自然诱发非豆科植物结瘤固氮技术方法和菌种

摘要

本发明涉及自然诱发非豆科植物结瘤固氮技术方法和菌种，该发明人为地从自然选育一组微生物菌群，能使豆科植物和130多种原本不能在根系结瘤固氮的非豆科植物一并地结瘤固氮；在尽量符合自然的条件下，即“开口发酵技术”，大工业化生产这一有益菌群，制成能用于各种植物(包括菌类——蘑菇)的广谱液体生物服料；进而又在自然条件下经多次固体发酵，生产固体生物肥料，这对人类赖以生存的农业生产，具有重大的科学意义和重大经济价值，可以解决土壤板结，对水资源和环境的污染及作物遗传性的破坏，农产品品质下降等种种难题。

说明书

技术领域

本发明涉及一种自然诱发非豆科植物结瘤固氮技术方法及菌种。

背景技术

自然界有些微生物能将空气中的氮转化为氨，为植物、动物和其他微生物生长提供氮源，称之为生物固氮，据联合国粮农组织(FA0)1995年粗略估计，全球每年度由生物固定的氮量已近2亿吨(相当于4亿吨尿素)，100多年的科学研究，认识到生物固氮只提供能与固氮微生物共生结瘤的高等植物，包括豆科植物和部分非豆科植物(主要是树木)，生长所需的氮素，而其他植物，特别是重要粮食作物、果树、蔬菜等，却没有与之共生的固氮微生物，而土壤中的自生固氮微生物所提供给它们的氮素则有限。因此，人类的增加，所需这些作物的高产就只好依赖化学肥料。而由于大量施用化肥再加上化学农药，造成土壤板结、水系及环境的污染、农作物遗传性能变异，农产品品质下降又给人类造成巨大危害。

人类终于认识到未来农业的发展必将从无机农业再次转向有机农业，而对于生物固氮的研究范围必然从豆科植物扩大到非豆科植物，这就是本发明技术产生的社会需要。

人类100多年对生物固氮的研究，曾产生豆科作物接种剂，化学模拟固氮等许多成果，但对农业生产的作用有限；1981年中国王曼新公布了用磁致诱变的方法人工诱发非豆科植物结瘤固氮技术成功，引起国内外农业及微生物界的重视，但很快就被并不了解非豆科植物结瘤固氮技术的专家权威否定，成了一个学术上有争议的无头公案。，后来山东师范大学聂元富用2-4D激素使非豆科植物结瘤并被所谓7个科研单位重复。但没有它固氮作用不明显，因此不了了之。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种全新的绿色环保肥料，使农业产量增加，品质改善；继王曼新之后，经过17年的科学研究并紧密结合生产实际，研究成功了一种自然诱发非豆科植物结瘤固氮技术方法和菌种及多方面的应用技术方法。

微生物最大的特点就是极易变异。企图在实验室分离出一个有效固氮菌种，解决生物固氮的问题是不可能的。况且受豆科植物一非豆科植物，自生固氮一共生固氮，自养微生物一异养微生物这些原有理论的局限，如不从这些误区解脱出来，要解决“非豆科植物”结瘤固氮的问题，更是不可能的。日本微生物学者提出“农用微生物研究只有回归大自然，才是唯一出路”，这种观点是十分正确的。已被加拿大、德国及澳大利亚许多学者接受。

本发明正是这样，从自然界采集豆科根瘤菌，非豆科根部内生菌，经过合理组合，在尽量接近自然的条件下进行扩大，人为地让有益菌占优势，再回到自然环境中，在土壤和植物的根系之间，在植物生长的全过程中诱变，使之成为一组有效又有益的组合菌群，直到达到非豆科植物根系结瘤固氮的效果，并在自然条件下复壮，防止菌种退化。

本发明的菌种，其样品已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(以下简称保藏中心)保存，其地址是北京市海淀区中关村北一条13号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100080，非豆科植物结瘤固氮的菌种是组合菌群，组合菌群的菌种及其保藏中心登记入册编号是：

绿色木霉(Trichoderma viride)            保藏中心登记入册编号0949

根瘤菌(Rhizobium sp.)                   保藏中心登记入册编号0948

色褐链霉菌(Streptomyces chromofuscus)   保藏中心登记入册编号0947

粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)        保藏中心登记入册编号0946

土壤杆菌(Agrobacterium sp.)             保藏中心登记入册编号0945

巨大芽孢杆菌(Bacillus megateriium)      保藏中心登记入册编号0944

以上这些菌种必须组合在一起，在低温0℃保存。使用时在自然条件下，在自然界中物理条件(温度、水分、土壤透气性、阳光)、化学条件(土壤中矿物质含量及pH值)、生物条件(土壤有机质含量及微生物种群)都具备的情况下，可重复率达80％，只要保持这些有益菌的优势即可使用，如分离出单一品种菌种，不保证非豆科植物结瘤固氮。

菌种选育的科学思路和5个步骤方法如下：

(1)菌种的制备

扬弃纯菌发酵的方法，将从自然采集来的生物活性强的菌种，根据微生物的共生关系及互生关系，互依机理，按优化原则进行科学整合。以豆科根瘤菌为主体，辅以非豆科植物根系中的内生菌，组成固氮微生物种群，进行组合菌种的混合引殖；

(2)培养基根据微生物在自然界中生存条件的需求，采用自然条件下可以得到的天然培养基，以保证发酵过程具备充足的碳源和氮源，并人为辅以微生物生长所需要的各种微量元素，如；铁(Fe)、钙(Ca)、钠(Na)、钾(K)、镁(Mg)、钼(Mo)等。

(3)开口发酵

为保证菌群的强大生命力，必须在自然条件下发酵(菌群增殖、扩大)，但发酵过程最忌杂菌污染，又要在自然环境下，又要防止污染，为此，采用了加大接种量的方法，造成发酵初期的菌种种群优势，充分利用微生物的拮抗关系，优势原则，确保发酵的正常进行；

(4)菌种的回接和检测

发酵后，将增殖扩大的菌群施入正在生长的植物根系，此时要在多种豆科和非豆科植物施用，观察结不结根瘤及根瘤情况，再采集根瘤检测有无固氮活性，分离内生菌种种类和数量与所接菌种对照比较，当品种、数量接近时，又有结瘤固氮效果，选择活性最强的菌群为本发明菌种；

(5)所谓自然条件下是指动物、植物、微生物生长最适条件，充分的营养(碳氮比)、温度24℃-34℃、湿度30％-80％、PH值6-8、通风良好，既保证充分的氧、氮等气候条件，通风良好还不只是供气充足，和植物、土壤、空隙间气体交换有关，阳光照射充足。以上条件，是保证菌种有效的必不可少的，而这在实验室是难以保证的。

开口发酵生产液体肥料。自然诱发非豆科植物结瘤固氮技术直接用于农业生产就是生产生物肥料，可以延伸用于制造农业生产中广泛实际应用的高效固体生物肥料，该生物肥料特点是从自然界中采集的豆科植物的根瘤菌，非豆科植物根系中的“内生菌”，土壤中的固氮菌，以及放线菌，真菌，进行科学组合，优化筛选，自然复壮，用天然培养基在尽量接近于自然条件下进行发酵生产出来的。用开口发酵方法扩大菌种，这种菌液就是液体肥料，具有广谱性，可以用于豆科和和非豆科植物，包括大田作物、林果、蔬菜、花卉，因为可以开口发酵，才能方便地工业化生产。

可以采用间歇式液体发酵生产液体肥料或连续性固体发酵生产固体肥料：

间歇式液体发酵，即：发酵一段时间停一停，加入新菌种后接着再发酵的多次过程。

连续性固体发酵，即：初次翻动式固体发酵后，粉碎后再进行堆积式发酵，再粉碎后再进行静态发酵的过程。

大量生产菌液，关键问题是菌种的退化问题，在生产中，要反复本发明本菌种的选育科学思路和5个步骤方法，特别是菌种的回接和检测，否则不能保证液体肥料的质量。

固体发酵生物肥料。本发明基于自然条件下选育菌种，开口发酵，无需对培养基灭菌，所以选育一组适合农作物的菌种，开口发酵扩大成二次菌种，再接种到固体培养基中经固体多次发酵可以生产固体肥料。这种肥料使用方法适当，自然条件良好。可以使非豆科植物结瘤固氮。即使暂时不结瘤，也有菌群侵入植物根系的细胞中，达到固氮作用。使农业产量增加，品质改善。可以认为这是一种全新的绿色环保肥料。

本发明生物肥料的定义：生物肥料是从自然界中采集的豆科植物的根瘤菌，非豆科植物根系中的“内生菌”，进行科学组合；优化筛选，自然复壮，用天然培养基在尽量接近于自然条件下进行发酵生产出来的。

生物肥料的主要特点：

打破了豆科植物与非豆科植物的界限，既可以在豆科植物上施用，也可以在非豆科植物上施用：既可以作接种剂使用，也可以作基肥施用；既可以以固体方式施用，也可以以提取液方式施用；既可以用在农作物的根部，也可以喷施在农作物的茎叶上；

这是因为生物肥内既有生命力强烈的微生物的活动，亦包含因这些有益种群在其复杂的生命活动过程中产生的多元的生长素、调节素、酶、蛋白质、氨基酸等对农作物极为有益的物质：

生物肥料已经发展了几代，现在已搞到第五代，在全国除西藏以外各省市、地区都做过试验，有上千万亩地的试验田和数量巨大的试验报告。大量生产实践证明该肥料有明显的社会效益和经济效益。

该肥料施用于生姜、西红柿、草莓、伊丽沙白瓜等许多非豆科植物都达到了结瘤固氮作物品质好的效果。，山东省莱芜市高庄镇一农民使用该肥料种植生姜，生姜的产量提高一倍以上，又防止了姜瘟，生姜的品质明显提高，把施用该肥料和未施用该肥料的生姜经过化验，化验单位是北京市农林科学院植物营养与资源研究所，化验时间是2002年12月4日，化验结果见表1。

表1

检验编号  样品名称    检测项目及结果粗蛋白％粗灰分％VcMg/kg可溶性糖mg/kg可溶性酸mg/kg氨基酸总量％硝态氮mg/kg02287-1鲜生姜(对照)1.740.987.443.450.1280.38237002287-2鲜生姜(G式生物肥)2.430.878.312.350.1170.288266以下空格

中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所，把施用该肥料与未施用该肥料的西红柿、草莓、伊丽沙白瓜经过化验。施用该肥料的西红柿、草莓、伊丽沙白瓜的所含的对人体有益的成份胡萝卜素、维生素C，糖、酸类等品质大大提高。见表2、表3、表4；表2是西红柿施用该肥料与未施用该肥料的测试报告表；表3是草莓施用该肥料与未施用该肥料的测试报告表，表4是伊丽沙白瓜施用该肥料与未施用该肥料的测试报告表。

表2

                          中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所测试报告

    检验项目及结果样品名称胡萝卜素(μg/100g)维生素C(mg/100)总糖(g/100g)总酸(g/kg)以柠檬酸计磷(mg/100g)钾(mg/100g)钙(mg/100g)锌(mg/100g)西红柿(生物肥料)456.0 16.2 3.6 4.74 36.0 134.4 7.83 0.13两红柿(对照)379.0 10.2 1.4 4.27 43.0 117.6 15.4 0.15

表3

         中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所测试报告

    检验项目及结果样品名称胡萝卜素(μg/100g)维生素C(mg/100)总糖(g/100g)总酸(g/100g)以柠檬酸计草莓(生物肥料)6.471.98 5.6 6.0草莓(对照)未检出30.23 4.3 6.6

表4

           中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所测试报告

  菌肥组(mg/100g  对照组(mg/100g)  菌肥组  对照组  天门冬氨酸  128.3  101.2  水分  86.6g/100g  88.3g/100g  苏氨酸  20.4  17.6  灰分  0.58g/100g  0.58g/100g  丝氨酸  43.5  38.4  蛋白质  1.16g/100g  0.97g/100g  谷氨酸  514.5  422.5  总糖  12.9g/100g  11.5g/100g  甘氨酸  31.3  24.7  总酸  1.716g/100g  2.034g/100g  丙氨酸  46.1  60.3  胡萝卜素  59.6μg/100g  39.9μg/100g  缬氨酸  28.8  21.6  膳食纤维  0.88g/100g  0.62g/100g  蛋氨酸  16.3  11.0  维生素B1  0.04g/100g  0.03g/100g  异亮氨酸  20.2  15.1  维生素B2  0.026g/100g  0.023g/100g  亮氨酸  30.4  24.6  维生素C  8.33g/100g  6.07g/100g  酪氨酸  10.6  8.5  尼克酸  1.00g/100g  0.73g/100g  苯丙氨酸  19.1  16.3  碳水化物  10.78g/100g  9.53g/100g  组氨酸  11.6  9.2  热量  47.8千卡/100g  42.0千卡/100g  赖氨酸  25.6  21.4  精氨酸  36.5  33.0  脯氨酸  17.6  15.7

生物肥料的定义是：基于本发明技术生产的生物肥料定义是由于生物的生命活动，能够直接或间接提供作物正常发育成长的养分，并能改善土壤，提高作物的产量和品质的物质。生物肥料有别于有机肥、无机肥、化肥，但应含盖“菌肥”“菌剂”“接种剂”，生命调节剂、生长素......等。

本发明所述技术，由于有强大的对农业有益的微生物菌群和开口发酵技术，所以能

用于城市生活垃圾及工业有机废料的处理。即把这些有机物作为固体培养基生产生物肥料，可以经过多次固体发酵，生产各种用途和不同档次的生物肥料。这有垃圾的自然堆放发酵和好氧发酵生产堆肥。而是在垃圾的各降解阶段加入本发明菌种，最终生产出高效、高价值的生物肥料。