人的重组白细胞介素－18（rhIL－18）的酵母表达方法及其产物

摘要

本发明公开了通过酵母的表达来生产IL－18的方法，它是利用基因工程手段将编码IL－18的基因导入酵母细胞，然后在诱导IL－18表达的条件下培养酵母细胞，最终收获表达产物。利用酵母表达IL－18有利于表达产物的纯化，可得到与天然蛋白结构完全一致的产物。

说明书

技术领域

本发明涉及酵母基因工程领域。更具体地，本发明涉及用基因工程化的酵母细胞表达白细胞介素-18(IL-18)，尤其是人的重组IL-18(rhIL-18)。

背景技术

IL-18的来源：

1989年，Nakamura等从痤疮丙酸杆菌和脂多糖(LPS)致内毒素休克的小鼠血清中分离出一种类似IL-12的因子，分子量约为75kD，有诱导IFN-γ产生的活性。1995年Okamura等发现用痤疮丙酸杆菌处理的小鼠再用抗CD3单克隆抗体刺激，可释放高水平的IFN-γ。从腹腔注射痤疮丙酸杆菌和LPS致内毒素休克的小鼠肝提取物中发现了一种均一的多肽，分子量为18.3kD，等电点为4.8，由157个氨基酸残基组成；因其可诱导IFN-γ的产生，称之为γ干扰素诱生因子(IGIF)。随着IGIF-cDNA的克隆成功，对该蛋白质的研究更加深入。由于IGIF有着与IL-1家族类似的结构同源性，有人称之为IL-1γ，但它与IL-1家族无任何功能上的相似。相反，IGIF与IL-12在功能上有相似之处，且在IFN-γ的诱生上两者有协同效应，但两者的分泌途径却各不相同。基于IGIF功能上的多效性，Ushio等建议将其命名为白细胞介素18(IL-18)。

IL-18的现有生产工艺

目前在临床试用的IL-18基因工程产物大都为大肠杆菌所表达(杜勇，王海涛：人PBMC中IL-18基因的克隆及在E.coli中的高效表达与纯化，免疫学杂志，第15卷，第4期，1999年10月)。大肠杆菌包含体表达的产物存在纯化工艺复杂，复性困难等问题，尤其是复性后产物的活性仅有天然产物的30-40％，也就是仅仅有部分产物有活性。另一个方面是大肠杆菌包含体表达的产物在结构上与天然产物不同，其分子由于大肠杆菌翻译过程的要求必须在N端加上一个甲硫氨酸(Met)。

另一种表达IL-18基因工程产物的方法是，通过中国仓鼠卵巢(CHO)细胞进行分泌表达(成军，柯亨宁等：小鼠白细胞介素18的cDNA克隆及在真核细胞中初步表达的研究，中国免疫学杂志，第16卷，2000年)。这样表达得到的IL-18有接近100％的天然蛋白活性，但是由于其成本等问题，目前在规模化产业生产过程中还不能采用。

发明内容

本发明旨在提供一种能得到活性较高的rhIL-18产物、并具有规模化产业生产应用前景的方法，以克服现有大肠杆菌表达和CHO细胞表达的不足。

为此，本发明提供了一种用酵母工程细胞进行IL-18表达的方法，包括在诱导IL-18基因表达的条件下培养含有IL-18基因的酵母细胞，并收获表达产物。

更具体地，本发明利用酵母细胞表达IL-18的方法包括：

1)选择适于大规模生产的酵母菌株作为宿主细胞；

2)将IL-18目标基因按照1)所选宿主细胞的偏好进行密码子优化；

3)将优化后的目标基因引入所述宿主细胞；

4)诱导酵母宿主细胞中的目标基因进行表达。

在如3)所述将目标基因引入宿主细胞时，为了提高成功引入的可能性，可以借助适当的表达载体，优选能使目标基因在酵母细胞中进行分泌表达的那些载体。为此，需要在将目标基因引入宿主细胞之前，构建目标基因与表达载体的构建体。从提高表达能力，即生产能力的方面考虑，可以使所述构建体包含尽可能多拷贝的目标基因。

为了保证表达产物的活性，可以将目标基因连接在酵母的信号肽酶切位点之后。从而使得表达产物能被准确酶切，得到与天然产物更为接近或完全相同活性的产物。

为了明确指示目标基因已成功引入宿主细胞，可以使所述构建体中的目标基因与报道基因相连。常用的报道基因如抗药性基因(如氨苄青霉素抗性基因，四环素抗性基因)，萤光素酶基因等。

本发明用于进行表达的宿主细胞是酵母细胞，优选糖酵母属(Saccharomyces)和毕赤酵母属(Picha)的细胞。

本发明还涉及用于通过酵母表达生产IL-18的表达系统，它包括IL-18基因，以及适于在酵母细胞中表达的启动子。在所述表达系统中，所述启动子可以选自T3/T7启动子，PHO1启动子/AOX1启动子中的一或多种。所述表达系统还可包含信号肽序列，以达到分泌表达的目的。该信号肽序列可与目标基因直接相连，也可通过本领域常用的其它接头序列相连。所述表达系统可以是一种质粒，优选pYE3载体。

本发明还包括用这种方法得到的IL-18产物。

附图说明

图1是表达载体的模式图，该载体用于在酵母细胞中表达本发明所述的重组IL-18。

图2的序列是经过酵母偏性密码子优化以后的目的基因序列。

图3是IL-18表达产物的HPLC图谱。

具体实施方式

IL-18的鉴定特征：

Okamura等从内毒素休克的小鼠肝中提纯出IL-18，经胰蛋白酶消化后获得多肽片断，根据其氨基酸序列合成了一段核苷酸作为引物，从肝脏mRNA中用反转录法克隆出cDNA片断，继而以该片断为探针从cDNA文库中筛选，获得一个编码192个氨基酸前体多肽的基因，全长约0.9kb。该多肽包括一个不常见的含35个氨基酸的前导序列，没有N-糖基化位点，推测的序列中也不包含有任何疏水的信号肽。重组的IL-18经层析柱纯化，SDS-PAGE显示其分子量为18～19kD，以单体形式表现生物学活性。Ushio等用鼠IL-18的cDNA做探针，从正常人的肝cDNA文库中分离出人IL-18的cDNA克隆。该cDNA克隆有一个大的开放读码框，长度约1.1kb，编码一个193个氨基酸的前体多肽。经分析，它与鼠的IL-18在氨基酸水平和核苷酸水平上均有65％的同源性。预测的人IL-18的氨基酸序列中也没有疏水的信号肽位点，同样它也不含有N-糖基化位点。目前普遍认为193个氨基酸的人IL-18的裂解位点是36Asp-37Tyr，成熟的IL-18的长度为157个氨基酸。它们的分子中没有N-糖基化位点，不存在二硫键，很可能巯基(-SH)就是分子的活性中心。我们通过中国人的基因家族分析，发现了结构域基本相似的多个其他IL-18亚型，具有系统的生物学活性。

IL-18的生物学作用

1)诱导Th1细胞产生IFN-γ。体外实验发现，用抗CD3单抗刺激T细胞后，单独加入IL-18或IL-12均可促进IFN-γ的产生；当IL-18与IL-12共同加入后，产生的IFN-γ可以达到非常高的水平。这表明IL-18和IL-12在诱导IFN-γ的产生上有协同效应。此外，在二者的协同效应中，IL-12主要是诱导原始T细胞分化为Th1细胞，而IL-18作为一种激活因子作用于Th1细胞，促进IFN-γ的产生。

2)促进T细胞增殖。在体外实验中，以抗CD3单抗刺激的T细胞为对象，结果发现：IL-18的加入可促进受刺激T细胞的增殖，促进IL-2和GM-CSF在T细胞的表达，并且使T细胞表达的CD25(IL-2受体α链，是活化T细胞的标志)达到最大程度。同时还观察到，T细胞的增殖可以被抗IL-2中和抗体阻止，但不被抗IFN-γ的抗体阻止。这些结果提示，IL-18促进T细胞增殖的作用为IL-2依赖性，进而增强Th1细胞产生细胞因子的能力。为了观察IL-12和IL-18在产生细胞因子上是否有协同效应，向抗CD3单抗激活的T细胞中加入IL-12和IL-18，未观察到两者在IL-2和GM-CSF产生上的协同性，仅在IFN-γ的产生上有协同效应。

3)加强FasL介导的细胞毒效应，鼠IL-18可以选择性地激活FasL介导的鼠Th1细胞，而非Th2或Th0细胞的细胞毒效应。体外培养Th0、Th1、Th2细胞，加入抗原和抗原提呈细胞，用FasL特异的引物进行PCR扩增，检测FasL的表达情况，结果只有Th0和Th1细胞表达了FasLmRNA。进一步用鼠Fas转染的细胞系A-1及其母细胞系L5178Y作靶细胞，检测FasL的功能活性，发现IL-18单独作用就可加强Th1细胞对A-1的细胞毒效应，而当IL-18和抗CD3单抗共同作用时，这种细胞毒效应被加强，但上述因素对L5178Y细胞均无作用。同样的实验在Th0和Th2细胞中也没有观察到细胞毒效应。这表明Th1细胞细胞毒效应是通过Fas而进行的。这个结论以后在Jurkat(人或鼠系统中Fas依赖的细胞毒效应的靶细胞)中被确证。抗体中和实验证明，这种细胞毒效应不是由内源性IL-18诱生的IFN-γ所介导。所有这些都有力地证明，IL-18可直接增强FasL介导的Th1细胞毒效应。

4)与IL-12共同作用诱导B细胞产生IFN-γ。抗CD40抗体刺激的B细胞加入IL-12和IL-18，可诱导产生大量IFN-γ的mRNA和蛋白。而抗CD40抗体单独刺激B细胞或加入IL-12和IL-18中的任何一个，却几乎检测不到IFN-γ的mRNA和蛋白。体内实验表明，IL-12和IL-18共同作用可诱导IFN-γ产生，抑制IgE产生，而加入抗IFN-γ抗体后，发现IgE产生增加。B细胞经CD40活化后，在IL-12和IL-18的共同刺激下，可发育成IFN-γ产生细胞，进而产生IFN-γ，并因此而抑制IgE和IgG1的产生，且在不抑制B细胞增殖的条件下增强IgG2a的产生。

IL-18的抗肿瘤作用是目前IL-18在基础和临床上研究得较多的应用。Osaki等在实验中证实IL-18能抑制各种肿瘤细胞株的生长，如黑色素瘤、纤维肉瘤等。如在肿瘤细胞移植前用IL-18能抑制肿瘤细胞株的建立。IL-18的抗肿瘤效果是由NK细胞和CD4+细胞所介导。Micallet等亦证实在肿瘤移植前用IL-18预处理，至少90％的鼠存活期延长，这种效果可因消除NK细胞活性而消除。IL-18的抗肿瘤活性也需IFN-γ参与。但Yashida等将IL-12，IL-15，IL-18的基因通过逆转录病毒导入人胰腺癌细胞(AsPC-1)，然后接种于裸鼠，发现有IL-12及IL-15表达的AsPC-1细胞与未转基因的细胞相比较生长缓慢，但IL-18表达的AsPC-1细胞并未显示任何抗肿瘤作用，转基因的细胞肿瘤生长与野生型细胞相同。由此可见，上述IL-12，IL-15及IL-18对非T细胞的分化作用可以在裸鼠上产生不同的抗肿瘤作用，虽然它们都刺激Th1型T辅助细胞。IL-18与IL-12作为IFN-γ的共刺激因子有相同的生物活性。已证实IL-12除能诱导IFN-γ外，也能提高NK细胞活性及促进T细胞增殖，因此二者在功能上有协同性，但在结构上却无同质性。IL-12由单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞产生，由P35和P40两亚单位组成。IL-12可使CD4+T细胞、NK细胞产生IFN-γ，IL-12通过淋巴细胞和非淋巴细胞改变宿主-肿瘤关系。通过CD4-T细胞的Th1亚单位的分化提高细胞免疫，上调MHC抗原表达并分泌IL-2和IFN-γ。这些细胞因子促进或激活CD8-细胞毒性T细胞(CTL)、NK细胞和巨噬细胞，这些细胞均与肿瘤消退有关。又因IFN-γ能提高抗原-非特异性免疫反应，包括直接与TNF-α结合时产生的细胞毒性使细胞增殖减慢，产生一氧化氮及抑制肿瘤血管形成，特别是通过抑制肿瘤血管形成，IL-12可激活多种抗肿瘤机制。虽然IL-18的抗肿瘤作用是由于IL-12的协同作用使IFN-γ含量升高所致，但需要指出的是IL-18与IL-12作为IFN-γ共刺激因子时它们的受体和信号传递途径不同。同时IL-18的抗肿瘤效果不依赖IFN-γ或IL-12，而IL-12的抗瘤效果依赖IFN-γ。故IL-18用于治疗肿瘤的可能性是存在的。

在其他应用方面，IL-18有多种生物学功能，如诱导Th1细胞产生IFN-γ；增强NK细胞的活性；增强FasL介导的细胞毒效应；通过IFN-γ的产生调节免疫球蛋白的产生；促进IL-2和GM-CSF的产生等。这预示着IL-18是一种具有广泛应用的细胞因子，可能在抗微生物、抗自身免疫疾病等方面得到应用。早期研究表明，痤疮丙酸杆菌和LPS可引发小鼠的严重肝损伤，在无胸腺的裸鼠中加入IL-18抗血清可阻止肝损伤，并使血清GOT和GPT水平恢复正常，这说明IL-18可参与抗炎症反应。进一步研究表明，内毒素刺激可激活细胞因子网络，诱发IL-18的产生，从而诱导IFN-γ、TNF-α的产生，增强FasL介导的细胞毒效应。抗IL-18抗体可保护肝不受损伤，表明IL-18在这一全身性炎症反应中起着核心作用。弄清楚IL-18在炎症反应中的具体作用环节，对于临床上治疗和预防炎症反应有极大意义。最近的研究表明，小鼠表皮角质化细胞也是IL-18来源之一。IL-18可能作为表皮T细胞的共生长因子，表达一种限制性的γδT细胞。虽然它的功能未知，但其它表皮细胞生长因子，如IL-7、IL-15等，已被证明是γδT细胞增殖的诱导因子；IL-18有可能在这些细胞的分化过程中发挥作用。IL-18的发现、克隆和生物学活性的确认，尤其是发现它具有诱导Th1细胞产生IFN-γ、增强NK细胞活性、增强FasL介导的细胞毒效应等功能。

针对肿瘤的免疫反应主要依靠Th1淋巴细胞，TH1细胞应答包括分泌细胞因子IL-2/IL-12/IL-18以及IFN-gama，以及产生特异的细胞毒T淋巴细胞识别特异的肿瘤抗原。TH1反应还是机体防御多种微生物的主要机制。

IL-18可以作为抑制肿瘤生长和转移的辅助药物。在研究模型中，其主要是通过激活NK细胞和产生IFN-gama，但是在这些临床治疗实验中，IL-18产生的毒副作用不容忽视，正是这些毒副作用可能影响其全身给药使用。因为在肿瘤细胞表面或抗原提呈细胞表面的表达只是一种局部作用，没有全身作用。并且IL-18还有被血液中的IL-18结合蛋白(IL-18BP)中和的问题，IL-18BP对其亲和力高(400pM)，并且在血液中浓度高，比IL-18的摩尔浓度高出20倍，推测其功能是在感染后尽量使TH1细胞应答控制在低水平，以防止自体免疫疾病的发生。而在有些肿瘤细胞能产生IL-18BP以抑制机体的免疫反应。

由于IL-18在临床上使用的前景，其功能与TH1淋巴细胞的抗肿瘤、抗微生物功能相关，所以受到人们的关注。

材料

所有引物由上海生工公司合成：

上游引物例1：tcatttggcaagcttgaatct(序列2)

上游引物例2：tactttggcaagcttgaatctaaat(序列3)

下游引物例1：gtcttcgctttgaacagtga(序列4)

下游引物例2：gtcttcgctttgaacagtgaacat(序列5)

RT-PCR采用GIBCOBRL公司的SuperScript II^TM(cat#：18089-011；Lot#：1072465)反转录试剂盒进行反转录，采用TAKARA公司的Ex Taq酶(cat#：DRR001A)进行PCR反应。

菌株GS115/KM71/购自Invitrogen公司。

菌株XL-1Blue购自CLONTECH公司。

制备方法

表达载体构建

设计大肠杆菌-酵母穿梭载体作为表达载体pYE3。该载体中包含大肠杆菌的复制信号，AMP/NEO抗性基因，T3/T7启动子，PHO1启动子/AOX1启动子，α因子信号肽序列，增强子序列，PHO1基因的3’非翻译序列等(图1)。

目的基因的获取

提取中国人血淋巴细胞的mRNA，采用特异性引物(如序列2或3，序列4或5)进行RT-PCR扩增，将得到的产物克隆到pMD18-T(#D504CA，TAKARA)载体中，筛选出阳性克隆并进行测序。

基因序列的优化

得到的IL-18mut(甲醇利用阳性，methanol utilization plus)基因序列，可按照文献所述(Wright F.：Gene 1990 Mar 1；87(1)：23-9；Zhang等，Gene(1991)105，61-72；XH Xia.(1998)Genetics，149：37-44)进行酵母偏性密码子优化我们得到如下序列：

tactttggtaagttagcatctaaattatcagtcattagaaatttgaatgaccaagttttattcattgaccaaggtaatagacctttatttgaagatatgactgattctgactgtagagataatgcaccaagaaccatttttattatttctatgtatgcagattctcaacctagaggtatggctgttactatctctgttaagtgtgaaaaaatttcaactttatcctgtgaaaacaaaattatttcctttaaggaaatgaatcctcctgataacatcaaggatacaaaatctgacatcattttctttcaaagatctgtcccaggtcatgataataagatgcaatttgaatcttcatcatacgaaggttactttttagcttgtgaaaaagaaagagacttatttaaattaattttgaaaaaagaagatgaattgggtgatagatctattatgttcactgttcaaaacgaagactgatag(序列1)

设计拼接寡核苷酸序列合成以上序列，测序得到所要求产物后，克隆到表达载体。

合成的目的基因用Xba I/EcoR I酶切克隆到酵母表达载体pYE3(图1)上，转化到XL-1 BLUE大肠杆菌中，挑选阳性克隆，并且进行质粒扩增。

宿主细胞

宿主细胞采用毕赤酵母的GS115菌株，以电转化把线性化的基因序列转到酵母细胞中，再用YPD-G418平板(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，1.5％琼脂，100mg/ml来自Life Technologies，Inc.的G418)筛选出阳性克隆，进一步用高浓度G418抗性平板筛选出多拷贝整合菌株。

         表1 YPD-G418平板中的G418浓度

G418终浓度(mg/ml)               ml G418原液/250ml YPD

0.25                            0.625

0.50                            1.25

0.75                            1.875

1.00                            2.5

1.50                            3.75

1.75                            4.375

2.00                            5.0

3.00                            7.5

4.00                            10.0

纯化方法

工程菌培养与上清收集设定发酵温度30℃，利用全自动发酵罐(BiostatC，B.BraunBiotech)进行发酵。根据需要进行培养基成分添加，待甘油耗尽后(OD600：1-10)，进入甲醇诱导阶段。在诱导阶段，将pH控制在3.5-7.5的范围内，溶氧量控制在10-30％的范围内。整个发酵时间视工程菌生长情况确定。培养结束后离心法收集发酵上清液。发酵液预处理利用Pellicon超滤系统(美国Millipore公司)的孔径为5000的超滤膜堆，以5∶1的比例，用20mmol/LTris HCl(pH80)缓冲液对发酵上清进行超滤脱盐处理，使最终发酵上清的电导小于5mS cm。rhIL-18的纯化采用的层析系统为AKTApurifier(瑞典Pharmacia公司)。发酵上清先经SPSepharoseFF柱层析纯化。柱子先用20mmol LTris HCl(pH80)平衡，经预处理的发酵上清液直接上样后，用NaCl梯度洗脱(洗脱液为20mM NaAc，0.5M NaCl，pH6.6，分40％、70％、10％，三个梯度，所述梯度为NaCl/NaAc)。收集rhIL-18目标峰，再加入固体硫酸铵至20mol/L，加载至PhenylSephrose HP柱，用20-0mol/L硫酸铵梯度洗脱。收集目标峰后，再上经5mmol L磷酸缓冲液(pH7.0)平衡的SephadexG25柱脱盐获得纯化终产品。

从纯化工艺上来看，毕赤酵母和酿酒酵母的表达上清中杂蛋白含量很低(参见图3)，所以减低了纯化难度，降低了纯化成本；从表达产物的结构上来看，把酵母的信号肽酶切割位点直接设计在成熟肽的前面，试验证明：酵母细胞能准确识别该位点，所以能得到结构和天然蛋白完全一致的产物，减少了临床用药过程中产生抗体，从而降低药效的可能性；另一方面，酵母分泌的IL-18，其活性接近天然蛋白，活性比大肠杆菌包涵体产物提高一倍以上，并且酵母发酵生产成本低，适合大规模生产，经初步表达结果表明IL-18的表达量在500mg/L左右。

实施例

分泌表达质粒的构建

同时用EcoR I和Xba I双酶切拼接产物克隆载体pMD18T-IL18和酵母分泌表达载体pPICZαA，琼脂糖凝胶电泳分离片段，回收613bp的chIL18基因片段；乙醇沉淀纯化回收3.5kb的载体DNA片段。然后在T₄ DNA连接酶(2.5单位/μl，含ATP的10X连接缓冲液，TAKARA CO.#2011A CA)的作用下，将基因片段与载体相连接。连接产物转化感受态大肠杆菌宿主细胞TOP10F’(Invitrogen)。经Zeocin抗性平板筛选，对阳性转化子进行菌落PCR鉴定，筛选可扩增出613bp DNA片段的阳性克隆。任选其中两株，小量提取质粒，进行进一步的酶切鉴定。

质粒的大量提取

用QIAgen试剂盒提质粒时，按照试剂盒说明书进行，简述如下：

从固体培养基上挑取单个菌落接种于3-5ml含相应抗生素的LB培养基(5g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨，10g/L NaCl，pH7.0)中，37℃振摇过夜培养活化菌种；再按0.2-0.5％同前接种、培养100mL菌体；6000g 4℃15分钟离心收集菌体(约湿重0.3克)，沉淀重悬于10mL P1溶液中，混悬后加入10mL P2，冰浴5min，再加入10mL P3，冰浴20min，20,000rpm 4℃10min，离心2次；同时用10mLQBT预平衡质粒纯化柱，将离心后的上清加到平衡好的纯化柱上，让质粒与纯化柱上的树脂结合；待上清流出纯化柱后，用QC洗涤纯化柱2次，每次30mL，洗去树脂上样品中的杂质；最后用15mLQF将质粒从纯化柱上洗脱下来，收集洗脱液，加入10.5mL异丙醇室温沉淀10min，15,000rpm室温离心30min，5mL 70％乙醇洗涤沉淀，吹干，沉淀重悬于适量灭菌水中(其中P1，P2，P3，QBT，QC，QF为试剂盒提供，也可自行配制。)

化学法质粒转化

感受态细胞的制备

挑取单个宿主菌GS115或KM71，接种于10mL YPD培养基中，28-30℃过夜培养。次日将培养的菌液稀释至OD₆₀₀为0.1-0.2，取10mL继续培养4-6小时。使OD₆₀₀为0.6-1.0，500g，5分钟，室温离心收集菌体，沉淀重悬于10mL溶液I中，同上离心，沉淀重悬于1mL溶液I中，即得酵母菌感受态细胞。制备好的感受态细胞可分装成50-200μL的小份，迅速冻存于-70℃保存，反复冻融也不会明显地改变其转化效率。

转化

取50μL感受态细胞，加入3μg线性化的DNA，再加入1mL溶液II，振荡混匀，30℃放置1小时，并且每15分钟摇动混合一次；42℃，10分钟，热激活；将转化液分成两管，每管中加入1mL YPD，30℃放置1小时；3000g室温离心5分钟，收集沉淀，沉淀重悬于500μL溶液III中，并将转化液合并成一管；同上离心，沉淀重悬于100-150μL溶液III中；将转化液涂布于YPDs平板上，30℃倒置培养2-4天待转化子出现。

电击转化法

感受态细胞的制备

接种宿主菌GS115或KM71于5mL YPD培养基中，30℃过夜培养；次日以0.02-0.1％的比例接种于200mL YPD中，继续培养至OD₆₀₀为1.2-1.5；1500g 4℃离心5分钟，收集菌体，分别用200mL、100mL用冰预冷的灭菌水和8mL用冰预冷的1mol/L山梨醇溶液洗涤沉淀，最后将沉淀重悬于0.4mL用冰预冷的1mol/L山梨醇溶液中，即得感受态细胞。制备好的感受态细胞始终置于冰上，当天使用，不能保存。

转化

取80μL感受态细胞，加入5-10μg线性化的DNA(溶于5-10μL灭菌水中)，混匀，加到预冷的0.2cm电击杯中；冰浴5分钟；选取电压400V，电容20μF，电阻200Ω，时间5-10ms，电击；电击后迅速加入1mL用冰预冷的1mol/L山梨醇溶，30℃静置1-2小时；每份10-200μL涂布于YPDs平板上，30℃倒置培养2-4天待转化子出现。

酵母重组子的筛选

直接PCR筛选法

模板的制备：挑取单个菌落，于YPD培养基中过夜培养，次日取10μL，加到1.5mL离心管中，加入5μL的5U/μL裂解酶，30℃温浴10分钟；再将样品于-70℃中冻10分钟；随后取5μL作为细胞裂解物模板。

PCR反应：按照第一部分“标准PCR反应体系加入Taq酶和底物。反应程序为：95℃1分钟变性，54℃1分钟退火，72℃1分钟延伸，共30个循环。反应结束后，琼脂糖凝胶电泳分析结果。

营养表型的确定

用灭菌牙签挑取单个克隆，按照先MMH(添加了甲醇和组氨酸的基本培养基，Minimal Methanol+Histidine)平板后MDH(添加了组氨酸的基本葡萄糖培养基，Minimal Dextrose Medium+Histidine)平板的顺序平行点板，以GS115/白蛋白(Albumin)为Mut^s(甲醇利用缓慢，Mehanol Utilization Slow)对照，以GS115/pPICZ/lacZ为Mut⁺(甲醇利用阳性，Methanol Utilization Plus)对照。点好的平板于30℃温箱内倒置培养2天，观察、分析结果。

双层滤膜筛选法

将经PCR鉴定确有VEGF基因整合的重组子点在灭菌的醋酸纤维素薄膜上，于丰富培养基BMGY平板上培养40小时，将此醋酸纤维素薄膜重叠放在灭菌的硝酸纤维素薄膜上，于诱导培养基BMMY平板上诱导培养60-72小时，取下硝酸纤维素薄膜，进行免疫印迹分析。免疫印迹的方法参见Current Protocol in Protein Science，chapter 10，Unit 10.10：ImmunoblotDetection。

酵母菌的诱导表达

Mut⁺表型的诱导表达

将单个克隆接种于25mL BMGY培养基(缓冲型甘油复合培养基，Buffered Glycerol-complex Medium)中，28-30℃培养16-18小时，使OD₆₀₀为2-6，此时的酵母菌正处于对数生长期；

1500-3000g室温离心收集菌体，用BMMY培养基(缓冲型甲醇复合培养基，Buffered Methanol-complex Medium)重悬菌体沉淀，使OD₆₀₀为1.0；

在通气良好的摇瓶中28-30℃培养，摇床转速应在250rpm以上；

每天补加100％甲醇，使其终浓度为0.5％；

诱导后每12小时取样1mL，-70℃保存，最后进行SDS-PAGE分析。以GS115/白蛋白为分泌表达的阳性对照，以GS115宿主菌为空白对照。

Mut^s表型的诱导表达

将单个克隆接种于100mL BMGY培养基中，28-30℃培养16-18小时，使OD₆₀₀为2-6，此时酵母菌正处于对数生长期；

1500-3000g室温离心收集菌体，用BMMY培养基重悬菌体沉淀，使OD₆₀₀为1.0；

在通气良好的摇瓶中28-30℃培养，摇床转速应在250rpm以上；

每天补加100％甲醇，使其终浓度为0.5％；

诱导后每24小时取样1mL，-70℃保存，最后SDS-PAGE分析。以GS115/白蛋白为分泌表达的阳性对照，以KM71宿主菌为空白对照。

IL-18活性的测定

1)IL-18标准品稀释成10U/ml；

2)分离PBMC；用完全RPMI1640-10％FCS培养基配成10⁶细胞/ml，分成若干份，对应rhIL-18表达样本和标准品。然后在已稀释好的96孔板中每孔加入细胞100μl，37℃5％CO₂孵箱培养48小时。收集细胞上清，用ELISA测定IFN-γ含量。

表2 IL-18活性的测定

                           浓度    刺激产生IFN-γ活性(IU/mL)

酵母分泌重组IL-18          2nM     450

标准品                     2nM     500

阴性对照                   -       0

                    序列表

<110>华特森基因科技有限公司

<120>人的重组白细胞介素-18(rhIL-18)的酵母表达方法及其产物

<130>PJPY5575N

<141>2002-11-06

<160>5

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>477

<212>DNA

<213>人

<400>1

tactttggta agttagcatc taaattatca gtcattagaa atttgaatga ccaagtttta    60

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<210>2

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<212>DNA

<213>人工序列

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ttcatttggc aagcttgaat ct                                             22

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<212>DNA

<213>人工序列

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<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

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<212>DNA

<213>人工序列

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