用于预防和延缓早期老年痴呆症的隐丹参酮

摘要

本发明涉及使用式(I)所示结构的隐丹参酮或含有该隐丹参酮的药物组合物制造用于预防和延缓早期老年痴呆症的药物，以及用式(1)所示结构的隐丹参酮预防和延缓老年痴呆症的方法。

说明书

id="p0001" num="0001"> 用于预防和延缓早期老年痴呆症的隐丹参酮 发明领域

本发明涉及隐丹参酮 （Cryptotanshinone) 用于制备预防和延缓早 期老年痴呆症药物的用途以及用隐丹参酮预防和延缓老年痴呆症的方 法。 发明背景

老年痴呆症（Alzheimer's disease, 简称 AD) 是一种进行性神经退 化病症， 临床主要表现为中枢认知降低， 智力衰退， 记忆丧失并导致 生活不能自理等。 据统计， 5-10 % 60岁以上老人， 20-40 % 80岁以 上老人中都有程度不同的 AD症状。因此， AD是目前对老年人健康影响 极大的常见病。

AD患者的病理解剖特征是脑组织中发生 β-amyloid (Αβ-蛋白）的 凝聚沉积及神经元纤维缠结 （NFT)。 AD病因非常复杂， 其发病起因目 前还没有完全研究清楚。 研究结果证明， AD患者都具有不正常的血氨 升高和脑组织中氨浓度升高症状。 由于氨对脑组织的毒害最大， 因此， 科学家认为， 脑组织长期处于高氨浓度环境是 AD患者症状发展和恶化 的直接或间接原因 （K Michael, et al" Hyperammonemia in Alzheimer's Disease, Am j Psychiatry, 1985, 142, 71; S.Brian, et al., Elevated adenosine monophosphate deaminase activity in Alzheimer's disease brain, Neurobiology of Aging, 1998, 19, 385 ) ₀

人体内血氨主要来源于肠道产氨和肾脏产氨。 人体的肝脏功能正 常时， 大部分由肠道或肾脏产生的氨都可以通过肝脏内的鸟氨酸循环 合成尿素而解毒。 慢性肝炎和肝硬化患者的肝功能不正常， 肝脏清除 氨毒的功能减弱， 则氨渗透进入血液的量也增加。 因此， 慢性肝炎和 肝硬化患者常常伴随有高血氨症状。 氨是一类碱性有毒物质， 对人体 多种重要器官有毒害作用。

AD患者脑组织内的氨来源于两个方面： 一是血液中的氨通过血脑 屏障进入脑组织； 二是 AD患者脑组织中某些脱氨酶活性异常， 如 AMP 脱氨酶活性是对照的两倍， 其结果使 AMP中腺嘌呤碱基脱氨作用增加， 导致脑组织氨浓度升高。 由于脑组织中没有氨的解毒机制， 氨在脑组 织中可以长时间存在， 对脑组织造成严重毒害作用， 造成神经行为受 损， 是导致 AD症状加重和恶化的主要原因 (S. Nikolaus, An ammonia hypothesis of Alzheimer disease, in Advances in experimental medicine and biology, Vol 420, p235, Plenum Publishing Co., New York, 1997)。 到目前为止， 对 AD具有显著治疗效果的药物还极少， 因此， 对 AD 采取预防措施及对 AD早期患者进行治疗是一个重要方法。应用有效清 除高血氨和高脑组织氨的药物是对 AD进行预防及对早期患者进行治疗 的有效途径。

本发明申请者已经发现， 从中药丹参中分离得到的隐丹参酮 (Cryptotanshinone)具有优异的清除高血氨功能（PCT申请号： PCT / CN01 I 00861 )。

丹参是唇形科植物丹参 miltiorrhiza Bunge)的干燥根及根 茎， 性苦、 微寒， 归心、 肝经。 作为传统中药， 在临床方药中被广泛 应用。 主要用于祛瘀止痛， 活血通经， 清心除烦等。 但是到目前为止， 还没有关于用丹参的提取物， 如隐丹参酮来预防和治疗高血氨症和高 脑氨症， 以及用于对 AD进行预防及对早期 AD患者进行治疗的报导。

本发明的目的是寻找并开发丹参提取物中的隐丹参酮的医药新用 途。

本发明人经研究发现， 从丹参中提取的隐丹参酮能够有效降低血 氨和脑组织氨的浓度， 显示隐丹参酮具有预防及对早期 AD患者进行治 疗的良好的前景。

本发明是根据隐丹参酮具有能够高效地清除高血氨， 同时能够通 过血脑屏障进入脑组织， 并高效地清除脑组织中高浓度氨的作用机制 所发展的用于预防 AD及对早期 AD患者进行治疗的新类型药物。 发明概要

本发明提供一种使用以下式 （ I ) 所示的隐丹参酮或含有该隐丹 参酮成分的药学组合物制造用于预防和治疗早期 AD的药物：

( I ) 本发明还提供一种用于预防和治疗早期 AD的药学组合物。该药学 组合物含有上述式 （ I ) 所示隐丹参酮成分， 以及任意的药学上可接 受的稀释剂或载体。

本发明还提供一种制备用于对 AD进行预防以及对早期 AD患者进 行治疗的药学组合物的方法， 该方法包括将上述式 （ I ) 所示隐丹参 酮成分与任意的药学上可接受的稀释剂或载体一起配制。

本发明还提供一种预防 AD以及对早期 AD患者进行治疗的方法， 该方法包括用有效量的上述式 （ I ) 所示隐丹参酮或含该隐丹参酮成 分的药学组合物对患者进行治疗。

本发明的式 （ 1 ) 所示的隐丹参酮能够通过血脑屏障进入脑组织 中， 通过清除早期老年痴呆症病人脑组织中不正常高浓度氨， 达到预 防和延缓早期老年痴呆症的目的。

根据本发明， 上述式 （ I ) 所示隐丹参酮或其药学组合物可以按 本领域公知的方法制备并通过口服给药、 非肠道给药（例如静脉注射、 肌肉注射、 皮下注射等） 或局部途径 （例如舌下、 直肠等） 给药。 口 '服制剂包括片剂、 口嚼剂、 胶囊、 丸剂、 悬浮剂、 乳剂、 溶液等。 非 肠道制剂包括注射剂， 局部给药制剂包括霜剂、 软膏剂、 贴剂、 栓剂、 喷雾剂等。

本发明所提供的上述式 （ I ) 所示隐丹参酮或其药学组合物是一 种安全性好， 能够用于预防 AD及对早期 AD患者进行治疗的药物。 发明的详细说明

本发明入的研究结果表明， 隐丹参酮能与氨在温和条件下反应形 成新的丹参酮类衍生物。 隐丹参酮也能与脑组织中存在的其它有毒胺 类物质， 如苯乙胺等发生相类似的反应。 提示这种化合物具有清除高 血氨和高脑氨的功能， 显示该化合物可用于治疗高血氨症和高脑氨症， 具有独特的预防 AD及对早期 AD患者治疗的作用。其反应如下式所示：

在本发明中使用的隐丹参酮， 可以用溶剂提取的方法从中药丹参 中分离得到； 也可以通过化学合成方法得到。 由于丹参资源丰富， 考 虑到成本等因素， 一般采用提取法获得本发明的化合物。

本发明通过化学反应实验， 确定隐丹参酮在温和条件下能与氨或 胺作用形成丹参酮类衍生物。 提示此化合物可用于降低血液中和脑组 织中高浓度的氨 （胺）。

本发明通过高血氨动物模型实验， 确定隐丹参酮能有效降低高血 氨模型大鼠的血氨浓度。 显示可成为预防和治疗高血氨症， 以及用于 对 AD进行预防及对早期 AD患者进行治疗的有效药物。

本发明通过高脑氨动物模型实验， 确定隐丹参酮能有效降低大鼠 脑组织中氨的浓度。 显示可成为预防和治疗高脑氨症， 以及用于对 AD 进行预防及对早期 AD患者进行治疗的有效药物。

本发明通过模型动物 AD神经行为实验， 确定隐丹参酮能有效延缓 模型大鼠受损的神经行为时间， 改善模型大鼠受损的神经行为症状。 显示可成为用于对 AD进行预防及对早期 AD患者进行治疗的有效药物。

本发明通过大鼠毒理实验， 确定隐丹参酮类是一类无毒副作用， 可以安全使用的药物。

本发明通过对隐丹参酮在大鼠体内代谢实验， 发现隐丹参酮在血 液和脑组织中含量最高。 表明隐丹参酮容易被吸收进入血液。 由于隐 丹参酮是脂溶性小分子化合物 （分子量 296 Da), 容易通过血脑屏障， 进入脑组织中。 隐丹参酮的这一特点， 是它可以成为预防和治疗血液 和脑组织高氨浓度症， 以及用于对 AD进行预防及对早期 AD患者进行 治疗的有效药物的重要原因 （M. P. William, Crossing the blood-brain barrier: are we getting it right? Drug Discovery Today, 2001, 6, 1 )。

目前用于治疗高血氨症的药物主要有乳果糖、 谷氨酸钠和精氨酸 等 药物， 王汝龙， 原正平主编， 化学工业出版社， 第三版（1999)， 655-665] , 但均有其局限性， 效果也不理想。 而安全性好， 能够通过 血脑屏障并高效清除脑组织中高浓度氨的药物则尚未见诸报道。 以下通过实施例对本发明作进一步详细说明。 实施例 1

丹参中隐丹参酮的提取、 分离及纯化：

干燥丹参 1 kg， 用 1500 mL 95%乙醇分 3次抽提， 每次 24小时， 抽提液减压浓缩至 500 mL， 然后加入 500 mL水， 用 1000 mL三氯甲烷 分四次萃取， 萃取液减压浓縮， 柱层析分离， 硅胶为 100-200 目， 洗 脱液为含 10%- 50%的乙酸乙酯的石油醚 /乙酸乙酯混合溶液，进行梯度 洗脱。 可得隐丹参酮约 0. 35g。 实施例 2

隐丹参酮体外与氨的作用：

在试管中加入 0. 5 mmol的氨及 30 mL水， 再分别加入溶于 1. 0 mL 乙醇的 0. 5 ranol隐丹参酮， 在 37 ± 5°C振荡 0. 5-3小时， 用 TLC进行 监测， 柱层析分离， 可得隐丹参酮与氨的作用产物 1-氨基 -2- ( 羟基 -2' -丙基）-8， 8-二甲基 -5， 6， 7, 8-四氢菲 -3， 4-二酮 (l-amino-2-(l '- ydroxy-2， -propyl)-8,8-dimethyl-5,6,7,8-tetrahydro-phenanthrene-3 ,4-dion e)和 3-氨基- 2- (1' -羟基 -2' -丙基 ) -8， 8-二甲基 -5， 6， 7, 8-四氢菲 -1, 4 -二酮（3-amino-2-(l，-hydroxy-2，-propyl)-8,8-dimethyl-5,6,7,8- tetra ydrop enanthrene- 1 ,4-dione) 产物结构已经 ¹³C」HNMR、>

丹参酮 IIA (Tanshinone IIA, 丹参中其它类型的丹参酮类化合物）体 外与氨的作用：

按与实施例 2相同的条件，以丹参酮 ΠΑ取代隐丹参酮， TLC监测， 在 48小时内未见明显反应。表明丹参酮 ΠΑ与氨在此条件下无相互作 用。 实施例 4

隐丹参酮和丹参酮 ΠΑ降血氨实验（注射） ：

实验用动物为健康雄性 SD系大鼠 50只， 体重为 250-300g。 随机 分成 5组， 即分正常对照组、 试验对照组（醋酸胺组）、 谷氨酸钠 /醋 酸胺组、隐丹参酮 /醋酸胺组和丹参酮 ΠΑ/醋酸胺组。 除正常对照组 外， 分别由腹腔注射生理盐水， 谷氨酸钠注射液（剂量为 410 mg/kg)， 隐丹参酮的生理盐水溶液（含少量表面活性剂， 剂量为 10 mg/kg)， 丹 参酮 ΠΑ的生理盐水溶液（含少量表面活性剂，剂量为 10 mg/kg); 给 药 45 min后， 除正常对照组外， 其余各组腹腔注射 5. 5 mmol/kg醋酸 胺； 连续四天。 第四天在注射醋酸胺溶液后 30 min, 各组大鼠立即摘 眼取血， 用 EDTA-Na抗凝， 应用常规方法测定血氨浓度。 结果见表 1。

本实施例以及以下的实施例中的谷氨酸钠的剂量是参照该药物的 临床实际剂量而确定的。 本实施例以及以下的实施例中的血氨浓度测 定方法采用酶 -UV法， 使用仪器为 HITACHI-7170自动分析仪， 使用的 试剂盒为 AMM0NIA。表 1和以下各表中的降低率计算方法：降低率 =[ 1 一 (治疗组浓度 -正常对照组浓度） I (试验对照组浓度-正常对照组浓度)] χ 100%。 表 1

按同样实验条件， 第四天在注射醋酸胺溶液后 90 min, 各组大鼠 立即摘眼取血， 测定血氨浓度。 所得结果见表 2。

表 2

实施例 5

隐丹参酮和丹参酮 ΠΑ降血氨实验 （口服）

按实施例 4实验条件， 不同的是谷氨酸钠注射改为口服谷氨酸（剂 量为 200 mg/kg), 隐丹参酮注射改为口服（剂量为 100 mg/kg) ， 丹 参酮 IIA注射改为口服（剂量为 100 mg/kg)。 第四天在注射醋酸胺溶 液后 30 min, 各组大鼠立即摘眼取血， 测定血氨浓度。 其结果见下表 3。

表 3

按同样实验条件， 第四天在注射醋酸胺溶液后 90 min， 各组大鼠立 即摘眼取血， 测定血氨浓度。 其结果见下表 4。

表 4

实施例 6

隐丹参酮降低脑组织氨浓度的实验（注射） ：

实验用动物为健康雄性 SD系大鼠 50只， 体重为 250_300g。 随机 分成 4组， 即分正常对照组、 试验对照组 （醋酸胺组）、 谷氨酸钠 /醋 酸胺组和隐丹参酮 /醋酸胺组。 除正常对照组外， 分别由腹腔注射生 理盐水， 谷氨酸钠注射液 （剂量为 410 mg/kg)， 隐丹参酮的生理盐水 溶液 （含少量表面活性剂， 剂量为 30 mg/kg); 给药 45 min后， 除正 常对照组外， 其余各组腹腔注射 5. 5 mmol/kg醋酸胺； 连续四天。 第 四天在注射醋酸胺溶液后 60 min, 各组大鼠立即处死， 摘取鼠脑， 在 低温条件下匀浆， 应用谷氨酸脱氢酶法测定脑氨浓度。 结果见表 5。

表 5

实施例 7

隐丹参酮降低脑组织氨浓度的实验（口服）

按实施例 6实验条件，不同的是谷氨酸钠注射改为口服谷氨酸（剂 量为 200 mg/kg), 隐丹参酮注射改为口服（剂量为 150 mg/kg ) o 第四 天在注射醋酸胺溶液后 60 min, 各组大鼠立即处死摘脑， 测定脑氨浓 度。 其结果见下表 6。 表 6

实施例 8

隐丹参酮减轻 AD模型大鼠受损的神经行为症状试验：

实验用动物为健康雄性 SD系大鼠 40只， 体重为 250-300g。 随机 分成 4组， 即分正常对照组、 模型对照 A组 （D-半乳糖 /喹啉酸组）、 模型对照 B组 （D-半乳糖 I醋酸胺组)、 隐丹参酮组（D-半乳糖 I醋 酸胺 /隐丹参酮组）。应用 Morris水迷宫法评价 D-半乳糖致亚急性衰 老加上化学毁损所致大鼠模型的神经行为症状。

正常对照组： 常规饲养。

模型对照 A组（D半乳糖 I喹啉酸组）：皮下注射 D-半乳糖（50 mg / kg /天， 连续 6周）， 造成大鼠亚急性衰老， 在大鼠双侧海马体注 射喹啉酸（1 L,含喹啉酸 75 nmol ) ，使大鼠迷宫学习记忆明显下降， 成为类似 AD动物模型。

模型对照 B组（D-半乳糖 I醋酸胺组)：皮下注射 D-半乳糖（50 mg / kg /天， 连续 6 周）， 造成大鼠亚急性衰老， 在大鼠腹腔注射 10 mmol/kg醋酸胺， 连续 7天， 由高血氨导致高脑氨， 造成对脑组织毁损 作用， 使大鼠迷宫学习记忆明显下降， 成为类似 AD动物模型。

隐丹参酮组（D-半乳糖 /醋酸胺 /隐丹参酮组）： 在皮下注射 D- 半乳糖（50 mg / kg /天， 连续 6周） 的同时， 口服隐丹参酮 （剂量 为 200 mg / kg /天）， 在大鼠腹腔注射 10 mmol/kg醋酸胺， 连续 7 天 （同时口服隐丹参酮 200 mg / kg /天）。

上述各组大鼠 Morris水迷宫测试结果见表 7。

表 7

组别 AD症状 -记忆障碍综合指数 （化学毁损处理后按天统计）

第一天 第二天 第三天 第四天 第五天 第六天 第七天 正常对照组 ― ― ― - ― - - 模型对照 A组 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 模型对照 B组 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 隐丹参酮组 ― - - ― + + + 注： -正常， + 记忆障碍 （+ 的数目表示记忆毁损程度， +++++为最严重) 实施例 9

隐丹参酮毒理试验：

小鼠急性毒性试验： 实验用动物为健康雄性小鼠。 采用灌胃方法 试验。 给药量至 1. 5 g/kg时仍未发现供试小鼠有中毒症状和死亡。 试 验表明， 隐丹参酮 LD₅。>

小鼠 30天毒性试验： 实验用动物为健康雄性小鼠。 釆用灌胃方法 试验， 给药量为 200 mg/kg /天， 连续 30天。 试验表明， 受试鼠无死 亡， 生长发育、 造血功能、 生化指标等， 均无明显的异常变化或毒性 反应； 重要脏器的解剖检査和组织镜检未发现病理变化。

实施例 10

隐丹参酮进入脑组织试验

实验用动物为健康雄性大鼠。 采用灌胃方法试验。 给药量为 300 mg/kg/天。 连续 5天。 在第 5天给药后 1小时， 处死摘脑。 将脑组织 匀浆后用氯仿提取， 应用 HPLC可以检测出显著量隐丹参酮。 工业上的实用性

本发明的上述实验表明：

(1)本发明的式 （ I ) 所示的隐丹参酮在生理条件下能与氨作用， 达到清除氨的目的。

(2) 高血氨动物模型实验说明本发明的式 （ 1 ) 所示隐丹参酮具 有优良的降低血氨浓度功能。

(3) 高脑氨动物模型实验说明本发明的式 （ 1 ) 所示隐丹参酮具 有优良的降低脑氨浓度功能。

(4) AD模型动物神经行为实验说明本发明的式 （ 1 ) 所示隐丹参 酮能有效延缓 AD模型大鼠受损的神经行为时间， 减轻模型大鼠受损的 神经行为症状。

(5) 使用本发明的式 （ 1 ) 所示隐丹参酮的毒理试验表明， 在正 常剂量下， 其作为药物应用是安全的。

(6) 本发明的式 （ 1 ) 所示隐丹参酮能够通过胃肠道吸收， 进入 血液， 达到清除血氨的目的。 同时， 隐丹参酮也能够通过脑血屏障进 入脑组织中， 达到清除脑氨的目的。

(7) 与现有的临床常用的治疗高血氨药物谷氨酸相比， 本发明的 化合物只要使用较小的剂量， 即可获得与谷氨酸相同或者更有效的结 果。 特别是在肝功能受损的情况下， 本发明的化合物的治疗效果比谷 氨酸更加显著。

(8) 由于谷氨酸不能通过血脑屏障， 所以谷氨酸降低脑氨浓度作 用很小。 而隐丹参酮能够通过脑血屏障进入脑组织中， 具有良好的清 除高脑氨功能。

(9) 本发明的式 （ 1 ) 所示隐丹参酮能够通过脑血屏障进入脑组 织中， 具有良好的清除脑氨功能。 显示可用于预防和治疗高脑氨症， 以及用于对 AD进行预防及对早期 AD患者进行治疗的有效药物。