用趋磁细菌生产磁性颗粒的方法及其中使用的培养基

摘要

本发明提供一种使用趋磁细菌生产磁性颗粒的方法，包括以下步骤：在含有碳源、氮源和铁源的培养基中通过深层培养法在25℃～35℃下培养趋磁细菌，其中培养基中碳氮比为4∶1～15∶1，pH值控制在7.0～7.8之间，氧分压控制在0.5％～21％之间，菌体生长完成后通过降低氧分压使细菌产生磁颗粒；然后收集菌体并提取磁颗粒。本发明还涉及培养趋磁细菌的培养基。

说明书

                         技术领域

本发明涉及利用趋磁细菌生产磁性颗粒的方法。这种方法通过在控制的条件下使趋磁细菌快速生长并在细胞内合成磁性颗粒，从而获得细菌磁性颗粒。本发明还涉及培养趋磁细菌的培养基。

                         背景技术

细菌磁颗粒是由趋磁细菌合成的一种Fe₃O₄颗粒，在细胞内逐步合成并沿磁力线排列成链状。它们颗粒大小均匀、一般直径为纳米级(40～50nm)，并具有稳定晶型。每个磁颗粒都有脂蛋白膜包被，因此被称为磁小体(magnetosome)。经研究发现，细菌磁颗粒在医学、生物技术等领域具有十分广泛的应用前景，它的应用主要表现在以下几个方面：

1)作为固定化酶载体和生物传感器的组成部分

Matsunaga等(1987)将葡萄糖氧化酶和脲酶分别固定在细菌磁颗粒、人造磁粒和Zn-Fe颗粒上制成磁化酶，发现，同样的酶量在细菌磁颗粒上和人造磁粒的固定量分别是Zn-Fe颗粒固定量的100倍和40倍。连续使用5次后，细菌磁颗粒固定的酶活力变化不大，而人造磁粒和Zn-Fe颗粒固定的酶活则明显降低。说明被细菌磁颗粒所固定的酶具有稳定、高效等特点。另外，有人试验将葡萄糖氧化酶和脲酶固定在这种磁性颗粒上，作为葡萄糖和尿酸生物传感器的组成部分，也在医学诊断上具有重要意义。

2)连接抗体用于快速、高灵敏度的免疫检测

利用戊二醛处理后的磁小体，每毫克可偶联29微克的抗体。因此有人利用抗SCC(扁皮细胞癌)抗体连接视频监测系统，可检测SCC抗原。当有SCC抗原存在时，由于抗原抗体结合可使磁颗粒聚集在监测系统而反映出来，这种方法的检测限可达到1.5ng/ml的水平。

此技术还可以用于荧光免疫测定。如图1所示，用FITC-抗老鼠抗原抗体-磁小体复合物测定老鼠的IgG。Matsunaga T等(1999)利用基因工程技术在Magnetospirllum sp.AMB-1中合成磁小体的关键基因magA和它的启动子之间插入ProteinA基因，得到了在磁小体表面表达有ProteinA蛋白的磁小体，建立了用磁小体-ProteinA复合物快速高灵敏度地测定人IgG的化学发光酶免疫测定方法，用这种方法检测IgG的最低浓度为1ng/ml。

3)制备磁性细胞和纯化某些难以纯化的细胞产物

利用趋磁细菌和某些有特殊功能的细胞融合，从而使这种具有特殊功能的细胞带有磁性，利用外加磁场的磁导向作用使之定向地行使其功能。例如，当有免疫活性的细胞与磁细菌融合后，具有趋磁性，它可能在外加磁场的作用下定向地攻击肿瘤细胞。Matsunaga T等1987年成功的用聚乙二醇作融合剂，使趋磁细菌与绵羊的红细胞融合，因而使绵羊的红细胞具有趋磁性。Matsunaga T等又于1989年利用人体白细胞的吞噬作用将趋磁细菌导入了粒细胞和单核白细胞，每个粒细胞和单核白细胞可以吞噬20-40个趋磁细菌，利用Sm-Co磁铁收集除去这些具有趋磁性的细胞，就可得到污染率极低的淋巴细胞。依据这种原理，Matsunaga T(1991)利用磁场控制来回收和纯化产生干扰素的细胞也获得成功。

4)用于基因转移

利用载有DNA和RNA的微发射物进行基因转移的技术近年发展较快。人们发现细菌磁小体比钨、金或人造磁粒可更多地吸附DNA或RNA，同时用粒子枪转移而获得某一基因的细胞可以方便地利用Sm-Co磁铁选择性的分离，从而使细菌磁小体作为一名自然的侯选者应用于这一生物技术领域。Matsunaga T等(1995)用细菌磁性颗粒作为DNA的载体进行了海洋蓝细菌的弹道转化，经Southern杂交和CAT测定表明，外源基因已被成功导入受体细胞，并得以表达。此外，细菌磁性颗粒还可用于mRNA的分离。

5)作为药物的载体用于肿瘤的靶向定位治疗

利用人造磁性颗粒Fe₃O₄作为载体与药物混合制备的磁性药物制剂，在足够强的体外磁场作用下注入血管，定位于肿瘤靶区，药物以受控的方式从载体中逐步释放，攻击肿瘤细胞，对正常组织影响较小，此技术为肿瘤的靶向定位治疗开辟了一条新的途径。目前国内外分别开展了一些研究。Lubbe(1996)实施了人造磁粒对大鼠的急性毒性试验，认为人造磁性颗粒的加入不会影响磁性药物制剂的急性毒性，器官毒性在临床治疗中也没有增加。德国、英国也开始对磁性微球免疫毫微粒进行了临床试验，得到肯定结果。我国以张阳德教授为首的课题组，利用血清白蛋白和抗肿瘤药物阿霉素与人造磁粉混合后制备成微小颗粒，在小鼠肝癌细胞的靶向定位治疗中取得令人满意的效果。

基于以上研究，我们认为，细菌磁小体颗粒均匀，利用其表面的游离基团，更容易连接药物而用于肿瘤的靶向定位治疗。

由于趋磁细菌的生长对环境要求比较苛刻，人工培养困难。通常采用液体静置的培养方法，5～7天后，细胞光密度只能达到OD₆₀₀ 0.2，无法获得大量细胞和磁性颗粒，限制了应用。为了解决这一问题，德国、日本、美国和我国学者对趋磁细菌的培养和细菌磁性颗粒的生产进行了一些研究，但目前还没有突破性的进展。德国学者D.Schuler(1997)等采用乙酸钠为碳源的培养基，控制空气供给‘进行格瑞菲斯瓦尔德磁螺菌(Magnetospirillum gryphiswaldense)的液体培养，70小时后细胞密度为OD₄₀₀1.4(相当于OD₆₀₀的0.7)，磁颗粒产量为2.6mg/L培养液。日本学者Matsunaga(2001)在以琥珀酸钠为碳源的培养基培养磁螺菌(Magnetospirillum sp.AMB-1)，144小时后磁颗粒的产量仅为7.4mg/L培养液。因此，本领域希望有一种快速培养趋磁细菌并使其高产率地产生磁颗粒的方法。

                       发明内容

为了实现利用趋磁细菌有效生产磁性颗粒的目的，发明人进行了深入的研究，明确了碳源、氮源的种类及浓度与磁螺菌生长和磁性颗粒合成的关系，氧分压和pH值对磁螺菌生长和磁性颗粒合成的影响，最终获得了以下新发现：

1)磁螺菌的生长速度和磁性颗粒的合成与碳源的种类和浓度密切相关。该菌仅能利用少数几种有机酸或有机酸盐为碳源，如苹果酸钠、乙酸钠、乳酸钠等，且浓度不宜过高(0.05％-2.0％)，否则抑制细胞生长和磁颗粒的合成。

2)碳氮比与磁颗粒的合成密切相关。过高或过低的碳氮比均会影响磁颗粒的产率。

3)在无铵固氮生长的条件下，细胞不合成磁颗粒。

4)环境中氧分压是影响磁颗粒合成的关键因素之一。

5)pH值小于6.8或高于8.5不利于细胞生长和磁颗粒的合成。

发明人基于这些新发现完成了本发明。本发明利用趋磁细菌生产磁颗粒的方法包括以下步骤：

在含有碳源、氮源和铁源的培养基中通过深层培养法在25℃～35℃下培养趋磁细菌，其中培养基中碳氮比为4∶1～15∶1，pH值控制在7.0～7.8之间，氧分压控制在0.5％～21％之间，菌体生长完成后通过降低氧分压使细菌产生磁颗粒；然后收集菌体并提取磁颗粒。

本发明还提供了一种新的培养趋磁细菌的培养基。

                      附图说明

图1是用磁小体-Protein A复合物测定人IgG的化学发光酶免疫测定方法的原理。

图2显示不同种类碳源对磁细菌(格瑞菲斯瓦尔德磁螺菌)生长的影响。其中单一碳源培养基中的碳源浓度均为15mM的碳原子数；混合碳源培养基中的各碳源浓度分别为7.5mM碳原子数。a，乙酸钠；b，酒石酸钾钠；c，柠檬酸钠钠；d，D，L-苹果酸；e，琥珀酸钠；f，乳酸钠；g，乙酸钠+酒石酸钾钠；h，乙酸钠+柠檬酸钠；I，乙酸钠+D，L-苹果酸；j，乙酸钠+琥珀酸钠；k，酒石酸钾钠+柠檬酸钠；l，酒石酸钾钠+D，L-苹果酸；m，酒石酸钾钠+琥珀酸钠；n，柠檬酸钠+D，L-苹果酸；o，柠檬酸钠+琥珀酸钠；p，D，L-苹果酸+琥珀酸钠；q，Blakemore培养基。

图3显示不同浓度的D，L-苹果酸对磁细菌(格瑞菲斯瓦尔德磁螺菌)生长的影响。

图4显示不同浓度的乳酸钠对磁细菌(格瑞菲斯瓦尔德磁螺菌)生长的影响。

图5显示不同氧浓度对磁细菌(格瑞菲斯瓦尔德磁螺菌)生长的影响。

                      具体实施方式

本发明的方法中，培养趋磁细菌的培养基中含有碳源、氮源和铁源，并且，碳源和氮源的比例应控制在一定范围。

本发明的培养基中所使用的碳源为一些有机酸或有机酸盐，如乙酸钠、苹果酸、琥珀酸钠、乳酸钠及它们的组合，优选有机酸盐。如果选择有机酸，需用NaOH调至中性以后使用。单一的碳源优选乙酸钠、苹果酸，更优选乳酸钠，其浓度应控制在1g/L～13g/L。也可使用混合碳源。

氮源可以选自硝酸盐或铵盐，优选铵盐，其中更优选氯化铵，其浓度控制在0.1g/L～1g/L。

铁源可以选自喹啉酸铁或硫酸亚铁，优选喹啉酸铁，浓度控制在20μM～150μM，优选20μM～50μM。

在本发明的具体实施方案中，所使用的培养基是Schuler培养基，其中含有如下成分：乙酸钠1.0g，NH₄Cl 0.1g，喹啉酸铁20μmol/L，酵母粉0.1g，K₂HPO₄ 0.5g，硫代乙醇酸钠0.05g，MgSO₄·7H₂O 0.1g，加蒸馏水至1000ml。

培养基的pH值控制在6.8～8.3之间，种子培养的起始pH优选7.0；深层培养前期(细胞生长期)的pH优选7.8，后期(磁颗粒合成期)的pH优选7.0。

本发明的一个具体实施方案中，在含有碳源、氮源和铁源的培养基中振荡培养趋磁细菌，获得种子培养液，其中所述培养基中碳氮比为4∶1～15∶1，pH值为6.8～8.3，初始氧分压控制在5％～21％。

种子培养过程中，氧分压的控制可以采用排水法进行。具体方法为：在60～500ml的血清瓶中装入蒸馏水50ml～450ml，塞上棉塞，灭菌后补无菌水至满，换无菌橡皮塞，利用针头通入无菌高纯氮气，同时插入无菌排水针头，直至无菌水全部被无菌氮气置换。然后用无菌注射器将瓶中一定量的无菌氮气置换为无菌空气，制备出一定初始氧分压的培养瓶。一般将初始氧分压控制在5％～21％之间，优选10％～21％，更优选10％～15％。

种子培养时，首先将菌种在半固体培养基上活化2～3次，每次3～5天。半固体培养基的琼脂浓度控制在0.1％～0.3％之间，优选0.1％～0.2％。然后将活化好的菌种转接至一定初始氧分压的培养瓶(瓶中用注射器注入1/2～1/3瓶体积的无菌培养基)，在30℃、60～150转/分的振荡培养条件下活化2～3次，每次接种量为10％。最后一次转接也可在塞上棉塞的三角瓶中振荡培养。经过这样培养的种子液的OD₆₀₀为0.4～1.8(种子液细胞密度OD₆₀₀的高低与培养基的种类密切相关)。

在本发明的另一个具体实施方案中，在含有碳源、氮源和铁源的培养基中通过深层培养法培养趋磁细菌，其中培养基中碳氮比为4∶1～15∶1，培养温度为25℃～35℃，pH值控制在7.0～7.8之间，氧分压控制在0.5％～21％之间，菌体生长完成后通过降低氧分压使细菌产生磁颗粒，然后收集菌体并提取磁颗粒。

液体深层培养时，培养基的成分与种子培养基的成分相同。pH值控制在7.0～7.8之间，氧分压控制在0.5％～21％之间，前期优选5～10％后期优选1％～3％。通气量控制在0.5L/min～2.0L/min之间，优选0.5L/min～1.0L/min。搅拌转速控制在200转/分～800转/分之间，优选300转/分～500转/分。培养温度为25℃～35℃，优选28℃～32℃。在5升、20升、80升自动发酵罐中装入培养基，灭菌冷却后接入10％的种子液，最终培养液的体积为罐体积的75％。培养周期为30～50小时，最终细胞密度OD₆₀₀稳定控制在1.8～2.2，磁颗粒产量在20mg/L～28mg/L(湿重)。

以下通过实施例更具体地说明本发明。应当理解，实施例仅为说明目的，并非限制本发明。

实施例：

实施例1：碳源种类对趋磁细菌生长的影响。

将Schuler培养基(乙酸钠1.0g，NH₄Cl 0.1g，喹啉酸铁20μmol/L，酵母粉0.1g，K₂HPO₄ 0.5g，硫代乙醇酸钠0.05g，MgSO₄·7H₂O 0.1g，加蒸馏水至1000ml，pH7.0)中的碳源分别用15mM(以碳原子摩尔数计，以下相同)的单一碳源乳酸钠、D，L-苹果酸、酒石酸钾钠、琥珀酸钠、柠檬酸钠及它们的两两组合取代(各7.5mM)，制备含有不同碳源及其组合的培养基各20ml。注入已预先制备好的含有O₂(5％)，N₂(95％)的60ml血清瓶中，将活化好的格瑞菲斯瓦尔德磁螺菌液体培养物2ml接种在Schuler培养基中，30℃，100r/min，振荡培养48小时，测OD₆₀₀。

结果见图2。结果表明，磁细菌(格瑞菲斯瓦尔德磁螺菌)能以乙酸钠、苹果酸、琥珀酸钠和乳酸钠作为单一碳源生长，苹果酸和乳酸钠明显优于乙酸钠和琥珀酸钠。在混合碳源中，乙酸钠+苹果酸、乙酸钠+酒石酸钾钠、乙酸钠+琥珀酸钠、酒石酸钾钠+苹果酸、酒石酸钾钠+琥珀酸钠均能生长。在这些组合中，以乙酸钠+苹果酸的组合最好。不能生长的组合碳源有乙酸钠+柠檬酸钠、酒石酸钾钠+柠檬酸钠、柠檬酸钠+苹果酸钠、柠檬酸钠+琥珀酸钠、苹果酸+琥珀酸钠。

实施例2：碳源浓度对趋磁细菌生长的影响。

A)分别用7.5、15、22.5、30、37.5、45及52.5mM(以碳原子摩尔数计，以下相同)的D，L-苹果酸代替Schuler培养基中的乙酸钠，NH₄Cl按比例增减，维持C∶N为10∶1。灭菌后各取20ml注入已预先制备好的含有O₂(5％)、N₂(95％)的60ml无菌血清瓶中，接种量10％，30℃，100r/min振荡培养48小时后，测定OD₆₀₀。

B)分别用1.3、2.6、6.5、13.0克的乳酸钠代替Schuler培养基中的乙酸钠，NH₄Cl按比例增减，以维持C∶N为10∶1。各取20ml装入60ml的血清瓶中，塞上棉塞，灭菌，接种量10％，30℃，100r/min振荡培养48小时，测定OD₆₀₀。

碳源浓度以苹果酸和乳酸钠浓度试验为例。实验结果分别见图3和图4。图3表明，当以苹果酸作为单一碳源时，最适合的浓度为7.5～15mM(0.25～0.5克/升)，当苹果酸浓度达到22.5mM(0.75克/升)时，磁细菌(格瑞菲斯瓦尔德磁螺菌)细胞生长受到明显抑制。

图4表明，当以乳酸钠为单一碳源时，最适合的浓度为6.5g/L，但浓度增加至13g/L也不抑制细胞生长。

实施例3：氧分压对生长及磁颗粒合成的影响。

以Schuler培养基加维生素和矿质元素混合液作为试验培养基，取20ml分别注入含有0、2.5％、5.0％、7.5％、10.0％、12.5％、15.0％、17.5％及21％O₂浓度的60ml血清瓶中，接种量10％，30℃，100r/min振荡培养24小时，测OD₆₀₀。

实验结果见图5。结果表明，磁螺菌对氧的耐受力较强，在摇床上振荡培养或在发酵罐中通空气培养细胞都能生长，但磁颗粒的合成必须限氧。

维生素混合液的组成如下：

生物素(Biotin)                                     2mg

叶酸(Folic acid)                                   2mg

盐酸吡哆辛(Pyridoxine-HCl)                         10mg

盐酸硫胺素(Thiamine-HCl·2H₂O)                    5mg

核黄素(Riboflavin)                                 5mg

烟酸(Nicotinic acid)                               5mg

泛酸钙(D-Ca-pantothenate)                          5mg

维生素B12(Vitamin B12)                             0.1mg

对-氨基苯甲酸(p-Aminobenzoic acid)                 5mg

硫辛酸(Lipoic acid)                                5mg

蒸馏水                                             至1000ml

矿质元素混合液的组成如下：

氨三乙酸(Nitrilotriacetic acid)                    1.5g

硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)                              3.0g

硫酸锰(MnSO₄·2H₂O)                              0.5g

氯化钠(NaCl)                                       1.0g

硫酸铁(FeSO₄·7H₂O)                              0.1g

硫酸钴(CoSO₄·7H₂O)                              0.18g

氯化钙(CaCl₂·2H₂O)                              0.1g

硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)                              0.18g

硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)                              0.01g

硫酸铝钾(KAl(SO₄)₂·12H₂O)                      0.02g

硼酸(H₃BO₃)                                      0.01g

钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O)                           0.01g

氯化镍(NiCl₂·6H₂O)                              0.025g

亚硒酸钠(Na₂SeO₃·5H₂O)                         0.3mg

蒸馏水                                             至1000ml

实施例4：液体深层培养

液体深层培养中使用的培养基组分如下(以1000ml计算)：

乳酸钠(60％-70％)                              6.5g

NH₄Cl                                         1.0g

Fe³⁺(喹啉酸铁)                                80μM

酵母粉                                         0.1g

K₂HPO₄                                      0.5g

硫代乙醇酸钠                                   0.05g

MgSO₄.7H₂O                                   0.1g

维生素混合液                                   10ml

矿质元素混合液                                 5ml

蒸馏水                                         至1000毫升

在5L自控发酵罐中装入3600ml培养基，灭菌冷却后，接入10％的种子液，控制温度为30℃、搅拌速度为400r/min、通气量为0.5L/min的情况下，通过改变氧浓度和pH值进行6批次的实验。其中氧浓度的改变是通过调节空气与氮气的比例来进行，氧浓度用气相色谱仪监测。培养完成后，按照以下方法提取磁颗粒。

磁颗粒提取与纯化：

A)培养液于4℃，5000r/min离心30min，去掉上清，加入10～20ml10mM HEPES缓冲液(pH7.4)，振荡悬浮。

B)合并悬浮液至100ml烧杯中进行超声波破碎。

C)烧杯底部加一块磁铁(约2000guass)，静置20～30min。

D)倾去上清液，加入30～50ml的10mM HEPES缓冲液(pH7.4)，振荡洗涤，磁铁收集，重复洗涤3～4次。

E)倾去上清液，加入10ml 0.2M PBS缓冲液(pH7.4)，4℃保存。

实验结果见以下表1。

                            表1 5L发酵罐中6批次试验结果

培养批次            前期           后期总时间(h)细胞密度(OD₆₀₀)磁性颗粒产量(mg/L)   pH  氧浓  度  (％)  培养  时间  (h)  pH  氧浓  度  (％)  培养  时间  (h)  1  7.2  10  17  --  --  --  17  0.8  无  2  7.2  3.5  14  --  --  --  14  1.0  无  3  7.8  5  18  --  --  --  18  1.9  无  4  7.8  21  20  7.0  2  20  40  2.1  25  5  7.0  21  20  7.0  1  20  40  0.7  20  6  7.8  10  20  7.0  1  20  40  2.0  28

由表1看出，磁螺菌在pH值7.0～7.8之间均可生长，但最适生长pH为7.8。当控制pH7.8、氧含量在3.5％～21％之间，细胞密度可达1.8～2.1OD₆₀₀，但没有磁颗粒合成。在培养20小时后，调节氧含量为1％～2％、pH7.0，磁颗粒开始积累，继续培养20小时，磁颗粒产量可达20mg/L～28mg/L。