利用噬菌体展示技术展示抗原制备抗体的方法

摘要

本发明属于基因工程技术领域。利用噬菌体展示技术原理将外源抗原基因与丝状噬菌体III基因蛋白融合展示于噬菌体颗粒尾部，将抗原表位与丝状噬菌体VIII基因蛋白融合展示于丝状噬菌体颗粒表面。用展示有外源抗原及抗原表位的噬菌体颗粒为免疫原制备抗体。该技术拓宽了噬菌体展示技术的应用范围，同时也为抗体的制备提供了新途径。保护范围：1.一种用噬菌体展示技术展示抗原用以制备单克隆抗体及多克隆抗体的方法。2.一种用噬菌体展示技术展示人心肌肌钙蛋白抗原及其抗原表位用以制备cTnI单克隆抗体及多克隆抗体的方法。3.一种pIII型噬菌体展示载体pFD5。4.一种噬菌体展示融合表达载体pFD5－cTnI。5.一种pVIII型噬菌体展示融合表达载体PC89－cTnI95～108。6.将展示有cTnI及cTnI95～108的噬菌体颗粒作免疫原，免疫新西兰白兔获得cTnI抗体。

说明书

一.技术领域

本发明属于基因工程技术领域。该技术利用噬菌体展示技术原理将外源抗原基因与丝状噬菌体III基因蛋白融合展示于噬菌体颗粒尾部，将抗原表位与丝状噬菌体VIII基因蛋白融合展示于丝状噬菌体颗粒表面。用展示有外源抗原及抗原表位的噬菌体颗粒为免疫原制备抗体。

二.背景技术

近20年来，抗体作为体外诊断用药在医学及生物学领域得到广泛发展。在过去的半个世纪，基于酶促反应动力学，化学发光，配体-受体相结合等原理为基础而建立的检测技术，尤其是基于蛋白质三大标记技术(荧光、核素、酶)而衍生的ELISA、RIA、MRIA、Western-blot、电化学发光、免疫比浊等特异、灵敏检测方法的建立，为分子生物学、生物化学、免疫学、微生物学、免疫病理学及对临床疾病的诊断、治疗及预防作出了重大贡献。随着生物芯片技术的出现，将基因芯片及蛋白质芯片的开发成为各种体外诊断试剂是这一领域发展的重点，其中蛋白质芯片占有相当重要的地位。从技术角度而言，无论是免疫蛋白技术还是蛋白芯片技术，其关键是高质量抗体，其中包括单抗(McAb)及多抗(PcAb)。因此，高特异，高亲和性抗体的研制具有十分重要的意义。

抗体的产生-般有三种方法：1.异种动物免疫(多抗)，2.杂交瘤技术(单抗)，3.基因工程(小分子鼠源或人源Fab，scFv)。无论何种技术，抗体的产生取决于抗原。理论上一个氨基酸就能产生抗体。但是肽链的长度、分子量大小与抗原性直接相关。理论上分子量越大，免疫原性越强，颗粒性抗原大于可溶性抗原。对普通分子量抗原而言，用常规免疫学方法产生抗体并无困难，但分子量小于20000的抗原，就有可能使产生的抗体滴度很低，亲和力不强，无法应用于临床。解决办法国内外普遍用戊二醛，碳化二亚胺等作偶联剂，将小分子抗原偶联于BSA或KLH成大分子蛋白，增强其抗原性。但前提是：1.足够的抗原，2.性质相对稳定，3.偶联蛋白不改变原有抗原的性质。然而对一些稀有的，分子量较小，半衰期较短的抗原，如某些激素及其代谢产物，某些肿瘤标志物等，给抗原纯化及抗体制备带来困难。基因工程可有效地解决这一问题，如用一般的表达系统可以解决稀有蛋白的生产制备问题，但不能解决小分子肽的免疫原性问题，因为以制备抗体为目的的小分子肽表达并纯化后仍需与大分子载体进行偶联，偶联过程极为烦琐、复杂，且偶联反应不易控制。

三、发明内容

噬菌体展示技术自1985年由G.P.Smith建立以来，在生物学许多领域带来了巨大影响，被誉为生命科学中又一次技术上的重大突破。噬菌体展示技术是将外源基因插入噬菌体的基因组中，使产物与其衣壳蛋白融合表达，外源肽的结构与功能通过活病毒的形式表现出来。基于此原理，大多数研究者将此技术应用于随机肽文库的构建、表位文库的构建及人源抗体库的构建等，通过文库提供的大量结构与功能的信息，实现了高通量筛选，在研究分子间相互作用，新药设计，寻找新配体，寻找并制备人源单抗等方面提供了全新的策略。用于噬菌体展示技术的噬菌体主要包括M13、fd、fl等，它们的亲缘关系、基因组组织形式、病毒大小与形态相近，都是柔性杆状病毒，长1μm，直径6nm，有98％的核苷酸序列同源，基因组包括6407～6408个碱基，编码10个不同蛋白，其中与噬菌体展示有关的蛋白是基因VIII(g8)所编码的主要外壳蛋白pVIII(major coat protein)，大约有2700个左右的拷贝，围绕噬菌体呈螺旋管状排列，蛋白的C端与DNA结合，N端暴露于病毒颗粒的表面，基因III(g3)所编码的次要外壳蛋白pIII(minorcoat protein)，参与构成噬菌体外壳的尾端，其C端锚定在外壳上，N端游离于噬菌体外，每个病毒颗粒约含3～5个cpIII的拷贝。当外源基因插入到噬菌体基因组的基因VIII或基因III的5’端时，外源蛋白或多肽则以蛋白融合的形式被表达，分泌到细菌的周质腔，切除信号肽后，融合在外壳蛋白N端的外源肽被展示在噬菌体颗粒表面。

为了解决抗原制备和免疫原性问题，为体外诊断试剂的研制，小肽的药代动力学研究及随机肽文库的构建建立了通用技术平台。利用免疫学的基本原理，我们设想：丝状噬菌体是一种细菌病毒，是颗粒性抗原，如果把它作为一种载体，理论上应当具有很强的免疫原性，把cTnI基因插入到噬菌体基因组的基因VIII或基因III的5’端，使其与基因VIII或基因III融合，最终cTnI将以蛋白融合的形式被表达并展示在噬菌体颗粒表面，以此为免疫原免疫动物，制备抗体。如果这种设想得到实现，则可将抗原的制备和抗原的免疫原性问题一步解决，为抗体的制备提供了新的途径，同时也为体外诊断试剂盒的研制建立了全新的技术平台。本研究成功地将人心肌肌钙蛋白及其抗原表位展示于丝状噬菌体颗粒表面，并以此为免疫原免疫新西兰白兔，得到了高滴度的抗体，实现了预期目标。

本发明的技术方案为

1.将抗原与丝状噬菌体III基因蛋白融合展示于噬菌体颗粒尾部，将抗原表位与丝状噬菌体VIII基因蛋白融合展示于丝状噬菌体颗粒表面，并用展示有抗原及抗原表位的噬菌体颗粒为免疫原制备抗体。

2.将人心肌肌钙蛋白I(cTnI)与丝状噬菌体III基因蛋白融合展示于噬菌体颗粒尾部，将人心肌肌钙蛋白抗原表位与丝状噬菌体VIII基因蛋白融合展示于丝状噬菌体颗粒表面。用展示有人心肌肌钙蛋白及其表位的噬菌体颗粒为免疫原制备cTnI抗体。

3.一种pIII型噬菌体展示载体。载体含LacZ启动子-Pelb引导序列-XcmI PCR产物克隆位点及多克隆位点-M13噬菌体包膜蛋白III基因部分序列，利用XcmI双酶切用以克隆PCR产物，用多克隆位点插入外源抗原基因，外源抗原基因表达后在Pelb的引导下定位于细胞周质腔，用辅助噬菌体超感染，将外源抗原展示于M13丝状噬菌体的尾部。将人心肌肌钙蛋白I基因插入多克隆位点，基因表达后在Pelb的引导下定位于细胞周质腔，用辅助噬菌体VCSM13超感染，将cTnI展示于M13丝状噬菌体的尾部。

4.一种pVIII型噬菌体展示载体。载体含LacZ启动子-cTnI_95～108基因-M13噬菌体包膜蛋白VIII基因部分序列，用辅助噬菌体VCSM13超感染，将cTnI_95～108展示于M13丝状噬菌体的表面。

5.将展示有抗原或抗原表位的噬菌体颗粒作免疫原，免疫动物制备抗体，将展示有cTnI及cTnI_95～108的噬菌体颗粒作免疫原，免疫新西兰白兔获得cTnI抗体。

四.具体实施方式

1.噬菌体展示载体的构建

pCOMB₃第二个克隆位点的切除

pCOMB₃用NheI+XbaI双酶切，可见272bp条带，切除上述片段后，将剩余大片段回收，自连后转化并抽提质粒，分别用NheI，XbaI，SpeI，XhoI及XhoI+SpeI酶切检查，结果显示：XbaI，NheI无酶切，SpeI，XhoI可见单酶切条带，酶切位点正确。

片段插入及鉴定

pET-28(a)⁺(中国药科大学生物技术研究中心储存)作模板PCR扩增后，可见550bp条带，回收片段后与相同酶切的Pa载体连接，转化后筛选阳性质粒，1.5％琼脂糖电泳条带出现在Pa之后。随机挑选10个单菌落进行PCR检查，其中9个出现550bp条带，阳性率90％。SpeI+XhoI双酶切检查，可见550bp及3800bp条带。XcmI单酶切可见在540bp及3810bp位置出现条带。质粒送生工测序，结果与预期序列一致，测序结果正确的质粒命名为pFD5。

pFD5的构建如图1。

2.人心肌肌钙蛋白I-pIII噬菌体展示

pFD5-cTnI表达载体的构建及鉴定

以含cTnI的pMD-18T为模板扩增得到的PCR产物与载体pFD5经SpeI+XhoI双酶切，回收相应片段，用T4连接酶使两个片段通过粘性末端相连，转化至XL1-Blue。随机挑取10个转化子扩增后抽提质粒，分别用PCR及SpeI+XhoI双酶切等方法作鉴定。其中有9个克隆出现630bp条带，酶切鉴定出现3800bp及630bp两条带。阳性质粒测序结果与预期序列一致。

pFD5-cTnI的构建如图2。

cTnI蛋白的表达

阳性菌落扩增后，经ITPG诱导，培养基及细胞周质均检测到cTnI蛋白抗原活性，表达量周质大于培养基(图3)。

cTnI的噬菌体展示

由于经反复多次传代的宿主菌可能会发生变异，对辅助噬菌体感染不敏感，从15个单菌落中，只筛选到3株对辅助噬菌体敏感的XL1-Blue宿主菌。通过辅助噬菌体的复苏及扩增，经测定，VCSM13的滴度为1.1×10¹²PFU/ml。pFD5-cTnI质粒经转化对辅助噬菌体敏感的XL1-Blue感受态细胞，用VCSM13超感染，扩增后用PEG8000进行纯化，并用ELISA检测试剂盒检测抗原性，结果显示OD＝0.1770。通过标准曲线计算：cTnI蛋白的相对展示量为5ng/ml。3.人心肌肌钙蛋白I抗原表位-pVIII噬菌体展示

PC89-cTnI_95-108表达载体的构建及鉴定

用含酶切位点EcoRI的T1及酶切位点BamHI的T2退火，得到含EcoRI及BamHI酶切位点的寡聚核苷酸双链，与经EcoRI+BamHI双酶切的PC89，用T4连接酶通过粘性末端相连后，转化至XL1-Blue。通过蓝白斑筛选，得到约40％的蓝色克隆。随机挑取5个转化子扩增后抽提质粒，分别用PCR及EcoRI+BamHI双酶切等方法作鉴定。其中有3个转化子在450bp位置扩增出阳性条带，酶切鉴定未出现预期的50bp条带。阳性质粒测序结果与预期序列一致。

PC89-cTnI_95-108的构建如图4。

cTnI_95-108的分泌表达

阳性菌落扩增后，经IPTG诱导，培养基及细胞周质均检测到cTnI_95-108抗原活性，表达量周质大于培养基(图5)。

cTnI_95-108的噬菌体展示

PC89-cTnI_95-108质粒经转化对辅助噬菌体敏感的XL1-Blue感受态细胞，用VCSM13超感染，扩增后用PEG 8000进行纯化，并用ELISA检测试剂盒检测抗原性，结果显示OD＝1.7210。通过标准曲线计算：cTnI_95-108的相对展示量为96ng/ml。

4 cTnI抗体的产生

PC89-cTnI_95-108质粒及pFD5-cTnI质粒转化XL1-Blue感受态细胞，挑单菌落接种Amp+Tet双抗LB培养液扩大培养，加入10¹² PFU的VCSM13进行超感染，超感染后的噬菌体用40g/L的PEG 8000及30g/L的NaCl纯化2次，调整噬菌体浓度为0.25mg/ml，加佐剂制成油包水乳剂，免疫新西兰白兔，加强免疫5次后用ELISA方法测定抗体滴度，结果显示：pIII组1号兔及2号兔抗体滴度均为1.300，pVIII组1号兔抗体滴度为1∶900，2号兔滴度为1∶1800，对照组无阳性结果(图6)。兔血清用半饱和硫酸铵沉淀粗提，沉淀用适量PBS溶解后，采用Sephedex G-200凝胶层析分离纯化免疫球蛋白G(IgG)，收集合并第一峰，浓缩后测定蛋白浓度为76.50mg/ml。

五.附图说明

图1.PFD5载体的构建。

图2.PFD5-cTnI表达载体的构建。

图3.cTnI基因的表达。

图4 PC89-cTnI_95-108表达载体的构建。

图5.cTnI_95-108的表达。

图6.抗体滴度。