一种克服基因型障碍的小麦组织培养方法

摘要

一种克服基因型障碍的小麦组织培养方法。本发明选择幼穗作为适宜的外植体；找出了幼穗的最佳发育时期，为护颖分化期到雌雄蕊原基分化期。研究出了不同培养时期各个适宜的培养基与培养条件。本发明通过选择适宜外植体、调整培养基成分和配套改进措施，可有效克服小麦组织培养中基因型障碍问题，大幅度提高植株再生频率和组织培养效率。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种克服基因型障碍的小麦组织培养方法。

背景技术：

目前，转基因小麦的研究基本处于建立和优化转基因体系阶段，与水稻、玉米相比研究差距很大。主要原因之一是小麦转基因受体的植株再生频率偏低和基因型障碍，这已经成为限制小麦转基因成功的瓶颈。植株再生频率高的小麦品种，无论用基因枪法还是农杆菌法都已经得到转基因植株，而植株再生频率差的品种即使用基因枪法也无法得到转基因植株。正是由于品种的基因型差异而导致的再生频率问题，使全世界的转基因小麦研究大都集中在诸如Bobwhite、Pavon等少数基因型上，而这类基因型综合性状往往不够理想，较难在生产中应用。

作为小麦基因转化的受体，取决于所用的转基因方法。因为未成熟胚及其愈伤组织具有相对较强的再生能力，作为受体较容易再生出转基因植株，目前未成熟胚及其衍生物被公认并被广泛采用。如文献(Vasil V，et al，Bio/Technology，1992，10：667-674)以长期培养的胚性愈伤组织为外植体，通过基因枪将GUS/Bar基因导入小麦品种“Pavon”，获得对除草剂Basta具有抗性的再生植株及其后代。但是，这个受体系统的植株再生频率仍然偏低，且仍较明显地受品种基因型的制约，特别是有接近20％的基因型很难得到再生植株。还有人在小麦组织培养中选择小花分化至四分体形成期的幼穗作为外植体，但其结果并不比传统的未成熟胚及其衍生物受体材料优越(舒理慧，科学通报，1982，14：882-884；陈梁鸿等，华北农学报，1998，13：1-5)。

先前研究者大多只选择了1个或几个品种基因型为材料，由于研究的品种数量小，不具代表性，这些研究均难以回答和解决基因型障碍问题。因此，提高小麦转基因受体的植株再生频率和克服基因型障碍，是获得小麦转基因成功的重要因素。

发明内容

本发明要解决的技术问题是选择适宜外植体及培养条件，以提高小麦转基因受体的植株再生频率和克服基因型障碍

本发明研究了不同发育时期的幼穗对离体培养的反应。

本发明选用了5个品种(品系)植物材料。取材时期分别为二棱期(1mm)、护颖原基形成期(2mm)、小花原基形成期(2.5mm)、雌雄蕊原基形成期(4mm)、药隔分化期(6mm)和四分体形成期(10mm)，对这些时期的幼穗进行离体培养，在分化培养之后增加了一个芽苗的诱导及伸长阶段。

比较不同时期幼穗的愈伤组织诱导率和绿苗分化率，结果表明，护颖期、小花分化期、雌雄蕊原基分化期的幼穗，不仅愈伤组织诱导率高，而且分化绿苗也较多，说明小麦幼穗离体培养的适宜时期是护颖分化期到雌雄蕊原基分化期

1、选择幼穗作为适宜的外植体；

2、找出了幼穗的最佳发育时期，为护颖分化期到雌雄蕊原基分化期，即幼穗长度为2～3mm；

3、研究出了不同培养时期各个适宜的培养基与培养条件如下：

诱导培养基为MS+2、4-D(2mg/l)；

分化培养基为MS基本培养基；

壮根培养基为1/2MS+IAA2mg/l。

芽苗伸长培养基为MS+NAA0.2mg/l+BA1.5mg/l。

培养条件：

愈伤组织诱导期室温(25±1)℃，暗培养；

绿苗分化期室温(26±1)℃，12h/d光培养，光照度为1500-2000lx。

4、围绕保证愈伤组织发生过程中形态建成的完整和正常，适当延长脱分化过程，在分化潜力高峰期转入再生培养。

本发明通过选择适宜外植体、调整培养基成份和配套改进措施，可有效克服小麦组织培养中基因型障碍问题，大幅度提高植株再生频率和组织培养效率。在76个基因型的试验中，适时幼穗的愈伤组织的平均诱导频率达到98％以上，比未成熟胚的绝对百分比高29％，愈伤组织平均植株再生频率达到71％，比未成熟胚的绝对百分比高54％，所有参试的基因型均能获得再生植株。

具体实施方式

实施例1 不同发育时期的幼穗对离体培养的反应

A植物材料：选用6756、8581、H89、311和1772共5个品种(品系)。

B取材时期：分别对二棱期(1mm)、护颖原基形成期(2mm)、小花原基形成期(2.5mm)、雌雄蕊原基形成期(4mm)、药隔分化期(6mm)和四分体形成期(10mm)时期的幼穗进行离体培养，其中，药隔期和四分体期幼穗切成2-3段培养。接种前用0.1％HgCl₂消毒8-10分钟，无菌水冲洗3-5次，用镊子与解剖针剥离出幼穗，接种于诱导培养基上。

C培养基

诱导培养基为MS+2、4-D(2mg/l)；

分化培养基为MS基本培养基；

芽苗伸长培养基为MS+NAA0.2mg/l+BA1.5mg/l；

壮根培养基为1/2MS+IAA2mg/l。

D培养条件：

愈伤组织诱导期室温(25±1)℃，暗培养；

绿苗分化期室温(26±1)℃，12h/d光培养，光照度为1500-2000lx。

操作步骤：

①接种前选好材料，用0.1％HgCl₂消毒8-10分钟，无菌水冲洗3-5次，用镊子与解剖针剥离出幼穗，接种于诱导培养基上25-30天，诱导愈伤组织；

②愈伤组织转接到分化培养基上25-30天；

③在芽苗伸长培养基上培养25-30天，诱导芽苗长出及伸长。

④待苗长至3cm左右高时，将绿苗转至壮根培养基上；

⑤比较不同时期幼穗的愈伤组织诱导率和绿苗分化率。

结果见表1和表2：

                表1  小麦不同时期出愈率的比较

                      护颖原基  小花原基    雌雄蕊原    药隔      四分体

品种       二棱期

                      形成期    形成期      基形成期    分化期    形成期

6756       97.4       100       100         96.7        95.8      96

8581       -          92.9      96.9        100         100       93.2

H89        96         98.8      100         98.4        100       92

311        -          100       100         100         98.5      100

1772       98.8       100       100         100         98.7      97.2

                表2小麦不同时期绿苗分化率的比较

品种      二棱期     护颖原基形 小花原基形  雌雄蕊原基  药隔期    四分体

          成期       成期       形成期                            时期

6756      18.4       68.8       54.9        40.4        32.4      34.2

8581      -          49         53.7        51.9        27.4      -

H89       2          5.1        18.8        27          18.7      4.2

311     -      54.6    40.6    45.4    36.4    26.7

1779    16    133      19.4    38.9    26.6    26.5

从上表中看出，二棱期、药隔期和四分体时期的幼穗虽然都能诱导出愈伤组织，但状态不好，绿苗分化的频率较低。

护颖期、小花分化期、雌雄蕊原基分化期的幼穗，不仅愈伤组织诱导率高，而且分化绿苗也较多，

结论：小麦幼穗离体培养的适宜时期是护颖分化期到雌雄蕊原基分化期。

实施例2不同外植体对离体培养的反应

A适期幼穗选材与培养方法同上；

B未成熟胚选材与培养方法

操作步骤：a.取开花后14天未成熟胚，用0.1％HgCl₂消毒8-10分钟，无菌水冲洗3-5次，用镊了与解剖针剥离出幼胚，接种于诱导培养基上暗培养25-30天；b.愈伤组织转接于分化培养基上进行分化(25-30天)；c.绿苗转接于壮根培养基上。

培养基与培养条件：诱导培养基为MS+2、4-D(2mg/1)；分化培养基为MS基本培养基；壮根培养基为1/2MS+IAA2mg/l。愈伤组织诱导期室温(25±1)℃，暗培养；绿苗分化期室温(26±1)℃，12h/d光培养，光照度为1500-2000lx。

C试验方法

选用24个品种(品系)的适期幼穗和未成熟胚作为外植体，并围绕保证愈伤组织发生过程中形态建成的完整和正常，适当延长脱分化过程，在分化潜力高峰期转入再生培养，比较研究了24个品种(品系)适期幼穗和未成熟胚的愈伤组织诱导率和绿苗分化率。

D试验结果

不同基因型的适期幼穗和未成熟胚的愈伤组织诱导率均高，但不同外植体愈伤组织的形成及状态不同，适期幼穗接种后一周左右可见愈伤组织，淡黄色，质地较硬；未成熟胚接种后2-3天即可见愈伤组织，白色、质地松软。不同基因型对适期幼穗、未成熟胚的绿苗分化率的影响很大。24个品种的适期幼穗绿苗分化率平均为40％，最高达85％；而未成熟胚绿苗分化率平均只有10％，最高为48.72％；有近50％的品种的未成熟胚的绿苗分化率均在10％以下，其中2个品种为0(晋麦60和原冬9428)，而相对应的适期幼穗的绿苗分化率平均达到了39％(见表3)。

研究还发现，当分别用H6756品系的未成熟胚和适时幼穗作基因枪法转化的受体时，未成熟胚的未获得再生植株，而基因枪轰击后适时幼穗的植株再生频率达到37.7％。

E结论

通过选择适宜外植体、调整培养基成份和配套改进措施，可有效克服小麦组织培养中基因型障碍问题，大幅度提高植株再生频率和组织培养效率。

                     表3不同外植体对小麦离体培养的反应^*

品种名称外植体接种数出愈数 出愈率  (％) 转分化  愈伤  绿苗数 绿苗分化率    (％)98-824适时幼穗    64    64    1    59    21    0.36未成熟胚    90    90    1    90    15    0.17秦农731适时幼穗    40    40    1    23    7    0.30未成熟胚    97    92    0.95    92    4    0.04京9428适时幼穗    48    48    1    25    5    0.20未成熟胚    89    89    1    89    8    0.08临旱205适时幼穗    56    56    1    53    18    0.34未成熟胚    100    96    0.96    96    18    0.19晋麦60适时幼穗    56    56    1    46    13    0.28未成熟胚    96    94    0.98    96    0    0济南17适时幼穗    55    55    1    47    20    0.43未成熟胚    84    84    1    84    2    0.02豫农9233适时幼穗    47    47    1    32    12    0.38未成熟胚    96    96    1    96    13    0.14935031适时幼穗    64    64    1    56    12    0.21未成熟胚    87    87    1    75    10    0.13原冬9428适时幼穗    96    96    1    76    32    0.42未成熟胚    86    86    1    86    0    0.00临汾137适时幼穗    48    48    1    43    18    0.42未成熟胚    90    90    1    100    4    0.04冀Z76适时幼穗    56    56    1    47    40    0.85未成熟胚    89    89    1    89    10    0.11徐州25适时幼穗    56    56    1    44    23    0.52未成熟胚    92    92    1    92    14    0.15石98-7126适时幼穗    52    52    1    40    14    0.35未成熟胚    87    87    1    87    19    0.22晋麦61适时幼穗    47    47    1    48    27    0.56未成熟胚    96    96    1    96    4    0.04Y18适时幼穗    64    64    1    58    37    0.64未成熟胚    60    60    1    60    1    0.02中优9701适时幼穗    64    64    1    53    19    0.36未成熟胚    72    72    1    72    7    0.10农大152适时幼穗    48    48    1    40    15    0.38未成熟胚    94    62    0.66    60    6    0.10农大3197适时幼穗    48    48    1    47    16    0.34未成熟胚    88    88    1    88    7    0.08冀5066适时幼穗    54    54    1    50    19    0.38未成熟胚    92    92    1    92    7    0.08豫麦47适时幼穗    56    56    1    31    13    0.42未成熟胚    78    60    0.77    60    11    0.18高优503适时幼穗    56    56    1    54    22    0.41未成熟胚    96    96    1    96    18    0.19皖麦33适时幼穗    56    56    1    13    0.43未成熟胚    92    92    1    92    9    0.1095中44适时幼穗    61    61    1    60    17    0.28未成熟胚    91    91    1    91    13    0.14京冬10号适时幼穗    56    56    1    55    12    0.22未成熟胚    100    97    0.97    97    11    0.11

*适时幼穗的幼穗长度为2-3mm；未成熟胚为开花后14-16天的幼胚。

实施例1不同外植体对离体培养的反应

对36个品种(品系)适宜时期的幼穗和幼胚进行了愈伤组织诱导率和绿苗分化率的比较研究，结果表明，不同基因型的幼穗和幼胚的愈伤组织诱导率均高，但不同外植体愈伤组织的形成及状态不同，幼穗接种后一周左右可见愈伤组织，淡黄色，质地较硬；幼胚接种后2-3天即可见愈伤组织，白色、质地松软。基因型对幼穗、幼胚的绿苗分化率的影响很大，幼穗最高绿苗分化率可达85％(冀Z76)；幼胚最高绿苗分化率只有48.72％(藁城8901)。