入NH4OH溶液以向该反应器填料中额外补充15-30mg/L的NH4+。使用蠕动泵(COLE-PARMER INSTRUMENT CO.TM，Chicago IL.)将流入废水补充入该反应器，其水力流速足以产生3.3天的反应器HRT。同样使用蠕动泵将自来水连续地加入该反应器以补偿蒸发的损失。定期从反应器中除去一定体积的混合液体以维持MLVSS值于4000到5000mg/L并且维持污泥年龄值为60到100天。FBOD/M比值被维持于0.14-0.25天-1以提供反应器中草甘膦降解的恒定水平。
这些测试表明，草甘膦降解的最优参数为40到80天的MCRT、3到6天的HRT、4到8g/L的MLVSS、3500到6000mg/L的流入BOD、0.14到0.23天-1的FBOD/M、18到35℃的温度、10到30mg/L的流入氮浓度以及50到250mg/L的流入草甘磷浓度。
同样的系统使用在实施例1中所描述的PCR方法进行了测试。在如前所述的最优操作参数下对竞争性qPCR以及竞争性qRT-PCR所产生的产物水平进行了测量，并且从多种方面对该系统进行了扰动以观察PCR产物的改变。对多种参数进行了测定，包括：
活性微生物含量(AMC)为竞争性qPCR产物量×CF1，其中CF1为第一换算因子。活性生物除污物含量(ABC)为竞争性qRT-PCR产物量×CF2，其中CF2为第二换算因子。比生物除污物含量(SBC)为ABC/AMC×CF3。这些换算因子可为1或者便于操作者的任何单位。
用于改变实验室反应器的草甘膦加载量的实验设计在表4中描述。
表4
使用实验室反应器进行的草甘膦加载量研究
表5提供了一个例子，该例子详述了在向两个反应器加载草甘膦之前和之后的gox DNA和gox mRNA产量
表5
在草甘膦加载前后的GOX DNA和MRNA产量
*等于或者低于检测限，**检测到，但未定量
在表5中，AMC被任意地选定以每μg提取自特定样品的起始DNA的fg PCR产物为单位而表达，而不是每μg起始DNA的含有gox基因的生物物质的质量(kg)。因此，该测定假定对于不同样品的DNA提取效率是相等的，否则样品的处理则是一致的。设计了一些实验用于证实提取效率是一致的，并且如果观察到了变异，可以进行核酸掺加研究，该项研究对数据或者提取和/或逆转录方法学进行了标准化，该方法学对结果一致性进行了优化。
类似地，表5中的ABC被任意地选定以每μg用于qRT-PCR的起始RNA的fg gox mRNA为单位而表达。在该情况下使用的为总RNA，但是如果考虑到灵敏度，聚A+RNA可被用于真核生物处理生物。在两种情况下都应该进行实验来保证提取效率、逆转录、扩增以及，如果使用，聚A+选择效率并非RT-PCR方法中显著变异的来源。确保提取一致性的一种途径为在液氮中迅速冷冻样品沉淀并且将该样品在苯酚中融化，这样便防止了收集后的RNA酶活性。当然，有很多可靠的提取和操作RNA的方法，在这一点上，实施者是充分熟练的。
表6为在稳态条件下受测PCR产物对草甘膦加载量的可重复的反应提供了额外的例子。这些实验在3或4天中进行，使用含量可能不同的真正的流出物。
表6
在草甘膦加载阶段3和4中GOX DNA以及mRNA水平
*ND＝未检测
在本实施例中，在相等的草甘膦加载量条件下所测定的gox DNA和mRNA水平是相近的。与之相反，gox DNA和mRNA PCR产物的丰度在反应器B中随着流入草甘膦的浓度从1000减至300mg/L而有所降低。
因此，实施例显示gox DNA和mRNA水平与草甘膦降解活性相关。gox PCR产物的产生随着草甘膦到反应器的加载量的提高而增加(表5)。近一步，gox PCR产物的水平随着草甘膦到实验室反应器加载量的减少而降低(表6，反应器B)。
进行了一个实验，用于测定反应于模拟的零mg/L溶解氧(DO)的系统扰动或者过程干扰条件的gox DNA和mRNA水平。使用一种连续流动实验室反应器将DO浓度从4-5降至0mg/L，维持在0mg/L下24小时，并且随后返回至正常的4-5mg/L的操作条件(见图5)。反应于系统扰动，混有液体的反应器的pH从8.0-8.3降至6.7，这同活性污泥微生物的生物活性的降低相一致。
在相同的实验中，在4小时后草甘膦从该反应器中最初被检测到并且在24小时后达到40mg/L的水平(图6)。这些结果同氧气在将草甘膦向AMPA的转化中被GOX酶被利用的发现是一致的(US5463175)。尽管gox DNA丰度在本实验的最初2小时内下降得很缓慢(图7)，但gox mRNA丰度迅速下降；在10分钟内约降低了66％(图8)。
这些数据支持，草甘膦降解活性的迅速改变是通过gox mRNA产生或者ABC的控制而受到调节，而且基于PCR的监测手段可以迅速地检测到生物处理效力的变化。在3-6小时的周期时间内，通过对gox DNA丰度的测定而提供了负责GDA的微生物群的大小的定量估测，这可被认为是测量草甘膦降解潜能。与之协同，通过对gox mRNA水平的测定而提供了gox基因表达的定量估测，这代表了负责GDA的微生物群在取样时间点上所表达的GDA。这样的数据可被用于将给定的gox DNA和RNA水平同给定的草甘磷处理能力相关联。本发明的该实施方案所产生的结果，即，gox DNA丰度和gox mRNA表达水平，提供了一种主动而非被动的方法以用于草甘膦生物处理系统的过程控制。这样的数据在本发明的该实施方案中预示了一个系统对于草甘膦的生物处理的能力，或者在其它的实施方案中预示了对于生物处理设备处理其它特异的目标成分的能力。
实施例5：对PIA降解的监测
在一个填入了处理含有N-膦酰甲基亚氨基二乙酸(PIA)的废水的活性污泥的反应器中明显检测到了gox DNA，PIA是gox蛋白的另一种底物。但是，在缺乏PIA的对照反应器中并未检测到gox DNA。因此，这些结果表明根据本发明的方面而进行的基于PCR的监测可不仅被用于检测草甘膦的降解，还可以监测PIA的降解。
实施例6：氮/微量营养物对GDA的影响的测定
前人的研究已经表明，添加氨可以在生物处理系统中提高草甘膦处理效力(Hallas et al.1992.Appl.Environ.Microbiol.58：1215-1219；Heitkamp et al.1992.Can.J.Microbiol.38：921-928)。但是，直到如今仍没有用于特异性测定氮对GDA的影响的方法，而且已经观察到的提高可能是由于促进细菌硝化作用的间接影响或者直接增加了草甘膦降解性细菌的数量和/或活性所造成的。同样还缺少用于特异性测定在有或者无氮(例如，以氨的形式)的情况下添加微量营养物对GDA的影响的方法。
以实施例4中所述的方式应用的本发明(即，提供了对含有诸如gox这样的效应基因的微生物的丰度和活性的测量)，将定量地显示氨对于功能性草甘膦降解群的大小和/或活性的任何影响，而不是对于整个活性污泥微生物群落的影响。现有的常规方法不能提供如此详细的信息，因此这些方法不能实现对控制过程的有效修饰。
以实施例4中所述的方式应用的本发明，还可以定量地显示微量营养物的添加对于功能性草甘膦降解群的大小和/或活性的任何影响。然而，对于微量营养物的添加，微量营养物添加对于gox AMC和/或ABC的影响可在实验室内使用酵母提取物作为微量营养物补充物而进行初步估测——酵母提取物为维生素和微量营养物质的一种常见来源。如果有利，进行随后的实验以评估添加商业化微营养制剂对于大规模生物处理系统的效果。
实施例7：毒性分子(或者任何抑制性因子)对GDA的影响
类似地，本发明提供了一些方法，这些方法可被用于测试毒性物质(或者任何抑制性因子)对于GDA的影响，并且测定毒性(或抑制)是由于细胞致死所导致还是由于对基因表达的总体效果所导致。毒性物质可包括多种杀细胞化合物，包括氰化物中的任何一种。抑制性因子所包括的范围甚广，例如，pH、温度、溶解氧、离子强度或者任何超出设计操作限之外的活性污泥关键参数。除效应基因之外还可对某种对照管家基因进行监测以提供评估细胞健康的对照。本发明在该情况下的使用将为该毒性事件是否杀死细胞、普遍地影响细胞健康或者特异性地影响GDA途径中基因的表达提供详细的信息。
根据本发明的实施方案而获得的结果将有助于确定所需要的纠正措施，例如对已经存在于系统中的GDA活性所必需的细菌进行复苏，或者向系统中补充额外数量的该细菌。
实施例8：在连续流动系统中监测GDA
在过去，已经实现了用于对有益于鉴定在活性污泥中建立并且维持适应的草甘膦氧化剂的条件的多种方法。根据本发明的一个方面而实施的基于PCR的监测将很大地增加这些方法的效力。
活性污泥方法已经在草甘膦处理废水的生物处理中起到了关键性的作用。相对于生活活性污泥，在用于处理草甘膦处理废水的活性污泥中已经发现了不同的微生物群。一些工业分离株已被发现能够利用广泛的有机物质(包括草甘膦)，这暗示了一个更为多样的微生物类别。
现场研究中，用于在废水生物处理系统的活性污泥中建立GDA的方法包括：(1)填入来自于工业生物系统需氧蒸煮器的污泥，(2)填入含有高水平草甘膦的处理废水流，以及(3)将浓缩的填料调理剂同提高的HRT(即，低F/M比例)相结合。这样的现场研究部分受阻于取样到测定之间所必需的延迟，以及在控制过程中作出有效改变(例如，通过调整MCRT、HRT、MLVSS、微生物群落结构、温度、pH、溶解氧、盐浓度(例如磷酸盐、硫酸盐或者硝酸盐)和/或活性污泥中的有机物浓度)的信息不足。
根据本发明的一个方面而实施的基于PCR的监测会显著地增强所有这些方法的效力，特别是通过根据本发明的另一个方面而实施的控制过程的实现。例如，基于PCR的监测可被用于在观察流出物中的草甘膦之前评估对含草甘膦的废水流的处理能力。高加载水平的含草甘膦的废水流对于COD、BOD或者草甘膦去除所需的微生物活性通常是抑制性的。gox丰度和表达水平的测定值可以是处理高加载水平的草甘膦所需的GDA的迫近损失的预测。在一些生物处理系统中，gox mRNA转录水平与存在的gox DNA序列的比值(由gox SBC值所表示)在可以从最终流出物中测量草甘膦之前便降低。在对gox SBC值和可能出现在最终流出物中的草甘磷量之间随时间的关系具有准确了解的情况下，可对关键性控制参数进行知情和有效的调整(例如，可通过降低流入水力加载速率而降低草甘膦加载速率，从而增加了水力存留时间)从而使存在于活性污泥之中的用于进行草甘膦降解的微生物具有更长的反应时间。
实施例9：检测程序化分批反应器中的GDA
半连续废水处理操作，例如使用程序化分批反应器进行的处理，为一种时间导向的过程，该过程可在单个池中进行。在许多情况下，相对于常规的活性污泥处理，使用程序化分批反应器提供了对二级处理设计的独特优势。例如，提供强选择压力的操作策略可更容易地在这样的系统中实现；在FILL、REACT、SETTLE、DRAW和IDLE方案中仅仅需要使用单个池(或者池序列)。基于PCR的监测可极大地增强该方法的效力，特别是通过由基于PCR的方法所实现的实时监测和系统最优化。
实施例10：监测固定化细胞系统中的GDA
固定化细菌技术的一个特别具有吸引力的应用是用于从大体积的液体废水流中将低浓度的特定化学物质“拭净(polishing)”或者“最终清除”。特别地，固定化于填充床反应器中的细菌已经证明对于在释放前从废水中进行低水平的活性除草剂的三级清除具有高效。正如连续流动和利用了程序化分批反应器活性污泥处理过程的情况，基于PCR的监测将显著增强固定化细菌系统的效力。
在此所引用的所有参考文献和专利均在此特意全文引入作为参考。
序列表
<110>孟山都技术有限公司
D.B.卡森
J.F.赖斯
<120>废水生物处理系统中基于PCR的监测
<130>49202_5
<150>US60/285,846
<151>2001-04-23
<160>12
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>192
<212>DNA
<213>人苍白杆菌LBAA株(OCHROBACTRUM ANTHROPI STRAIN LBAA)
<220>PCR产物
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<400>1
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tctggccgtt gatgcagcgg ttgtcgcagc cggcgcacac tcgaaatcac ttgctaattc 180
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<211>142
<212>DNA
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<220>PCR产物
<223>由细菌产生
<400>2
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tgtcatcggc tttgagactg aaggtagggc gcttaaaggc attacaacca cgaacggcgt 120
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acttgctaat tcgctaggcg atga 504
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<212>DNA
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<223>由细菌产生
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gcggcgtctc aacggtgttc gcacgcagat cctcagcgcc gatgcgttgc gggatttcga 240
tccgaacttg tcgcatgcgt ttaccaaggg cattcttata gaagagaacg gtcacacgat 300
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<213>未知
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机译： 废水生物处理系统中基于PCR的监测
机译： 废水生物处理系统中基于PCR的监测
机译： 废水生物处理系统中基于PCR的监测
