伴随有AOP－1基因或AOP－1的表达减少的疾病的治疗方法以及该疾病的治疗药

摘要

在伴随有AOP－1基因或AOP－1的表达减少的疾病的预防或治疗方法中由至少(1)导入编码AOP－1的核酸、或导入编码AOP－1的氨基酸序列中的氨基酸附加、缺失、置换一个以上的具有AOP－1功能的多肽的核酸，或(2)给予增强AOP－1基因表达的物质、增强AOP－1产生的物质或增强AOP－1功能的物质构成的该预防或治疗方法。

说明书

技术领域

本发明涉及到疾病的预防方法、治疗方法或诊断方法、疾病预防药或治疗药、与制剂的有效成分有关的物质的筛选方法、非人转化动物以及转化组织。

背景技术

很多疾病随着病态的进展，组织细胞中发生代偿变化，变成暂时的平衡状态。在病态进一步恶化的过程中，代偿结构出现失败，细胞功能降低甚至引起细胞死亡。由于这样的细胞脱落，疾病治愈变得更困难，预后不良，会再复发。特别是在以心脏为首的脑、肾脏等自己不能再生脏器的疾病治疗中抑制细胞的坏死脱落是重要的治疗方针。

(1)心脏疾病

1.心衰竭：心衰竭定义为由于心肌收缩力低下，心脏向各个脏器不能博出充足量的血液的状态。作为达到心衰竭的前阶段，心脏为了使全身血液流通保持正常进行代偿再调节。在这个时期内，心肌细胞持续肥大伸展，心博出压保持很高水平同时，保持心博出量，但同时心组织内的纤维化在进行，对收缩细胞的负荷增加。对心肌细胞的负荷和由于肥大化引起的代偿的平衡达到极限时，心功能出现失败，变成心衰竭。已知处于心衰竭状态的心肌细胞收缩力低下(Am JPhysiol 1997 Vol.273(1 Pt 2)，H183-91)。到目前为止慢性心衰竭治疗在心衰竭状态，即导致患者正常的日常生活障碍时起，使用使心肌收缩力增加的洋地黄制剂和黄嘌呤制剂等强心剂。然而人们都清楚，这些药物由于心肌能量的过量消耗，长期服用会促进细胞死亡，使生存率恶化。最近，可使在代偿再调节期亢进的交感神经和高血压蛋白原酶-血管素引起的对心脏的过量负荷减轻的β阻断剂和ACE抑制剂用于治疗正成为主流。然而，不能说在作用机制上具有防止心肌细胞肥大化的药物对所有陷于心衰竭状态的患者的治疗都有效，在慢性心衰竭预防剂方面更好。另外这些药物销售后也依然不能改善慢性心衰竭患者的长期生存率的事实表明这些药物的作用机制的局限。因此打破代偿期后，就使改善处于慢性心衰竭期的生活质量、生存率两方面的新的慢性心衰竭治疗药的开发成为当务之急。人们期待着对作为随着由代偿期向衰竭期过渡引起的失败机制的本质原因的细胞死亡、细胞功能低下进行治疗的新的治疗药的开发。

2.缺血性心脏病：缺血性心脏病是以包括心绞痛和心肌梗塞症在内的冠状血管性血流不良为特征的疾病类。例如，心绞痛被分为安静性心绞痛和劳作性心绞痛。现在对于重症患者实施外科手术，进行对血管实施物理扩张后的移植片固定模留置等。对于比较轻的患者，作为发作时的治疗药使用硝酸药、硝酸甘油、尼可地尔等血管扩张剂。而降低胆固醇制剂以及抗血液凝固剂被用作预防梗塞目的的处方中。这样一来急性期治疗和以改善血液循环为目的的治疗方法正被确立。最初发作被认为是起因于由于无症状期的慢性缺血引起的伤害积蓄使得心肌适应能力降低。然而现在对于这一点的治疗方法还未确立。另外由心绞痛转向重症心肌梗塞的患者多，虽然希望对由于心绞痛发病引起的大规模缺血进行预防治疗，但适合预防治疗的治疗方法还没有找到。

(2)神经变性疾病

神经变性疾病是以神经细胞的变性为特征的一类疾病，具体来说，如脑梗塞、阿耳茨海默病、帕金森病、头部外伤、亨廷顿舞蹈病、脑血管性痴呆、运动神经变性症、宾斯旺格氏病等的白质伤害等。脑梗塞、脑血管性痴呆、头部外伤、阿耳茨海默病、运动神经变性症、帕金森病等有共同点：作为神经递质的谷氨酸在细胞外浓度过量上升。(Eur J Neurosci 2000 Vol.12(8)，2735-45)(BrainRes 1994 Vol.11，No.642(1-2)，117-122)(Acta NeurochirSuppl.2000 Vol.76，437-8；Neurosci Lett 2001 Vol.299(1-2)，37-40；J Neurosci Res 2001 Vol.63(5)，377-87；Drugs Aging 2001Vol.18(10)，717-24)。过量的谷氨酸刺激神经细胞表面的谷氨酸受体(NMDA受体)，诱导神经的过渡兴奋。由于过渡的神经兴奋诱导细胞内离子环境的破坏，引起细胞死亡，这种说法是有说服力的。现在作为脑梗塞治疗剂可以使用抗血小板药、血栓溶解剂，但由于是以血流的再开、维持为目的的，所以具有对于神经细胞本身的保护作用的治疗方法还没有确立。作为试验阶段的治疗药，NMDA受体拮抗药、谷氨酸释放抑制剂、活性氧消除剂正在开发中，其有效性还没有被确认。有关阿耳茨海默病的治疗，最近胆碱酯酶抑制剂被确认为是唯一治疗剂，其机制是通过增强细胞间信息传递改善学习功能，不是直接抑制神经细胞死亡。作为对一系列的神经变性疾病的有效治疗方法希望开发以保护神经细胞为作用机制的治疗药。

(3)风湿病

风湿病中特别是慢性风湿性关节炎是以关节滑膜的连续增殖为特征的慢性关节炎，可以说其原因来自自身免疫作用。人们认为除了老化、基因的因素以外，还有复合生活环境因素形成的危险因素，以感染症为代表的任一种关节炎作为开端，对自身抗原产生免疫致敏。就发展的慢性风湿性关节炎来说有报道认为在软骨破坏、骨破坏的同时，成软骨细胞死亡、成骨细胞死亡(Arthritis Rheum 1999Vol.42(7)，1528-37；Z Rheumatol 2000 Vol.59，Suppl.1，10-20)。认为由于成软骨细胞死亡、成骨细胞死亡引起的疾病是进入到不可逆的阶段。现在利用类固醇、非类固醇制剂实施以免疫抑制作用作为基础的治疗，但该治疗效果不持续，不能根治。因此，希望开发以保护关节、成软骨细胞、成骨细胞为机制的新的治疗剂。

(4)肾病

肾病中特别是慢性肾衰竭是以肾脏内的肾小球、肾小管的伤害为特征的疾病，具体来说，可举出糖尿病性肾病、高血压性肾病、狼疮性肾病等。作为具有过滤血液中废物功能的肾小球和从尿中再吸收为其功能的肾小管中功能发生异常的原因可以举出由于高血糖引起的糖化蛋白造成的细胞伤害、由于高血压引起的血液循环不良造成的细胞伤害、自身免疫性慢性肾炎。现在还没有找到对慢性肾衰竭的有效治疗方法，对于以狼疮性肾炎为首的主要炎症作为处方疗法适合用类固醇系、非类固醇系抗炎药，对于高血压性肾衰竭时适合用降压剂。现在，希望开发对肾小球构成细胞、肾小管构成细胞有直接保护作用的药物。

(5)肝病

肝病从病毒性、过量饮酒、药物性等肝炎，直至肝硬化、肝衰竭。在治疗方法中，作为对症治疗法有熊脱氧胆酸、甘草亭酸制剂、中药疗法等。对于病毒性肝炎，作为病因疗法有干扰疗法，不过副作用也大，治疗效果也不完全。肝脏是可再生脏器，但由于肝衰竭从肝硬变开始肝功能陷于不能再生的状态，所以超过再生能力的应激慢慢地累加成为病因。因此，要保护肝细胞、当然要有预防肝衰竭效果。而现在还没有找到副作用小的有效治疗方法。

而AOP-1基因作为在通过DMSO使小鼠红白血病细胞分化诱导时表达量增加的因子被鉴定(Gene 1989 Vol.80，337-343：当初称之为MER-5，后来改称为AOP-1)。之后判明AOP-1蛋白质属于peroxiredoxin家族，文献一般记述为peroxiredoxin 3(PRx3)(以下，在本说明书中将AOP-1蛋白质记载为AOP-1)。Peroxiredoxin家族通过使用纯化蛋白质进行生物化学解析，他是以具有巯基(thiol)特异的抗氧化活性(Pro.Natl.Acad.Sci.USA 1994Vol.91，7017-7021)为特征的一类蛋白质，广泛存在于从原核生物到包括人在内的高等生物中。另外最近使用bacteria peroxiredoxin进行解析发现在peroxiredoxin中具有除去过氧亚硝酸(peroxynitrite)的能力(Nature 2000 vol.407，No.14,211)。

即使在peroxiredoxin家族中由于AOP-1局限于线粒体中，所以与其他的peroxiredoxin不同(Methods inenzymology，vol.300)。作为抗氧化蛋白质广泛为人所知的超氧化物岐化酶(superoxide dismutase，SOD)和过氧化氢酶由于在表现抗氧化活性时不需要巯基，不能除去过氧化亚硝酸等，可以预见peroxiredoxin家族与SOD、过氧化氢酶在生理功能方面也不同。最近发现作为存在于细胞质的peroxiredoxin 1型以及2型的生理功能对培养甲状腺细胞中过氧化氢伤害有保护作用(J.BiologicalChemistry 2000 Vol.275，No.24，18266-18270)。但还没有发现分布于线粒体的AOP-1(peroxiredoxin 3型)的生理功能。另外包括AOP-1的peroxiredoxin家族究竟与哪种疾病有直接关系还没有发现。

本发明正是想提供伴随有AOP-1基因或AOP-1的表达减少的疾病，例如心脏病(慢性心衰竭、缺血性心衰竭、缺血性心脏病等)、神经变性疾病(脑梗塞、阿耳茨海默病、帕金森病、头部外伤、亨廷顿舞蹈病、脑血管性痴呆、运动神经变性症、宾斯旺格氏病等)、风湿病(慢性风湿性关节炎等)、肾病(肾衰竭)、肝病(肝炎、肝硬变、肝衰竭等)的预防方法、治疗方法或诊断方法、该疾病的预防药或治疗药、与该制剂的有效成分有关的物质的筛选方法、对AOP-1进行表达抑制或进行缺失的非人转化动物以及转化组织等。

发明内容

本发明涉及到以下事项。

(1)在伴随有AOP-1基因或AOP-1的表达减少的疾病的预防或治疗方法中，有由(1)导入编码AOP-1的核酸、或导入编码AOP-1的氨基酸序列中的氨基酸附加、缺失、置换一个以上的具有AOP-1功能的多肽的核酸，或(2)给予增强AOP-1基因表达的物质、增强AOP-1产生的物质或增强AOP-1功能的物质或(3)给予AOP-1蛋白质或在AOP-1的氨基酸序列中附加、缺失、置换一个以上氨基酸的具有AOP-1功能的多肽构成的该预防或治疗方法。另外所谓AOP-1基因通常是指编码AOP-1的核酸序列(外显子序列)和在其间的核酸序列(内含子序列)，还包括抑制AOP-1基因转录的核酸序列，但在本发明中除了特别指明时，所谓AOP-1基因是指AOP-1 mRNA。

(2)由将编码AOP-1基因的核酸、或编码AOP-1的氨基酸序列中附加、缺失、置换一个以上氨基酸的具有AOP-1功能的多肽的核酸导入患部组织的细胞构成的上述(1)记载的预防或治疗方法。

(3)由给予增强AOP-1基因表达的物质构成的上述(1)记载的预防或治疗方法。

(4)由给予增强AOP-1产生的物质构成的上述(1)记载的预防或治疗方法。

(5)上述(4)记载的预防或治疗方法，其中具有增强AOP-1产生的物质是编码AOP-1的核酸、或编码AOP-1的氨基酸序列中附加、缺失、置换一个以上氨基酸的具有AOP-1功能的多肽的核酸。

(6)由给予增强AOP-1功能的物质构成的上述(1)记载的预防或治疗方法。

(7)上述(1)至(6)记载的预防或治疗方法，其中伴随有AOP-1基因或AOP-1的表达减少的疾病是慢性心衰竭、缺血性心衰竭、缺血性心脏病、慢性风湿性关节炎、神经变性疾病、肝病或肾衰竭。

(8)伴随有AOP-1基因或AOP-1的表达减少的疾病的预防药或治疗药，其中作为有效成分含有(1)编码AOP-1的核酸、或编码在AOP-1的氨基酸序列中附加、缺失、置换一个以上氨基酸的具有AOP-1功能的多肽的核酸，或(2)增强AOP-1基因表达的物质、增强AOP-1产生的物质或增强AOP-1功能的物质，或(3)AOP-1蛋白质或在AOP-1的氨基酸序列中附加、缺失、置换一个以上氨基酸的具有AOP-1功能的多肽。

(9)上述(8)记载的预防药或治疗药，其中作为有效成分含有编码AOP-1基因的核酸、或编码在AOP-1的氨基酸序列中附加、缺失、置换一个以上氨基酸的具有AOP-1功能的多肽的核酸。

(10)上述(8)记载的预防药或治疗药，其中作为有效成分含有增强AOP-1基因表达的物质。

(11)上述(8)记载的预防药或治疗药，其中作为有效成分含有增强AOP-1产生的物质。

(12)上述(11)记载的预防药或治疗药，其中具有增强AOP-1产生的物质是编码AOP-1的核酸、或编码在AOP-1的氨基酸序列中附加、缺失、置换一个以上氨基酸的具有AOP-1功能的多肽的核酸。

(13)上述(8)记载的预防药或治疗药，其中作为有效成分含有增强AOP-1功能的物质。

(14)上述(8)至(13)记载的预防药或治疗药，其中伴随有AOP-1基因或AOP-1的表达减少的疾病是慢性心衰竭、缺血性心衰竭、缺血性心脏病、慢性风湿性关节炎、神经变性疾病、肝病或肾衰竭。

(15)伴随有AOP-1基因或AOP-1的表达减少的疾病的诊断方法，对AOP-1基因的表达量或AOP-1的产生量进行测定，以该表达量或产生量作为指标进行诊断。

(16)上述(15)记载的诊断方法，其中伴随有AOP-1基因或AOP-1的表达减少的疾病是慢性心衰竭、缺血性心衰竭、缺血性心脏病、慢性风湿性关节炎、神经变性疾病、肝病或肾衰竭。

(17)伴随有AOP-1基因或AOP-1的表达减少的疾病的诊断剂或诊断试剂盒，其中包括以AOP-1基因的表达量或AOP-1的产生量作为指标进行测定的手段。

(18)上述(17)记载的诊断剂或诊断试剂盒，其中伴随有AOP-1基因或AOP-1的表达减少的疾病是慢性心衰竭、缺血性心衰竭、缺血性心脏病、慢性风湿性关节炎、神经变性疾病、肝病或肾衰竭。

(19)可以作为由于抑制AOP-1产生、抑制AOP-1基因的表达或缺失AOP-1基因导致的伴随有AOP-1基因或AOP-1的表达减少的疾病的疾病模型使用的非人转化动物。

(20)上述(19)记载的非人转化动物，其中伴随有AOP-1基因或AOP-1的表达减少的疾病是慢性心衰竭、缺血性心衰竭、缺血性心脏病、慢性风湿性关节炎、神经变性疾病、肝病或肾衰竭。

(21)可以作为由于抑制AOP-1产生、抑制AOP-1基因的表达或缺失AOP-1基因导致的伴随有AOP-1基因或AOP-1的表达减少的疾病的疾病模型使用的转化组织或转化细胞。

(22)上述(21)记载的转化组织或转化细胞，其中伴随有AOP-1基因或AOP-1的表达减少的疾病是慢性心衰竭、缺血性心衰竭、缺血性心脏病、慢性风湿性关节炎、神经变性疾病、肝病或肾衰竭。

(23)包括向上述(18)至(21)记载的非人转化动物、转化组织或转化细胞中给予或添加通过合成或基因重组技术得到的物质、来自天然的物质或他们的衍生物，对AOP-1基因的表达量或AOP-1的产生量进行检测，从增强AOP-1基因表达的物质、增强AOP-1产生的物质以及增强AOP-1功能的物质组成的物质中选出至少一种物质的筛选方法。

(24)包括使通过合成或基因重组技术得到的物质、来自天然的物质或他们的衍生物与(1)含有AOP-1基因的转录调控区和AOP-1基因或报告基因的转化细胞或试管内表达系接触，对AOP-1基因或报告基因的表达量进行检测，或与(2)AOP-1或AOP-1的靶分子接触，对AOP-1或AOP-1的靶分子的量进行检测的从增强AOP-1基因表达的物质、增强AOP-1产生的物质以及增强AOP-1功能的物质组成的物质中选出至少一种物质的筛选方法。

(25)上述(24)记载的筛选方法，其中包括构建将AOP-1基因的转录调控区连接在报告基因的翻泽区的上游或下游的表达载体后，导入适当的宿主细胞中进行培养，向该培养细胞中添加通过合成或基因重组技术得到的物质、来自天然的物质或他们的衍生物，一定时间后检测报告基因的表达量或报告蛋白的产生量的变化。

(26)上述(25)记载的筛选方法，其中包括使通过合成或基因重组技术得到的物质、来自天然的物质或他们的衍生物与AOP-1或AOP-1的靶分子接触，检测与该物质结合或没有结合的AOP-1或AOP-1的靶分子的量。

(27)上述(24)记载的筛选方法，其中包括将AOP-1或AOP-1的靶分子固定在载体上，然后向该固定的AOP-1或AOP-1的靶分子中添加通过合成或基因重组技术得到的物质、来自天然的物质或他们的衍生物以及AOP1或AOP-1的靶分子，检测与该物质结合或没有结合的AOP-1或AOP-1的靶分子的量。

(28)上述(24)记载的筛选方法，其中包括将通过合成或基因重组技术得到的物质、来自天然的物质或他们的衍生物固定在载体(substrate)上，然后向该固定的物质中添加AOP-1或AOP-1的靶分子，检测与该物质结合或没有结合的AOP-1或AOP-1的靶分子的量。

(29)增强AOP-1的功能的物质的筛选方法，其中包括使通过合成或基因重组技术得到的物质、来自天然的物质或他们的衍生物与AOP-1或AOP-1的靶分子接触，测定AOP-1的抗氧化或消去过氧亚硝酸能力。

(30)上述(29)记载的筛选方法，其中包括向AOP-1或AOP-1的靶分子中添加通过合成或基因重组技术得到的物质、来自天然的物质或他们的衍生物和AOP-1或AOP-1的靶分子，测定AOP-1的抗氧化或消去过氧亚硝酸能力。

(31)上述(29)记载的筛选方法，其中包括将AOP-1或AOP-1的靶分子固定在载体上，然后向该固定的AOP-1或AOP-1的靶分子中添加通过合成或基因重组技术得到的物质、来自天然的物质或他们的衍生物和AOP-1或AOP-1的靶分子，测定AOP-1的抗氧化或消去过氧亚硝酸能力。

(32)上述(29)记载的筛选方法，其中包括将通过合成或基因重组技术得到的物质、来自天然的物质或他们的衍生物固定在载体上，然后向该固定的物质中添加AOP-1或AOP-1的靶分子，测定AOP-1的抗氧化或消去过氧亚硝酸能力。

(33)(1)编码AOP-1基因的核酸、或编码在AOP-1的氨基酸序列中附加、缺失、置换一个以上氨基酸的具有AOP-1功能的多肽的核酸，或(2)增强AOP-1基因表达的物质、增强AOP-1产生的物质或增强AOP-1功能的物质，或(3)AOP-1蛋白质或在AOP-1的氨基酸序列中附加、缺失、置换一个以上氨基酸的具有AOP-1功能的多肽在制造伴随有AOP-1基因或AOP-1的表达减少的疾病的预防药或治疗药中的应用。

(34)上述(33)记载的应用，含有作为有效成分的编码AOP-1基因的核酸、或编码在AOP-1的氨基酸序列中附加、缺失、置换一个以上氨基酸的具有AOP-1功能的多肽的核酸。

(35)上述(33)记载的应用，其中作为有效成分含有增强AOP-1基因表达的物质。

(36)上述(35)记载的应用，其中具有增强AOP-1产生作用的物质是编码AOP-1的核酸、或编码在AOP-1的氨基酸序列中附加、缺失、置换一个以上氨基酸的具有AOP-1功能的多肽的核酸。

(37)上述(33)记载的应用，其中作为有效成分含有增强AOP-1产生的物质。

(38)上述(33)记载的应用，其中作为有效成分含有增强AOP-1功能的物质。

(39)上述(33)至(38)记载的应用，其中伴随有AOP-1基因或AOP-1的表达减少的疾病是慢性心衰竭、缺血性心衰竭、缺血性心脏病、慢性风湿性关节炎、神经变性疾病、肝病或肾衰竭。

附图的简单说明

图1表示各慢性心衰竭病态模型大鼠的AOP-1蛋白质在心肥大期以及心衰竭期的表达变化。

图2表示各慢性心衰竭病态模型大鼠的AOP-1基因在心肥大期以及心衰竭期的表达变化。

图3表示在心肌梗塞后慢性心衰竭模型大鼠的AOP-1、TSA、CuZn-SOD、Mn-SOD以及Catalase基因的表达变化。

图4表示AOP-1基因强制表达对细胞存活率的影响。

图5表示AOP-1基因强制表达对细胞自律博动率的影响。

图6表示AOP-1基因强制表达对MTT分解活性的影响。

图7表示反义AOP-1基因强制表达对培养心肌细胞的影响。

图8中，8a：肾炎模型中引起炎症后第7天时AOP-1基因表达量与正常对照进行比较的结果。8b：注入微量鹅羔氨酸(ibotenic acid)引起神经变性疾病模型中AOP-1、过氧化氢酶(Catalase)以及CuZn-SOD基因的表达量与正常对照进行比较的结果。

图9传染性肝炎模型中AOP-1基因表达量与正常对照进行比较的结果。

图10表示AOP-1基因强制表达对培养神经细胞谷氨酸伤害的保护作用。

图11表示AOP-1基因强制表达对培养神经细胞的神经突触伸展的促进和保护作用。

图12，图12a表示分别导入AOP-1、TSA、CuZn-SOD基因的细胞于无氧条件下进行培养(Hypoxia)的存活率，图12b表示分别导入AOP-1、TSA、CuZn-SOD基因的细胞于暴露于过氧化氢条件下的存活率，图12c表示分别导入AOP-1、TSA、CuZn-SOD基因的细胞于高葡萄糖培养条件下进行培养的存活率。

图13，图13a表示AOP-1于缺血再灌注时的心功能保护作用，图13b表示AOP-1于缺血再灌注时的缺血僵硬抑制作用，图13c表示AOP-1于缺血再灌注时对心肌坏死的抑制作用。

图14，图14a表示AOP-1保护神经细胞的结果，PTBBS的量减少的结果，图14b表示由于AOP-1保护神经细胞，与对照相比，存活的神经细胞增加。图14b中的箭头表示对照组中的损伤部位以及AOP-1基因导入组中的同一部位。

图15，图15a表示各组血中尿素氮量随时间的变化，图15b表示炎症发生第7天AOP-1抑制血中尿素氮量的上升，图15c为炎症发生后第28天的肾脏组织照片，表明AOP-1保护肾小管、肾小球。

具体实施方式

在本发明中，所谓「AOP-1的功能」指的是以心脏和心肌细胞代谢活化作用、心脏和心肌细胞功能保护作用以及心脏和心肌细胞死亡抑制作用、神经细胞活化作用、神经细胞死亡抑制作用、肾功能保护作用为代表的脏器、细胞的活化和保护作用。因此在本发明中所谓「具有AOP-1的功能」指的是具有脏器、细胞的活化和保护作用。是否「具有AOP-1的功能」的判定可以使用(6)筛选方法中的方法以及下面实施例中叙述的各种方法进行。

在本发明中，所谓心脏疾病指的是心衰竭(包括慢性心衰竭、缺血性心衰竭、糖尿病性心衰竭等)、缺血性心脏病(包括心绞痛、心肌梗塞等)等。在本发明中所谓神经性变性疾病指的是脑梗塞、阿耳茨海默病、帕金森病、头部外伤、亨廷顿舞蹈病、脑血管性痴呆、运动神经变性症、宾斯旺格氏病等。本发明提到的风湿病包括慢性风湿性关节炎等。本发明中所谓肾病指的是糖尿病性肾病、高血压性肾病、狼疮性肾病等肾衰竭等。本发明中所谓肝病指的是肝炎(包括病毒性肝炎、酒精性肝炎、药物性肝炎)、肝硬变、肝衰竭等。

发明人等为了找到作为心脏疾病、神经变性疾病、风湿病、肾病、肝病的共同现象的细胞功能低下、诱导细胞死亡的共同原因，进行了一系列实验。

(1)心脏疾病

首先为了查明慢性心衰竭的代偿期的失败原因，对伴随有由心肥大发展到慢性心衰竭的组织中的各种蛋白质的表达变化进行了测定。将组织提取液中的蛋白质混合液粗分为水溶性级分和表面活性剂溶性级分，分别通过双向电泳进行解析。作为慢性心衰竭病态模型使用大动脉狭窄鼠(心脏压负荷模型)、动静脉分流鼠(心脏容量负荷模型)、遗传性高血压鼠(SHR)、Dah1食盐感受性鼠进行比较解析。对在许多模型共同的代偿期的失败以及表达量变化的蛋白质进行检索，得到普遍的慢性心衰竭关连蛋白质组。发现其中之一的AOP-1蛋白质随着代偿期的失败表达减少。

为了研究随着慢性心衰竭的发展，该蛋白质的变化是否受到基因表达水平的调节，对基因表达进行了解析。由于解析结果在研究的所有模型中都看到该基因的表达抑制，表明随着慢性心衰竭的发展，AOP-1的减少是受到基因表达调节的结果。而使用作为缺血性慢性心衰竭模型的心肌梗塞后心衰竭大鼠进行基因表达解析时，看到该基因的表达抑制。由此表明在由各种各样原因引起的慢性心衰竭中普遍存在AOP-1基因表达低下、而且AOP-1减少。另外进一步对作为2型peroxiredoxin的Thiol-specific antioxidant(TSA)的基因表达变化和在抗氧化活性功能中具有共同性的CuZn-superoxidedismutase(CuZn-SOD)，Mn-superoxide dismutase(Mn-SOD)，catalase的基因表达进行解析时，判明TSA、CuZn-SOD、Mn-SOD、catalase在基因表达量上没有变化。由此判明AOP-1在peroxiredoxin家族、代表性的抗氧化蛋白中特征性地随着向心衰竭过渡表达减少。这表明AOP-1基因受到了与其他抗氧化蛋白质不同的基因调节。

接下来，进行了AOP-1是否对心脏功能改善或进一步恶化有某些作用的验证。首先分离出大鼠AOP-1基因的全长基因，构建适当的表达载体后，将AOP-1基因导入大鼠培养心肌细胞中。在无氧条件下对培养细胞进行培养的无氧处理、无氧培养后再氧化，进行一定时间培养的再氧化处理、在通常氧浓度下进行培养的未处理的各种实验条件中，AOP-1基因导入组与为了增加由于强制性基因表达、蛋白质生产造成的影响，导入作为无害无益基因的β-半乳糖苷酶基因的对照组进行比较解析。作为比较方法1进行存活细胞数的确认、作为比较方法2进行存活细胞中表现出自律博动的细胞数的确认、作为比较方法3进行通过MTT法(J.Immunol.Methods 1983 Vol.65，55-63)的存活细胞数和细胞代谢活性的确认。对以上3点进行比较研究的结果表明：相对于对照组，AOP-1基因导入组存活细胞数经无氧处理、再氧化处理有意义上升，同时具有自律博动能力的细胞数也有意义增加。而在MTT法中，相对于对照组，AOP-1基因导入组经无氧处理、再氧化处理、未处理中表现出高值，表现出损伤时的存活活细胞数的增加和在损伤时、正常时的代谢活性的亢进。就是说，判明对于无氧伤害、再氧化伤害，AOP-1在维持细胞存活率、细胞功能两个方面都表现出很高的有效性。另外，我们构建了将AOP-1基因的互补链设计成能进行表达的反义AOP-1表达腺病毒载体(反义AOP-1载体)。有报道由这种载体表达的mRNA与由内源性AOP-1基因表达的mRNA互补结合，一般都抑制翻译成蛋白质(Gene 1990 Vol.91，261-265)。我们将反义AOP-1载体、AOP-1表达载体、β-半乳糖苷酶表达载体导入心肌细胞，与未导入的细胞一起培养3天。对这些细胞分别进行MTT分析，观察到导入反义AOP-1载体的细胞抑制色素生成，宏观可以看到存活细胞数的减少。就是说，可以判明由于反义AOP-1载体抑制内源性AOP-1的表达，对细胞的存活产生恶劣的影响。为了对AOP-1、TSA、CuZn-SOD在细胞保护作用中的有效性进行直接比较验证，进行可以强制表达这些基因的腺病毒载体的构建。利用该载体增强大鼠心肌细胞中各个蛋白质、对以下应激的耐性进行了解析。结果表明在过氧化氢、Hypoxia、高葡萄糖应激中，AOP-1表现出最有效的细胞保护作用。这表明在维持细胞结构中AOP-1起着特别重要的作用。而发现在高葡萄糖损伤中的细胞保护作用表明AOP-1对糖尿病性心脏疾病(起因于糖尿病的心衰竭以及缺血性心脏疾病(心绞痛、心肌梗塞等))的有效性。

以上表明各种心脏疾病中的AOP-1的减少成了代偿结构失败(病态恶化)的一个主要原因。

特别应当注目的地方是AOP-1不仅对再氧化的活性氧伤害、而且对无氧状态下的各种伤害，即对能力枯竭伤害和细胞内酸性化伤害都能保护，还能活化通常氧浓度培养下的细胞代谢功能。即，清楚地表明AOP-1的细胞功能保护作用以及细胞死亡抑制作用不仅源于抗氧化作用还包括细胞代谢活化作用(线粒体活化作用)在内的新的功能。

另外我们为了验证AOP-1在生物体内是否表现保护作用，将AOP-1基因导入心脏内，进行以下解析。将基因导入后，等到蛋白质表达，立刻摘出心脏连接在灌流装置上。通过用含有与血液同等量的气体的溶液灌流心脏，努力做到减少由于摘出造成的伤害、保持与生物体内同等条件下的心脏功能。为了将该心脏作成缺血状态，暂时停止灌流，为了研究由于再氧化产生的影响进行再灌注。使AOP-1强制表达的心脏相对于作为阴性对照只进行导入基因操作的心脏(Sham)，缺血时的缺血性心僵硬有意义延长，再灌注时的功能恢复有意义良好，进一步看到再灌注时对细胞坏死的有意义抑制作用。表明缺血僵硬与心肌细胞ATP枯竭密切相关(J Mol Cell Cardiol1996，Vol.28，1045-1057)。AOP-1延长缺血至缺血僵硬的时间表明通过培养心肌细胞我们发现的AOP-1的线粒体活化作用在体内心脏也发挥作用。这一结果表明AOP-1不仅在培养细胞，而且在生物体内除了通过抗氧化作用以外，还通过新的线粒体活化作用共同保护缺血伤害、再灌注伤害。以上表明AOP-1基因的导入、AOP-1的表达增强剂、AOP-1功能增强剂是缺血性心衰竭、缺血性心脏疾病的有效的治疗方法。有报道不仅在缺血性心衰竭、缺血性心脏疾病，而且在慢性心衰竭中也有起因心肥大的心肌组织内血液循环衰竭(Chin.Med.Sci.J.1995 Vol.10(3)，151-157)，所以认为缺血、缺血再灌注是慢性心衰竭病态中普遍的伤害要因。因此将该蛋白质补充到表现出慢性心衰竭或慢性心衰竭征兆的病态心脏中在保护防止心肌细胞死亡的同时，预料可以作为对于使心脏博出功能维持的慢性心衰竭的有效治疗方法。

(2)心脏以外的疾病形成部位

以下以调查AOP-1的功能在心脏以外的脏器中是否是疾病形成的原因为目的在其他患病脏器中进行基因表达解析。结果表明肾炎模型的肾脏、神经变性病模型的脑、以及传染性肝炎(Septic shock)的肝脏中AOP-1的表达都低下。因此清楚表明AOP-1的表达低下是许多疾病中普遍病态形成和恶化的一个因素。另外不仅心衰竭模型，而且在神经变性疾病模型的脑组织对于CuZn-SOD，catalase基因都看不到表达变化，但AOP-1基因表现出表达低下。因此即使在心脏以外的脏器中AOP-1基因的表达也表现出受到与其他抗氧化蛋白质不同的调节。

1.神经变性疾病

在脑梗塞、脑血管性痴呆、头部外伤、阿耳茨海默病、运动神经变性症、帕金森病等病中由于细胞外谷氨酸浓度的上升使得谷氨酸受体(Glutamate receptor，NMDA受体)过度活化(Eur J Neurosci2000 Vol.12(8)，2735-45；Brain Res 1994 Vol.11，No.642(1-2)，117-122；Acta Neurochir Suppl.2000 Vol.76，437-8；NeurosciLett 2001 Vol.299(1-2)，37-40；J Neurosci Res 2001Vol.63(5)，377-87；Drugs Aging 2001 Vol.18(10)，717-24)。受到NMDA受体活化的细胞使其钙通道打开，引起钙流向细胞内。过量NMDA受体的活化给细胞带来钙过负荷状态。由于这样的钙过负荷引起神经细胞凋亡或坏死，神经功能损伤变成不可逆的损伤。象前面所示那样由于AOP-1在脑神经变性疾病中表达低下，所以与心脏疾病同样补充AOP-1可能是有效的。实际上在对AOP-1对培养神经元的谷氨酸伤害是否能够保护进行验证的结果是，AOP-1基因导入细胞可以有意义地抑制细胞死亡。进一步判明在无负荷状态，促进神经突触的伸展，激活作为神经元功能的网络形成。因此判明AOP-1在神经细胞中对钙过负荷表现出细胞保护作用以及神经细胞活化作用这样的很高的有用性。

为了确认在神经变性疾病动物模型中的有效性，对鹅羔氨酸的脑损伤模型进行解析。鹅羔氨酸是NMDA受体的激动剂，引起钙过量流入细胞内，诱发神经细胞死亡。将AOP-1表达基因导入脑的海马，诱导AOP-1表达后，于同一部位注入鹅羔氨酸。2日后摘出脑，观察神经细胞。将没有导入AOP-1基因的作为对照组进行比较解析，显然在导入AOP-1基因的脑中神经细胞死亡被抑制。另外对神经胶质细胞的增殖和浸润进行定量解析，结果表明与对照组相比看到明显的抑制。由于神经胶质细胞的增殖和浸润与神经细胞死亡的量表现出相关性(Journal of Neuroimmunology 2000 Vol.1009，105-111；BrainResearch 1991，Vol.565，312-320)，该结果表明由于AOP-1基因的导入，神经细胞被保护。因此判明AOP-1对组织内的神经细胞也有保护作用。因此认为补充AOP-1对脑梗塞、脑血管性痴呆、头部外伤、阿耳茨海默病、运动神经变性症、帕金森病等神经变性疾病是有效的。

2.肾病

就象前面所示那样，由于AOP-1在肾衰竭模型中表达低下，所以与心脏疾病、神经变性疾病同样，补充AOP-1可能是有效的。实际上为了确认AOP-1基因对慢性肾衰竭的有效性，对Thy-1肾炎模型进行了解析。所谓Thy-1肾炎模型是通过注入针对在作为肾的肾小球细胞的肾小球膜细胞中特异表达的Thy-1细胞表面抗原(Thy-1)蛋白的抗体，对Thy-1进行自身免疫致敏，通过自身免疫作用，会发生肾小球膜细胞的细胞死亡，接着是尿小管的伤害。一般认为Thy-1肾炎模型是以炎症作为主体的肾衰竭模型。在注入Thy-1抗体的同时注入AOP-1基因，经时以血中尿素氮作为指标测定肾功能。以未导入AOP-1的组作为对象进行比较解析，结果表明AOP-1基因导入组有意义地抑制肾功能低下。因此我们认为AOP-1对慢性肾衰竭是有效的。

3.肝病

肝病包括病毒性、过量饮酒、药物性等肝炎，直至肝硬变、肝衰竭。肝脏虽然是可再生脏器，但由于肝衰竭从肝硬变开始，肝功能就陷于不能再生的状态，所以超过再生能力的应激慢慢地累加成为病因。因此，显然要保护肝细胞就是要有预防肝衰竭效果。就象前面所示那样，由于AOP-1在肝炎模型中表达低下，所以与心脏疾病、神经变性疾病、肾病同样补充AOP-1可能是有效的。

4.风湿病

风湿病中，向免疫细胞分化、增殖的滑膜的细胞、向关节浸润的外周血中的炎症细胞，通过诱导软骨和骨破坏，对关节造成不可逆破坏。最近，已经了解到由于过氧亚硝酸等应激，成软骨细胞凋亡，使得软骨不能再生(Arthritis & Rheumatism  1999Vol.42，No.7，1528-1537；J Agric Food Chem.2001 Vol.49(8)，3614-21)。由心脏疾病、神经变性疾病、肾衰竭、肝衰竭的解析结果认为在与细胞的生死相关的应激状态下AOP-1的表达低下。因此可以预料到处于风湿病病态的成软骨细胞和成骨细胞中AOP-1的表达低下。线粒体与细胞内凋亡级联反应有密切关系。而线粒体的功能低下成了凋亡的直接“扳机”(概述：最新医学1999年54卷4号)。从我们的解析可以看到AOP-1对各种各样的细胞、组织具有保护作用。向成软骨细胞和成骨细胞补充AOP-1可以对线粒体功能进行保护、活化，抑制成软骨细胞死亡和成骨细胞死亡。由此使软骨和骨的再生能力维持成为可能。

通过以上工作，作为新的AOP-1功能我们发现了以心肌细胞代谢活化作用、心肌细胞功能保护作用以及心肌细胞死亡抑制作用、神经细胞活化作用、神经细胞死亡抑制作用为代表的细胞保护和活化作用。我们还发现AOP-1的补充对慢性心衰竭、缺血性心衰竭、缺血性心脏病、慢性肾衰竭、神经变性疾病、风湿病等为首的伴随有AOP-1基因或AOP-1的表达减少的疾病的治疗是有效的，完成了本发明。

而在本发明中所谓伴随有AOP-1基因或AOP-1的表达低下的疾病指的是在患部组织(例如，如果是心衰竭则是心脏、如果是脑则是神经细胞、如果是风湿病则是关节等)含有AOP-1基因或AOP-1的表达低下的细胞。而所谓AOP-1的量减少是与细胞内的AOP-1功能减少同义，因此由于遗传变异引起的AOP-1的功能低下的疾病也包括在本发明的范畴内。

作为本发明涉及到的伴随有AOP-1基因或AOP-1的表达减少的疾病的预防药或治疗药的有效成分可以使用的物质如以下(1)至(4)涉及到的物质。

(1)具有增强AOP-1基因表达作用的物质

具有增强AOP-1基因表达作用的物质无论是通过合成或基因重组技术得到的物质、来自天然的化合物或他们的衍生物中任一种都可以，作为这样的物质如作用于AOP-1基因的启动子或增强区，具有增强AOP-1基因向mRNA转录作用的物质，或借助于细胞中的转录因子等表现出同样作用的物质(例如，与转录因子或协同激活剂(co-activator)结合，促进与DNA、其他转录因子、协同激活剂的结合的物质，或与转录抑制因子或协同阻遏剂结合，抑制对DNA、其他转录因子、协同阻遏剂的结合的物质等)。

(2)具有增强AOP-1产生作用的物质

具有增强AOP-1产生作用的物质无论是通过合成或基因重组技术得到的物质、来自天然的化合物或他们的衍生物中任一种都可以，作为这样的物质如编码AOP-1的核酸(RNA或DNA：序列号1至3)、或编码在AOP-1的氨基酸序列中附加、缺失、置换一个以上氨基酸的具有AOP-1功能的多肽的核酸(RNA或DNA)。也包括在严格条件下与编码AOP-1的核酸(RNA或DNA：序列1至3)的互补链杂化的，而且编码具有AOP-1功能的多肽的核酸(RNA或DNA)。例如也包括作为标准方法如文献(Molecular Cloning：A LaboratoryMannual，Sambrook et al.，Cold  Spring Harbor LaboratoryPress，1989)所记载的那样，在6xSSC，0.5％SDS，10mM EDTA，5xDenhardt’s solution，10mg/ml denatured salmon sperm DNA的溶液中于68℃下进行杂化的杂化核酸。这样的核酸与编码AOP-1的核酸(RNA或DNA，序列号1至3)具有90％、优选具有95％以上的序列同源性。将这些核酸插入到病毒改变载体等其他的生物基因中的物质也同样。例如病毒载体、优选是慢病毒载体、腺苷伴随病毒载体、更优选的是腺病毒载体，或化学合成的脂质体、病毒包膜、或病毒包膜与合成脂质体的复合体等中整合在宿主细胞内发挥作用的那样启动子序列、例如巨细胞病毒启动子(CMV promoter)等的下游连接AOP-1基因的核酸序列的载体。

另外对于TNF-α，已知TNF-α产生受到转录后mRNA的稳定性的调节，由于HuR蛋白质的结合被稳定化，同样在与AOP-1 mRNA结合的物质或蛋白质、或核酸中，还可以举出如抑制AOP-1 mRNA分解的物质或具有使翻译效率提高的活性的物质。

(3)具有增强AOP-1功能作用的物质

AOP-1通过酶促使活性部位半胱氨酸残基的氧化还原可逆化，消除氧化以及过氧亚硝酸活性。增强AOP-1功能的物质，通过合成或基因重组技术得到的物质、来自天然的化合物或他们的衍生物中任一种都可以，作为这样的物质如与该活性部位半胱氨酸残基结合、促进氧化还原循环的物质，或与AOP-1的活性部位以外部位结合，通过别构效应促进活性部位的氧化还原循环的物质。另外如促进AOP-1和AOP-1作用的AOP-1靶分子(例如受体)的结合或细胞内的信息传递、对亢进AOP-1具有的活性的物质。例如已知硫氧还蛋白(thioredoxin)可以与AOP-1结合，使生物化学的抗氧化活性上升。借助于这样的使AOP-1功能增强的蛋白质本身或基因的导入、利用化学合成物质等诱导，间接地增强AOP-1功能，发挥有效性的物质。另外，特异分解AOP-1的蛋白酶的活性抑制物质等也包括在内。

(4)AOP-1蛋白质和具有AOP-1功能的多肽

在本发明中作为伴随有AOP-1基因或AOP-1的表达减少的疾病的预防药或治疗药的有效成分可以使用AOP-1蛋白质本身或在AOP-1的氨基酸序列中附加、缺失、置换一个以上氨基酸的具有AOP-1功能的多肽。

(5)制剂

作为有效成分含有上述那样的物质的制剂可以使用通常制剂时用的载体或赋形剂、以及其他的添加剂进行制备。

本发明涉及到的医药组合物的有效成分无论是游离型，还是该药物容许的盐都可以。作为与无机酸的盐如与盐酸、硫酸、磷酸的盐，或与有机酸的盐，如可以使用与甲酸、醋酸、丁酸、琥珀酸、柠檬酸等有机酸盐。盐无论是钠、钾、锂、钙等金属盐、还是由有机碱形成的盐的形态都可以。

有效成分最好是通过与众所周知的药理学上容许的载体、赋形剂、稀释剂等混合后，使用医药上一般使用的给药方法、例如优选经口服给药，或静脉给药、肌肉给药或皮下给药等非口服给药方法给药。本发明的药物组合物，例如有效成分可以与生理学上容许的载体、香味剂、赋形剂、稳定剂、稀释剂、乳化剂、溶液剂、混悬液、糖浆剂等适当混合进行制造，可以做成片剂、散剂、颗粒剂、溶液剂等。作为可以混合到片剂等制剂的添加剂如明胶那样的粘合剂、玉米淀粉那样的润滑剂等，另外也可以用糖衣或易溶性或肠溶性物质的膜被膜。剂型为胶囊时，在上述组合物中还可以含有液体状载体。用于注射的无菌组合物也适合利用通常处方进行制造。作为注射用的水性液体如含有葡萄糖等的等渗液等，也可以与聚乙二醇那样的适当的溶解辅助剂等合用。另外，也可以配合缓冲剂、稳定剂、保存剂、防止氧化剂、无痛剂等。有效成分是肽时，由于经口给药在消化道中受到分解，所以这种给药方法一般来说效果不好，也可以做成在消化道中难于分解的制剂、例如将活性成分肽包在脂质体中的微囊，进行经口给药。另外也可以使用从直肠、鼻腔内、舌下等消化道以外的粘膜吸收的给药方法。此时以栓剂、滴鼻喷雾剂、舌下片的形态给药。

而在用于基因治疗的情况下，可以使用向病毒载体、优选是慢病毒载体、腺苷伴随病毒载体、更优选的是腺病毒载体，或化学合成的脂质体、病毒包膜、或病毒包膜与合成脂质体的复合体等众所周知的适合基因治疗的介质中整合在宿主细胞内发挥功能那样的启动子序列、例如巨细胞病毒启动子(CMV promoter)等的下游连接AOP-1基因或与增强AOP-1基因表达的物质、增强AOP-1产生的物质或增强AOP-1功能的物质有关的核酸后的载体。

本发明药物组合物的给予量取决于治疗中使用情况、对治疗有效的给药量，由于给药量因给药对象的年龄、体重、症状的程度以及给药途径等而有所不同，应根据各种情况确定。通常经口给药时，成年人一天的给药量为0.1～1000mg左右，可以分为1至数次给药。

(6)筛选方法

可以用作本发明涉及到的预防药或治疗药的有效成分的物质的筛选法如以下列举的方法。

在增强AOP-1基因表达的物质或增强AOP-1产生的物质的筛选中使用的AOP-1基因或AOP-1、或其衍生物无论是来自哪种来源都可以，例如来自人(AOP-1基因：序列1、AOP-1：序列4)、来自大鼠(AOP-1基因：序列2、AOP-1：序列5)、小鼠(AOP-1基因：序列3、AOP-1：序列6)等哺乳动物的。其中，在对人的预防药或治疗药的研究、开发中利用上优选使用来自人的AOP-1的。另外动物模型、即、从使用由于AOP-1基因进行表达抑制或缺失引起慢性心衰竭症状等的非人转化动物的研究、开发的必要性考虑，优选使用例如来自小鼠、大鼠等动物的模型。但是，在使用动物模型对药物进行筛选时，希望使用来自人的模型。

在增强AOP-1基因表达的物质或增强AOP-1产生的物质、或增强AOP-1功能的物质的筛选方法中，一般使用利用报告基因的方法。作为报告基因例如可以使用氯霉素乙酰基转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶(β-Gal)、荧光素酶等。增强AOP-1基因表达的物质，例如构建将AOP-1基因的转录调控区(启动子、增强子区等)连接到报告基因的翻译区的上游或下游的表达载体，导入到适当的培养细胞中，向该培养细胞添加作为样品的物质(该物质可以是通过合成或基因重组技术得到的物质、来自天然的物质或他们的衍生物中的任一种)，可以于一定时间后通过测定报告基因的表达量、或报告蛋白质的量进行筛选。AOP-1基因的转录调控区(启动子、增强子区等)可以通过以AOP-1 cDNA的片段为探针从销售的基因文库进行噬斑杂交等得到。报告蛋白质的量可以以酶活性进行测定，作为蛋白质的表达量可以使用抗体等进行测定。

对于增强AOP-1产生的物质包括含有AOP-1序列的DNA或RNA，即使是将他们整合到脂质体、或病毒改变载体也可以得到同样的效果。

作为增强AOP-1功能的物质的筛选方法，例如可以通过将纯化AOP-1、或细胞溶解液、最好是线粒体级分与过氧化氢、含有巯基的还原剂(例如二硫苏糖醇)、可测定酶活性的检测酶这4种混合，测定一定时间后的检测酶的活性来进行(Biochemical andBiophysical Research Communications 1994 Vol.199，No.1，199-206；Journal of Biological Chemistry 1996 Vol.271，No.26，15315-15321)。而在使用过氧亚硝酸(peroxynitrite：例如可以通过酸性亚硝酸盐与过氧化氢混合得到)时，将纯化AOP-1、或细胞溶解液、最好是线粒体级分与过氧亚硝酸和可测定酶活性的检测酶或过氧亚硝酸修饰的物质(例如DNA)这3种试剂混合，测定一定时间后的检测酶的活性或物质的修饰量来进行(Nature 2000Vol.407，No.14，211-215)。即，通过测定AOP-1对由于自由基伤害检测酶失活的保护活性，可以筛选增强AOP-1功能的物质。

(7)诊断方法、诊断剂以及诊断试剂盒

AOP-1基因，其表达量随着各种疾病的恶化而减少的事实本发明人已经搞清楚了。使用患者的活组织样品，通过测定AOP-1基因的表达量，可以了解到慢性心衰竭的进一步恶化程度。例如使用ISOGEN(日本基因公司生产)从患者活组织样品100mg提取总RNA，经DNase处理后合成cDNA，用适当的引物，通过PCR反应扩增AOP-1基因，通过凝胶电泳判定相当于AOP-1的带的浓度等方法可以测定AOP-1基因的表达量。AOP-1基因表达的定量不限于该方法，例如实施例3记载的方法或northern杂交法、cDNA数组法(cDNAarray)等，只要是RNA、DNA的定量法无论哪一种方法都可以利用。

另外，本发明已经表明AOP-1基因是各种疾病的改善因子，所以AOP-1基因以及其调控区中存在任一种变异使AOP-1的功能低下，基因表达量减少的情况下，很容易想到具有该变异的个体易得慢性心衰竭等疾病，或具有容易进一步恶化的倾向。因此通过对这些基因上的变异进行试验，危险因素的诊断成为可能。作为了解基因上变异的方法，例如可以根据常规方法从患者的血液中分离DNA，按照实施例1-5记载的方法确定其碱基序列，与正常的序列进行比较来进行。另外一旦变异与慢性心衰竭的关系明确，可以利用只检测该变异的DNA芯片法、SSCP法等方法。

另外，使用伴随慢性心衰竭疾病的很多患者的活组织样品，通过测定心肌细胞内AOP-1的浓度，可以了解慢性心衰竭或上述疾病的进一步恶化程度。作为测定方法可以利用例如使用抗AOP-1抗体的ELISA或RIA法、通过HPLC和质谱的定量法等。此时AOP-1不必是完全形态，只要是可测定，即使是其片段也可以。

另外本发明包含包括使用上述测定手段等对AOP-1基因的表达量或AOP-1的产生量进行测定的手段的慢性心衰竭的诊断剂和诊断试剂盒。

(8)AOP-1基因导入转化动物以及转化人细胞和组织等

本发明涉及到的物质的鉴定在上述(6)筛选方法中已经有记载，也可以利用具有通过抑制AOP-1的表达引起的慢性心衰竭症状等的非人转化动物进行。作为宿主动物的非人动物除了小鼠、大鼠、兔子等小动物以外，狗、猪、羊、牛等大动物也可以成为选择的对象，只要是对基因进行表达、可以确认功能和生理作用的动物无论什么样的动物都可以。对基因表达进行抑制通过在AOP-1转录调节区导入变异或缺失等是可能的，只要是抑制基因表达，无论用什么方法都可以。另外，AOP-1的产生抑制，通过向AOP-1 mRNA导入互补的DNA或RNA或导入编码该互补序列的基因可以得到，只要是能够抑制AOP-1的产生，无论使用什么方法都可以。另外作为基因缺失的方法如使用胚胎干细胞的人工破坏特定基因鼠技术，只要是抑制基因的表达的系统使用什么样系统都可以。

通过以下实施例进一步详细地说明本发明，但本发明并不限定于这些实施例。

实施例

实施例1：通过蛋白质双向电泳法检索AOP-1

1-1慢性心衰竭病态模型大鼠的制作和左心室样品的采集

A.Dah1慢性心衰竭模型大鼠

Dah1大鼠是通过在Spague-Dawley系大鼠中用含有8％高食盐食物饲养，进行继代交配在第3代分离为高血压易发性的食盐感受性大鼠(Dah1-S)和不产生高血压的食盐抗性大鼠(Dah1-R)。Dah1-S大鼠通过京都大学木原等人的研究，经从6周龄开始用含有8％高食盐食物饲养，出现代偿性左心室肥大后，向伴有收缩衰竭的左心室扩大、即非代偿性慢性心衰竭过渡，由于肺充血而死亡(Am.J.Physuol.1994 Vol.267，H2471-2482)。本模型在模型制作中不需要特殊的手法，在短时期内可以引发慢性心衰竭症，而在一个体中可以很清楚区分为代偿肥大期和非代偿慢性心衰竭期，类似于人的高血压性慢性心衰竭和发病过程。

雄性Dah1食盐感受性大鼠(Dah1-S)(清水实验材料)从6周龄开始用含有8％高食盐食物饲养，在心肥大期(11周龄)和慢性心衰竭期(14周龄)采取左心室。

B.腹部大动脉狭窄大鼠(压负荷模型：由于压负荷引起的大鼠心肥大模型：AOB)的制作以及左心室样品的采取

实验中使用Sprague-Dawley系的9周龄雄性大鼠。通过向腹腔内注入戊巴比妥钠(40mg/kg)对大鼠进行麻醉，然后腹卧位固定，开腹后，使腹部大动脉露出，剥离左右的肾动脉间的部分。沿着大动脉，使21G注射针在左右的肾动脉间与大动脉一起用丝线结扎，然后通过拔出注射针，进行大动脉狭窄。本模型中通过这样的腹部大动脉狭窄使得收缩期血压上升，心脏的后负荷增大，产生左心室肥大。对于假手术(Sham-operation(Sham))组只实施腹部大动脉的剥离。

由于动脉的狭窄收缩期血压在手术后3个月、17个月分别达到比通常高的232mmHg，188mmHg值。在3个月时确认心脏重量/体重比有意义上升，而17个月的大鼠与3个月相比，作为心功能指标的Fractional Shortening(FS)由52％降低到26％。因此将狭窄手术后3个月作为代偿性肥大期，17个月作为非代偿性慢性心衰竭期，分别采取它们的左心室和假手术组的左心室。

C.腹部动静脉分流大鼠(容量负荷模型：由于容量负荷引起的大鼠心肥大模型：ACS)的制作以及左心室样品的采取

实验中使用Sprague-Dawley系的9周龄雄性大鼠。通过向腹腔内注入戊巴比妥钠(40mg/kg)对大鼠进行麻醉，然后腹卧位固定，开腹后，使腹部大动脉露出，在大动脉的肾动脉分支部位以及大腿动脉分支部位分别用夹子止住血流。在止血部位将18G注射针插入大动脉内，使大静脉贯通，制作动静脉分离。拔出注射针，用手术用粘合剂塞住动脉部位的伤口，松开夹子。在确认在分流部动脉血流入静脉内后，进行开腹。在本模型中通过这样的腹部大动静脉分流的形成，静脉压上升，心脏的前负荷增大，按照右心房、右心室、左心房、左心室顺序施加负荷，产生肥大。进而，由于静脉系的伸缩率(compliance)低，所以血液贮流，呈现出肺充血。在假手术[Sham-operation(Sham)]组中只实施腹部大动静脉的剥离。

在术后3个月、11个月通过超声心动进行心功能测定后，对解剖、心重量以及解剖所见进行了确认。与手术后3个月相比，11个月的大鼠的血细胞比容值低下，同时所有例子都产生肺水肿，认为是容量负荷进行的结果。另外右心系的心重量/体重比和肺重量/体重比增加，表明充血由右心室扩展到肺。FS由57％降低到31％。因此，判断分流手术后3个月为代偿期，11个月为非代偿性慢性心衰竭期，分别采取它们的左心室和假手术组的左心室。

D.自然发病高血压大鼠(压负荷模型)的制作以及左心室样品的采取

对已知的作为自然发病高血压大鼠的SHR大鼠进行饲养，随时测定血压、超声心动。3个月龄的SHR的血压以及心重量/体重比比通常的高，表现出由于高血压引起的心肥大。在19个月龄，除了立毛、坐等外在表观外，FS由56％降低到32％，收缩期血压也低下，表现出慢性心衰竭。另外还看到胸水、浮肿等症状。分别通过解剖采取左心室。

E.心肌梗塞后心衰竭模型大鼠的制作以及左心室样品的采取

使用体重180g-200g的Sprague-Dawley(SD)大鼠，进行冠动脉结扎。结扎4周后进行心功能测定，心脏摘出后测定心肺重量(左右心室、肺)。对于心功能进行扩张末期压、最大收缩期压的测定。扩张末期压随着心衰竭的恶化上升，就该模型来说，相对于sham组，Vehicle组上升3.1倍。最大收缩期压，相对于sham组，Vehicle组降低29％。右心室重量与体重的比随着心肥大而上升，就该模型来说，相对于sham组，Vehicle组上升2.2倍。肺重量随着心功能的低下，由于充血而上升，就该模型来说，相对于sham组，Vehicle组上升2.3倍。由此认为本模型是经历心肌梗塞后的心肥大引起的代偿期达到心衰竭的典型的心衰竭模型。

通过解剖采取左心室非梗塞区域。

1.2蛋白质样品的制作

相对于大鼠心脏1/4量，加入1ml的匀浆缓冲液1(20mM TrisHCl pH7.4，1mM EDTA，1mM EGTA，1mM PMSF)。用匀浆机将组织破坏后再进行超声处理。经离心得到上清，作为可溶性蛋白级分。将沉淀用同样匀浆缓冲液洗净后，加入与沉淀同体积的匀浆缓冲液2(匀浆缓冲液1+2％triton X100)，再次混合后将离心后的上清作为膜蛋白和膜相互作用蛋白级分。

1.3蛋白质的定量

使用利用了蛋白质中肽键与铜的二价离子螯合，与Bicinchoninic acid(BCA)反应呈紫色现象的BCA法简化的Pierce公司生产的蛋白质定量试剂盒进行蛋白质的定量。标准蛋白使用试剂盒附带的牛血清白蛋白。

1.4双向电泳

A.第一向电泳

将相当于125～750μg的蛋白质悬浮于样品缓冲液(8M Urea，0.5％Triton X-100，10mM DTT，Orange G微量)中，用该悬浮液使干燥胶(Pharmacia Biotech.公司生产Immobiline Drystrip)膨润。使用Pharmacia Biotech.公司生产的MultiphorII，按照制造者的标准操作方法进行电泳。电泳后于-20℃下可以保存一周左右，随时供第二向电泳用。

B.第二向电泳

将上述凝胶用平衡缓冲液(50mM Tris-HCl，6M Urea，30％glycerol，1％SDS)进行前处理后，放置在聚丙烯酰胺凝胶上。使用Biorad公司生产的电泳装置进行电泳。电泳后立即将蛋白固定于凝胶中，同时用银染色法进行染色，得到双向电泳图。

1-5蛋白表达比较解析

对同一样品最少进行2次电泳，将在各个模型中与组内的最低2个个体有关的表达变化具有再现性的蛋白吸出。在被吸出的这些蛋白中，将多数的模型中共同变化的因子与慢性心衰竭相关蛋白质确立位置关系。其中通过下面实施例1-6对鉴定为AOP-1的蛋白质点进行数值化的图如图1所示。在图1中Dah1、AOB、ACS、SHR分别称为上述的1-1.A至D.中制作的慢性心衰竭病态模型大鼠。

1-6蛋白质的鉴定

A.目的蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶中的回收

将凝胶片用适当的缓冲液洗净后，除去SDS。使胰蛋白酶(trypsin)(PROMEGA公司生产)浸透凝胶内，通过对凝胶中的目的蛋白质进行消化，使其片段化，然后从凝胶网孔中洗脱出来。

B.通过质量分析鉴定AOP-1

将上述A中得到的目的蛋白质的片段组混合物直接用MicroMass公司生产的质量分析仪(电喷射离子化法/飞行型质量分析仪)进行解析，得到目的蛋白质片段组的质量信息。通过进一步对一部分片段照射氦气，使肽键断裂，得到蛋白质片段的内部序列N末端[H(I/L)SVNDL]]C末端和质量信息(亲离子分子量1206.6、子离子分子量1069.481，956.428，869.418，770.379，656.336，541.324，428.244)。以这些信息为基础对网上公开的基因序列数据资料进行检索，对AOP-1进行鉴定(SwissProt Accession No.P20108：序列6)。

实施例2：AOP-1基因的表达解析

用通过实施例1-1-A～D记载的方法得到的左心室作为样品。

使用ISOGEN(日本基因公司生产)按照说明书记载的方法从各左心室制备总RNA，进行DNase处理。使用TaqMan(登录商标)Reverse Transcription Reagents(PE Applied Biosystems公司生产)从DNase处理的总RNA各1μg于50μl反应液中合成cDNA。基因的表达解析通过使用ABI PRISM 7700(PE Applied Biosystems公司生产)的real time PCR定量系统进行定量。AOP-1检测用的引物和TaqMan探针是使用引物设计软件ABI PRISM Primer Express以小鼠AOP-1 cDNA碱基序列为基础设计的。正向引物5’TGCAGTTTCAGTGGATTCCCA3’(序列7)、反向引物5’TTCATGTGGCCCAAACCA3’(序列8)、TaqMan探针5’TCTTGCCTGGATCAACACACCAAGAAAG3’(序列9)。

real time PCR定量反应以上述cDNA 1μl作为模板，于40μl反应液中，使用TaqMan(登录商标)Universal PCR Mater Mix(PEApplied Biosystems公司生产)，按照说明书记载的方法进行。使用同样的方法对GAPDH的表达量进行解析，用作内部标准。GAPDH向引物5’TGCACCACCAACTGCTTAG3’(序列24)反向引物5’GGATGCAGGGATGATGTTC3’(序列25)、TaqMan探针5’CAGAAGACTGTGGATGGCCCCTC3’(序列26)。GAPDH是构成的蛋白质之一，一般都用作内部标准。解析结果如图2所示。结果在所有模型中都发现伴随慢性心衰竭病态的发展，AOP-1基因的表达低下。

实施例3：TSA(PRx2)，CuZn-SOD，Mn-SOD，过氧化氢酶基因的表达解析

用通过实施例1-1，E记载的方法得到的左心室作为样品。

使用ISOGEN(日本基因公司生产)按照说明书记载的方法从左心室制备总RNA，进行DNase处理。使用TaqMan(登录商标)ReverseTranscription Reagents(PE Applied Biosystems公司生产)从DNase处理的总RNA各1μg于50μl反应液中合成cDNA。基因的表达解析通过使用ABI PRISM 7700(PE Applied Biosystems公司生产)的real time PCR定量系统进行定量。检测用的引物和TaqMan探针是使用引物设计软件ABI PRISM Primer Express以大鼠TSA，CuZn-SOD，Mn-SOD，catalase cDNA的碱基序列为基础设计的。大鼠TSA正向引物5’CCCTCTGCTTGCTGATGTGACT3’(序列10)、反向引物5’CCTGTAAGCGATGCCCTCAT3’(序列11)、TaqMan探针5’AGCTTGTCCCAGAATTACGGCGTGTTGAA3’(序列12)。CuZn-SOD正向引物5’GCGGATGAAGAGAGGCATG3’(序列13)、反向引物5’GCCACACCGTCCTTTCCA3’(序列14)、TaqMan探针5’TGGAGACCTGGGCAATGTGGCTG3’(序列15)。catalase正向引物5’ACGGGTGCTCAGCCTCC3’(序列16)、反向引物5’AGGCTTGTGCCCTGCTTC3’(序列17)、TaqMan探针5’CAGCCTGCACTGAGGAGATCCCTCA3’(序列18)。Mn-SOD正向引物5’TTACAGATTGCCGCCTGCTC3’(序列21)、反向引物5’CCAGCAGTGGAATAAGGCCT3’(序列22)、TaqMan探针5’AATCACGACCCACTGCAAGGAACCA3’(序列23)。

real time PCR定量反应以上述cDNA 1μl作为模板，于40l反应液中，使用TaqMan(登录商标)Universal PCR Mater Mix(PEApplied Biosystems公司生产)，按照说明书记载的方法进行。使用同样的方法对GAPDH的表达量进行解析，用作内部标准。解析结果如图3所示。该结果在相对于sham组的Vehicle组中可以看到AOP-1基因的有意义的表达低下(p＝0.05)、而在TSA，CuZn-SOD，Mn-SOD，过氧化氢酶中没有看到基因表达变化。

实施例4：大鼠AOP-1 cDNA的克隆

4-1大鼠AOP-1PCR片段的克隆

用实施例2制作的cDNA作为模板，使用正向引物为5’AACCGCGGTCGTGGCTCTTGCGTTCTCT3’(序列19)、反向引物为5’GCGCTAGCTTATTGATGGACCTTCTCAAAG3’(序列20)进行PCR，将扩增产物TA克隆到PCRII载体(Invitrogen公司生产)。

4-2碱基序列的确定

碱基序列使用THERMO Sequenase^TM II dye terminator cyclesequencing kit(Amersham Pharmacia公司生产)通过型号为373A的自动DNA序列读取仪(Applied Biosystems公司生产)解析确定。对得到的基因序列查询GenBank的数据库，结果判明1个菌落(pFH1)是与大鼠AOP-1(Genebank Accession No.AF106944：序列2)一致的基因。

实施例5：AOP-1表达腺病毒改变载体的构建

5-1粘粒的构建

使用宝酒造株式会社生产的腺病毒表达载体试剂盒(AdenovirusExpression Vector Kit)构建腺病毒改变载体。从实施例3中构建的pFH1中切出含有AOP-1基因的SacII，NheI片段，克隆到pQBI25(宝酒造株式会社生产)。然后通过使用NheI，BamHI使GFP基因缺失，构建在CMV启动子的下游带有AOP-1基因，该基因下游带有来自牛生长激素的poly A信号的AOP-1表达单元。将该表达单元用Bg1II，DraIII切出，使用DNA Blunting试剂盒(宝酒造株式会社生产)使末端变平，克隆到腺病毒表达载体试剂盒附带的粘粒pAxcW的SwaI位点。

5-2使用了293细胞的AOP-1表达腺病毒改变载体的制作和扩增

用上述粘粒和腺病毒表达载体试剂盒附带的DNA-TPC共转染293细胞(Bio Whittaker公司生产)。在293细胞中AOP-1粘粒和引起DNA-TPC同源重组、AOP-1表达腺病毒改变载体被构建，借助于293细胞恒定表达的E1蛋白的作用，作为病毒增殖。而由于作成的AOP-1表达腺病毒改变载体缺失了E1基因，只能在人为地组成表达E1基因那样的转化细胞内(例如293细胞)进行增殖。

5-3 AOP-1表达腺病毒改变载体的滴度检测

实施例4-2中构建的AOP-1表达腺病毒改变载体的滴度检测按照腺病毒表达载体试剂盒附带的说明书记载的方法依次进行。

实施例6：大鼠培养心肌细胞的制作和AOP-1基因导入

对出生后1至3天的新生大鼠用乙醚麻醉，断头后摘出心脏。将心室剥离出来，通过胶原酶(warthington biomedicalcorporation公司生产)消化，使细胞分散。用Percoll(amershampharmacia biotech公司生产)进行密度梯度离心，分别收集心肌细胞和非心肌细胞。使用混合有终浓度为10％胎牛血清(EQUITECH-BIO公司生产)的日研生物医学研究所生产的D-MEM(低糖)培养基，对收集的心肌细胞进行培养。用实施例5制作的AOP-1表达腺病毒改变载体以1.6×10²(M.O.I.)感染1小时后，用培养基清洗2次。培养24小时后供实施例7使用。

实施例7：对导入基因的细胞进行无氧培养、再氧化应激应答解析

使用通过与实施例5同样的方法制作的β-半乳糖苷酶表达腺病毒改变载体，用与实施例6同样的方法制作β-半乳糖苷酶强制表达细胞。将强制表达细胞作为通过在基因导入系使无害无益蛋白质强制表达的比较对照组，用于以下实验中。将实施例6制作的AOP-1强制表达细胞和对照细胞于无氧培养系中培养24小时，然后返回到大气氧浓度、5％二氧化碳浓度的通常培养系(再氧化)，培养72小时。另外同时制作在通常氧浓度下进行24小时培养的通常氧浓度对照组。从通常氧浓度下培养的细胞、无氧培养后再氧化培养后的细胞分别取样，于显微镜下观察。测定存活的细胞数、自律博动的细胞数，进行统计处理。然后利用属于线粒体呼吸链的琥珀酸-四唑氮还原酶(Succinate-tetrazolium reductase)系使MTT试剂(NacalaiTesque公司生产)还原，使用细胞存活率、细胞代谢活性测定试剂进行解析。

结果表明：在通常氧浓度下培养的AOP-1导入组、对照组间，细胞存活率没有差别，但在无氧条件下培养24小时后，再氧化培养后的细胞存活率在AOP-1基因导入组中表现出有意义的增加(图4)。而在无氧条件下培养24小时后、再氧化培养后的细胞自律博动率在AOP-1基因导入组中表现出有意义的增加(图5)。另外，在使用MTT的实验中，于无氧条件下培养24小时后、再氧化培养后也观察到在AOP-1基因导入组中MTT分解活性表现出有意义的上升(图6)。特别是于通常氧浓度下培养，即由于无伤害状态下使细胞代谢功能激活(图6)，表明存在着AOP-1有使线粒体功能提高的可能性。

一般来说，处于氧缺乏状态的细胞内，引起由需氧能量产生系统切换到厌氧能量产生系统，由于柠檬酸的蓄积等引起的细胞内酸性化伤害、厌氧能量产生系统相对于需氧能量产生系统来说是无效率的，会发生细胞内能量的枯竭伤害。而再氧化时，在线粒体中表现出发生活性氧类，通过蛋白质、DNA、细胞膜磷脂等氧化，使细胞受到伤害。本实施例中的结果表明，AOP-1可以去除心肌细胞中的这些伤害，具有保持细胞正常功能的活性。

由于不仅在缺血型慢性心衰竭(心肌梗塞后慢性心衰竭)，而且在慢性心衰竭中也有报道起因于心功能低下、心肥大的对心肌细胞的血流不足(缺血)，通过将该蛋白质补充到慢性心衰竭状态的心肌细胞中，保护心肌细胞，进而保持博出功能，可以成为慢性心衰竭治疗药。

实施例8：反义AOP-1表达腺病毒改变载体的构建

从带有实施例5用的CMV启动子的下游连接AOP-1基因、该基因下游连接来自牛生长激素的poly A信号的AOP-1表达单元切出AOP-1基因，切出的两方的片段用DNA Blunting试剂盒(宝酒造株式会社生产)进行平末端化，再进行连接。通过序列解读确认AOP-1被克隆的方向。用Bg1II、DraIII切出该表达单元，使用DNA Blunting试剂盒(宝酒造株式会社生产)进行平末端化，克隆到腺病毒表达载体试剂盒附带的粘粒pAxcw的SwaI位点。象实施例5那样，使用该粘粒制作病毒载体(腺病毒反义AOP-1粘粒)。

实施例9：反义AOP-1基因强制表达对培养心肌细胞的影响

用与实施例6同样的方法，制作反义AOP-1、AOP-1、β-半乳糖苷酶强制表达细胞。将未导入上述基因细胞以及导入上述基因细胞同时进行72小时培养后，利用属于线粒体呼吸链的琥珀酸-四唑氮还原酶系使MTT试剂(Nacalai Tesque公司生产)还原，使用细胞存活率、细胞代谢活性测定试剂进行解析。这样操作后，只有在导入反义AOP-1组中有意义地抑制MTT试剂分解物的生成(图7)。在于显微镜下进行观察后，结果可以看到在反义AOP-1组中存活细胞数有意义地减少。由此判明反义AOP-1的强制表达对培养心肌细胞的存活有不利的作用。

实施例10：其他病态模型的制作

A.肾炎模型制作

使用8周龄的Wistar系雌性大鼠。在乙醚麻醉下摘出左肾脏。1小时后通过向静脉内注入抗Thy-1单克隆抗体(1-22-3)(500μg/鼠)引起肾炎(Acta Pathol.Jpn.36：1191，1986)。引起肾炎后一定时间间隔内(1日、4日、7日、14日、28日后)摘出肾脏。

B.septic shock(传染性肝炎)模型的制作

向3只150～300g的同令大鼠腹腔注入脂多糖(lipopolysaccharide)10mg/kg，2小时后摘出肾脏。

C.脑损伤模型的制作

在戊巴比妥钠麻醉下将slc wistar雄性大鼠(11w)固定于脑定位固定装置，头盖骨露出后，确认前卤、人字缝尖的水平，从前卤后方4.5mm、侧方2.7mm打开一个直径约为0.5mm左右的洞。使用微量注射器，从前卤向下深3.0mm的部位注入鹅羔氨酸0.6μg。72小时后回收切片用样品，供基因表达解析用。鹅羔氨酸是谷氨酸类似物，是使NMDA受体具有特异性的化合物。因此，鹅羔氨酸引起的神经细胞伤害是上述谷氨酸伤害的2个主要机制中通过NMDA受体的过度兴奋引起神经细胞伤害的。

实施例11：其他病态模型中的AOP-1以及其他基因的表达解析

使用ISOGEN(日本基因公司生产)按照说明书记载的方法从上述实施例10得到的各个脏器的组织制备总RNA，进行DNase处理。使用TaqMan(登录商标)Reverse Transcription Reagents(PEApplied Biosystems公司生产)从DNase处理的总RNA各1μg于50μl反应液中合成cDNA。基因的表达解析通过使用ABI PRISM7700(PE Applied Biosystems公司生产)的real time PCR定量系统进行定量。AOP-1以及其它基因检测用的引物以及TaqMan探针是使用引物设计软件ABI PRISM Primer Express以小鼠AOP-1 cDNA碱基序列为基础设计的。AOP-1向引物(序列7)、反向引物(序列8)、TaqMan探针(序列9)。TSA正向引物(序列10)、反向引物(序列11)、TaqMan探针(序列12)。CuZn-SOD正向引物(序列13)、反向引物(序列14)、TaqMan探针(序列15)。过氧化氢酶正向引物(序列16)、反向引物(序列17)、TaqMan探针(序列18)。Mn-SOD正向引物(序列19)、反向引物(序列20)、TaqMan探针(序列21)。

real time PCR定量反应以上述cDNA 1μl作为模板，于40μl反应液中，使用TaqMan(登录商标)Universal PCR Mater Mix(PEApplied Biosystems公司生产)，按照说明书记载的方法进行。使用同样的方法对GAPDH的表达量进行解析，用作内部标准。解析结果如图所示(图8a：肾炎模型、8b：脑障碍模型，图9：传染性肝炎模型)。该结果在各个疾病模型的疾病器官中都发现伴随病态的进行AOP-1基因的表达低下。

实施例12：来自胎仔大鼠的培养神经细胞的制作

对Wistar系妊娠18～20日大鼠用乙醚麻醉后、开腹。从子宫取出胎仔，再从胎仔中取出脑，保存在冰冷HBSS(制备组织培养用缓冲液「Nissui」②(日水制药公司生产)9.8g/l、NaHCO₃ 0.35g/l，过滤灭菌)中。然后立即在实体显微镜下分离大脑，用蛋白分解酶木瓜蛋白酶(papain)(worthington公司生产)使细胞分散。使用混合有终浓度为10％的马血清的日研生物医学研究所公司生产的D-MEM(高葡萄糖)培养基，对分离提取的神经细胞进行培养。培养开始后第4天加入含上述血清培养基，再培养3天。总计培养7天后，通过AOP-1或β-半乳糖苷酶腺病毒载体导入基因。导入基因后培养48小时，进行谷氨酸伤害、无血清化等刺激。

实施例13：AOP-1对于培养神经细胞的谷氨酸伤害保护作用的检测

对于实施例12制作的培养神经细胞，通过与实施例6同样的方法导入AOP-1基因。象实施例7那样将β-半乳糖苷酶强制表达的组作为比较对照组，用于以下的实验。加入谷氨酸(终浓度分别为0，100，500μM)，培养48小时后，供MTT分析。用不加谷氨酸的各个基因导入组的MTT值除谷氨酸伤害组的MTT值得到的值作为神经细胞保护率进行作图(图10)。另外在图10中的MK-801是(+)-二苯并环庚烯亚胺(dibenzocyclohepteneimine)，是NMDA受体的拮抗剂，表现出使神经培养细胞免于谷氨酸伤害(Eur J Pharmacol 1993Vol.248(4)303-312)。就象图中所示那样，导入AOP-1组与未添加MK-801组中导入β-半乳糖苷酶组比较，表现出有保护培养神经细胞倾向。而与添加MK-801组中导入β-半乳糖苷酶组进行比较，由于表现出有意义地保护培养神经细胞作用，所以表明AOP-1对MK-801的保护作用有相加作用。在神经细胞的谷氨酸伤害中，发现了通过上述的NMDA受体的钙过负荷和借助于胱氨酸、谷氨酸的反向转运(cystine，glutamate-antiporter)活化的细胞内胱氨酸(cystine)枯竭这两种伤害(Neuroscience 1992 Vol.48(4)906-914)。由上述结果可以认为AOP-1对上述两种伤害都具有保护作用。

实施例14：AOP-1对培养神经细胞神经突触伸展促进作用的检测

对实施例12中未添加谷氨酸的细胞(10％FBS组)、添加谷氨酸(10％FBS组+100μM谷氨酸组)无血清(0％FBS组)进行照像(图11)。

在各种刺激存在下在导入AOP-1组中经常观察到神经突触伸展促进、保护作用。

实施例15：AOP-1、TSA、CuZn-SOD对培养心肌细胞的保护作用的比较

使用实施例4记载的方法获得rat TSA，进行序列确认(序列27)。序列28表示由序列27翻译的蛋白质序列。另外CuZn-SOD使用从著者获得的含有文献(FEBS letter 1990 Vol.20：269(1)89-92)记载的人CuZn-SOD基因(序列29)的质粒(pYS0200)。序列30表示由序列29翻译的蛋白质序列。对于各个基因使用实施例5记载的方法，制作TSA表达腺病毒改变载体、CuZn-SOD表达腺病毒改变载体。另外在用实施例6记载的方法制作的培养心肌细胞中，使用实施例6记载的方法导入基因。有关应激抗性的解析如下进行。

①无氧条件培养(Hypoxia)时的细胞存活率

导入基因后培养24小时的细胞暴露于无氧条件下再培养24小时。使用实施例7记载的MTT法测定细胞存活率。导入AOP-1、TSA、CuZn-SOD基因的细胞分别相对于对照(导入β-半乳糖苷酶的细胞)表现出存活率有意义增加作用(p＜0.01)。导入AOP-1基因的细胞相对于导入TSA的细胞存活率有意义增加，相对于导入CuZn-SOD细胞存活率表现出增加倾向(图12a)。

②暴露于过氧化氢引起的细胞存活率

导入基因后培养24小时的细胞暴露于0.1、1mM的过氧化氢再培养24小时。使用实施例7记载的MTT法测定细胞存活率。导入AOP-1基因的细胞的细胞存活率相对于对照有意义增加(p＜0.05)。但在导入TSA、CuZn-SOD组虽然表现出细胞存活率改善倾向，但从统计学上看无意义(p＜0.05)(图12b)。

③高葡萄糖培养条件下的细胞存活率

导入基因后培养24小时的细胞暴露于30mM葡萄糖(是通常浓度的6倍左右)再培养24小时。使用实施例7记载的MTT法测定细胞存活率。导入AOP-1基因的细胞的细胞存活率相对于对照有意义增加(p＜0.05)。然而在导入CuZn-SOD组虽然表现出细胞存活率改善倾向，但从统计学上看无意义。

另外在导入TSA基因的细胞中，相对于对照存活率没有差别(图12c)。高葡萄糖培养基培养类似于糖尿病时高血糖状态，AOP-1对与糖尿病有关的合并症也有效。

实施例16：AOP-1对心脏的保护作用

对大鼠心脏进行AOP-1表达腺病毒改变载体感染。同时使用稀释液(生理盐水)制作只进行感染操作的Sham组。感染方法按照文献(circulation 2001 Vol.104 1424-1429)报道进行。对导入后4-5天动物进行饲养后，供Langendorff法缺血再灌注实验用。用戊巴比妥钠(50mg/kg，i.p.)麻醉，从尾静脉注入肝素(heparin)(500U/kg)。开胸后，心脏与肺一起摘出，将插管插入大动脉后，利用Langendorff法(70mmHg定压灌流)进行灌流。将连接在压力交换器的乳胶气球从左心耳插入左心室内，测定左心室压。向气球内充水使左心室舒张末期压约为5mmHg。灌流液使用modified KrebsHenseleit bicarbonate buffer(mM：NaCl 118，KCl 4.7，CaCl₂1.25，MgSO₄ 1.2，KH₂PO₄ 1.2，NaHCO₃ 25.0，葡萄糖11.0)。通过起博器将右心房在约280bpm下起博，使心博数保持一定。

通过使灌流液停止35分钟，实施缺血，然后再灌注30分钟，制作缺血再灌注损伤。在缺血前和再灌注30分钟后测定左心室压，求心功能恢复率。另外测定从缺血开始直至产生缺血僵硬为止的时间。表明缺血僵硬与心肌细胞ATP枯竭有密切关系(J Mol Cell Cardiol1996，Vol.28，1045-1057)。通过测定释放到心灌流液中乳酸脱氢酶(LDH)活性(再灌注后1～30分钟)，比较心肌细胞坏死量。

使AOP-1强制表达的心脏相对于只进行导入基因操作的Sham组的心脏，再灌注时的功能恢复有意义良好(图13a)。对从缺血开始直至产生缺血僵硬为止的时间进行计测，结果AOP-1强制表达的心脏，相对于对照组(Sham组)具有有意义延长效果(图13b)。这表明AOP-1抑制缺血时心肌细胞内的ATP减少。另外，测定缺血再灌注后释放到心灌流液中的LDH活性量，结果在AOP-1组，相对于对照组有意义的抑制LDH释放(图13c)。LDH的释放一般都作为与细胞伤害、细胞坏死相关的标志蛋白(Am J Physiol2001，Vol.280，H2313-2320)。因此认为AOP-1抑制再灌注时的细胞坏死。由上述结果可以判明AOP-1不仅对培养细胞，而且在生物体内，除了抗氧化作用以外，还通过新的线粒体活化作用，对缺血伤害、再灌注伤害都有保护作用。

实施例17：AOP-1对脑的保护作用

使用实施例10-c制作脑损伤模型的手法，向脑海马内注入8.5×10⁶PFU的AOP-1表达腺病毒改变载体。注入72后小时，在同一部位象实施例10c那样注入鹅羔氨酸。作为对照组，制作导入β-半乳糖苷酶基因组，同样实施鹅羔氨酸处理。72小时后回收组织切片用样品，12天后进行periferal benzodiazephine binding site(PTBBS)解析用样品回收。所谓PTBBS解析是以对benzodiazephine的结合性作为指标的神经胶质细胞的增殖和游走的定量解析方法。该方法一般都用作对由于神经细胞死亡引起神经胶质细胞活化、游走增殖的所谓神经胶质细胞瘤进行测定的方法(Journal of Neuroimmunology 2000 Vol.1009 105-111，BrainResearch 1991 Vol.565 312-320)。使用切片用的样品，利用冷冻切片法制作厚10μm切片，供神经细胞特异染色方法的尼斯耳氏染色用。PTBBS解析用的样品通过密闭式组织破碎器破坏海马，制作组织溶解液。用实施例1-3记载的方法求蛋白质浓度。将氚标记的benzodiazephine与组织溶解液混合，于37℃下进行1小时结合反应。然后将蛋白质和与蛋白质结合的氚标记的benzodiazephine加到玻璃纤维滤膜收集，洗涤除去没有结合的氚标记的benzodiazephine。对上述玻璃纤维滤膜的放射能进行定量。在PTBBS解析中相对于对照组(β-半乳糖苷酶表达组)，导入AOP-1基因组有意义地抑制神经胶质细胞的增殖和游走(图14a)。另外，对组织切片中神经细胞进行特异染色，可知相对于对照组，在导入AOP-1基因组，神经细胞被定性保护(图14b)。通过上述解析判明AOP-1具有保护脑神经细胞的效果。

实施例18：AOP-1对肾的保护作用

从7周龄雌性Wister大鼠摘出一侧肾，注入Thy-1抗体。注入Thy-1抗体后立即向部分动物的静脉内注入强制表达AOP-1或β-半乳糖苷酶的腺病毒载体。每周进行一次腺病毒载体感染，共计进行3次。Thy-1致敏后，于第3天、7天、14天、28天回收血液样品，进行血中尿素氮量(BUN)的解析。于28天后进行组织回收，通过糖蛋白染色法的PAS染色得到组织图像。在组织图像解析结果导入AOP-1基因组中的一个体中，由于与处于Thy-1肾炎的其他个体所见进行比较之后发现人为的病因，并且在通过抛弃测定(Thompson)对Day7的BUN解析的结果进行解析时也被抛弃，所以从解析中除去。

图15a表示了血中BUN量随时间的变化。在Day7，sham组(没有引起Thy-1肾炎、没有导入基因组)与Vehicle组(引起Thy-1肾炎、没有导入基因组)之间存在有意义差别，而在其他所有时期内Vehicle组、sham组间看不到有意义差别。关注Day7的结果(图15b)，结果表明相对于Vehicle组在AOP-1基因导入组间看到有意义保护作用。而导入AOP-1组相对于Sham组没有看到有意义差别。图15c给出了典型的组织图像。在Vehicle导入组，在方框围起来的部位中看到大范围的肾小管的萎缩图像，正常肾小管几乎不存在，而在Sham组中完全看不到伤害。在AOP-1导入组中用方框围起来的部位也能看到肾小管萎缩，但由于其范围与Vehicle组相比很局限，因此正常肾小管占绝对多数。用圆圈围起来的部位表示肾小球。将Sham组和Vehicle组进行比较，看到的色素沉着(深紫色的部位：*标记)范围很大。将AOP-1导入组和Vehicle组进行比较，该色素沉着在AOP-1组中少。该色素沉着表示肾小球膜细胞的增殖。表明肾小球膜细胞是伴随有肾小球伤害出现的(Lab.Invest.1992 Vol.66485-497)，另外也表明过量的肾小球膜细胞增殖会诱导由于肾小球硬化引起的功能损伤(Kidney international 1995 Vol.48 111-117)。因此色素沉着的抑制，即肾小球膜细胞的增殖抑制可以认为是AOP-1保护肾功能的结果。由以上结果可以判明AOP-1具有抑制肾损伤的能力。

                        序列表

<110>第一三得利制药株式会社

株式会社第一三得利生物医学研究所

<120>伴随有AOP-1基因或AOP-1的表达减少的疾病的治疗方法以及该疾病的治疗药

<130>YCT-687

<160>30

<210>1

<211>1542

<212>mRNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>1

ctgaagatgg cggctgctgt aggacggttg ctccgagcgt cggttgcccg acatgtgagt   60

gccattcctt ggggcatttc tgccactgca gccctcaggc ctgctgcatg tggaagaacg  120

agcttgacaa atttattgtg ttctggttcc agtcaagcaa aattattcag caccagttcc  180

tcatgccatg cacctgctgt cacccagcat gcaccctatt ttaagggtac agccgttgtc  240

aatggagagt tcaaagacct aagccttgat gactttaagg ggaaatattt ggtgcttttc  300

ttctatcctt tggatttcac ctttgtgtgt cctacagaaa ttgttgcttt tagtgacaaa  360

gctaacgaat ttcacgatgt gaactgtgaa gttgtcgcag tctcagtgga ttcccacttt  420

agccatcttg cctggataaa tacaccaaga aagaatggtg gtttgggcca catgaacatc  480

gcactcttgt cagacttaac taagcagatt tcccgagact acggtgtgct gttagaaggt  540

tctggtcttg cactaagagg tctcttcata attgacccca atggagtcat caagcatttg  600

agcgtcaacg atctcccagt gggccgaagc gtggaagaaa ccctccgctt ggtgaaggcg  660

ttccagtatg tagaaacaca tggagaagtc tgcccagcga actggacacc ggattctcct  720

acgatcaagc caagtccagc tgcttccaaa gagtactttc agaaggtaaa tcagtagatc  780

acccatgtgt atctgcacct tctcaactga gagaagaacc acagttgaaa cctgctttta  840

tcattttcaa gatggttatt tgtagaaggc aaggaaccaa ttatgcttgt attcataagt  900

attactctaa atgttttgtt tttgtaattc tggctaggac cttttaaaca tggttagttg  960

ctagtacagg aatcgtttat tggtaacatc ttggtggctg gctagctagt ttctacagaa 1020

cataatttgc ctctatagaa ggctattctt agatcatgtc tcaatggaaa cactcttctt 1080

tcttagcctt acttgaatct tgcctataat aaagtagagc aacacacatt gaaagcttct 1140

gatcaacggt cctgaaattt tcatcttgaa tgtctttgta ttaaactgaa ttttctttta 1200

agctaacaaa gatcataatt ttcaatgatt agccgtgtaa ctcctgcaat gaatgtttat 1260

gtgattgaag caaatgtgaa tcgtattatt ttaaaaagtg gcagagtgac ttaactgatc 1320

atgcatgatc cctcatccct gaaattgagt ttatgtagtc attttactta ttttattcat 1380

tagctaactt tgtctatgta tatttctaga tattgattag tgtaatcgat tataaaggat 1440

atttatcaaa tccagggatt gcattttgaa attataatta ttttctttgc tgaagtattc 1500

attgtaaaac atacaaataa catatttaaa caaaaaaaaa aa                    1542

<210>2

<211>1433

<212>mRNA

<213>大鼠(Rattus norvegicus)

<400>2

gctatcgtgg ctcttgcgtt ctctgaagat ggcggcagct gcgggaaggt tgctctggtc   60

ctcggtggct cggcctgcga gcactatttt ccggagtatt tctgcctcaa cagttcttag  120

gcctgttgct tctagaagaa cctgcttgac agacatgctg tggtctgcct gtccccaagc 180 aaagtttgcc tttagcacca

gttcttcatt ccacacccct gctgtcaccc agcatgcgcc   240

ccattttaaa ggtactgctg ttgtcaatgg agagttcaaa gagctgagtc tcgacgactt  300

taaggggaaa tacttggtgc ttttcttcta ccctttggat ttcacatttg tgtgtcctac  360

agaaattgtt gctttcagtg acaaagccaa tgagtttcat gacgtaaact gtgaagtagt  420

tgcggtttct gtggattccc acttcagtca tcttgcctgg atcaacacgc caagaaagaa  480

tggtggtttg ggccacatga acatcacgct gttgtcggac ttaactaagc agatatcccg  540

agactacgga gtactgttgg aaagtgctgg cattgcgctc agaggtctct tcattattga  600

ccctaatggt gtcatcaagc acctgagtgt caatgacctt ccggtgggcc gaagtgtgga  660

agaaccactc cgtttggtaa aggcgttcca gtttgtggag acccatggag aagtctgccc  720

acccaactgg acaccagagt cccctacgat caagccaagt ccaacagctt caaaagagta  780

ctttgagaag gtccatcaat aataggtcat cctatgtctg ctggtttacc tgaagcttct  840

catgccaaaa gagagcccca gctggaatcc tgaagattat ttatagaatg gcaaaaacct  900

caccatgctt gtgtttataa gtactgctcc atgggctttg taattttaag acaggttcag  960

gttaaaggtg gccagctcct tccatagctg tccttactag ggacttcttg atggctacca 1020

attctctaca agtgcttggt ccccatttct tagatcatgt cttcagaggg ttaagatttc 1080

ttagcctgcc ctgaagcttg gtctacagtg aagtagcaca tagcaccagt acttagtgaa 1140

atgaagtagc acatagcgcc agcacttagt gaaatgaagt agcatatagt gccagcactt 1200

agtgaaagct tctgatcaag gtcctgaaat ttcctcttgg atttttgtta attatgctga 1260

atttcccatt attttttagt gtagtcatta actcacagtg tccttgtgtg ttctaaggta 1320

ttgatgagtt ataatcatga aggactatgt ttctaaaaca ctatgtcatt ttcttttctt 1380

caagtgctgg atgtaaagaa taaaaataaa cattaagata aaaaaaaaaa aaa        1433

<210>3

<211>1382

<212>mRNA

<213>小鼠

<400>3

ctactcctcg gtatctccgc ctatcgtgcc tcttgcgtgc tctgaagatg gcggcagctg   60

cgggaaggtt gctctggtcc tcggttgctc gtcatgcaag tgctatttcc cggagtattt  120

ctgcctcaac agttcttagg cctgttgctt ctagaagaac ctgtttgaca gacatactgt  180

ggtctgcctc tgcccaagga aagtcagcct ttagcaccag ttcctctttc cacacccctg  240

ctgtcaccca gcacgcgccc tattttaaag gtactgctgt tgtcaatgga gagttcaaag  300

agctgagtct cgacgacttt aagggaaaat acttggtgct tttcttctac cctttggatt  360

tcacatttgt gtgtcctaca gaaattgttg ctttcagtga caaagccaat gaatttcatg  420

atgtaaactg tgaagtagtt gcagtttcag tggattccca cttcagtcat cttgcctgga  480

tcaacacacc aagaaagaat ggtggtttgg gccacatgaa catcacactg ttgtcggata  540

taactaagca gatatcccga gactacggag tgctgttgga aagtgctggc attgcactca  600

gaggtctctt cattattgac cctaatggtg tcgtcaagca cctgagtgtc aacgaccttc  660

cggtgggccg cagtgtggaa gaaacactcc gtttggtaaa ggcgttccag tttgtagaga  720

cccatggaga agtctgccca gccaactgga caccagagtc ccctacgatc aagccaagtc  780

caacagcttc caaagagtac tttgagaagg tccatcagta ggccatccta tgtctgcaat  840

tacctgaagc ttttcaggcc aaaaaagagc cccagctgga atccttccaa tgccttgaag  900

attatttata gaatggcaaa acctcattat gtttgtgttt ataagtactg ctccacaggc  960

tttgtaattc taagacaggt tcaggctctc taaaggtggc tagctgcttc catagctgcc 1020

cttactaggg acttcttggt ggctaaccaa ttctccccga gtgctttgcc cccatttctt 1080

ggatcatgtc cttagagggt aagcattctt tcccttagcc tgccctgaac cttggtctac 1140

agtgaagtag cacatagtgc cagtacttgg tgaaatgaag tagcacatag caccagcact 1200

taatggaagc ttctgatcaa ggtcctaaaa tttcctcttg aatttttgtg aattatgctg 1260

aatttccctt tttttttttt taaacagtgt ccttgtgtgt tctgaggtat tgaagaggta 1320

taatcatgaa ggactatgtc taatccataa gtcattttct tcaagagctg gatatataga 1380

at                                                                1382

<210>4

<211>256

<212>PRT

<213>人类

<400>4

Met Ala Ala Ala Val Gly Arg Leu Leu Arg Ala Ser Val Ala Arg His

                  5                  10                  15

Val Ser Ala Ile Pro Trp Gly Ile Ser Ala Thr Ala Ala Leu Arg Pro

             20                  25                  30

Ala Ala Cys Gly Arg Thr Ser Leu Thr Asn Leu Leu Cys Ser Gly Ser

         35                  40                  45

Ser Gln Ala Lys Leu Phe Ser Thr Ser Ser Ser Cys His Ala Pro Ala

     50                  55                  60

Val Thr Gln His Ala Pro Tyr Phe Lys Gly Thr Ala Val Val Asn Gly

 65                  70                  75                  80

Glu Phe Lys Asp Leu Ser Leu Asp Asp Phe Lys Gly Lys Tyr Leu Val

                 85                  90                  95

Leu Phe Phe Tyr Pro Leu Asp Phe Thr Phe Val Cys Pro Thr Glu Ile

            100                 105                 110

Val Ala Phe Ser Asp Lys Ala Asn Glu Phe His Asp Val Asn Cys Glu

        115                 120                 125

Val Val Ala Val Ser Val Asp Ser His Phe Ser His Leu Ala Trp Ile

    130                 135                 140

Asn Thr Pro Arg Lys Asn Gly Gly Leu Gly His Met Asn Ile Ala Leu

145                 150                 155                 160

Leu Ser Asp Leu Thr Lys Gln Ile Ser Arg Asp Tyr Gly Val Leu Leu

                165                 170                 175

Glu Gly Ser Gly Leu Ala Leu Arg Gly Leu Phe Ile Ile Asp Pro Asn

            180                 185                 190

Gly Val Ile Lys His Leu Ser Val Asn Asp Leu Pro Val Gly Arg Ser

        195                 200                 205

Val Glu Glu Thr Leu Arg Leu Val Lys Ala Phe Gln Tyr Val Glu Thr

    210                 215                 220

His Gly Glu Val Cys Pro Ala Asn Trp Thr Pro Asp Ser Pro Thr Ile

225                 230                 235                 240

Lys Pro Ser Pro Ala Ala Ser Lys Glu Tyr Phe Gln Lys Val Asn Gln

                245                 250                 255

<210>5

<211>257

<212>PRT

<213>大鼠

<400>5

Met Ala Ala Ala Ala Gly Arg Leu Leu Trp Ser Ser Val Ala Arg Pro

                  5                  10                  15

Ala Ser Thr Ile Phe Arg Ser Ile Ser Ala Ser Thr Val Leu Arg Pro

             20                  25                  30

Val Ala Ser Arg Arg Thr Cys Leu Thr Asp Met Leu Trp Ser Ala Cys

         35                  40                  45

Pro Gln Ala Lys Phe Ala Phe Ser Thr Ser Ser Ser Phe His Thr Pro

     50                  55                  60

Ala Val Thr Gln His Ala Pro His Phe Lys Gly Thr Ala Val Val Asn

 65                  70                  75                  80

Gly Glu Phe Lys Glu Leu Ser Leu Asp Asp Phe Lys Gly Lys Tyr Leu

                 85                  90                  95

Val Leu Phe Phe Tyr Pro Leu Asp Phe Thr Phe Val Cys Pro Thr Glu

            100                 105                 110

Ile Val Ala Phe Ser Asp Lys Ala Asn Glu Phe His Asp Val Asn Cys

        115                 120                 125

Glu Val Val Ala Val Ser Val Asp Ser His Phe Ser His Leu Ala Trp

    130                 135                 140

Ile Asn Thr Pro Arg Lys Asn Gly Gly Leu Gly His Met Asn Ile Thr

145                 150                 155                 160

Leu Leu Ser Asp Leu Thr Lys Gln Ile Ser Arg Asp Tyr Gly Val Leu

                165                 170                 175

Leu Glu Ser Ala Gly Ile Ala Leu Arg Gly Leu Phe Ile Ile Asp Pro

            180                 185                 190

Asn Gly Val Ile Lys His Leu Ser Val Asn Asp Leu Pro Val Gly Arg

        195                 200                 205

Ser Val Glu Glu Pro Leu Arg Leu Val Lys Ala Phe Gln Phe Val Glu

    210                 215                 220

Thr His Gly Glu Val Cys Pro Pro Asn Trp Thr Pro Glu Ser Pro Thr

225                 230                 235                 240

Ile Lys Pro Ser Pro Thr Ala Ser Lys Glu Tyr Phe Glu Lys Val His

                245                 250                 255

Gln

<210>6

<211>257

<212>PRT

<213>小鼠

<400>6

Met Ala Ala Ala Ala Gly Arg Leu Leu Trp Ser Ser Val Ala Arg His

                  5                  10                  15

Ala Ser Ala Ile Ser Arg Ser Ile Ser Ala Ser Thr Val Leu Arg Pro

             20                  25                  30

Val Ala Ser Arg Arg Thr Cys Leu Thr Asp Ile Leu Trp Ser Ala Ser

         35                  40                  45

Ala Gln Gly Lys Ser Ala Phe Ser Thr Ser Ser Ser Phe His Thr Pro

     50                  55                  60

Ala Val Thr Gln His Ala Pro Tyr Phe Lys Gly Thr Ala Val Val Asn

 65                  70                  75                  80

Gly Glu Phe Lys Glu Leu Ser Leu Asp Asp Phe Lys Gly Lys Tyr Leu

                 85                  90                  95

Val Leu Phe Phe Tyr Pro Leu Asp Phe Thr Phe Val Cys Pro Thr Glu

            100                 105                 110

Ile Val Ala Phe Ser Asp Lys Ala Asn Glu Phe His Asp Val Asn Cys

        115                 120                 125

Glu Val Val Ala Val Ser Val Asp Ser His Phe Ser His Leu Ala Trp

    130                 135                 140

Ile Asn Thr Pro Arg Lys Asn Gly Gly Leu Gly His Met Asn Ile Thr

145                 150                 155                 160

Leu Leu Ser Asp Ile Thr Lys Gln Ile Ser Arg Asp Tyr Gly Val Leu

                165                 170                 175

Leu Glu Ser Ala Gly Ile Ala Leu Arg Gly Leu Phe Ile Ile Asp Pro

            180                 185                 190

Asn Gly Val Val Lys His Leu Ser Val Asn Asp Leu Pro Val Gly Arg

        195                 200                 205

Ser Val Glu Glu Thr Leu Arg Leu Val Lys Ala Phe Gln Phe Val Glu

    210                 215                 220

Thr His Gly Glu Val Cys Pro Ala Asn Trp Thr Pro Glu Ser Pro Thr

225                 230                 235                 240

Ile Lys Pro Ser Pro Thr Ala Ser Lys Glu Tyr Phe Glu Lys Val His

                245                 250                 255

Gln

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

tgcagtttca gtggattccc a

<210>8

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

ttcatgtggc ccaaacca

<210>9

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

tcttgcctgg atcaacacac caagaaag

<210>10

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

ccctctgctt gctgatgtga ct

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

cctgtaagcg atgccctcat

<210>12

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

agcttgtccc agaattacgg cgtgttgaa

<210>13

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

gcggatgaag agaggcatg

<210>14

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

gccacaccgt cctttcca

<210>15

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

tggagacctg ggcaatgtgg ctg

<210>16

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

acgggtgctc agcctcc

<210>17

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>17

aggcttgtgc cctgcttc

<210>18

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>18

cagcctgcac tgaggagatc cctca

<210>19

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>19

aaccgcggtc gtggctcttg cgttctct

<210>20

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>20

gcgctagctt attgatggac cttctcaaag

<210>21

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>21

ttacagattg ccgcctgctc

<210>22

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>22

ccagcagtgg aataaggcct

<210>23

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>23

aatcacgacc cactgcaagg aacca

<210>24

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>24

tgcaccacca actgcttag

<210>25

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>25

ggatgcaggg atgatgttc

<210>26

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>26

cagaagactg tggatggccc ctc

<210>27

<211>877

<212>mRNA

<213>大鼠

<400>27

gaattcggca cgagggtcgt ccgcgtgtcc ggctcttgcc cacgcagtca tggcctccgg   60

caacgcgcac atcggaaagc ctgcccctga cttcacgggc accgccgtgg tggatggtgc  120

ctttaaggaa atcaagcttt cagactacag agggaagtac gtggtcctct ttttctatcc  180

actggacttc acttttgttt gccccacgga gatcatcgct tttagcgacc acgctgagga  240

cttccgaaag ctaggctgcg aggtgctggg agtgtctgtg gactctcagt tcacccacct  300

ggcctggatc aataccccac ggaaggaggg aggcttgggc ccactgaata tccctctgct  360

tgctgatgtg actaaaagct tgtcccagaa ttacggcgtg ttgaaaaatg atgagggcat  420

cgcttacagg ggcctcttta tcatcgatgc caagggtgtc cttcgccaga tcacagtcaa  480

cgacctacct gtgggacgct ctgtagatga ggctctccgc ctcgtccagg cctttcagta  540

tacagatgag catggggaag tctgtcctgc tggctggaag cccggcagtg acaccatcaa  600

acccaatgtg gatgacagca aggaatactt ctccaaacac aactgagatg ggtaaacatc  660

ggtgagcctg aatcccggat ctcacctgcg cccttacctg gatgtcctgt gctggcccag  720

aaaacgctag atcttcctct acattctaaa ggggctggag gctaggccga ggctttctca  780

ttacccacct ggaatctggt gaatagtgac cctgccctga gcacacccag ctgggcccag  840

gtctatagga aaccaataaa gtattaggga cagtgta                           877

<210>28

<211>198

<212>PRT

<213>大鼠

<400>28

Met Ala Ser Gly Asn Ala His Ile Gly Lys Pro Ala Pro Asp Phe Thr

                  5                  10                  15

Gly Thr Ala Val Val Asp Gly Ala Phe Lys Glu Ile Lys Leu Ser Asp

             20                  25                  30

Tyr Arg Gly Lys Tyr Val Val Leu Phe Phe Tyr Pro Leu Asp Phe Thr

         35                  40                  45

Phe Val Cys Pro Thr Glu Ile Ile Ala Phe Ser Asp His Ala Glu Asp

     50                  55                  60

Phe Arg Lys Leu Gly Cys Glu Val Leu Gly Val Ser Val Asp Ser Gln

 65                  70                  75                  80

Phe Thr His Leu Ala Trp Ile Asn Thr Pro Arg Lys Glu Gly Gly Leu

                 85                  90                  95

Gly Pro Leu Asn Ile Pro Leu Leu Ala Asp Val Thr Lys Ser Leu Ser

            100                 105                 110

Gln Asn Tyr Gly Val Leu Lys Asn Asp Glu Gly Ile Ala Tyr Arg Gly

        115                 120                 125

Leu Phe Ile Ile Asp Ala Lys Gly Val Leu Arg Gln Ile Thr Val Asn

    130                 135                 140

Asp Leu Pro Val Gly Arg Ser Val Asp Glu Ala Leu Arg Leu Val Gln

145                 150                 155                 160

Ala Phe Gln Tyr Thr Asp Glu His Gly Glu Val Cys Pro Ala Gly Trp

                165                 170                 175

Lys Pro Gly Ser Asp Thr Ile Lys Pro Asn Val Asp Asp Ser Lys Glu

            180                 185                 190

Tyr Phe Ser Lys His Asn

    195

<210>29

<211>560

<212>mRNA

<213>人

<400>29

atggcgacga aggccgtgtg cgtgctgaag ggcgacggcc cagtgcaggg catcatcaat   60

ttcgagcaga aggaaagtaa tggaccagtg aaggtgtggg gaagcattaa aggactgact  120

gaaggcctgc atggattcca tgttcatgag tttggagata atacggcagg ctgtaccagt  180

gcaggtcctc actttaatcc tctatccaga aaacacggtg ggccaaagga tgaagagagg  240

catgttggag acttgggcaa tgtgactgct gacaaagatg gtgtggccga tgtgtctatt  300

gaagattctg tgatctcact ctcaggagac cattgcatca ttggccgcac actggtggtc  360

catgaaaaag cagatgactt gggcaaaggt ggaaatgaag aaagtacaaa gacaggaaac  420

gctggaagtc gtttggcttg tggtgtaatt gggatcgccc aataaacatt cccttggatg  480

tagtctgagg ccccttaact catctgttat cctgctagct gtagaaatgt atcctgataa  540

acattaaaca ctgtaatctt                                              560

<210>30

<211>154

<212>PRT

<213>人

<400>30

Met Ala Thr Lys Ala Val Cys Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val Gln

                  5                  10                  15

Gly Ile Ile Asn Phe Glu Gln Lys Glu Ser Asn Gly Pro Val Lys Val

             20                  25                  30

Trp Gly Ser Ile Lys Gly Leu Thr Glu Gly Leu His Gly Phe His Val

         35                  40                  45

His Glu Phe Gly Asp Asn Thr Ala Gly Cys Thr Ser Ala Gly Pro His

     50                  55                  60

Phe Asn Pro Leu Ser Arg Lys His Gly Gly Pro Lys Asp Glu Glu Arg

 65                  70                  75                  80

His Val Gly Asp Leu Gly Asn Val Thr Ala Asp Lys Asp Gly Val Ala

                 85                  90                  95

Asp Val Ser Ile Glu Asp Ser Val Ile Ser Leu Ser Gly Asp His Cys

            100                 105                 110

Ile Ile Gly Arg Thr Leu Val Val His Glu Lys Ala Asp Asp Leu Gly

        115                 120                 125

Lys Gly Gly Asn Glu Glu Ser Thr Lys Thr Gly Asn Ala Gly Ser Arg

    130                 135                 140

Leu Ala Cys Gly Val Ile Gly Ile Ala Gln

145                 150

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