公开/公告号CN1512868A
专利类型发明专利
公开/公告日2004-07-14
原文格式PDF
申请/专利权人 通用医疗公司;
申请/专利号CN02811284.9
发明设计人 迈克尔·J·德特马;矢野喜一郎;
申请日2002-04-11
分类号A61K7/00;A61K7/42;A61K7/44;A61K38/00;
代理机构11105 北京市柳沈律师事务所;
代理人巫肖南;封新琴
地址 美国马萨诸赛州
入库时间 2023-12-17 15:22:13
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2007-10-03
授权
授权
2004-09-22
实质审查的生效
实质审查的生效
2004-07-14
公开
公开
相关申请
本申请要求2001年4月13日递交的序列号为60/283874的美国临时申请的利益，其内容全部引入作为参考。
背景技术
光老化是由于长期暴露于UVB照射下所导致的，尤其在皱纹的形成过程中。
发明内容
本发明部分是基于发现阻止皮肤血管发生能防止UVB诱发皮肤的损伤，例如长期(慢性的)的UVB引起的光老化、例如皱纹在哺乳动物如人类的体内的形成。
因而，本发明的特征在于一种防止或处理由于长期UVB所引起皮肤损伤如皱纹的方法。方法包括抑制受试者皮肤血管发生。优选的实施方式是血管发生的抑制应是在暴露于UVB的时候或之前。
在优选的实施方式中，该方法同样包括在长期的UVB引起的皮肤损伤的危险中，确定一个受试者，例如哺乳动物、如人类或非人类哺乳动物。一个处于长期的UVB引起的皮肤损伤如皱纹危险之中的受试者的确定，是通过受试者、卫生保健供应者或者化装品供应者。实施血管发生的抑制作用也可以通过受试者、卫生保健供应者或者化装品供应者。
在优选的实施方式中受试者至少需要5岁。更适宜的甚至需要10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多岁。
一优选的实施方式是防止和减少皱纹的形成。
在优选的实施方式中，抑制血管发生是通过增加一种或多种抗血管生成因子的活性来完成的，诸如增加自然形成的在受试者体内抗血管生成蛋白如TSP-2或TSP-1的活性，从而抑制皱纹的形成。增加TSP-2的活性是例如通过给予一种试剂来实现的。在优选的实施方式中，使TSP-2活性增加的试剂是下列的一个或多个：TSP-2多肽、或者生物学上的活性片段、或它的类似物，如TSP-2衍生多肽或逆向(retroinverso)多肽；编码TSP-2多肽核酸，或者生物学上的活性片段、或它的类似物；一种TSP-2多肽的激动剂，如抗体、或具有或增加的TSP-2活性的小分子；或者一个增加TSP-2核酸表达的试剂，如能结合TSP-2启动子区并提高表达的小分子。
在优选的实施方式中，TSP-2的增加是通过试剂如诱导TSP-2表达的小分子，例如能促进TSP-2表达的试剂包括胎牛血清和TGF-α。优选的实施方式中，诱导TSP-2表达的试剂是局部给药的。在优选的实施方式中，试剂在UVB下暴露如日晒前要充分实施于受试者，这样抗血管发生作用才会出现在暴露在UVB下的受试者的皮肤上。
TSP-2活性同样可以通过控制释放到受试者的TSP-2核酸或TSP-2蛋白质、片段、或类似物来实现。TSP-2核酸，蛋白质、片段、或类似物可结合了一种控制释放装置实施于受试者，如一种生物相容聚合体、微颗粒或者网状结构。这种装置能减小降解和控制TSP-2核酸、蛋白质、片段、或类似物的释放。这样的一种TSP-2生物相容的控制系统能被实施于受试者，如在器官、关节腔或损伤部位或通过注射和植入，如肌注、皮下注射、静脉注射。
TSP-2的水平也能够通过内源性的TSP-2活性的增加而增长。活性是通过提高基因表达的水平增加的，如增加TSP-2基因的转录；增强TSP-2信使核糖核酸的稳定性，如改变信使核糖核酸的第二级或第三级的结构；增大TSP-2信使核糖核酸的转换，如改变TSP-2信使核糖核酸的序列；和/或增加TSP-2蛋白质的稳定性。增强TSP-2基因转录是通过如改变内源性的TSP-2基因的调控序列。在一个实施方式中调节序列的改变是通过增加一种正调节元件(诸如作为转录催化剂的一种增强子或一个DNA结合部位)；一种负调节元件缺失(诸如作为转录抑制剂的一个DNA结合部位)和/或用另一基因置换内源性调节序列，或其中的元件，从而使TSP-2基因更有效的转录。
在优选的实施方式中，试剂是一种用来诱导TSP-2的化合物如小分子。
TSP-1的活性增强是通过如给予一种能增强其活性试剂来完成的。在优选的实施方式中，增强TSP-1的活性的试剂可以是下列的一个或多个：TSP-1多肽、或生物学上的活性片段或它的类似物，如TSP-1衍生多肽或它的逆向多肽；TSP-1多肽的编码核酸、或者生物学活性片段、或它的类似物；TSP-1多肽的激动剂，如抗体、或或增加的TSP-1活性的小分子；或者一个增加TSP-1核酸表达的试剂，如一个能结合TSP-1启动子区并增加的表达的小分子。
在优选的实施方式中，TSP-1的活性增加是通过试剂如诱导TSP-1表达的小分子实现。例如能促进TSP-1表达的试剂包括胎牛血清和TGF-α。优选的实施方式中，诱导TSP-1表达的试剂试局部实施的。在优选的实施方式中，试剂在UVB下暴露如日晒前充分实施于受试者，这样抗血管发生作用才会出现在暴露在UVB下的受试者的皮肤上。
TSP-1活性同样可以通过控制释放到受试者的TSP-1核酸或TSP-1蛋白质、片段、或类似物来实现。TSP-1核酸，蛋白质、片段、或类似物可结合了一种控制释放装置实施于受试者，如一种生物相容聚合体、微颗粒或者网状结构。这种装置能减小降解和控制TSP-1核酸、蛋白质、片段、或类似物的释放。这样的一种TSP-1生物相容的控制系统能被实施于受试者，如在器官、关节腔或损伤部位或通过注射和植入，如肌注、皮下注射、静脉注射。
TSP-1的水平也能够通过内源性的TSP-1活性的增加而增长。活性是通过提高基因表达的水平增加的，如增加TSP-1基因的转录；增强TSP-1信使核糖核酸的稳定性，如改变信使核糖核酸的第二级或第三级的结构；增大TSP-1信使核糖核酸的转换，如改变TSP-1信使核糖核酸的序列；和/或增加TSP-1蛋白质的稳定性。增强TSP-1基因转录是通过如改变内源性的TSP-1基因的调控序列。在一个实施方式中调节序列的改变是通过增加一种正调节元件(诸如作为转录催化剂的一种增强子或一个DNA结合部位)；一种负调节元件缺失(诸如作为转录抑制剂的一个DNA结合部位)和/或用另一基因置换内源性调节序列，或其中的元件，从而使TSP-1基因更有效的转录。
在优选的实施方式中，试剂是一种用来诱导TSP-1的混合物如小分子。
在优选的实施方式中，用来增加一个或多个抗血管生成因子的试剂，是通过如诱导天然抗血管生成蛋白质诸如TSP-2或TSP-1来实施的，如局部实施试剂、全身实施、口腔给药、注射、更优选的皮层和皮下实施。在优选的实施方式中，试剂是用一种合适的输送载体来实施的。优选地，试剂包含在一个局部使用的组合物中，如凝胶、乳膏或液体。组合物还可以包含一种化妆品成分，如芳香剂或遮光剂，例如甲氧基肉桂酸辛酯、氨基苯甲酸、羟苯甲酮(oxybenzone)，padimate O，胡莫柳酯(homosalate)或二氧化钛。该组合物还可以包括一些植物提取物，如芦荟浸出液、葡萄浸出液。该组合物还可以包括维生素，如维生素A如松香油、维生素C如抗坏血酸维生素C或棕榈酸酯、维生素E如醋酸生育酚(tocopherol acetate)。
在优选的实施方式中，试剂在UVB下暴露如日晒前要充分实施于受试者，这样抗血管发生作用会出现在暴露在UVB下的时候。
在另一优选的实施方式中，用于增加一个或多个抗血管发生因子活性如通过增加一种自然形成的抗血管发生蛋白质诸如TSP-2或TSP-1活性的试剂实施是重复的，如至少在许多天内重复1、2、3、5、10、20次或更多次。在优选的实施方式中，试剂实施是长期性的。在优选的实施方式中，试剂的实施至少每周一次，优选每周2、3、4、5次或至少在两周内每日一次，最好的是至少在1、2、3、4、5或6个月内。例如，在3-12周内定时实施如贯穿整个夏天。在优选实施方式中，试剂被实施以抑制或预防，受试者暴露于UVB辐射下的脸部、颈部、胸部、耳部和手以及头部的谢顶部位的其中一处或多处皱纹。
在优选的实施方式中，受试者是已经或即将长期暴露于UVB辐射下的。
在优选的实施方式中，受试者所显出的一或多个光老化的标志，如皱纹、皱纹线(lines)、下垂、雀斑、黑色皮肤、污点、色素沉着、老年斑、如肝斑、皮肤磨损、白内障、表皮增生、皮肤弹性组织变性、细胞外基质简并、癌前或癌症期间皮肤生长(光化角质物、日光化角质物)。
在优选的实施方式中，血管发生被抑制是通过减少受试者体内的VEGF的活性实现的，如在受试者体内通过VEGF受体抑制信号转导如通过KDR；通过抑制VEGF蛋白质的水平；降低VEGF基因表达的水平；和/或减少受试者VEGF蛋产生和/或活性，从而防止有UVB引起的皮肤损伤，如长期UVB引起的皮肤损伤如皱纹的形成。
在优选的实施方式中，抑制VEGF是通过使用抑制VEGF活性的试剂来完成的。抑制VEGF活性的试剂可以是一或多个，试剂如小分子，其抑制VEGF受体，如通过抑制VEGF与其受体的结合或抑制VEGF受体信号转导(signaling)；可以结合一个细胞的VEGF核酸序列的VEGF核酸分子，如信使核糖核酸，抑制蛋白质表达，如反义分子或VEGF核糖酶；可特异性结合VEGF的抗体，如破坏VEGF结合其正常的细胞靶的抗体；一种减少VEGF基因表达的试剂，如结合VEGF的启动子的小分子。
在另一优选的实施方式中，VEGF活性的抑制是通过降低一种内源性VEGF基因的表达水平来实现，如减少VEGF基因的转录。在优选的实施方式中，减少VEGF基因的转录是通过改变内源VEGF基因的调节序列，如增加负调节序列(诸如DNA结合位点的转录抑制剂)。
在另一优选的实施方式中，试剂是一种化合物，如抑制VEGF活性的小分子，比如通过抑制VEGF受体信号(signaling)或者和VEGF启动子间接或直接地相互作用。
在优选的实施方式中，抑制VEGF表达的试剂被给药，如局部实施试剂、全身实施、口腔给药、注射、更优选的皮层和皮下实施。在优选的实施方式中，试剂是用一种合适的输送载体来实施的。优选地，试剂包含在一个局部使用的组合物中，如凝胶、乳膏或液体。组合物还可以包含一种化妆品成分，如芳香剂或遮光剂，例如甲氧基肉桂酸辛酯、氨基苯甲酸、羟苯甲酮(oxybenzone)，padimate O，胡莫柳酯(homosalate)或二氧化钛。该组合物还可以包括一些植物提取物，如芦荟浸出液、葡萄浸出液。该组合物还可以包括维生素，如维生素A如松香油、维生素C如抗坏血酸维生素C或棕榈酸酯、维生素E如醋酸生育酚(tocopherol acetate)。
在优选的实施方式中，试剂在UVB下暴露如日晒前要充分实施于受试者，这样抗血管发生作用会出现在暴露在UVB下的时候。
在另一优选的实施方式中，用于增加一个或多个抗血管发生因子活性如通过增加一种自然形成的抗血管发生蛋白质诸如TSP-2或TSP-1活性的试剂实施是重复的，如至少在许多天内重复1、2、3、5、10、20次或更多次。在优选的实施方式中，试剂实施是长期性的。在优选的实施方式中，试剂的实施至少每周一次，优选每周2、3、4、5次或至少在两周内每日一次，最好的是至少在1、2、3、4、5或6个月内。例如，在3-12周内定时实施如贯穿整个夏天。在优选实施方式中，试剂被实施以抑制或防止，受试者暴露于UVB辐射下的脸部、颈部、胸部、耳部和手以及头部的谢顶部位的其中一处或多处皱纹。
在优选的实施方式中的方法包括实施一种或多种可增加TSP-2活性、可增加TSP-1活性或者可抑制VEGF的试剂。在优选的实施列中，要实施一种或多种血管发生抑制剂如一种或多种诱导或增加抗血管生成抑制剂的试剂。
在另一方面，本发明的特征在于一种防止或处理由UVB引起的受试者皮肤损伤的方法，如长期UVB引发的皮肤损伤如皱纹。方法包括实施于受试者如局部，一种含有血管发生抑制剂，如试剂，如能增加或诱导血管发生抑制剂的小分子，或试剂，如能抑制血管生成分子的小分子的组合物，能充分减少或防止UVB引起的皮肤损伤，如长期UVB引发的皮肤损伤如皱纹。在优选的实施方式中，试剂在UVB下暴露如日晒前要充分实施于受试者，这样抗血管发生作用会出现在暴露在UVB下的时候。
在一种优选的实施方式中，试剂是一种化合物，如一种能诱导TSP-2的小分子。
在一种优选的实施方式中，试剂是一种化合物，如一种能抑制VEGF的小分子。
在优选的实施方式中，试剂被局部实施，能够实施于脸部、颈部、胸部、耳部和手以及头部的谢顶部位以及身体其他部位。处理可以包括多于一种的血管发生抑制剂的实施方式，如至少2、3、4种方式。处理也可以包括每天的血管发生抑制剂的给药。
在优选的实施方式中，血管发生抑制剂如促进或诱导血管发生抑制剂的试剂是预备在一个无菌的组合物中。
在优选的实施方式中，血管发生抑制剂是指TSP-2。
在优选的实施方式中，血管发生抑制剂是指TSP-1。
在优选的实施方式中，组合物可以更进一步包括化妆品的成分，如芳香剂或遮光剂，例如甲氧基肉桂酸辛基酯、氨基苯甲酸、羟苯甲酮，padimateO，胡莫柳酯或二氧化钛。该组合物还可以包括一些植物提取液，如芦荟浸出液、葡萄浸出液。该组合物还可以包括一种维生素，如维生素A如松香油、维生素C如抗坏血酸维生素C或棕榈酸酯、维生素E如醋酸生育酚。
在优选的实施方式中，组合物是需要长期实施的。在实施方式中，试剂的实施至少每周一次，更适宜的每周2、3、4、5次或至少在两周内每日一次，最好的是至少在1、2、3、4、5或6个月内。例如，在3-12周内定时实施如贯穿整个夏天。在优选的实施方式中，方法包括实施增加TSP-2活性的试剂、增加TSP-1活性的试剂和抑制VGEF试剂中的一种或更多种。在优选的实施方式中，可以实施一种或多种血管发生抑制剂。
在另一方面，本发明的特征在于是一种防治由紫外线引起的受试者皮肤损伤的方法，如长期紫外线所引起的皮肤的损伤如皱纹。方法包括确定需要防护由于紫外线损伤皮肤的受试者，如长期紫外线引起的皮肤损伤如防护皱纹的形成；给受试者实施一种血管发生抑制剂，如试剂如提交或诱导血管生成抑制剂的小分子；给受试者实施一种血管发生抑制剂，如抑制血管生产分子的试剂如小分子；以及评价处理皱纹的作用。确定需要防护由于长期紫外线引起损伤皮肤如皱纹的受试者可以通过受试者本人、卫生保健供应商以及化妆品供应商。血管发生抑制剂的实施和评价应用于抑制皱纹所起到的作用同样也是通过受试者本人、卫生保健供应商以及化妆品供应商来完成的。
在优选的实施方式中，血管发生抑制剂是指TSP-2。
在优选的实施方式中，血管发生抑制剂是指TSP-1。
在优选的实施方式中，血管发生分子是指VEGF。
在优选的实施方式中，皱纹是由于暴露于紫外线辐射下所引起的。
在优选的实施方式中，试剂是局部实施的。在实施方式中，试剂在紫外线下暴露如日晒前充分实施于受试者，这样非血管发生作用会出现在暴露在紫外线下的受试者的皮肤上。
在优选的实施方式中，试剂是长期应用的。在优选的实施方式中，试剂的实施至少每周一次，更适宜的每周2、3、4、5次或至少在两周内每日一次，最好的是至少在1、2、3、4、5或6个月内。例如，在3-12周内期实施如贯穿整个夏天。
在优选的实施方式中，血管发生抑制剂如促进或诱导血管发生抑制剂试剂是预备在一个无菌的组合物中。
在优选的实施方式中，方法包括实施增加TSP-2活性的试剂、增加TSP-1活性的试剂(TSP-1活性的增加可以通过类似于增加TSP-2活性的方法完成的)或者抑制VGEF的试剂中的一种或更多种。在优选的实施方式中，可以给予一种或多种血管发生抑制剂。
另一方面，本发明的特征在于评价一种对于具有诱导抗血管发生蛋白质表达能力的待试化合物的方法，如TSP-1或TSP-2在皮肤上诱导。方法包括：提供细胞如表皮细胞，其包含核酸的转基因，所述核酸编码功能性连接到抗血管发生基因的控制区域如启动子的报道子(reportor)，如TSP-1或TSP-2，其中所述报道子分子不是通常与启动子有关的基因编码的蛋白；将细胞与测试的化合物接触；评价通过报道子产生的信号，通过测试其存在或强度与抗血管发生表达的调节有相互关联。化合物可以是蛋白、多肽或小分子，如分子量小于2000道尔顿甚至于1000道尔顿的小分子。
在优选的实施方式中，报导子是指一种可提供荧光信号的分子。报导子可以是如荧光素酶、GFP、或BFP。在其他实施方式中，报导子是指一种酶。
在优选的实施方式中，细胞是一种培养的细胞，如一种无限增值化的人体表皮角质化细胞。
在优选的实施方式中，细胞来自于转基因动物。
在优选的实施方式中，细胞来自于转基因动物，测试的化合物实施于转基因动物，如局部应用于转基因动物的皮肤。
在优选的实施方式中，方法还可以包括在人或动物体内测试化合物，如通过将化合物实施于暴露于UVB下的动物来评价该化合物的作用。
在另一方面，本发明的特征还在于一种对于测试具有抑制血管发生蛋白，如VEGF表达的能力的化合物的评价方法，如抑制其在皮肤上。方法包括：提供细胞如表皮细胞，其包含核酸的转基因，所述核酸编码功能性连接到抗血管发生基因的控制区域如启动子的报道子(reportor)，如VEGF，其中所述报道子分子不是通常与启动子有关的基因编码的蛋白；将细胞与测试的化合物接触；评价通过报道子产生的信号，通过测试其存在或强度与抗血管发生表达的调节有相互关联。化合物可以是蛋白、多肽或小分子，如分子量小于2000道尔顿，优选小于1000道尔顿甚至于500道尔顿的小分子。
在优选的实施方式中，报导子是指一种可提供荧光信号的分子。报导子可以是如荧光素酶、GFP、或BFP。在其他实施方式中，报导子是指一种酶。
在优选的实施方式中，细胞是一种培养的细胞，如一种无限增值化的人体表皮角质化细胞。
在优选的实施方式中，细胞来自于转基因动物。
在优选的实施方式中，细胞来自于转基因动物，测试的化合物实施于转基因动物，如局部应用于转基因动物的皮肤。
在优选的实施方式中，方法还可以包括在人或动物活体测试化合物，如通过将化合物实施于暴露于UVB下的动物来评价该化合物的作用。
在另一方面，本发明的特征在于一种防止或处理由UVB引起的皮肤损伤如皱纹的组合物。该组合物包括血管发生抑制剂(如TSP-1或TSP-2)、如增加或诱导TSP-1或TSP-2的试剂如小分子，或者试剂、抑制血管生成分子的小分子，如抑制VEGF的试剂和制剂学上可接受的载体。更适宜的是该组合物是无菌的。
在优选的实施方式中，试剂是一种化合物，如诱导TSP-2的小分子。
在优选的实施方式中，组合物的是局部实施的。
在优选的实施方式中，血管发生抑制剂是指TSP-2。
在优选的实施方式中，血管发生抑制剂是指TSP-1。
在优选的实施方式中，包括增加TSP-2活性的试剂、增加TSP-1活性的试剂、抑制VEGF活性的试剂中的一或多个。在优选实施方式中，包括一个或多个血管发生抑制剂。
在优选的实施方式中，组合物也可以包括一种化妆品成分，如芳香剂或遮光剂，例如甲氧基肉桂酸辛基酯、氨基苯甲酸、羟苯甲酮，padimate O，胡莫柳酯或二氧化钛。该组合物还可以包括一些植物提取液，如芦荟提取液、葡萄提取液。该组合物还可以包括一种维生素，如维生素A如松香油、维生素C如抗坏血酸或维生素C如L-棕榈酸酯、维生素E如醋酸生育酚。
在另一方面，本发明的特征还在于提供一种保护由于UVB引起的受试者皮肤损伤的方法，如长期UVB引起的皮肤损伤，皱纹的形成。方法包括提供给受试者一种组合物，组合物含有血管发生抑制剂如试剂如能够增加或诱导血管发生抑制剂的小分子、如TSP-2或TSP-1或试剂、如抑制血管生成分子的小分子、抑制VEGF的试剂；以及可以防止或减少由紫外线引起的受试者皮肤损伤如长期UVB引起的皮肤损伤、如皱纹的该组合物的使用方法说明。
在优选的实施方式中，使用方法包括暴露在日光下和/或暴露在日光之前应用该组合物的指导说明。
在优选的实施方式中，组合物是需要长期实施的。在实施方式中，试剂的实施至少每周一次，更适宜的每周2、3、4、5次或至少在两周内每日一次，最好的是至少在1、2、3、4、5或6个月内。例如，在3-12周内定时实施如贯穿整个夏天。
在优选的实施方式中，血管发生抑制剂是指TSP-2。
在优选的实施方式中，血管发生抑制剂是指TSP-1。
在优选的实施方式中，试剂是一种化合物，如诱导TSP-2或TSP-1的小分子。
在优选的实施方式中，组合物还应包含一种化妆品的成分，如芳香剂或遮光剂，例如甲氧基肉桂酸辛基酯、氨基苯甲酸、羟苯甲酮，padimate O，胡莫柳酯或二氧化钛。该组合物还可以包括一些植物浸出液，如芦荟浸出液、葡萄浸出液。该组合物还可以包括一种维生素，如维生素A(如松香油)、维生素C(如抗坏血酸或维生素C棕榈酸酯)、维生素E(如醋酸生育酚)。
在优选的实施方式中，组合物包括增加TSP-2活性的试剂、增加TSP-1活性的试剂或抑制VEGF的试剂中的一种或多种。在实施方式中组合物包括一种或多种血管发生抑制剂。
在另一方面，本发明的特征在于可以防止UVB引起的受试者皮肤损伤如长期UVB引起的皮肤损伤、皱纹的试剂盒。该试剂盒包括含有血管发生抑制剂、试剂、可以增加或诱导血管发生抑制剂的小分子的组合物；以及可以防止由紫外线引起的受试者皮肤损伤如长期紫外线引起的皮肤损伤、皱纹的该组合物的使用方法的说明。
在优选的实施方式中，试剂是一种化合物，如诱导TSP-2的小分子。
在优选的实施方式中，使用方法的说明包括暴露在日光下和/或暴露在日光之前应用该组合物的指导说明。
在优选的实施方式中，使用方法的说明包括长期性应用的指导说明。在优选的实施方式中，使用方法还包括应用组合物至少每周一次，更适宜的每周2、3、4、5次或至少在两周内每日一次，最好的是至少在1、2、3、4、5或6个月内。例如，说明书中可以指出在3-12周内定期使用如贯穿整个夏天。
在优选的实施方式中，血管发生抑制剂是指TSP-2。
在优选的实施方式中，血管发生抑制剂是指TSP-1。
在优选的实施方式中，组合物还可以包括化妆品成分，如芳香剂，增湿剂，或遮光剂，例如甲氧基肉桂酸辛基酯、氨基苯甲酸、羟苯甲酮，padimateO，胡莫柳酯或二氧化钛。该组合物还可以包括一些植物浸出液，如芦荟浸出液、葡萄浸出液。该组合物还可以包括一种维生素，如维生素A(如松香油)、维生素C(如抗坏血酸或维生素C棕榈酸酯)、维生素E(如醋酸生育酚)。
在优选的实施方式中，使用方法的说明还包括组合物应用于皮肤的指导说明，如外露皮肤、脸部、颈部、胸部、耳部和手以及头部的谢顶部位。更适宜的是包括组合物在暴露于紫外线下如日晒和/或暴露于UVB之前的使用方法的指导说明。
在优选的实施方式中，组合物包括增加TSP-2活性的试剂、增加TSP-1活性的试剂或抑制VEGF的试剂中的一种或多种。在实施方式中组合物包括一种或多种血管发生抑制剂。
在这里所指的皱纹是指皮肤表面被改变的外形。在皱纹的组织学水平上可能有或可能没有特殊的构造改变。可以按照Kligman et al.(1985)BrJDerm 113：37-42的描述中分类的，此文引入作为参考。Kligman把皱纹分为三类：线形皱纹、沟形(glyphic)皱纹、波状皱纹。线形皱纹是直的，通常出现在面部皮肤，是由于自然老化和暴露于紫外光下引起的。沟形皱纹这是在外观上形成了三角形或长方形的皱纹，是基于暴露于日光下的脸部、手部、和颈部形成的，在紫外光下或皮肤日射病进一步恶化。波形(crinkles)皱纹比较细，波状出现在松弛的皮肤上，基于皮肤的任何部位，作为代表性的是指手背和眼睑的四周的皮肤。皱纹还包括有时涉及到的线纹(lines)、细的皱纹(finewrinkles)、皱纹、眼角纹(crow′s feet)或者下垂。
在这里使用的术语“小分子”包括肽、拟肽(peptidomimetics)或非肽化合物，诸如有机分子，分子量不少于2000道尔顿，更适宜的是不少于1000道尔顿。
这里所说的处理意思是整体或局部地缓和或消除紊乱的征状或影响。这里的防止的意思是指完全预防或在外表延迟紊乱的征状或影响。
在这里所说的暴露于长期的(慢性的)UVB辐射下是指暴露于自然光下或人造的UVB放射下(如紫外光灯(UVB sun lamp)、人工日晒或光线疗法，如牛皮癣、遗传性过敏症皮炎或白癜风的处理)。例如，慢性暴露是指暴露在UV指数为3-6之间或者更高的阳光下至少3次每次10分钟，更适宜的至少5次、或10次在预先选择的一段时间里。预先选择的时间段可以是1个月、2、3、6、12或24个月，如在12个月的时间里暴露于累计5个小时的UVB的辐射下如阳光或人造UVB光。处于长期可能由紫外线引起的皮肤损伤如皱纹的危险中的受试者，可以是已经或者将要暴露于UV指数为3-6或更高的阳光下至少10分钟，在一年至少10次的时间段里的受试者，或者已经或将要暴露于一年时间里累计5个小时的紫外线辐射中的受试者。更适宜的是，受试者要暴露在至少三年每年至少20次每次又至少30分钟的紫外线辐射中。更进一步的是，受试者在上午11点到下午3点间暴露于日光下，或者受试者暴露于整个夏天的日光下，或者受试者暴露于UV指数高到极高的白天的日光下。处于长期可能由UVB引起的皮肤损伤如皱纹的危险中的受试者包括生活在高海拔的地区的人群，如至少在海拔1000英尺以上的人群；生活在近赤道地区的人群，如赤道两旁1000英里以内；一年中参加户外运动至少10次的人群，如参与慢跑、网球、登山、滑雪或滑水；已经或正在进行UVB光线疗法的人群。
发明详述
暴露于UVB辐射
主要的UVB辐射来自于自然的阳光。UVB光线的强度各改变取决于白天时间的变化、一年四季的变化、太阳在天空的位置、海拔和距离赤道的远近。虽然光线总是存在，在冬季的岁月里，但在夏季正午的时候是最强烈的。海拔和距离赤道的远近也是考虑的重要因素。海拔越高UVB光线的强度越大。因此，登山运动员、滑雪者和那些居住在高海拔地区的人群都处于长期UVB带来损伤的危险中。同样，距离赤道越近的人群UV光线的强度就越强，长期UVB带来的损伤的危险就越大。
雪地、水面和沙滩反射的阳光，增大了UVB辐射到达皮肤的总量。即使云遮日的时候，UVB仍然很强以至于长期暴露使皮肤光老化如皱纹。
在特定的白天UV的指数(环境保护局制定)显示的是太阳光中紫外线的强度。强度分为四个级别：适度(UV指数不小于3)、高(指数在3-6)、很高(指数在6-10)、极高(指数大于10)。适度的UV指数是指超过1小时会灼伤皮肤；极高的水平是指小于15分钟就已经灼伤皮肤。指数通常是出现在天气预报里。临床上，UVB的照射量是用MED来测定的。一个MED是在敏感皮肤上出现晒斑(sunburn)所需的UVB的总量。因为UVB的照射效果是累积的，长期的或慢性的UVB会诱导产生的皱纹作为长期的UVB照射的结果的水平要低于在急性照射下所产生的红斑或水肿或严重烧伤(如低于一个MED)。例如，如果受试者长期暴露于阳光下即使受试者暴露在低的或适中的UV指数的数天那么他就有长期UVB诱导产生皱纹的危险。
血管发生和慢性的UVB的照射
光老化皮肤的特征在于表皮的增生、皮肤弹性和基质蛋白质的简并(5，38)，以及静脉周淋巴组织细胞浸润的存在(23)。这里描述的结果显示皮肤的慢性的UVB照射明显与皮肤的血管发生、在增生的表皮上增加VEGF表达以及通过TSP-1预防由UVB引起的皮肤损伤和皱纹形成的皮肤血管发生的靶抑制有关系。
一个制定的慢性光老化的实验模型Skh-1无毛老鼠经过10周的UVB辐射，我们发现明显地皱纹的形成以及组织学上特有的表皮和真皮的增生与增加紊乱的弹性检测以及皮肤的胶原纤维有关。计算机帮助下的对于内皮结合处分子CD31(39)的组织部分褪色的定量的图像分析在有效地增加脉管密度和体积的情况下显示出在长期的UVB辐射下皮肤血管发生的显著感应现象。脉管的改变与出现在皮肤创伤愈合时间的抗原的改变相比较，先前存在的血管芽和脉管的增生有助于富含血管的颗粒状组织的形成(24)。与此相对，慢性皮炎如牛皮癣主要表现为脉管的改变即皮肤微脉管的延长和增生，并没有新的脉管芽(vessel sprouts)的形成。这些发现说明皮肤在长期的UVB的辐射下导致了一种慢性的组织修补反应，进一步暗示血管发生(angiogenesis)在由UVB引起的皮肤损伤处理中起到重要的作用。
脉管内皮的增长因子(VEGF)证实是主要的，源自皮肤血管发生因子(40)的角化细胞，在由于牛皮癣损伤皮肤(12)的增生的表皮上与另外和皮肤血管发生(14，41)有关皮肤性疾病的增加表达，也可以在康复新表皮(13，42)中。在实验记录中，VEGF信使核糖核酸表达的一个显著的增量调节是基于慢性UVB照射皮肤所造成的皮肤增生，优选的是基底上角化细胞。这些发现是和之前所介绍的在人体内外(43)(44)严重的UVB照射诱导VEGF表达是一致的。
血管发生与长期UVB引起的皱纹
血管发生抑制剂TSP-1在皮肤特异性过量表达的转基因小鼠暴露于长期UVB的照射下。使用确定的角蛋白14(K14)启动子盒(cassette)对于靶向TSP-1转基因表达到表皮的角化细胞，我们之前确定的K14/TSP-1转基因小鼠是通过增加表皮的TSP-1的表达水平、形态上，厚度正常的表皮和真皮以及在皮肤创伤的康复(24)期间皮肤血管发生有力的抑制。K14启动子的使用保证了在表皮增生条件下高度的转基因的表达，因为K14基因表达在增生扩散的角化细胞中大大增强。这里实施例描述的结果显示表皮的TSP-1的过量的表达有力的抑制皮肤和胶原蛋白和弹性纤维组织的破坏，同时也完全抑制了皮肤皱纹的形成。这与皮肤血管发生被有效的抑制减少内皮增值速率以及增加内皮细胞的编程性细胞死亡有关。总之，这些结果表明，与修复有关的、UVB引起的血管发生的抑制作用也防止了包括皱纹的形成在内的皮肤光损伤。
已有发现TSP-1通过I型重复(repeats)内不同序列与内皮细胞上的用CD36受体的特异性交互作用，介导血管发生的抑制，结果导致增加了内皮细胞的死亡速率(46)。近来的证据暗示TSP-1类似于所叙述的分子TSP-2，同样能抑制基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的活化，为它的抗血管发生作用提供了重要启示(48，49)。这些结果证实存在一个TSP-1的额外机理，通过对于MMP-9活化的抑制，可以减小由于UVB辐射而诱导的皮肤血管发生。MMP-9是消化细胞外基质的成分的锌蛋白酶的分子家族的成员，已发现在UV照射下人的皮肤上MMP-9的表达和活性水平的增强(35，50，51)。
相反的，相对于野生型小鼠，TSP-2敲除小鼠在长期UVB的暴露下的反应中起皱现象增强。然而我们发现在长期的UVB照射后TSP-2敲除小鼠和野生型小鼠在MMP-9的活性上没有显著性的差别。结果表明皮肤血管发生的特异性抑制(与MMP作用相反)可能代表了对于防止长期UVB引起的皮肤损伤如皱纹的一个有前景的新的方法。
TSP的类似物
类似物区别于自然形成的TSP-1或TSP-2是在氨基酸序列、在不包括序列的情形或者前两者均有。非序列的修饰包括体内外TSP-1或TSP-2的化学衍生作用。非序列的修饰包括乙酰化作用、甲基化、磷酸化、羧化作用或糖基化作用的改变。
TSP-1或TSP-2的序列如人体的TSP-1或TSP-2在现代技术中是已知的。优选的类似物包括TSP-1或TSP-2(或其中的生物学的活性片段)的序列通过一个或多个保守的氨基酸置换或者一个或多个非保守的氨基酸置换，缺失，或插入来区别于野生序列部分这些所述改变未取消TSP-1或TSP-2的生物活性。代表性的保守性的置换包括一个氨基酸的置换为具有类似特征的另一个，如置换在如下组中进行：缬氨酸、甘氨酸；甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。其他的保守置换可以按下表中进行。
表1
保守性氨基酸置换
本发明的其他类似物是指其具有可以增强肽稳定性的修饰；类似物可以包括例如在肽序列中一个或多个非肽键(替代肽键)。也可以包括含有除了自然存在的L-氨基酸以外的残基的类似物，如D-氨基酸或非天然存在的氨基酸或合成的氨基酸，如β或γ氨基酸；和其他环状类似物。
片段和类似物的产生
片段的产生
一种蛋白质片段可以用几种方法制造，如通过蛋白水解的消化或通过化学水解的合成的重组。内在的或末端的多肽的片段可以通过从核酸一端(对于末端片段)或两端(对于内部片段)去除一个或多个编码多肽的核苷酸来产生。诱变DNA的表达产生多肽片段。有″末端啮咬性(end-nibbling)″核酸内切酶的消化可产生编码系列(an array of)片段的DNA。由DNA编码的蛋白质片段也可以通过随机切变(random shearing)，限制酶消化或上述方法的组合而产生。
片段也可以通过用现代已知技术化学合成如常规的Merrifield固相f-Moc或t-Boc化学。例如，本发明的肽可分为任意想要的长度的片段，片段无重叠，或者分成所需长度的重叠的片段。
类似物的产生：通过随机方法生产改变DNA和肽序列
蛋白质氨基酸序列的变体可以通过编码蛋白质或者一个特定域或的DNA的随机诱变制成。有用的方法包括PCR诱变和饱和诱变。随机氨基酸序列变体文库也能通过一系列的简并的寡聚核苷酸序列的合成来产生。(在变体文库中筛选蛋白质的方法在申请的其他部分。)
PCR的诱变
在PCR的诱变中，减小tap聚合酶的精确度用于随机突变引入到DNA的克隆片段中(Leung et al.，1989，Technique 1：11-15)。这是一个非常有力和相对迅速的引入随机突变的方法。待诱变的DNA区域采用聚合酶链式反应扩增，其条件是降低tapDNA聚合酶DNA合成的精确度，如通过利用dGTP/dATP比率为5和在PCR反应中加入Mn2+。
饱和诱变
饱和诱变可以迅速引入许多的单碱基置换到克隆的DNA片段(Mayerset al.，1985，Science 229：242)。这项技术包含了突变的产生，如在体外通过化学处理或照射单链的DNA，互补DNA链的合成。突变频率是可以通过调节处理强度来调整的，本质上所有可能的碱基置换都可以得到。因为此方法不包括对于突变片段的选择中性置换，那些改变功能的置换都可以得到。这种点突变的分布对于保守序列元件没有偏差。
简并寡聚核苷酸
同系物文库也能从一系列的寡聚核苷酸序列中产生。简并序列的化学合成是在自动的DNA合成仪中完成的，合成基因连接到一个适当的表达载体。简并寡聚核苷酸的合成是已知技术(如Narang，SA(1983)Tetrahedron 39：3；Itakura et al.(1981)Recombinant DNA，Proc 3rd Cleveland Sympos.Macromolecules，ed.AG Walton，Amsterdam：Elsevier pp273-289；Itakura etal.(1984)Annu.Rev.Biochem.53：323；Itakura et al.(1984)Science 198：1056；Ike et al.(1983)Nucleic AcidRes.11：477.)此技术中已经用于其他蛋白质的直向进化中(如：Scott et al.(1990)Science 249：386-390；Roberts et al.(1992)PNAS 89：24292433；Devlin et al.(1990)Science 249：404-406；Cwirlaet al.(1990)PNAS 87：6378-6382；as well as U.S.Patents Nos.5,223,409，5,198,346，and 5,096,815)。
类似物的产生：通过定向诱变生产改变的DNA和肽序列
非随机或定向诱变技术通常用于在特定区的特定序列或突变。此技术通常用于制造变体，其包括蛋白质已知氨基酸序列的残基的缺失、插入或置换。突变位点可以个别或系列修饰，如通过(1)首先用保守氨基酸取代然后进行根据取得的结果用更激烈的方式，(2)删除靶残基，或(3)插入与所定位点相同类别或相邻的不同类别的残基，或上述1-3项的结合。
丙氨酸扫描诱变
丙氨酸扫描(scanning)诱变对于确定所需蛋白的要突变的优选位置或域的特定残基或区是一个有用的方法，Cunningham和Wells(Science 244：1081-1085，1989)。在丙氨酸的扫描中，残基或靶残基的一组被识别(如带电残基，如Arg，Asp，His，Lys，和Glu)并被中性或负电氨基酸取代(最优选丙氨酸或聚丙氨酸)。氨基酸的置换影响氨基酸与细胞内外的周围水环境的相互作用。对于置换证明功能灵敏性的域可以通过引入进一步的或其他的变体在置换的位置而精选。因而，当对于引入一个氨基酸序列变化的位点是预定的，突变本身的本质是不需要预定的。例如，为使在特定位置的突变的性能最优化，丙氨酸的扫描或随机诱变可以在靶向编码子或区域被实施，筛选表达的所要蛋白亚单位变体以优化所要活性的组合。
寡聚核苷酸调节的诱变
寡聚核苷酸调节的诱变对于制备置换、缺失、插入DNA变体是有用的方法，如Adelman et al.，(DNA 2：183，1983)。简要地，想得到的DNA是通过杂交到编码突变的低聚糖核苷酸到DNA模板而改变，模板是包括想得到的蛋白质的不变的或天然的DNA序列的质体或噬菌体的单链形式。杂交之后，DNA的聚合酶通常用于合成模板完整的第二互补链从而整合寡聚核苷酸引物，并将编码所要蛋白DNA中的所选改变。通常，寡聚核苷酸至少是25核苷酸长。最佳的寡聚核苷酸是由对于模板在核苷译码任意一边都完全互补的12-15个核苷酸。这就保证了寡聚核苷酸将正确与单链DNA模板分子杂交。寡聚核苷酸在现有技术中是易合成的，诸如Crea et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.(1978)USA，75：5765)中的记载。
盒诱变
预备变体的另外的方法，盒(cassette)诱变，是基于Wells et al.(Gene(1985)34：315)中关于记载。对于变异而言原材料是一个包括待突变蛋白质DNA亚单位DNA的质粒(或其他载体)。待变异的蛋白质亚单位DNA的编码子可以被识别的。在识别的变异位点每一边肯定有一个独特的限制核酸内切酶的位点。如果没有这些限制酶切位点的存在，在想得到的蛋白质亚单位DNA的适当部位用上述的寡聚核苷酸调节的诱变方式导入，可以引导它们的产生。在限制性酶切位点导入质粒中后，在这些位点酶切时其线性化。限制位点之间编码DNA序列但包含所要突变的双链寡聚核苷酸通过标准程序合成。两条链分别合成然后通过标准方法杂交在一起。双链的寡聚核苷酸是作为盒被归类的。盒被设计为有3’和5’端这与线性化质粒的端相容，这样就能直接连接到质粒。现有质粒含有变异的想得到的蛋白质亚单位DNA序列。
细合的诱变
组合诱变也通常被用于产生突变体。例如排列同系物或其他有关系的蛋白质的组的氨基酸序列，适宜的是促进最高同源性的可能性。出现在排列序列的特定的部位的所有氨基酸能挑选出组合序列的简并组。变体的多样化文库是通过在核酸水平上的组合诱变来产生的，并通过多样化(variegated)的基因文库来编码的。例如，一种合成的寡聚核苷酸的混合物能被酶促地连接到基因序列以至于潜在序列的简并组是作为个别的肽被表达出来的，或者二者择一的，作为一组含有简并序列组的较大融合蛋白质。
用于筛选肽片段或同系物文库的主要高产方法
在现有技术中对于筛选产生的突变基因产物有不同的技术。筛选大基因文库的技术通常包括克隆基因文库到可复制的表达向量，用向量的合成文库转化适当的细胞，在想得到的活性的可检测到条件下表达基因，组合成三聚合分子，结合一个自然配基，如一个受体或基质，促进相关的向量编码的检测到产物的基因的分离。以下描述的每项技术对于大量已引起的序列的筛选高产量分析是可修改的，如通过随机诱变技术。
两个杂种体系
两种杂种(hybrid)(交互作用肼(trap))分析通常能确定和VEGF有交互作用的蛋白质。可以包括激动剂、superagonists、拮抗剂。(受试者蛋白质和与其有交互作用的蛋白质是指习惯使用的饵蛋白(bait protein)和鱼蛋白(fishproteins)。)这些分析依赖于检测功能性转录激活剂的重构，其由采用饵蛋白的蛋白-蛋白相互作用介导。尤其是，这些分析是利用表达杂种蛋白的嵌合基因完成的。第一杂种包含融合到饵蛋白的DNA结合域，如TSP-1或TSP-2分子或它的片段。第二杂种蛋白包括融合到”鱼”蛋白的转录活化域，如表达文库。如果鱼和饵蛋白能相互作用，它们将靠近DNA结合和转录活化域。这种接近足以使可操作连接到转录调控位点的报道基因转录，所述位点可为DNA结合域识别，标记基因的表达可以检测到并用于对饵蛋白与另一蛋白的交互作用计分。
展示文库
在筛选分析的一个方法中，后补肽在细胞或病毒粒的表面显现出来，具体细胞或病毒颗粒通过展示的产物结合合适的受体蛋白在″淘选检测(panning assay)″中测定。例如，对于细菌细胞表面膜蛋白，基因文库能克隆到所述基因，通过淘选检测所得融合蛋白(LacIner et al.，WO 88/06630；Fuchset al.(1991)BiolTechnology 9：1370-1371；and Goward et al.(1992)TIBS 18：136-140)。在一个近似的方法中，一个可检测的标记的配基能被用于潜在的功能性的肽的同系物计分。荧光标记的配基，如受体，可用于检测保持配体结合活性的同系物。荧光标记的配基的使用，可以使细胞在荧光显微镜下在视觉上被检测和分离出来，或者在细胞形态学上可以通过荧光细胞分类器分离出来。
基因文库可表达为在病毒粒表面上的融合蛋白质。例如，在纤维状的噬菌体体系中，异质的肽序列能在有感染力的噬菌体的表面上表达，因此具有两大优势。首先，由于这些噬菌体适于每毫升浓度超过1013噬菌体的上亲合基质，大量的噬菌体都能通过一次筛选。第二，由于这些有感染力的噬菌体在它们表面显现出基因产物，如果特殊的噬菌体在低产量下能从亲合基质中回收，噬菌体能够通过另一轮感染而扩增。几乎同样的E.大肠杆菌纤维状噬菌体M13.fd组，和fl.常用于噬菌体的展示文库。噬菌体gIII或gVIII膜蛋白中任意一个在未破坏病毒粒的最终包装情况下能用于融合蛋白质的产生。异质的抗原决定基在pIII的NH2-末端被表达，携带这类抗原决定基的噬菌体能从缺乏抗原决定基的过量噬菌体中回收(LacIner et al.PCT publication WO 90/02909；Garrard et al.，PCT publication WO 92/09690；Marks et al.(1992)J.Biol.Chem.267：16007-16010；Griffiths et al.(1993)EMBOJ 12：725-734；Clackson et al.(1991)Nature 352：624-628；and Barbaset al.(1992)PNAS 89：4457-4461)。
一个普通的方法是用大肠杆菌的麦芽糖受体(外膜蛋白质LamB)作为肽融合partner(Charbit et al.(1986)EMBO 5，3029-3037)。寡聚核苷酸被插入编码LamB基因质粒来生产融合到蛋白质细胞外的环(loop)肽。这些肽可用于结和配基，如对于抗体，当细胞实施于动物时能引出免疫响应。其他细胞表面的蛋白质，如OmpA(Schorr et al.(1991)Vaccines 91，pp.387-392)，PhoE(Agterberg，et al.(1990)Gene 88，37-45)，and PAL(Fuchs et al.(1991)BiolTech9，1369-1372)，以及大的细菌表面结构对于肽的显示是作为一个媒介物。肽融合于菌毛蛋白，聚合的蛋白质形成通管为了遗传信息的细菌间交换(Thiry etal.(1989)Appl.Environ.Microbiol.55，984-993)。因为它在与其他细胞相互作用中的作用，纤毛提供了一个对于在细胞外环境中肽的表达的有利的支持。另外用于显示肽的大的表层结构是细菌的运动结构如鞭毛。肽的融合到亚单位蛋白质的鞭毛蛋白提供了一个肽拷贝在宿主细胞的密集排列(Kuwajima et al.(1988)BiolTech.6，1080-1083)。其他细菌种类的表面蛋白质也提供了作为肽融合配偶体。如葡萄球菌蛋白质A和外膜的奈瑟氏菌属的蛋白酶IgA(Hansson et al.(1992)J.Bacteriol.174，4239-4245 and Klauseret al.(1990)EMBO J.9，1991-1999)。
以上所描述的纤维状噬菌体体系和LamB体系中，肽和它的编码DNA之间的物理连接是通过在其表面的这种肽的粒子(噬菌体或细胞)内DNA包含(containment)实现的。捕获了肽，也就捕获了该粒子和其中的DNA。另一种可供选择的方案是使用DNA结合蛋白LacI在肽和DNA之间形成一个连接(Cull et al.(1992)PNAS USA 89：1865-1869)。这种系统需要使用一种质粒，这种质粒在它的寡核苷酸克隆位点的3′-末端含有LacI基因。在阿拉伯糖的受控诱导下，产生一种LacI-肽融合蛋白。这种融合保留了LacI结合短DNA序列已知为LacO操纵基因(LacO)的天然能力。通过在表达质粒上建立两份LacO，LacI-肽融合物可以牢固的结合到编码它的质粒上去。因为每个细胞里面的质粒只含有单个寡核苷酸序列并且每个细胞只表达单个肽序列，肽与指导它的合成的DNA序列特异性并且稳定结合。文库细胞逐渐溶解，肽-DNA复合物暴露在固定受体的基质下以回收含有活性肽的复合物。然后把相关的质粒DNA再导入到细胞中进行扩增，进行DNA序列测定以确定肽配体的同一性。作为这种方法实用性的一个例证，有人建了一个含有十二肽的大随机文库，并且挑选一个单克隆抗体来抗类鸦片肽强啡肽B。结果显示回收了一组肽，与共有序列相关的所有肽都对应强啡肽B的一个6-残基片段(Cull等，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89-1869)。
这个方案有时候被认为是在质粒上肽方案。它与噬菌体展示方法在两个重要的方式上不同。首先，肽附加到融合蛋白的C-末端，这导致文库成员显示为具有游离羧基末端的肽。丝状噬菌体外壳蛋白，pIII和pVIII通过它们的C-末端都固定在噬菌体上，客体肽被放到向外延伸的N-末端区域。在一些设计中，被噬菌体显示的肽可以刚好出现在融合蛋白的氨基末端。(Cwirla，et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87，6378-6382)。第二个区别是，一系列的生物偏差会影响那些实际出现在文库里面的肽群体。LacI融合分子被限制在宿主细胞的胞浆里面。在翻译过程中噬菌体外壳融合物暂时暴露在胞浆里面，但是它们会迅速的通过内层膜分泌到胞质室，通过它们的C-末端亲脂区域，保持固定在膜上，在含有肽的N-末端，伸到胞质并等待着结合到噬菌体粒子上去。由于LacI里面的肽和噬菌体文库显示不同的蛋白分解活性，这导致它们可能有显著的差异。噬菌体外壳蛋白需要转运穿过内层膜，信号肽酶处理作为它并入到噬菌体的前奏。一些特定的肽在这些过程中发挥着不利的影响并且这些肽在文库里面没有代表性。(Gallop et al.(1994)J.Med.Chem.37(9)：12331251)。这些特殊的误差在LacI显示系统里面不是一个要素。
在重组体随机文库里面可获得的小分子肽的数量是巨大的。具有107-109个独立克隆的文库可以通过常规的方法建立。已经建立了具有1011个重组体这样大的文库，但是，这种文库的大小对克隆文库有实际的限制。这种文库大小的限制出现在转换那些含有随机片段的DNA到宿主细菌细胞里面这一步。为了克服这个限制，最近发展了一种体外系统，这个系统以多核糖体复合物里面的初始肽(nascent peptide)的作用为基础。这个显示文库方法具有产生比目前可获得的噬菌体/噬菌粒或者质粒文库大3-6个数量级文库数量的潜力。而且，文库的构建，肽的表达和筛选都是以一种完全不依赖细胞的方式完成的。
这种方法的一个应用(Gallop et al.(1994)J.Med.Chem.37(9)：12331251)，构建了可以编码1012个十肽的分子DNA文库并且在体外E.coliS30结合转录/翻译系统文库的表达。选择合适的条件的结合在mRNA上建立核蛋白体，使很大比例的RNA在多核糖体上积聚，从而产生含有那些仍然连接在它们的编码RNA上的初始肽的复合物。多核糖体足够的坚实以致于它在固定受体有亲和纯化，这种亲和方式与更多传统的重组肽显示文库以同样的方式进行筛选。从所结合的复合体得到的RNA被回收，转换为cDNA，并且通过PCR进行扩增以产生下一轮合成和筛选的模板。多核糖体显示方法可以结合噬菌体显示系统。几轮筛选之后，从多核糖体浓缩池里提取的cDNA被克隆到噬菌粒载体上。这种载体不仅可作为肽表达载体，显示融合到外壳蛋白上的肽，还可以作为鉴定肽时的DNA序列测定载体。通过表达噬菌体上的来自多核糖体的肽，我们可以继续以这种方式进行亲和挑选，还可以通过噬菌体ELISA实验测定每个克隆上肽的结合活性，还可以通过一个完整的噬菌体ELISA实验测定肽的结合特异性。(Barret，etal.(1992)Anal.Biochem 204，357-364)。为了鉴定活性肽的序列，可以测定由噬菌粒宿主产生的DNA序列。
次级筛选
为了进一步确定生物活性，这些生物活性例如可以允许本领域一般技术人员区分显效药和拮抗药，然后，使用次级筛选进行上面描述的高通量测定。所使用的次级筛选的类型将会取决于那些需要实验的目标活性。例如，可以建立这样一个测定方法，在这个测定方法里，抑制目的蛋白例如TSP1或者TSP2与其配体之间相互作用的能力，可以从上述的初段筛选之一分离出来的一组肽片段中，区分显效药或者拮抗药。例如，一个测试化合物抑制皮肤中血管发生的能力可以通过许多现有技术进行测定，例如，通过对皮肤应用测试化合物或者对皮肤进行处理，例如实验动物(例如，小鼠)；评价在没有该化合物的情况下皮肤中血管的数量或者大小，并与存在该化合物的情况进行比较。能引起皮肤中血管的数量或者大小下降的化合物被认为是可以抑制皮肤中血管发生的化合物。
因此，现有技术已经知道产生片段以及类似物的方法和测试它们活性的方法。一旦确定重要的核心序列，本领域技术人员都可以获得类似物和片段并且可以测试它们的目标活性，这是一个常规的途径。
肽类似物
本发明同时也减少了TSP-1或者TSP-2多肽的蛋白结合域以产生类似物，例如，肽或者非肽剂。例如，“人乳头状瘤病毒蛋白肽抑制剂结合视网膜母细胞瘤基因蛋白”欧洲专利申请EP 0 412 762和EP 0 031 080
可以使用下面物质产生关键残基的非水解肽类似物：苯并二氮杂(benzodiazepine)(例如，见Freidinger et al.in Peptides：Chemistry andBiology，G.R.Marshall ed.，ESCOM Publisher：Leiden，Netherlands，1988)，氮杂卓(例如，见Huffman et al.in Peptides：Chemistry and Biology，G.R.Marshalled.，ESCOM Publisher：Leiden，Netherlands，1988)，γ取代gama内酰胺环(Garvey et al.in Peptides：Chemistry and Biology，G.R.Marshall ed.，ESCOMPublisher：Leiden，Netherlands，1988)，南五味子酮(ketomethylene)假肽(Ewenson et al.(1986)JMed Chem 29：295；and Ewenson et al.in Peptides：Structure and Function(Proceedings of the 9th American Peptide Symposium)Pierce Chemical Co.Rockland，IL，1985)，β-旋转(turn)二肽核心(Nagai et al.(1985)Tetrahedron Lett 26：647；and Sato et al.(1986)JChem Soc Perkin Trans1：1231)，和β-氨基醇(Gordon et al.(1985)Biochem Biophys Res Commun126：419；and Dann et al.(1986)Biochem Biophys Res Commun 134：71).
融合蛋白
用来调节TSP-1或者TSP-2蛋白水平的多肽可以融合到另一个蛋白或者它的一部分上去。例如，一个TSP-1或者TSP-2蛋白或者它们的一部分可以操作连接到另一个多肽部分上以提高它的溶解性。可以融合TSP-1或者TSP-2或者它们的一部分的蛋白包括血浆蛋白或者它的片段，它们可以提高VEGF的循环半衰期。例如，融合蛋白可以是TSP-1或者TSP-2免疫球蛋白(Ig)融合蛋白，在这个蛋白里TSP-1或者TSP-2序列与来自免疫球蛋白总科的一个序列进行融合。已经发现了几个可溶的融合蛋白的构造物，在这个构造里，细胞外结构域的细胞表面糖蛋白与免疫球蛋白的不变F(c)域进行融合。例如，Capon et al.(1989)Nature 337(9)：525-531，提供了关于通过融合CD4与免疫球蛋白(IgGI)生成更长久性CD4类似物的指导。又见，Capon et al.，U.S.Patent Numbers：5,116,964 and 5,428,130(CD4-IgG融合构建体)；Linsley et al.，U.S，Patent Number 5,434,131(CTLA4-IgG1 and B7-IgGI融合构建体)；Linsley et al.(1991)J.Exp.Med.174：561-569(CTLA4-IgGI融合构建体)；and Linsley et al.(1991)J.Exp.Med 173：721-730(CD28-IgGI and B7-IgGI融合构建体)。已经证实这种融合蛋白对于调节受体-配体相互作用和减少体内炎症方面作用很大。例如，融合蛋白已经在体内使用了，在这样的融合蛋白里面，细胞表面肿瘤坏死因子受体(TNFR)蛋白的细胞外结构域已经融合到免疫球蛋白的不变(Fc)域。例如，Moreland etal.(1997)N.Engl.J.Med.337(3)：141-147；and，van der Poll et al.(1997)Blood 89(10)：3727-3734)。
反义核酸序列
那些对编码阳性血管发生因子例如VEGF的核苷酸有反义作用的核酸分子，可以被用来作为此处所描述的方法来抑制血管形成的试剂。“反义”核酸包括一个核苷酸序列，这个序列与编码阳性血管发生因子例如VEGF的“有义”核酸互补，例如与一个双链cDNA分子的编码链互补或者与一个mRNA序列互补。因此，反义核酸可以与有义核酸形成氢键。反义核酸能够与一条完全的VEGF编码链互补或者与它的一部分互补。例如，可以使用对那些编码VEGF的核苷酸序列其中的编码链中“编码域”起反义作用的反义核酸分子。
目前已经知道编码VEGF的编码链序列。在给定编码VEGF的编码链序列的情况下，可以根据Watson-Crick碱基配对原则设计反义核酸。反义核酸分子可以与VEGF mRNA中的全部编码域互补配对，但是最好是选择只对VEGF mRNA编码域或者非编码域的一部分起反义作用的寡核苷酸。例如，反义寡核苷酸可以互补那些围绕VEGF mRNA翻译起始部位的区域。一个反义寡核苷酸例如在长度上可以大约有5，10，15，20，25，30，35，40，45，50个核苷酸。在现有技术下，可用进行化学合成和酶结合反应以构建一个反义核酸。例如，可以化学合成一个反义核酸(例如，一个反义寡核苷酸)，使用自然的存在的核苷酸或者那些目标在于增强分子的生物稳定性以及增强反义和有义核酸分子之间形成的双链的物理稳定性的各种修饰的核苷酸，例如，使用硫代磷酸盐(phosphorothioate)衍生物和吖啶取代核苷酸。可以用来形成反义核酸的修饰核苷酸的例子包括5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，次黄嘌呤，黄嘌呤，4-乙酰胞嘧啶，5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶，5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷，5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶，二氢尿嘧啶，β-D-galactosyl queosine，次黄苷，N6-异戊烯腺嘌呤，1-甲基鸟嘌呤，1-甲基次黄苷，2，2-二甲基鸟嘌呤，2-甲基腺嘌呤，2-甲基鸟嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N6-腺嘌呤，7-甲基鸟嘌呤，5-甲基氨基甲基尿嘧啶，5-甲氧氨基甲基-2-巯基脲嘧啶，β-D-甘露糖基queosine，5′-甲氧基羧甲基尿嘧啶，5-甲氧尿嘧啶，2-甲硫基-N6-异戊烯腺嘌呤，尿嘧啶-5-氧乙酸(v)，wybutoxosine，假尿嘧啶，queosine，2-巯基胞嘧啶，5-甲基-2-硫脲嘧啶，2-硫脲嘧啶，4-硫脲嘧啶，5-甲基尿嘧啶，尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯，尿嘧啶-5-氧乙酸(v)，5-甲基-2-硫脲嘧啶，3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶，(acp3)w，2，6-二氨基嘌呤。还有其它的方法，我们可以使用一种表达载体来生物合成反义核酸，在这种表达载体里面核酸已经以反义方向被亚克隆(即，从插入核酸转录而得到的RNA将会是靶核酸的反义定向)。
RNAi
能够沉默基因的双链核酸分子同样也可以被作为抑制IR信号途径部分表达的一种试剂，这个被沉默的基因可以编码这里所描述的IR信导途径的成分，例如这里所描述的一个成分。RNA干扰(interference)(RNAi)是部分植物在转录后发生基因沉默(gene silencing)的一种机制，在这个过程中对应目的基因(或者编码区)的双链RNA(dsRNA)被导入到细胞或者生物体里面，结果导致相应mRNA的降解。在恢复基因表达之前，RNAi作用对多细胞分裂起着持续的作用。因此，RNAi在RNA水平形成靶敲除或“敲下(knockdouns)”是一种特别强的方法。RNAi已经在人类细胞上得到成功的证明，包括人胚胎肾和海拉细胞(例如Elbashir et al.Nature 2001 May 24；411(6836)：494-8)。在一个具体实施方案里，在哺乳细胞可以通过增强RNA发夹(hairpins)的内源表达来诱导基因沉默。(见Paddison et al.，2002，PNASUSA 99：1443-1448)。在另一个具体实施方案里，转染小(21-23nt)dsRNA来专门抑制基因表达(综述Caplen(2002)Trends in Biotechnology 20：49-51)。
简单的说，RNAi被认为是按照如下过程起作用的。对应将要被沉默基因的一部分的dsRNA被导入到细胞。消化dsRNA到21-23个核苷酸siRNAs，或者短干扰(interfering)双链RNA分子。然后，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物或者RISC。RISC通过同源mRNA和siRNA链之间的碱基配对靶向到同源转录体上，并在距离siRNA 3′端12个碱基的位置切割mRNA。(综述见Sharp et al(2001)Genes Dev 15：485490；and Hammond et al.(2001)Nature Rev Gen 2：110-119)
基因沉默RNAi技术使用标准分子生物学方法。通过标准方法可以形成那些对应于要失活的靶基因序列的dsRNA。例如，通过用T7核糖核酸聚合酶同时转录模板DNA(对应靶序列)双链。在商业上可以获得在RNAi中所使用的产生dsRNA的试剂盒，例如，来自New England Biolabs公司。转染dsRNA或者转染那些工程化形成dsRNA的质粒的方法在现有技术上都是比较常规的方法。
据报道，通过在哺乳细胞上转染mRNA-cDNA杂种构建物，证明基因沉默效应与那些RNAi效应类似，(Lin et al.，Biochem Biophys Res Commun2001 Mar 2；281(3)：639-44)，他们提供了基因沉默的其它策略。
给予方式
调节血管发生的制剂比如血管发生抑制剂，例如，TSP-1或者TSP-2，或者调节TSP-1或者TSP-2的制剂都可以通过标准的方法给予受试者。例如，可以从各种不同的给予途径里面选择任何一种进行，包括静脉内，真皮内，皮下，口服(例如，吸入)，透皮(局部)和粘膜给药。在一个具体实施方案里，可以局部给药TSP-1或者TSP-2或者它的调节剂。
调节TSP-1或者TSP-2蛋白水平试剂，例如，TSP-1或者TSP-2核酸分子，TSP-1或者TSP-2多肽，片段或者类似物，TSP-1或者TSP-2调节剂，和抗-TSP-1或者抗-TSP-2抗体(这里也指活性化合物)，这些都可以并到药物组合物中使之易于对象例如人的给药。这些典型的组合物成分包括核酸分子，多肽，调节剂，或者抗体，和药用合适的载体。这里使用词语“药用合适的载体”意图在于包括任何所有的溶剂，分散试剂，包衣，抗细菌剂和抗真菌剂，等渗和吸收延迟剂等与给药相容的其它类似的制剂。目前已经知道药物活性物质的这些试剂和制剂的使用方法。除了那些与活性化合物不相容的一些普通的试剂或者制剂的范围，在组成成分的发明中可以使用这些试剂。补充的活性成分也可以并到合成中。
通过与目的给药途径相适应可以配制药物组合物。非肠道给药可以使用溶液或者混悬液，真皮内或者皮下应用包括以下成分：无菌稀释剂例如注射用水，生理盐水，固定油类，聚乙二醇，甘油，丙二醇或者其它的合成溶剂；抗菌剂例如苯甲醇或者尼泊金甲酯；抗氧化剂例如抗坏血酸或者亚硫酸氢钠；螯合剂例如乙二胺四乙酸；缓冲液例如醋酸盐，柠檬酸盐，或者磷酸盐缓冲液，以及调节渗透压的试剂例如氯化钠或者葡萄糖。可以用酸或者碱来调节pH，例如盐酸或者氢氧化钠。非肠道制剂可以附上安瓿，一次性注射器或者由玻璃或塑料制成的多剂量小药水瓶。
适合注射的药物组合物包括无菌水溶液(溶于水)或者分散体，和临用制剂的无菌注射溶液或者分散体的无菌粉末。对静脉给药，合适的载体包括生理盐水，消毒水，Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，NJ)或者磷酸盐缓冲液(PBS)。总之，所有成分都必须无菌并且应该具备一定的流动性使之可以很容易的在注射器里面存在。在制备和贮存的条件下必须稳定而且必须一直保持着防止像细菌和真菌这些微生物的污染。载体可以是一种溶剂或者分散试剂包括例如，水，乙醇，多元醇(例如甘油，丙二醇，液体聚乙二醇等等)，和与它相配的混合物。例如使用包衣例如卵磷脂，至于分散体通过保持所需的粒径和通过使用表面活性剂，保持适当的流动性。通过使用各种抗细菌剂和抗真菌剂可以防止微生物的生长，例如，尼泊金，氯代丁醇，苯酚，抗坏血酸，硫柳汞等等。许多情况下，在成分上将会优先选择物质包括等渗剂例如糖，多元醇例如甘露醇，山梨醇，氯化钠。通过在处方上加入那些可以延迟吸收的物质例如单硬脂酸铝和凝胶，引起注射成分的延长吸收。
通过把所需量的活性化合物(例如TSP-1或者TSP-2多肽)加到一个合适的溶剂中，按照需要可以单用或者合用刚才列举的成分，然后过滤灭菌，这样就可以制备无菌注射溶液了。通常，分散体的制备是通过把活性化合物加到无菌容器上，这个无菌容器含有一个基本的分散试剂和刚才列举的那些所需的成分。至于制备无菌注射溶液的无菌粉末，首选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，由这些方法可以得到活性成分的粉末并且还可以得到从它的以前的无菌过滤中的其它的想要的成分。
口服制剂通常包括一种惰性稀释剂或者可食用载体。它们可以附着在凝胶囊里或者被压成片剂。为了口服处理给药，活性化合物可以加到敷料中然后以片剂，药片或者胶囊的形式使用。口服制剂也可以使用流动载体来制备，流动载体作为含漱剂使用，在流动载体里面的化合物以口服的形式应用，swished，吐出或者吞咽下去。药物粘合剂或者敷料可以作为制剂的一部分。片剂，丸剂，胶凝，药片等等可以含有以下成分或者类似性质化合物中的任何一种：粘合剂例如微晶纤维素，黄蓍树胶或者明胶；敷料例如淀粉或者乳糖，崩解剂例如海藻酸，Primogel，或者玉米淀粉；滑润剂例如硬脂酸镁或者Sterotes；助流剂例如胶体二氧化硅；甜味剂例如蔗糖或者糖精；或者调味剂例如薄荷，水杨酸甲酯，或者橙调味剂。
也可以通过粘膜或者透皮的方式进行全身给药。对于粘膜或者透皮给药，在处方中使用适合穿透屏障的渗透激动剂。已知的这些渗透激动剂通常包括例如对于粘膜给药，洗涤剂，胆盐和夫西地酸衍生物。可以通过鼻腔喷雾或者栓剂实现粘膜给药。对于透皮给药，活性化合物加入到软膏，油膏，凝胶或者乳膏以及目前现有技术普遍的处方里。这些透皮处方可以应用到皮肤上来促进或者抑制毛发生长。
在一个具体的实施方案里，活性化合物以载体的形式制备，这种载体可以保护化合物防止在体内快速消除，例如控释处方，包括植入剂和微囊给药系统。可以使用生物可降解的和生物相容性的高分子材料例如乙烯醋酸乙烯酯，聚酸酐，聚乙醇酸，胶原，聚正酯和聚乳酸。制备这些制剂的方法与那些已经成熟的方法类似。也可以从商业公司得到一些材料例如Alza公司和NovaPharmaceuticals公司。脂质体混悬液(包括利用连接单克隆抗体针对病毒抗原的原理靶向感染细胞的脂质体)。脂质体混悬液也可以作为药剂可接受的载体。这些制剂都可以根据目前已经成熟的技术来制备，例如在U.S.PatentNo.4,522,811中描述的方法。
这里所描述的核酸分子可以插入到载体中并且作为基因处理的载体。可以通过例如静脉注射，局部给药(见U.S.Patent 5,328,470)或者立体定位注射(见Chen et al.，PNAS 91：3054-3057，1994)这些方法对受试者给基因处理载体。基因处理载体的制备包括基因处理载体在合适的稀释剂里面，或者包括缓释基质在这个缓释基质里面包埋基因处理载体。另外的方法，只要完整的基因给药载体例如逆转录病毒载体可以从重组细胞原封不动的得到，制剂制备就可以包括一个或者多个能够产生基因转运系统的细胞。
药物组合物可以装在一个容器，包，或者带有给药方式说明的分样器里面。
调节血管发生剂例如TSP-1，TSP-2，多肽，片段或者类似物可以进行局部性的给药，例如局部给药。这种制剂可以一次性给药或者连续给药，例如制剂分足够多次给药使得TSP-1或者TSP-2蛋白水平在选择的时间段内一直保持药效，选择的时间段例如5，10，20，30，50，90，180，365天或者更长。调节例如增加或者抑制TSP-1或者TSP-2蛋白水平，例如TSP-1或者TSP-2多肽水平或者它的片段以及类似物的制剂可以重复给药。
基因处理
本发明的基因构建物也可以作为基因处理内容的一部分来载运核酸。这些核酸可以编码正的或者负(negative)的血管发生因子例如血管发生抑制剂，例如TSP-1或者TSP-2多肽或者它的片段以及类似物。本发明的特点在于体内转染的表达载体和TSP-1或者TSP-2多肽在特定细胞类型例如表皮细胞里面的表达，从而在例如表皮抑制血管发生。TSP-1或者TSP-2多肽的表达构造体可能需要给到任何具有生物有效性的载体上，例如能够在体内有效载运TSP-1或者TSP-2基因到体内细胞的任何处方或者成分。方法包括把受试者基因插入到病毒载体里，病毒载体包括重组逆转录病毒，腺病毒，腺伴随病毒(adeno-associated virus)，单纯疱疹病毒-1，或者重组细菌以及真核质粒。病毒载体直接转染细胞；质粒DNA可以在例如阳离子脂质体(lipofectin)或者其衍生物(例如偶合抗体)，聚赖氨酸偶合物，短杆菌肽S6，人造病毒包膜，或者其它的像这样的细胞内载体的帮助下转运，而且还可以把基因构造体或者CaPO4沉淀物在体内直接注射来实现。
体内把核酸导入到细胞的优选方法是使用含有核酸例如cDNA的病毒载体，这种cDNA可以编码TSP-1或者TSP-2多肽以及VEGF反义核酸。使用病毒载体转染细胞有一个优点就是很大比例的靶细胞可以接收到核酸。而且，在病毒载体例如含有cDNA的病毒载体里面，编码的分子可以在那些已经占据了病毒载体核酸的细胞内有效的表达。
逆转录病毒载体和腺伴随病毒载体可以作为外源基因转运到体内的重组基因给药系统，尤其对转运到人身上。这些载体可以有效的把基因转运到细胞并且已经转运的核酸可以稳定的整合到宿主的染色体DNA上。那些仅仅能够产生复制缺陷逆转录病毒的特殊细胞系(称作“包装细胞(packagingcell)”)的发展增强了逆转录病毒在基因处理方面的实用性。而且缺陷逆转录病毒以在基因处理为目的的基因转移方面的使用为其特点。(综述见Miller，A.D.(1990)Blood 76：271)。缺陷逆转录病毒的复制体可以被包到病毒颗粒里面，病毒颗粒通过使用标准技术联合使用辅助病毒来传染靶细胞。用这些病毒在体内或者体外产生重组逆转录病毒和感染细胞的记录可以在分子生物学现行记录中找到。Ausubel，F.M.et al.(eds.)Greene PublishingAssociates，(1989)，Sections 9.10-9.14和其它的标准实验手册。合适的逆转录病毒的例子包括pLJ，pZIP，pWE和pEM，这些已经有成熟的现有技术。用来制备同向性(ecotropic)和两向性(amphotropic)逆转录病毒系统的合适包装病毒系包括ψcrip，ψCre，ψ2和ψAm。逆转录病毒已经被用来在体内或者体外把各种基因导入许多不同细胞类型包括上皮细胞。(见例子Eglitis，etal.(1985)Science 230：1395-1398；Danos and Mulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：6460-6464；Wilson et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：3014-3018；Armentano et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：6141-6145；Huber et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：8039-8043；Ferry et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：8377-8381；Chowdhury et al.(1991)Science 254：1802-1805；van Beusechem et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：7640-7644；Kay et al.(1992)Human Gene Therapy 3：641-647；Dai et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10892-10895；Hwu et al.(1993)J.Immunol.150：4104-4115；U.S.Patent No.4,868,116；U.S.Patent No.4,980,286；PCT Application WO 89/07136；PCT Application WO 89/02468；PCT Application WO 89/05345；and PCT Application WO 92/07573).
本发明中有用途的另一种病毒基因转运系统利用了源自腺病毒载体。操纵腺病毒基因组使它编码并表达目的基因产物，但是当在正常的细胞溶解酵素病毒生存周期条件下它的复制能力失活。见，例如Berkner et al.(1988)BioTechniques 6：616；Rosenfeld et al.(1991)Science 252：431-434；andRosenfeld et al.(1992)Cell 68：143-155。来自腺病毒毒株Ad 5 d1324型或者其它腺病毒毒株(例如Ad2，Ad3，Ad7等)的合适腺病毒载体已经有成熟的技术。重组腺病毒在特定的情况下有优势，因为它们没有能力感染非分化细胞所有可以被用来感染各种范围的细胞类型，包括上皮细胞(Rosenfeld etal.(1992)，出处同上)。而且，病毒粒子相对比较稳定，比较易于纯化和浓缩，就像上述提到的可以加以修饰来影响侵染性光谱。除此之外，导入的腺病毒DNA(和其中含有的外源DNA)不会整合到宿主细胞的基因组里面而是保持游离状态，因此可以避免那些由于在原位导入的DNA整合到宿主基因组(例如逆转录病毒DNA)发生插入诱变的潜在问题的发生。而且，腺病毒基因组对外源DNA的携带容量相对其它的基因转运载体来说很大(可达8千碱基对)(Berkner et al.出处同上；Haj-Ahmand and Graham(1986)J.Virol.57：267)。
然而另外一种有用的转运目的基因的病毒载体系统是腺伴随病毒(AAV)。腺伴随病毒是一种天然存在的有缺陷病毒，它需要其它的病毒例如腺病毒或者疱疹病毒来作为进行有效复制和有长生命周期的辅助病毒。(综述见Muzyczka et al.(1992) Curr.Topics in Micro.and Immunol.158：97-129)。腺伴随病毒也是能够把它的DNA整合到非分裂细胞和显示稳定整合的高频率的几种病毒之一。(见例子Flotte et al.(1992)Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.7：349-356；Samulski et al.(1989)J.Virol.63：3822-3828；andMcLaughlin et al.(1989)J.Virol.62：1963-1973)。仅仅含有少到300个碱基的AAV的载体可以被包装然后整合。外源DNA的空间局限在大约4.5千碱基对。就像在Tratschin et al.(1985)Mol.Cell.Biol.5：3251-3260描述的，AAV载体可以用来把DNA导入到细胞。使用AAV载体已经把各种各样的核酸导入到不同的细胞类型(见例子Hermonat et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6466-6470；Tratschin et al.(1985)Mol.Cell.Biol.4：2072-2081；Wondisford et al.(1988)Mol.Endocrinol.2：32-39；Tratschin et al.(1984)J.Virol.51：611-619；and Flotte et al.(1993)J.Biol.Chem.268：3781-3790)
除了病毒转运方法，例如上面说阐述的那些，也可以使用非病毒方法在动物组织内引起TSP-1或者TSP-2多肽，片段以及类似物的表达。基因转运的大多数非病毒方法都是根据哺乳动物细胞摄取大分子和在胞内运输大分子的正常机制。在首选的具体方案中，本发明的非病毒基因转运系统是根据靶细胞摄取目的TSP-1或者TSP-2基因的胞内途径。这种类型的基因转运例子包括来自脂质体系统，聚赖氨酸偶合物(cenjugate)和人造病毒包膜。其它的具体形式包括质粒注射系统就像Meuli等提到的，Meuli etal.(2001)JInvest Dermatol.116(1)：131-135；Cohen et al.(2000)Gene Ther 7(22)：1896905；or Tam et al.(2000)Gene Ther 7(21)：1867-74
在一个有代表性的实施方案中，编码TSP-1或者TSP-2多肽，活性片段或者类似物的基因可以被包入到表面有阳性电荷的脂质体上(例如lipofectins)并且(任选地)这些脂质体有针对靶组织的细胞表面抗原抗体标记(Mizuno et al.(1992)No Shinkei Gek(i 20：547551；PCT publicationWO91/06309；Japanese patent application 1047381；and European patentpublication EP-A-43075)
在临床上，通过许多方法中的任何一种，这些方法之间在现有技术上都很接近，对于处理性的TSP-1或者TSP-2基因的基因转运系统可以引入到受试者身上。例如，可以通过例如通过静脉注射把基因转运系统的药物制剂系统性的导入。倘若是基因转运媒介，细胞类型，或者由于转录调节序列控制受体表达的组织类型表达，或者这几种都有，靶细胞内蛋白的特殊转导的发生主要来自转染的特异性。在其它的实施方案中，重组基因的初期转运主要限制在在一个地方(being quite localized)导入到动物。例如，可以使用导管导入基因转运载体(见U.S.Patent 5,328,470)或者通过立体定位注射(stereotactic injection)(例如Chen et al.(1994)PNAS 91：3054-3057)
基因处理构建的药物制剂基本上包括基因转运系统在合适的稀释剂里面，或者制剂包括一种缓释基质，在这个缓释基质里面包埋基因转运载体。另外的方法，只要完整的基因转运系统例如逆转录病毒载体可以原封不动的从重组细胞得到，制剂制备就可以包括一个或者多个能够产生基因转运系统的细胞。
细胞处理
也可以在受试者上，通过导入到细胞增加TSP-1或者TSP-2例如表皮细胞，例如角化细胞，可导入调节产生TSP-1或者TSP-2的核苷酸序列例如编码TSP-1或者TSP-2多肽或者功能片段或者其类似物的核苷酸序列；启动子序列例如来自TSP-1或者TSP-2基因或者其它基因的启动子序列；增强子序列例如5′不翻译区(UTR)，例如来自TSP-1或者TSP-2基因或者其它基因的5′UTR，例如来自TSP-1或者TSP-2基因或者其它基因的3′UTR；聚腺苷酰化作用位点；绝缘序列(insulator sequence)；或者另外的调节TSP-1或者TSP-2表达的序列。然后把细胞导入到受试者中。
将要用作基因工程的原代和传代细胞可以从各种组织中得到，这些细胞包括那些在培养过程中能够保持繁殖的细胞类型。例如，原代(primary)和传代(secondary)细胞包括成纤维细胞，角化细胞，上皮细胞(例如乳房上皮细胞，肠上皮细胞)，内皮细胞，神经胶质细胞，神经细胞，血液的形成元素(例如淋巴细胞，骨髓细胞)，肌细胞(成肌细胞)和这些体细胞类型的前体细胞。原代细胞最好是从那些给予基因工程的原代或者传代细胞的个体获得。然而，原代细胞可以从相同种或者不同种(例如，小鼠，大鼠，兔，猫，狗，猪，牛，鸟，绵羊，山羊，马)的供体(不是接受者)获得。
术语“原代细胞”包括从脊椎动物组织(它们被传代之前即附着在组织培养基质例如小盘或者烧杯)分离出来的细胞混悬液中出现的细胞，来自组织的在外植块不仅包括那些首次传代的以前的细胞类型还包括来自这些传代细胞的细胞混悬液里面出现的细胞。术语“传代细胞”或者″细胞株″指的是在培养过程后来所有步骤的细胞。也就是说，第一次的传代的原代细胞从培养基质中清除并且再次传代(细胞传代)，此处指的是传代细胞，所有的细胞都进行后来的细胞传代。传代细胞是指含有传代细胞的细胞株，它们已经被传代一次或者多次。一个细胞株包括这样的传代细胞，1)它已经被传代一次或者多次；2)它在培养中显示有限数量的平均群体倍增数；3)显示接触抑制性质和支抗依赖性生长(支抗依赖不适用那些经悬浮培养繁殖的细胞)和4)是非永生的(anchorage)。定义(纯系细胞株)为源自于一种生成细胞的细胞株。定义“异源性细胞株”为源自于一种或者多种生成细胞的细胞株。
脊椎动物尤其哺乳动物的原代和传代细胞，它的起点可以用那些包括编码信号肽或者异源核酸序列例如编码TSP-1或者TSP-2外源核酸序列并且在长期时间内体外体内可以稳定重复的产生编码产物产生来转染。一个异源氨基酸也可以作为调节序列例如启动子，它可以诱导表达例如引起内源TSP-1或者TSP-2序列的诱导性表达或者上调。可以利用外源重组把外源核酸序列导入到原代和传代细胞，例如，U.S.PatentNo.：5,641,670，其内容在这里提供参考。
转染的原代和传代细胞可以包括DNA，这种DNA不仅编码一种可选标记，这种标记在其上面有可选表型，而且促进它们的识别和分离。产生那些可以稳定表达外源合成DNA，纯系(clonal)细胞株和异源细胞的异源性细胞株的原代或传代细胞的方法，产生纯系的异源细胞株的方法和通过使用大量的转染原代或传代细胞来处理或者防止异常或者不良的情况的方法，这些方法都是本发明的部分内容。
纯系或者异源性细胞株中原代或者传代细胞的转染
可以通过标准方法获得脊椎动物组织，这些方法例如钻取活组织检查或者获得原代细胞类型的组织的其它手术方法。例如，钻取活组织检查用来获得的皮肤作为成纤维细胞或者角化细胞的来源。使用已知的方法例如酶消化或者外植，从组织获得元代细胞的混合物。如果使用酶消化，可以使用的酶有例如胶原酶，透明质酸酶，分散酶，链霉蛋白酶，胰蛋白酶，弹性蛋白酶，糜蛋白酶。
最后得到的原代细胞混合物可以直接转染或者在转染之前先培养，然后从培养皿中分离，最后再次混悬。原代或者传代细胞与外源核酸序列接合例如稳定的整合到它们的基因组，然后为了完成转染进行处理。外源核酸序列可以任选包括编码可选标记的DNA。外源核酸序列和可选标记编码DNA可以在单独的构建物上或者同一个。使用合适量的DNA以确保可以产生含有至少一种稳定的转染细胞和适当的表达外源DNA。总之，大约使用0.1μg到500μgDNA。
在这里使用的，术语“转染”包括把外源核酸导入到细胞的各种技术包括磷酸钙或者氯化钙沉淀，微注射，DEAE-糊精介导的转染，lipofection或者电穿孔。
在适当的电压和电容(相当时间常数)下进行电穿孔，结果使得DNA构造物进入到原代或者传代细胞。可以在一个宽范围电压内(例如50-2000伏特)和相应电容下进行电穿孔。通常使用的全部DNA量大约是0.1μg到500μg。
磷酸钙沉淀法，改性磷酸钙沉淀法，多聚季胺(polybrene)沉淀法，脂质体融合和受体介导的基因转运这些方法都可以用来转染细胞。也可以使用微注射来转染原代或者传代细胞一个稳定的已转染细胞然后被分离，培养，和亚培养，使它在培养条件下有充足的时间来繁殖稳定的转染传代细胞即转染传代细胞的纯系细胞株。另外一个方法，不止一个转染细胞被培养和亚培养，结果都产生异源性细胞株。
转染的原代或者传代细胞有足够的成倍数量来产生足够大的纯系细胞株或者异源性细胞株以给个体提供有效量的处理蛋白。总之，例如，0.1平方厘米的皮肤进行活组织检查认为含有一百万个细胞；一个细胞被用来产生一个纯系细胞株并且经历大约27次倍增来产生一亿个转染传代细胞。如果从将近一百万个细胞的初转染总体来产生异源性细胞株，只需要10倍就可以产生一亿个转染细胞。
在转染的纯系异源性细胞株中所需的细胞数量是可变的，这个数量取决于各种因素包括转染细胞的使用，转染细胞中外源DNA的功能水平，转染细胞的植入部位(例如，可以使用细胞的数量局限在植入的解剖部位)，和年龄，表面积，受试者的临床情况，但是并不局限于这些。正确的安排这些因素来给予人生长激素处理水平，对于一个不健康的重10千克的孤立性生长激素缺乏症的受试者，大约会需要5亿分之一的转染成纤维细胞(这些细胞的体积大约像受试者的拇指尖那么大)。
植入转染传代细胞的纯系细胞株或者异源性细胞株
转染细胞例如本文描述所产生的细胞，可以导入到将要转运产品的个体。纯系细胞株或者异源性细胞株然后导入到个体。可以使用各种给药途径和各种部位(例如肾囊下(renal subcapsular)，皮下，中枢神经系统)(包括鞘内)，血管内，肝内，内脏内，腹膜内(包括网膜内)，肌肉内，植入)。在个体内植入一个转染细胞，转染细胞产生由异源DNA编码的产物或者转染细胞受异源DNA本身的影响。例如，遭受掉头发的个体是植入产生TSP-1或者TSP-2细胞的候选。
可以在个体做一小片皮肤活组织检查；这是一个可以在门诊受试者上实现的简单的操作。例如从臂下取出一片皮肤然后需要大约一分钟，处理样品，最后导致受试者细胞(例如成纤维细胞)的分离，然后利用基因工程原理来产生TSP-1或者TSP-2或者其它蛋白或者那些可以诱导产生TSP-1或者TSP-2的分子。根据受试者的年龄，体重和临床状态，所需数量的细胞进行大量培养。全部过程应该需要4-6周，在最后的时候，适当量的基因工程细胞导入到个体，一次给门诊受试者(例如通过在受试者的皮肤下注射到它们的背部，例如在头皮或者脸部)。受试者目前就会具有产生可以防止或者减少皱纹的TSP-1或者TSP-2的能力。
对一些人，这种方法会是一次性的处理，对其它人，需要多次细胞处理处理。
就像这个例子暗示的，使用的细胞通常会是受试者特异性的基因工程细胞。然而，也可以从相同种的其它个体或者从不同种来获得细胞。使用这些细胞可能需要服用抑制免疫力的药，另外可以选择抗原组织相容性，或者使用一种屏障设备来防止植入细胞的排斥作用。
转染原代或者传代细胞可以单独给药或者联合一种屏障以及给接受者抑制细胞免疫应答剂。例如，可以给对象免疫抑制剂来抑制或者防碍对象的正常反应。首选，免疫抑制剂是可以抑制对象的T细胞或者B细胞的活性的一种抑制免疫力的药物。这些抑制免疫力的药物可以从商业上获得(例如A Sandoz Corp.East Hanover，NJ生产的环孢菌素)。
一种免疫抑制剂例如药物可以使对象产生足够期望处理效果(例如，抑制细胞排斥反应)的剂量。现有技术已经知道抑制免疫力药物的剂量范围。见，例如Freed et al.(1992)N.Engl.J.Med.327：1549；Spencer et al.(1992)N.Engl.J.Med.327：1541′Widner et al.(1992)n.Engl.J.Mecl.327：1556)。剂量具体值可能根据一些因素例如个体的疾病状态，年龄，性别和体重的变化而变化。
另外一种可以被用来抑制受试者T细胞活性的物质可以是一种抗体或者它的衍生物片段。现有技术已经知道抗体具有在体内耗尽或者退隐(sequestering)T细胞的能力。可以使用多克隆抗血清例如抗淋巴细胞血清。另外的方法，可以使用一个或者更多的单克隆抗体。优选的耗尽T细胞的抗体包括可以与细胞表面CD2，CD3，CD4，CD8，CD40，CD40配体结合的单克隆抗体。现有技术已经知道这些抗体并且商业上可获得，例如美国模式培养物保藏所。结合人类T细胞的CD3的首先抗体是OKT3(ATCC CRL8001)。
可以在适当的时间给予那些在接收对象身上可以耗尽，退隐或者抑制T细胞的抗体一个剂量来抑制移植后细胞的排斥反应。抗体的给药方式首选那些可以静脉给药的药物适当的稀释剂(例如生理盐水)载体。
干扰或者抑制接受对象细胞免疫应答的另外一个方法就是使用免疫障碍物。此处使用的“免疫障碍物”指的是一种设备，它可以在受试者的所给细胞和涉及免疫应答的细胞之间充当一个屏障。例如，细胞可以以一种植入设备的方式给。可植入设备含有的细胞在一种半透性屏障里面，就是这样一种屏障，它可以允许养分和其产物进出屏障，但是阻止大免疫系统成分例如抗体或者补体的进入。典型的植入设备包括基质例如水凝胶，生物相容性网织品(mesh)，以及放置细胞的核部位。随意地，一种半透性包衣可以包裹凝胶。如果所给细胞被放置在凝胶芯里面，所给细胞应该与免疫系统的细胞进行分离而且应该与宿主的细胞和细胞毒抗体隔离。首选的方法是，使用一种渗透选择性包衣例如PLL或者PLO。包衣通常有空隙率，这样可以阻止接收对象免疫系统成分的进入并阻止这些成分破坏植入设备里面的细胞。
现有技术已经知道包囊细胞的许多方法。例如，使用一种水溶性树胶来获得半透性水不溶凝胶来包囊细胞细胞，其它包囊方法见U.S.patentNo：4,352,883。其它可以使用的植入设备见U.S.Patent No.：5,084,350，U.S.Patent No.5,427.935，WO 95/19743 published July 27，1995，U.S.Patent No.：5,545,423，U.S.Patent Number 4,409,331，U.S.Patent Number 4,663,286，andEuropean Patent No.301,777。
使用转染细胞或者传代细胞的一个优势在于，通过控制导入个体的细胞数量，可以控制转运到体内的蛋白量。而且，有些情况，使移去那些不再需要产生产物的转染细胞成为可能。本发明使用转染原代或者传代细胞来处理的另外的优势在于，通过例如给予锌，类固醇，或者可以影响蛋白，产物或者核酸产物转录的物质，或者影响核酸产物稳定性的物质，可以调节处理产物的产生，
实施例
实例1：长期UVB照射后增强皮肤血管发生
UVB照射(累积剂量：5.65J/cm2)10周后，从双份小鼠经过UVB照射和没有UVB照射的皮肤背部取出复制物，以评价皮肤表面起伏(relief)，作为皮肤损伤程度参数。在经UVB照射的小鼠上可观察到明显的皱纹形成，而在没有UVB照射的对照小鼠上没有发现可见的皱纹。肉眼观察皮肤下面证明，在UVB照射小鼠皮下血管发生增加并伴有增大血管和血管分枝增加。
组织学分析表明：UVB处理的小鼠其表皮，真皮和脂肪腺(36)增厚，并且在真皮上层伴有炎症细胞的积累。而且，与没有照射的对照皮肤上观察到的纤维的整齐性相比，我们在UVB照射皮肤上发现了碎裂的和不完整的胶原蛋白纤维以及弹性纤维。与没有处理的对照组相比，CD31免疫染色揭示了，在UVB照射小鼠的真皮内增大的血管的数量增加。这些变化在真皮乳头，紧接表皮下面的区域，最为显著。对增生标记物Ki67和内皮接合分子CD31的鉴别性的萤光免疫染色检验显示，在UVB照射皮肤，增大的血管内的增生内皮细胞的数量增加了很多，但是，在对照皮肤，很少观察到增生内皮细胞。在UVB照射皮肤的上层真皮内观察到内皮细胞的最高增生速率。在没有照射的表皮内，在基底层有选择性的发现增生表皮角化细胞。相反，绝大多数的增生角化细胞是在UVB照射后增生表皮层的基部上层发现的。
定量计算机-辅助形态测定分析皮肤血管密度和大小的技术可以利用CD31染色组织切片。与没有照射的对照组相比，长期照射UVB导致血管密度有显著性(p＜0.001)增长。UVB照射皮肤里面的血管显著的(p＜0.001)有67％的增大，这导致血管覆盖的皮肤面积有130％以上的增加(p＜0.001)。
实例2：长期UVB照射后表皮VEGF的表达增强。
考察了长期UVB照射对皮肤的VEGF mRNA表达的影响。使用原位杂交技术，发现长期UVB照射后在底部上层的表皮角化细胞里VEGF mRNA的表达得到有效的上调，但是，在没有UVB照射的小鼠皮肤里很少，几乎没有发现VEGF mRNA的表达。
实例3：TSP-1的过表达防止UVB引起的皮肤损伤，皱纹形成和血管发生。
为了表征皮肤血管发生对于长期UVB照射影响的生物学重要性，使具有皮肤特异性的内源血管发生抑制剂TSP-1过表达的转基因小鼠经历同样的UVB照射方案。这些小鼠以前曾经有详细的特征并且显示可以有效的抑制诱导的血管发生(24)。UVB照射(UVB累积剂量是6.52J/cm2)10周后，所有野生型的小鼠在它们的背部皮肤显示明显的皱纹形成。相反，在TSP-1过表达的转基因小鼠上很少发现几乎没有皱纹形成。肉眼观察，与野生型的同窝出生仔畜相比，K14/TSP-1转基因小鼠同样显示减少的皮肤血管发生。
组织学分析表明，UVB诱导真皮和皮下组织增厚不是表皮增厚，与野生型小鼠相比，K14/TSP-1转基因小鼠增厚的较少。与野生型小鼠相比，在K14/TSP-1转基因小鼠的真皮内发现伴随有较少的炎症细胞浸润和胶原纤维的更加有规则的排列和结构。而且，K14/TSP-1转基因小鼠的皮肤血管减少了很多。CD31染色皮肤部分的形态测定分析显示，TSP-1转基因小鼠的血管大小降低达55％以上(p＜0.001)而且被血管覆盖的皮肤面积有显著的下降(p＜0.001)。在TSP-1转基因小鼠上没有发现血管密度的显著下降。与UVB照射的野生型同窝出生仔畜相比，CD31和Ki-67的双重免疫荧光染色证实了，在UVB照射的TSP-1转基因小鼠的真皮层内，增生内皮细胞的数量有显著的下降。而且，TUNEL检测联合CD31染色揭示了，与野生型同窝出生仔畜相比，TSP-1转基因小鼠皮肤内凋亡的内皮细胞的数量增加。
实例4：TSP-1的过表达防止UVB诱导的MMP-9活化。
在调节UVB诱导的细胞外基质成分的降解中一直涉及到基质金属蛋白酶-9(MMP-9)(35)，而且，最近研究表明，通过控制VEGF的生物利用度，MMP-9在血管发生过程中起着决定性的作用(37)。在野生型和TSP-1转基因小鼠的背部皮肤给予单剂量UVB照射(126mJ/cm2)，然后通过凝胶酶谱测定皮肤裂解物中MMP-9的活性。对野生型小鼠进行单剂量UVB照射，24小时后结果发现皮下血管发生有显著的增加。但是，在TSP-1转基因小鼠血管发生不显著。凝胶酶谱证明了，野生型和TSP-1转基因小鼠正常皮肤里MMP-9的活性具有相同水平。UVB照射24小时后，然而，MMP-9的活性在野生型小鼠皮肤中显著增强，但是在TSP-1转基因小鼠下降。
实例5：TSP-2基因敲除小鼠显示增强皱纹的形成。
与野生型小鼠相比，TSP-2缺陷小鼠经长期UVB照射(UVB累积剂量：7.23J/cm2)显示显著的皱纹形成。与野生型同窝出生仔畜相比，慢性UVB照射后TSP-2缺陷小鼠出现增大的皮肤血管和增强的血管分支。
苏木素-伊红染色表明：与野生型对照皮肤相比，长期UVB照射后TSP-2缺陷小鼠的皮肤中出现表皮和真皮增厚。三色染色证实：与野生型小鼠相比，慢性UVB照射后TSP-2缺陷小鼠的乳头真皮里面出现胶原蛋白纤维的不规则排列。CAE染色揭示：与野生型小鼠相比，TSP-2缺陷小鼠出现炎症细胞浸润增强。
CD31免疫染色显示：与野生型同窝出生仔畜相比，慢性UVB照射后在TSP-2缺陷小鼠的真皮上层和全部皮肤(真皮和皮下组织)出现更多的而且增大的血管。CD31染色部分经计算机-辅助图像分析显示：与野生型同窝出生仔畜相比，慢性UVB照射后在TSP-2缺陷小鼠的全部皮肤里面血管大小和血管密度有显著的增加。与整个皮肤血管发生相似，慢性UVB照射后在TSP-2缺陷小鼠的真皮上层，表皮-真皮的边界100μm距离内，发现血管发生显著的增加。
CD31和BrdU的双重免疫荧光染色显示：与野生型小鼠相比，在TSP-2缺陷小鼠皮肤的真皮上层和真皮下层，增生内皮细胞(箭头)的数量有显著的增加。
VEGF原位杂交证明：与那些含很少或者几乎不含VEGF mRNA表达的野生型表皮相比，慢性UVB照射后，TSP-2缺陷小鼠在增生表皮的角化细胞基部上层出现增强的VEGF mRNA表达。
凝胶-酶谱显示：与没有照射的野生型小鼠相比，UVB照射的野生型小鼠皮肤中出现强的诱导MMP-9活性。慢性UVB照射后，在TSP-2缺陷小鼠和野生型小鼠之间，MMP-9活性没有主要的不同。
实例6：方法和材料
UVB照射方案
在第一个实验里，使用4个相同的有间隙的一排荧光灯(ElderPharmaceuticals，Bryan，OH)(25)，8周大的雌性无毛Skh-1小鼠(每组n＝7)暴露在UVB下进行照射。灯的高度调整到可以在小鼠背部皮肤表面传送0.35mW/cm2。小鼠用每周两次(trice)的UVB照射10周，起始剂量是0.5最低红斑(erythema)量(20mJ/cm2)，以后逐渐以0.5MED为增量增加直到最大剂量4.5MED(26)。UVB的总共累积剂量是5.62J/cm2。没有观察到急性阳光灼伤反应。对照小鼠进行假照射。在另外一个实验，8周大的雌性K14/TSP-1转基因小鼠(24)或者FVB野生型对照组(每组n＝7)按照上述的方法进行UVB照射总共12周(UVB累积剂量6.52J/cm2)。12周后，处死小鼠，然后使用(SILFLO；Flexico Developments Ltd，U.K.)(27)所描述的硅橡胶取出双份皮肤。背部皮肤样品可以在液氮中快速冰冻或者像(28)描述那样固定在10％福尔马林中。所有动物研究都经过Massachusetts General HospitalSubcommittee on Research Animal Care的批准。
CD31的免疫组织化学和皮肤血管的计算机-辅助形态测定分析
使用单克隆鼠抗-鼠CD31抗体(Pharmingen，San Diego，CA)，像(24)所描述的那样在7μm冷冻切片上进行免疫组织化学染色。从5个UVB照射的小鼠和5个年龄匹配且没有UVB照射的对照小鼠中取出有代表性的切片，然后使用Nikon E-600显微镜(Nikon；Melville，NY)进行分析。就像(24)描述的那样，使用光点数码相机(Diagnostic Instruments，Sterling Heights，MI)捕获图像，使用IP-LAB软件(Scanalytics Inc，Fairfax，VA)进行形态测定分析。在60倍放大的情况下观察切片的三个不同区域，在真皮和在距离表皮-真皮连接处100urn面积范围内检测每平方毫米血管的数量，血管平均大小和血管占有的相对面积。使用双侧单(two-sided anpaired)Student′s t-检验来分析微血管密度和血管大小的不同。除此之外，像(29)描述的那样，从相同小鼠的皮肤中获得石蜡切片并且进行常规的苏木素-伊红，Verhoeffs弹性和Weigert′s间苯二酚品红染色。
增生和编程性细胞死亡测定
为了分析内皮细胞增生，在7pm冷冻切片上进行内皮细胞标记物CD31和增生标记物Ki-67(30，31)的双重免疫荧光染色，使用单克隆鼠抗-鼠CD31抗体和兔抗-Ki-67多克隆抗体(Novocastra Laboratories，Burlingame，CA)。连接FITC的抗—鼠IgG和连接Texas-Red的抗—兔IgG(JacksonImmunoResearch Laboratories，West Grove，PA)被用作次生抗体(32)。每个实验小组可以从5只小鼠获得有代表性的切片，然后使用Nikon E-600显微镜分析切片。从完全相同的区域获得CD31和Ki-67染色的数字图像并且结合起来显示增生内皮细胞。像(24)描述的那样，使用Fluorescence-FragELDNA断裂检测试剂盒(Oncogene，Cambridge，MA)和连接结合Texas-Red的抗-鼠IgG的抗-鼠CD31抗体，通过双重免疫荧光检测凋亡内皮细胞。
原位杂交
像(19)描述的那样，在石蜡切片上进行原位杂交。简要地，用二甲苯处理载波片以移去石蜡，然后，连续的洗脱用粗级乙醇；0.2M HCI；含311g/ml蛋白酶K的Tris/EDTA；0.2％甘氨酸；4％pH 7.4的磷酸盐缓冲液的聚甲醛；含1/200(vol/vol)醋酐的0.1M三乙醇胺和2XSSC。载波片然后在52℃与标记35S的核探针在如下的混合物中进行过夜杂交，混合物包括：0.3M氯化钠，0.01M Tris pH 7.6，5mM EDTA，50％甲酰胺，10％糖酐酯，0.1mg/ml酵母tRNA，和0.01M二硫苏糖醇。杂交后清洗液包括65℃的2XSSC/50％甲酰胺/1OmM二硫苏糖醇和2XSSC。载波片然后用含有0.3M醋酸铵的粗级乙醇脱水，干燥，用Kodak NTB2乳剂包被，4℃暗处储存2周。用柯达19显影剂制备乳剂，用苏木素复染剂载波片。文献(12)报道，从一个393-bp鼠的VEGF cDNA片段制备VEGF的反义和正义单链35S标记的RNA探针，并把探针克隆到pGEM-3Z(Promega)。
凝胶酶谱
野生型FVB的背部剃毛皮肤小鼠和转基因小鼠(每组n＝4)暴露在单剂量的UVB照射(126mJ/cm2)。24小时后，处死小鼠，割去背部皮肤样品，然后在提取缓冲液(0.05M Tris/pH 7.5，0.2M NaCl，5mM CaCl2，0.1％TritonX-100)中进行匀化。离心后，收集上清做凝胶-酶谱。稍加改进文献(33，34)的方法，然后做酶谱。简要地说，皮肤裂解物再次混悬在非还原的4X SDS样品缓冲液(0.5M Tris-HCl/pH 6.8，0.02％溴酚蓝，40％(v/v)甘油，3％SDS)中，然后装到含有0.1％猪肉皮肤凝胶(SIGMA)的SDS聚丙酰胺凝胶里。20μg每种蛋白质裂解物加到SDS-PAGE中。凝胶和2.5％Triton X-100共同孵育以除去SDS，然后与孵育缓冲液(O.05M Tris-HCl/pH 8.0，5mM CaCl2，511M ZnCl)放置过夜。然后用0.5％库马西亮蓝R-250/30％甲醇/10％醋酸溶液对凝胶染色，随后用30％甲醇/10％醋酸溶液进行脱色。检测到MMP-9活性是分子量为92kDa的条带(35)。
1.Kripke，M.L.1994.Ultraviolet radiation and immunology：somethingnew under the sun--presidential address.Cancer Res.54：6102-6105.
2.Cox，N.H.，B.L.Diffey，and P.M.Farr.1992.The relationship betweenchronological age and the erythemal response to ultraviolet B radiation.Br JDermatol.126：315-319.
3.Pearse，A.D.，S.A.Gaskell，and R.Marks.1987.Epidermal changes inhuman skin following irradiation with either UVB or UVA.J Invest Dermatol.88：83-87.
4.Berton，T.R.，D.L.Mitchell，S.M.Fischer，and M.F.Locniskar.1997.Epidermal proliferation but not quantity of DNA photodamage is correlated withUVinduced mouse skin carcinogenesis.J Invest Dermatol.109：340-347.
5.Leyden，J.J.，G.L.Grove，M.J.Grove，E.G.Thome，and L.Lufrano.1989.Treatment of photodamaged facial skin with topical tretinoin.J Am AcadDermatol.21：638-644.
6.Kligman，A.M.1989.The treatment of photoaged human skin by topicaltretinoin.Drugs.38：1-8.
7.Bielenberg，D.R.，C.D.Bucana，R.Sanchez，C.K.Donawho，M.L.Kripke，and I.J.Fidler.1998.Molecular regulation of UVB-induced cutaneousangiogenesis.J Invest Dermatol.111：864-872.
8.Kramer，M.，C.Sachsenmaier，P.Herrlich，and H.J.Rahmsdorf.1993.UV irradiation-induced interleukin-1 and basic fibroblast growth factor synthesisand release mediate part of the UV response.J Biol Chem.268：6734-6741.
9.Strickland，I.，L.E.Rhodes，B.F.Flanagan，and P.S.Friedmann.1997.TNF-alpha and IL-8 are upregulated in the epidermis of normal human skin afterUVB exposure：correlation with neutrophil accumulation and E-selectinexpression.JInvest Dermatol.108：763-768.
10.Yano，K.，L.F.Brown，and M.Detmar.2001.Control of hair growth andfollicle size by VEGF-mediated angiogenesis.J Clin Invest.107：409-417.
11.Detmar，M.1996.Molecular regulation of angiogenesis in the skin.J.Invest.Dermatol.106：207-208.
12.Detmar，M.，L.F.Brown，K.P.Claffey，K.-T.Yeo，O.Kocher，R.W.Jackman，B.Berse，and H.F.Dvorak.1994.Overexpression of vascularpermeability factor/vascular endothelial growth factor and its receptors inpsoriasis.J.Exp.Med.180：1141-1146.
13.Brown，L.F.，K.T.Yeo，B.Berse，T.K.Yeo，D.R.Senger，H.F.Dvorak，and L.Van De Water.1992.Expression of vascular permeability factor(vascularendothelial growth factor)by epidermal keratinocytes during wound healing..J.Exp.Med.176：1375-1379.
14.Brown，L.F.，T.J.Harrist，K.-T.Yeo，M.Stahle-Backdahl，R.W.Jackman，B.Berse，K.Tognazzi，H.F.Dvorak，and M.Detmar.1995.Increasedexpression of vascular permeability factor(vascular endothelial growth factor)inbullous pemphigoid，dermatitis herpetiformis，and erythema multiforme.Jlnvest Dermatol.104：744-749.
15.Brown，L.F.，S.M.Olbricht，B.Berse，R.W.Jackman，G.Matsueda，K.A.Tognazzi，E.J.Manseau，H.F.Dvorak，Van，de，Water，and L.1995.Overexpression of vascular permeability factor(VPF/VEGF)and its endothelialcell receptors in delayed hypersensitivity skin reactions.Immunol.154：2801-2807.
16.Detmar，M.，L.F.Brown，M.P.Schon，B.M.Elicker，P.Velasco，L.Richard，D.Fukumura，W.Monsky，K.P.Claffey，and R.K.Jain.1998.Increased microvascular density and enhanced leukocyte rolling and adhesion inthe skin of VEGF transgenic mice.J.Invest.Dermatol.111：1-6.
17.Detmar，M.2000.The role of VEGF and thrombospondins in skinangiogenesis.Dermatol Sci.24 Suppl 1：S78-S84.
18.Tolsma，S.S.，O.V.Volpert，D.J.Good，W.A.Frazier，P.J.Polverini，and N.Bouck.1993.Peptides derived from two separate domains of the matrixprotein thrombospondin-1 have anti-angiogenic activity.J.Cell Biol.122：497-511.
19.Streit，M.，P.Velasco，L.F.Brown，M.Skobe，L.Richard，L.Riccardi，J.Lawler，and M.Detmar.1999.Overexpression of thrombospondin-1decreases angiogenesis and inhibits the growth of human cutaneous squamouscell carcinomas.Am J Pathol.155：441-452.
20.Wight，T.N.，G.J.Raugi，S.M.Mumby，and P.Bornstein.1985.Lightmicroscopic immunolocation of thrombospondin in human tissues.J.Histochem.Cytochem.33：295-302.
21.Bissett，D.L.，D.P.Hannon，and T.V.Orr.1987.An animal model ofsolaraged skin：histological，physical，and visible changes in UV-irradiatedhairless mouse skin.Photochem Photobiol.46：367-378.
22.Kligman，L.H.，C.H.Duo，and A.M.Kligman.1984.Topical retinoicacid enhances the repair of ultraviolet damaged dermal connective tissue.Connect Tissue Res.12：139-150.
23.Lavker，R.M.，and A.M.Kligman.1988.Chronic heliodermatitis：amorphologic evaluation of chronic actinic dermal damage with emphasis on therole of mast cells.JInvest Dermatol.90：325-330.
24.Streit，M.，P.Velasco，L.Riccardi，L.Spencer，L.F.Brown，L.Janes，B.Lange-Asschenfeldt，K.Yano，T.Hawighorst，L.Iruela-Arispe，and M.Detmar.2000.Thrombospondin-1 suppresses wound healing and granulation tissueformation in the skin of transgenic mice.EMBO J.19：3272-3282.
25.Kochevar，I.E.，M.Moran，N.Lyon，T.Flotte，E.Siebert，and R.W.Gange.1993.Effects of systemic indomethacin，meclizine，and BW755C onchronic ultraviolet B-induced effects in hairless mouse skin.J Invest Dermatol.100：186-193.
26.Kligman，L.H.1989.The ultraviolet-irradiated hairless mouse：a modelfor photoaging.JAm Acad Dermatol.21：623-631.
27.Chen，S.，I.Kiss，and K.M.Tramposch.1992.Effects of all-transretinoic acid on UVB-irradiated and non-irradiated hairless mouse skin.J lnvestDermatol.98：248-254.
28.Streit，M.，L.Riccardi，P.Velasco，L.F.Brown，T.Hawighorst，P.Bomstein，and M.Detmar.1999.Thrombospondin-2：a potent endogenousinhibitor of tumor growth and angiogenesis.Proc Natl Acad Sci USA.96：14888-14893.
29.Prophet，E.，B.Mills，J.Arrington，and L.Sobin.1992.LaboratoryMethods in Histotechnology.American Registry of Pathology，Washington，D.C.236237pp.
30.Key，G.，M.H.Becker，B.Baron，M.Duchrow，C.Schluter，H.D.Flad，and J.Gerdes.1993.New Ki-67-equivalent murine monoclonal antibodies(MIB1-3)generated against bacterially expressed parts of the Ki-67 cDNAcontaining three 62 base pair repetitive elements encoding for the Ki-67 epitope.Lab Invest.68：629-636.
31.Gerdes，J.，U.Schwab，H.Lemke，and H.Stein.1983.Production of amouse monoclonal antibody reactive with a human nuclear antigen associatedwith cell proliferation.Int J Cancer.31：13-20.
32.Skobe，M.，P.Rockwell，N.Goldstein，S.Vosseler，and N.E.Fusenig.1997.Halting angiogenesis suppresses carcinoma cell invasion.NatMed.3：1222-1227.
33.Delclaux，C.，C.Delacourt，M.P.D′Ortho，V.Boyer，C.Lafuma，andA.Harf.1996.Role of gelatinase B and elastase in human polymorphonuclearneutrophil migration across basement membrane.Am JRespir Cell Mol Biol.14：288-295.
34.Hanemaaijer，R.，P.Koolwijk，L.le Clercq，W.J.de Vree，and V.W.vanHinsbergh.1993.Regulation of matrix metalloproteinase expression in humanvein and microvascular endothelial cells.Effeets of tumour necrosis factor alpha，interleukin 1 and phorbol ester.Biochem J.296：803-809.
35.Koivukangas，V.，M.Kallioinen，H.Autio-Harmainen，and A.Oikarinen.1994.UV irradiation induces the expression of gelatinases in humanskin in vivo.Acta Derm Venereol.74：279-282.
36.Lesnik，R.H.，L.H.Kligman，and A.M.Kligman.1992.Agents thatcause enlargement of sebaceous glands in hairless mice.II.Ultraviolet radiation.Arch Dermatol Res.284：106-108.
37.Bergers，G.，R.Brekken，G.McMahon，T.H.Vu，T.Itoh，K.Tamaki，K.Tanzawa，P.Thorpe，S.Itohara，Z.Werb，and D.Hanahan.2000.Matrixmetalloproteinase-9 triggers the angiogenic switch during careinogenesis.NatCell Biol.2：737-744.
38.Kligman，A.M.，G.L.Grove，R.Hirose，and J.J.Leyden.1986.Topicaltretinoin for photoaged skin.JAm Acad Dermatol.15：836-859.
39.Dejana，E.，M.Corada，and M.G.Lampugnani.1995.Endothelialcell-toeell junctions.FASEB J.9：910-918.
40.Detmar，M.，K.-T.Yeo，J.A.Nagy，L.Van De Water，L.F.Brown，B.Berse，B.M.Elicker，S.Ledbetter，and H.F.Dvorak.1995.Keratinocyte-derived vaseular permeability factor(vascular endothelial growthfactor)is a potent mitogen for dermal microvascular endothelial cells.J.Invest.Dermatol.105：44-50.
41.Brown，L.F.，S.M.Olbricht，B.Berse，R.W.Jackman，G.Matsueda，K.A.Tognazzi，E.J.Manseau，H.F.Dvorak，and L.Van de Water.1995.Overexpression of vaseular permeability factor(VPF/VEGF)and itsendothelial cell receptors in delayed hypersensitivity skin reactions.Immunol.154：2801-2807.
42.Kishimoto，J.，R.Ehama，Y.Ge，T.Kobayashi，T.Nishiyama，M.Detmar，and R.E.Burgeson.2000.In vivo detection of human vascular endothelialgrowth factor promoter activity in transgenic mouse skin.Am JPathol.157：103-110.
43.Brauchle，M.，J.O.Funk，P.Kind，and S.Werner.1996.Ultraviolet Band H202 are potent inducers of vascular endothelial growth factor expression incultured keratinocytes.JBiol Chem.271：21793-21797.
44.White，F.C.，A.Benehacene，J.S.Scheele，and M.Kamps.1997.VEGFmRNA is stabilized by ras and tyrosine kinase oncogenes，as well as by UVradiation-evidence for divergent stabilization pathways.Growth Factors.14：199-212.
45.Yuan，F.，Y Chen，M.Dellian，N.Safabakhsh，N.Ferrara，and R.K.Jain.1996.Time-dependent vascular regression and permeability changes inestablished human tumor xenografts induced by an anti-vascular endothelialgrowth factor/vascular permeability factor antibody.Proc Natl Acad Sci USA.93：14765-14770.
46.Jimenez，B.，O.V.Volpert，S.E.Crawford，M.Febbraio，R.L.Silverstein，and N.Bouck.2000.Signals leading to apoptosis-dependentinhibition of neovascularization by thrombospondin-1.Nat Med.6：41-48.
47.Yang，Z.，D.K.Strickland，and P.Bornstein.2000.Extracellular MMP2levels are regulated by the LRP scavenger receptor and thrombospondin 2.JBiolChem.11：11.
48.Bein，K.，and M.Simons.2000.Thrombospondin type 1 repeats interactwith matrix metalloproteinase 2.Regulation of metalloproteinase activity.JBiolChem.275：32167-32173.
49.Taraboletti，G.，L.Sonzogni，V.Vergani，G.Hosseini，R.Ceruti，C.Ghilardi，A.Bastone，E.Toschi，P.Borsotti，E.Scanziani，R.Giavazzi，M.S.Pepper，W.G.Stetler-Stevenson，and M.R.Bani.2000.Posttranscriptionalstimulation of endothelial cell matrix metalloproteinases 2 and 1 byendothelioma cells.Exp Cell Res.258：384-394.
50.Kang，S.1998.Photoaging and tretinoin.Dermatol Clin.16：357-364.
51.Fisher，G.J.，Z.Q.Wang，S.C.Datta，J.Varani，S.Kang，and J.J.Voorhees.1997.Pathophysiology of premature skin aging induced by ultravioletlight.NEngl J Med.337：1419-1428.
其它实施方式
虽然发明是被与其相关的内容上逐条描述，但在前的表述以及例子只是为了举例说明并不是为了限定发明的范围，其限定是通过附加的权利要求完成的。其他方面、优点和修改都是在权利要求范围之内的。
引用的所有专利和参考文献都全部引入作为参考。其他的实施方式是在之后的权利要求中。
机译： 预防UVB引起的皮肤损伤的方法
机译： 预防UVB引起的皮肤损伤的方法
机译： 预防UVB引起的皮肤损伤的方法
