经鼻给药治疗缺血性脑血管疾病的药物制剂

摘要

本发明涉及含葛根有效成分的药物制剂，以及该药物经鼻给药在治疗缺血性脑血管疾病中的应用。本发明公开的药物组合物是由葛根有效成分提取物为活性组分与药用辅料组成的各种经鼻给药的制剂如滴鼻剂、喷雾剂、鼻粉剂、膜剂、凝胶制剂或乳剂等。该制剂能有效地预防和治疗缺血性脑血管疾病，具有生物利用度高，脑内药物浓度高，无不良反应，给药方便的特点。

说明书

技术领域

本发明涉及中药有效成分制剂，具体涉及含葛根有效成分的药物制剂，以及该药物经鼻给药在治疗缺血性脑血管疾病中的应用。

技术背景

脑血管疾病是人类的多发病和常见病。脑血管疾病的种类很多，常见的有脑动脉粥样硬化，脑供血不足，短暂性脑缺血发作，脑卒中(包括蛛网膜下腔出血、脑出血、脑梗塞)，高血压脑病，脑血管性痴呆等。其中脑卒中为城乡居民的三大主要死亡原因之一。随着医学的发展，脑血管疾病的死亡率虽有所下降，但依旧是威胁人类健康的主要疾病之一。脑血管疾病的发病多与脑供血不足、脑缺血、高血压、脑动脉粥样硬化有关。早期治疗可以减少脑组织的损伤。

目前，治疗脑血管疾病药物的给药途径主要是注射和口服给药。注射给药需要专业技术和器械，同时容易引起过敏反应，不适宜家庭用药；口服给药起效慢，部分药物胃肠道吸收差，在进入体循环之前就有可能被降解，包括胃肠道降解和代谢，肝脏首过效应等，导致药物的生物利用度降低，影响药物疗效的发挥。

经鼻给药在西医临床上耳鼻喉科应用极为广泛，一般用来冶疗各种鼻腔和鼻窦疾病，起到局部消炎、收敛和杀菌的作用。近几十年来随着对这一给药途径研究的深入，通过鼻粘模吸收发挥全身性治疗作用的药剂受到人们的重视，很有希望替代传统的注射给药途径。1984年，美国New Jersey，New Brun-swick召开了“全身性用药的鼻内给药途径”专题研讨会，认为鼻腔给药作为全身性用药是一个较为理想的给药途径。鼻粘膜表面积很大，人体鼻粘膜总吸收面积约150cm²。鼻粘膜下有丰富的毛细血管、静脉窦、动静脉吻合支以及淋巴网络。

西药经鼻给药已研究的药物已涉的有：抗生素、胰岛素、干扰素、脑垂体激素、麻醉药等。

目前已上市品种有：降钙素、催产素、安乃近、垂体后叶素、布托啡诺、舒马普坦等。布托啡诺是一种有效、安全的止痛剂，用于偏头痛的治疗。Sandoz公司二氢麦角胺用于治疗偏头痛的的鼻腔给药制剂均也已用于临床；尼古丁经鼻给药替代性戒烟也取得比较好的效果。

中药有效部位、有效成分经鼻给药治疗脑血管疾病还未见报道。

葛根为传统中药，《神农本草经》首次对葛根的性味功效作了记载，谓：葛根，味甘、平，主消渴、身大热、呕吐、诸痹、起阴气、解诸毒。《伤寒论》中记述太阳病或太阳阳明合病，用葛根治疗项背强几几、目痛等症。《肘后方》、《本草纲目》有用葛根治疗头痛等诸痹的记载。这里“诸痹”、“背强几几”等症可能与现代医学的高血压、脑血管疾病有关。

脑缺血等脑血管疾病的临床治疗目标是恢复供血供氧，抑制缺血部位的炎症反应及维持神经元结构和功能的完整性。中药葛根及其有效成分葛根素、大豆苷、大豆苷元等具有增加脑血流量、降低血压、保护神经细胞等功效。

目前含中药葛根的制剂主要有：“愈风宁心片”，为含葛根生药粉的半浸膏片，包糖衣或薄膜衣。存在口服给药吸收慢、口服生物利用度低，没有突释效应，10h左右释药不完全。以葛根素为指标愈风宁心胶囊在兔体内绝对生物利用度仅为5.45％；葛根素注射液是以葛根黄酮中的一种葛根素(Puerarin)为主，纯度大于98％的单一成分注射制剂。注射液需要专门的给药器械，使用不便，且容易出现多种不良反应。临床报道葛根素(普乐林)注射液的不良反应主要有致热反应、丙氨酸转氨酶、溶血反应，皮疹、血红蛋白尿、血管神经性水肿等。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种含葛根有效成分的经鼻给药制剂，该制剂能有效地预防和治疗缺血性脑血管疾病，具有生物利用度高，脑内药物浓度高，无不良反应，给药方便的特点。

本发明公开的预防和治疗缺血性脑血管疾病的药物组合物是以葛根有效成份提取物为活性组分与药用辅料组成的各种经鼻给药的制剂。

本发明所述的葛根有效成份提取物是指从葛根中提取的有效部位或分离获得的化学单体，如葛根总黄酮、葛根素、大豆苷或大豆苷元等。

本发明所述的葛根总黄酮是以野葛饮片为原料，以水为溶剂提取，再用大孔吸附树脂纯化获得。制得的葛根总黄酮经紫外分光光度法(UV)测定纯度大于60％，高效液相色谱(HPLC法)测试表明总黄酮中含葛根素大于20％，此外还含有葛根大豆苷、大豆苷元等黄酮类成分。

本发明所述的葛根素为市售，HPLC测定纯度大于97％。

本发明所述的大豆苷元为市售，HPLC测定纯度大于95％。

本发明所述的大豆苷是葛根总黄酮经氧化铝柱层析制备所得，HPLC测定纯度大于90％。

本发明所述的经鼻给药制剂是指医学上可接受的各种鼻腔制剂如滴鼻剂、喷雾剂、鼻粉剂、膜剂、凝胶制剂或乳剂等，所述的各种制剂均可采用常规方法制备获得。

本发明所要解决的另一技术问题是公开上述制剂在制备预防和治疗缺血性脑血管疾病的经鼻给药制剂药物中的应用。

本发明将葛根总黄酮经鼻给药制剂治疗缺血性脑血管疾病，药效学研究表明可以增加脑血流、保护脑缺血、减小脑梗死体积。本发明还将葛根有效成分葛根素同位素标记后，进行了经鼻给药与口服、注射给药等不同给药途径的生物利用度比较。结果表明，口服给药起效慢、生物利用度低，且吸收情况受胃内容物的影响较大。经鼻给药组，起效快，达峰时间15min左右，在一定程度上有望代替注射给药。

下面对本发明的药效和毒性试验作进一步的描述：

一、葛根有效成分葛根素不同给药途径血药浓度比较

将葛根素用¹²⁵I标记示踪，以雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠为试验动物。分注射、经鼻给药、口服禁食、口服不禁食四个试验组，给药后，不同时间采血，用γ-计数器测定血药浓度。结果表明：经鼻给药达峰时间、血药浓度均明显高于口服给药组。

1.1实验动物与试剂仪器

雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(由中科院啮齿类实验动物中心提供)，250g～270g；γ-计数器，Beckman DP5500XING型。

1.2实验方法

将雄性SD大鼠随机分为尾静脉注射、经鼻给药、口服禁食、口服不禁食四个试验组，每组动物3只。经鼻给药组每只老鼠每鼻孔给药10μl(浓度)，静脉、口服给药组，给药量为100μl(浓度)。给药后，不同时间颈动脉采血，离心，取血浆50μl。以γ-计数器测定放射活度。

1.3实验结果

实验结果表明，口服给药起效慢、生物利用度低，且吸收情况受胃内容物的影响较大。经鼻给药组，起效快，达峰时间15min左右，在一定程度上有望代替注射给药。结果见表1、图1。

表1葛根素不同给药途血药浓度比较(¹²⁵I同位素示踪，n＝3)

时间(min)15101530456090120180240300静脉注射7.62  ±0.564.01  ±0.262.85  ±0.0572.12  ±0.0441.74  ±0.0271.47  ±0.0421.31  ±0.0471.17  ±0.0961.06  ±0.0860.91  ±0.0570.79  ±0.00150.71  ±0.25经鼻给药0.21  ±0.120.89  ±0.061.27  ±0.141.45  ±0.401.28  ±0.371.12  ±0.320.97  ±0.290.77  ±0.230.74  ±0.180.63  ±0.330.39  ±0.18口服禁食0.14  ±0.0560.29  ±0.0590.40  ±0.0600.50  ±0.160.52  ±0.130.50  ±0.170.49  ±0.140.43  ±0.140.42  ±0.150.35  ±0.150.23  ±0.100.15  ±0.092口服不禁食0.011  ±0.0140.037  ±0.0220.053  ±0.0320.064  ±0.0440.070  ±0.0430.071  ±0.0490.070  ±0.0470.072  ±0.0470.069  ±0.0400.071  ±0.038

注：血药浓度以给药量的放射活度百分比表示。

二、总黄酮经鼻给药的药效学验证

用葛根总黄酮制剂多次经鼻腔给药治疗大脑中动脉栓塞模型(MCAO)大鼠(缺血1h，再灌注24h)，监测缺血2h内局部脑血流的变化，检查再灌注24h后神经功能缺损程度并计算脑梗死体积。结果表明MCAO引起局部脑血流显著下降，导致神经功能严重缺损、产生较大脑梗死体积；葛根总黄酮多次鼻腔给药可使脑血流下降幅度明显减小、神经功能缺损程度明显减轻、脑梗死体积显著缩小。因此，葛根总黄酮经鼻腔给药可以增加脑血流、缩小脑梗死体积，对急性脑缺血损伤具有很好的治疗作用。

2.1实验动物与试剂仪器

雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(由中科院啮齿类实验动物中心提供)，250g～270g；葛根总黄酮(PIF)滴鼻剂(上海中医药大学中药学院药剂教研室提供)；激光多普勒脑血流仪(PeriFlux System5000，PERIMED，USA)；红四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC，F20020401)，中国医药(集团)上海化学试剂公司(分析纯)。

2.2实验方法

大鼠大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型及实验分组：

采用Longa线栓法制作SD大鼠右侧局部脑缺血模型，脑缺血1h，再灌注24h。SD大鼠用乌拉坦1g/kg腹腔麻醉，仰卧固定，颈正中切口，分离组织，结扎右颈外动脉，暂时夹闭右颈总动脉、颈内动脉和翼额突动脉。将直径0.18mm的4/0型尼龙线(头端预先烫成圆球形，直径0.22mm)由颈外动脉切口插入颈内动脉，插线深度近20mm时有明显的阻力，脑血流监测可见B、C点脑血流骤然下降，MCAO模型即告成功，固定尼龙线并松夹，缝合切口。插线成功即开始记时，阻塞1h后，将尼龙线轻柔退致颈外动脉，即为再灌注开始。手术中和手术后(致动物苏醒)保温，肛温37±1℃。将尼龙线仅留在颈内动脉而不入颅为假手术组。

实验动物分4组，即MCAO模型组8只，PIF1组8只，PIF2组8只，假手术组(sham组)4只。其中PIF 1组与2组浓度差2倍，分别为含20％、10％的生理盐水滴鼻剂。在MCAO后0min、30min、再灌注后0min、30min、60min经鼻腔给药，每次10ul/鼻孔。模型组和假手术组用等剂量生理盐水滴鼻。

(1)脑血流监测

用颅骨钻于大鼠前囟后1.5mm水平，中线右侧旁开1mm、3mm、5mm处钻取三个直径1mm小孔(见模式图2)。插入激光多普勒脑血流仪光纤探头到大脑皮层表面(3mm深度)，检测并记录脑血流值，每5分钟记录一组数据。连续监测测读取MCAO前(基础值)、MCAO1h及再灌注1h内脑血流值。

(2)神经功能缺损评分

再灌注后24h进行神经功能缺损评分，评分标准^[11]：大鼠无任何不对称活动为0分，提起尾巴时左前爪不能完全伸展为1分，在1分的基础上左前肢活动障碍为2分，左前肢紧贴胸壁为3分，大鼠自由活动时向左侧转弯为4分，伴有明显的前爪后推动作为5分，只能围绕原点旋转为6分，完全不能支撑身体重量，只能躺向左侧为7分。

(3)脑梗死体积检测

再灌注24h，处死大鼠，快速取大脑，-20℃冷冻10min后，将大脑切成2mm厚脑片，浸入2％TTC-生理盐水溶液37℃，30min。染色后将脑片浸入4％中性多聚甲醛固定保存数天，拍照，用图象分析系统扫描测量脑梗死面积，换算成体积。计算出每个标本梗死体积占全脑体积的百分比。

统计分析：采用SPSS10.0软件，用单因素方差分析和t检验进行统计。

2.3结果

(1)PIF鼻腔给药对脑血流的影响

图3显示模型组脑血流的变化：A点在造模前后，仍维持在较高的血灌注水平，B、C点脑血流在造模后显著降低，C点脑血流降低程度最严重，持续处于很低的灌注水平，即使在再灌注1h内仍难以恢复到基础水平的一半。PIF鼻腔给药对脑血流的影响见图4，图4举例说明PIF对A、B、C点脑血流的影响；两PIF组均使受阻塞部位局部脑血流有明显的升高，减小了脑血流下降的幅度。

(2)PIF腔给药对大鼠神经功能评分的影响

神经功能缺损评分可评估脑缺血损伤的严重程度。结果(见图5)显示，脑缺血1h，再灌注24h时模型组大鼠神经功能缺损严重，平均达6级，而经PIF鼻腔多次给药后神经功能得到有效的保护，平均神经功能缺损分别仅为2和1.5级。

(3)葛根总黄酮鼻腔给药对MCAO大鼠脑梗死体积的影响

局部脑缺血的最终直接结果是脑梗死。脑组织缺血梗死体积的大小可以用TTC染色精确地反映(正常组织染成红色，梗死组织苍白)。图6分别显示了脑缺血1h、再灌注24后模型组、PIF鼻腔给药(鼻1组和鼻2组)和假手术组脑梗死面积的大小。图7为各组平均脑梗死体积百分比。模型组梗死体积平均为29.4％，PIF鼻腔多次给药两组的脑梗死体积均明显减小，分别平均为14.8％和12.2％。给药组与模型组梗死体积有显著性差异(t检验，P＜0.01)。

实验结果表明，在缺血再灌注的早期经鼻腔给予葛根总黄酮滴鼻剂能明显增加缺血局部脑血流。由于在脑缺血发生的早期及时增加脑血流，从而使脑组织避免严重和持续供血不足所导致的严重后果，有效地保护脑组织。脑梗死体积的检测和神经功能缺损记录的结果也说明早期采取的治疗措施由于增加了局部脑血流，最终使脑梗死体积显著缩小，神经功能得到有效保存。

三、毒性试验

3.1溶血试验

取家兔1只，心脏取血约20ml，置三角瓶中。用竹签搅拌去除纤维蛋白，然后将血移入刻度离心管内，加入生理盐水5～10ml，混匀后离心5分钟(2000～2500r/分钟)，去除上清液。再加生理盐水，混匀离心，反复3～4次，至上清液无色透明为止。将所得红细胞按容积，用生理盐水稀释成2％的混悬液。

取使馆试管7支，编号排列于试管架上，按下表加入各种溶液。第6管不加供试品溶液，作为空白对照。第7管，用蒸馏水代替生理盐水作为阳性对照，将各管轻轻摇匀，在37℃水浴中保温1小时。将配制葛根总黄酮滴鼻剂作为供试品溶液，结果高浓度组(20％)、低浓度组(10％)均不产生溶血反应，即试管中红细胞全部下降、上层液无色透明。说明葛根总黄酮对鼻黏膜细胞膜基本无毒性作用。

3.2鼻纤毛毒性试验

取中华大蟾蜍，体重30～40g，雌雄皆有。将蟾蜍仰卧固定于蛙板上，用止血钳牵拉，使口腔张开，于上腭粘膜处滴加药液0.5ml，使完全浸没上腭，接触30min后，分离上腭粘膜，用生理盐水洗尽血块、杂物及药物，粘膜面向上平铺于载玻片上，轻轻盖上盖玻片，于50倍生物显微镜下观察粘膜纤毛的运动情况，随后搁置于盛有少量生理盐水的培养皿中，密闭，使水气近饱和状态，环境温度20～25℃，此后每隔适当时间取出标本，显微镜观察，如纤毛继续运动，则将标本放回培养皿中，直至纤毛运动停止后，记录从给药开始至纤毛运动停止所持续的时间。以给药组的纤毛持续运动时间除以生理盐水对照组的时间，得纤毛持续运动时间的相对百分率，百分率越高，表示药物对纤毛运动的影响越小。

结果生理盐水组鼻纤毛摆动时间为738.0±50.6；葛根总黄酮滴鼻剂高浓度组(20％)，鼻纤毛摆动时间为698±32.7；葛根总黄酮低浓度组(10％)，鼻纤毛摆动时间为715±26.2。给药组与生理盐水组无显著性差异(t检验，P＞0.01)。说明葛根总黄酮对鼻纤毛基本无毒性作用。

本发明将葛根有效部位、有效成分以经鼻给药制剂的方式给药可大大减少患者的痛苦及医生的工作量。与口服给药相比，可以提高生物利用度，解决一些中药有效成分在胃肠道吸收较差，生物利用度低的问题；与注射剂相比，给药方便，可以提高脑内药物浓度，避免不良反应。

本发明以中药葛根为实例进行了研究，但不限于此味中药。具有增加脑血流量、保护脑缺血功效的中药有效部位、有效部位均可作为药物组合并制成相应的经鼻给药制剂。如中灯盏细辛中的灯盏花素、三七中的三七总皂苷等。

附图说明：

图1、不同给药途径血药浓度比较

图2、脑血流监测部位模式图

其中1为前囟，2为后囟

图3、模型大鼠局部血流变化

图4、葛根总黄酮鼻腔给药对MCAO大鼠局部脑血流的影响

图5、PIF鼻腔给药对MCAO大鼠神经功能缺损评分

图6、TTC染色显示模型、PIF1、PIF2和sham组脑梗死体积

图7、鼻腔给药对MCAO大鼠脑梗死体积的影响

具体实施方式：

实施例1：

滴鼻剂：取葛根总黄酮20g(纯度大于60％)，加入30ml丙二醇、50ml生理盐水使溶解。滤过，自滤器上加生理盐水至100ml，分装，即得。

实施例2：

喷雾剂：取葛根素20g，加入50ml丙二醇，150ml生理盐水使溶解。滤过，自滤器上加生理盐水至200ml，分装至鼻腔给药喷雾瓶中，即得。

实施例3：

鼻粉剂：将葛根素，粉碎，过筛。取粒径40～60μm的葛根素细粉8g，加入微晶纤维素2g，混匀，即得。共制得鼻粉剂10g。

实施例4：

鼻粉剂：将大豆苷元，粉碎，过筛。取粒径40～60μm的大豆苷元细粉8g，加入微晶纤维素2g，混匀，即得。共制得鼻粉剂10g。

实施例5：

鼻粉剂：将大豆苷，粉碎，过筛。取粒径40～60μm的大豆苷细粉4g，加入微晶纤维素1g，混匀，即得。共制得鼻粉剂5g。