百脉根花型和花序结构调控基因、编码蛋白及其应用

摘要

本发明提供了一种新的源自豆科模式植物百脉根(Lotus japonicus)的花型和花序结构调控蛋白LJCYC1和LJCYC2，编码LJCYC1和LJCYC2蛋白的多核苷酸。LJCYC1和LJCYC2编码基因参与了百脉根等豆科植物的花型和花序结构调控。本发明还提供了利用转基因技术异位表达LJCYC1和LJCYC2改变植物的花型和花序结构的方法，以及通过重组技术产生LJCYC1和LJCYC2蛋白的方法。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和植物学领域，具体地说，本发明涉及新的编码百脉根(Lotus japonicus)花型/花序结构调控蛋白LJCYCl和LJCYC2的多核苷酸，以及此多核苷酸编码的多肽。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的用途和制法。

背景技术

近十几年来，植物发育的分子遗传学取得了许多突破性进展。从分子遗传学的角度研究花发育的分子机理，主要是通过鉴别和克隆有关的调控基因，探讨这些基因的结构、时空表达模式以及生物学功能。

八十年代末，Coen博士的实验室首次提出在花发育的生物学过程中，存在着控制花型发育的背腹轴遗传机制。九十年代初，调控植物花发育的一系列基因相继被鉴别和克隆。在此基础上，已发展了广为公认的ABC模型，用于解释花器官发育的分子机理。罗达等人已从实验上证明了背腹轴遗传机制的存在，并首次在植物中克隆了控制花形状的基因Cycloidea(Cyc)(Luo D，et al.(1996)Nature.383：794-799；Luo D，et al.(1999)Cell，99：367-376)。在金鱼草中，Cyc基因家族成员的表达模式都具有不对称分布的特征：只在花原基的背部区域以及处于背部的花器官原基中表达。这种特殊的极性表达方式使Cyc基因家族在花发育的过程中具有早期和晚期两种生物学功能。在花发育的早期，Cyc基因家族在其表达的区域(背部区域)压抑了背部花器官原基的发生与生长，由此决定花器官原基的数目以及花器官原基发生的位置，最终为两侧对称花的发育确定背腹轴向。在花原基发育后期，Cyc基因家族成员只在背部花器官原基内表达。它们的功能具有非细胞自主性的特点，可决定每个花瓣的形态和形状。在金鱼草中，Cyc基因家族成员活性发生变化时，花形状变成全辐射对称，雌雄蕊外露。

由于植物的花型和花序结构是有花植物吸引动物传媒和被特异授粉者所识别的重要形态学特征；对于植物繁育系统的进化和生长发育具有重要作用，因此本领域迫切需要开发与花型/花序结构调控有关的各种基因及其表达产物。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的、在百脉根(Lotus japonicus Gifu cultivar)花型和花序结构发育过程中涉及的花型/花序结构调控蛋白LJCYC1和LJCYC2及其编码序列，以及它们片段、类似物和衍生物。

本发明的另一目的是提供生产这些花型/花序结构调控蛋白及其编码序列的制法，及其在改变植物花型和花序结构方面的用途。

在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的LJCYC1和LJCYC2多肽，该多肽是来自百脉根，它们选自下组：(a)含有SEQ ID NO：2或4氨基酸序列的多肽；(b)具有花型/花序结构调控功能的，多肽(a)的保守性变异多肽、或活性片段、或活性衍生物；(c)在SEQ ID NO：2或4限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或插入一个或几个氨基酸所衍生的，且具有花型/花序结构调控功能的蛋白。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO：2或4氨基酸序列的多肽。

在本发明的第二方面，提供编码分离的这些多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组：(a)编码如权利要求1所述多肽的多核苷酸；(b)SEQ ID NO：5中295-2018位的序列、SEQ ID NO：6中109-1583位的序列。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2或4所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列选自下组：(a)具有SEQ ID NO：1中1-1110位的序列；(b)具有SEQ ID NO：1中1-1239位的序列。

在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。

在本发明的第四方面，提供了花型/花序结构调控蛋白的制备方法，该方法包含：(a)在适合表达花型/花序结构调控蛋白的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出花型/花序结构调控蛋白。

在本发明的第五方面，提供了与上述的百脉根LJCYC1和LJCYC2多肽特异性结合的抗体。还提供了可用于检测的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中连续的15-1000个核苷酸。

在本发明的第六方面，提供了模拟、促进、拮抗百脉根LJCYC1和LJCYC2多肽活性的化合物，以及抑制百脉根LJCYC1和LJCYC2多肽的表达的化合物。还提供了筛选和/或制备这些化合物的方法。较佳地，该化合物是百脉根LJCYC1和LJCYC2多肽的编码序列或其片段的反义序列。

在本发明的第七方面，提供了本发明多肽和编码序列的用途，它们被用于改变植物的花型和花序结构。

在本发明的第八方面，提供了一种改变植物花型和花序结构的方法，包括步骤：(a)将本发明编码花型/花序结构调控蛋白的多核苷酸转入植物细胞；(b)将步骤(a)中的植物细胞再生成植株。

在一优选例中，所述的植物是豆科植物；更佳地，所述的植物选自：大豆、百脉根、豌豆等豆科作物和观赏植物。

本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1A和1B显示了本发明百脉根Ljcyc1和Ljcyc2的cDNA序列和氨基酸序列。

图2A和2B显示了本发明百脉根Ljcyc1和Ljcyc2的基因组序列，其中粗斜体表示内含子区域。

图3A-3K显示了含有百脉根Ljcyc1和Ljcyc2全长ORF或其片段的各质粒的图谱。

图4显示转入pCSL0072质粒后引起翼瓣旗瓣化。

图5显示转入pCSL0057后引起翼瓣龙骨瓣化。

图6显示转入pCSL0027质粒后引起龙骨瓣打开。

图7显示转入pCSL0066质粒后引起翼瓣和龙骨瓣形状改变。

图8显示转入pCSL0066质粒后产生双旗瓣表型(左侧为野生型花，右侧为转基因花)。

图9显示转入pCSL0057质粒后引起两朵花不同程度的融合。

图10显示转入pCSL0066质粒后在花序中产生新的花序。

图11显示转入pCSL0057质粒后产生在顶花结构(箭头所示位置为产生顶花结构的节)。

图12显示转入pCSL0057质粒后产生并生花序(箭头所示方向为产生并生花序的节位)。

具体实施方式

本发明经过深入而广泛的研究，从在豆科模式植物百脉根中分离出花型/花序结构调控蛋白LJCYC1，LJCYC2，它们控制豆科植物的花型和花序结构，对其活性进行调节可以产生具有不同花序结构和花型的植株，在此基础上完成了本发明。本发明人已证实，调节上述基因的活性和表达位置，可以产生花瓣的形状、数目、大小等花型特征和花朵的数目、排列方式、位置等花序结构特征发生改变的花序结构特征发生改变的植物，所以开发和利用这些基因在人工创造花卉新品种和改良作物异花受粉效率等方面具有很大的经济价值。

在本发明中，术语“LJCYC1蛋白”、“LJCYC1多肽”或“花型/花序结构调控蛋白LJCYC1”可互换使用，都指具有花型/花序结构调控蛋白LJCYC1氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的蛋白或多肽。术语“LJCYC2蛋白”、“LJCYC2多肽”或“花型/花序结构调控蛋白LJCYC2”可互换使用，都指具有花型/花序结构调控蛋白LJCYC2氨基酸序列(SEQ ID NO：4)的蛋白或多肽。

如本文所用，“花型/花序”指花型和/或花序。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的LJCYC1或LJCYC2蛋白多肽”是指LJCYC1或LJCYC2多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化LJCYC1或LJCYC2蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。

本发明还包括LJCYC1或LJCYC2蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然LJCYC1或LJCYC2蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列、分泌序列、或用来纯化此多肽的序列等)。根据本文的指导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“百脉根LJCYC1或LJCYC2多肽”指具有百脉根LJCYC1或LJCYC2蛋白活性的SEQ ID NO.2或4序列的多肽。该术语还包括具有与百脉根LJCYC1和LJCYC2蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2或4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括百脉根LJCYC1和LJCYC2蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与百脉根LJCYC1和LJCYC2 DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗百脉根LJCYC1和LJCYC2多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含百脉根LJCYC1和LJCYC2多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了百脉根LJCYC1和LJCYC2多肽的可溶性片段。通常，该片段具有百脉根LJCYC1和LJCYC2多肽序列的至少约至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供百脉根LJCYC1和LJCYC2蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然百脉根LJCYC1和LJCYC2多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。

在本发明中，“百脉根LJCYC1和LJCYC2蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：2和4的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

                        表1

最初的残基代表性的取代优选的取代Ala(A)Val；Leu；IleValArg(R)Lys；Gln；AsnLysAsn(N)Gln；His；Lys；ArgGlnAsp(D)GluGluCys(C)SerSerGln(Q)AsnAsnGlu(E)AspAspGly(G)Pro；AlaAlaHis(H)Asn；Gln；Lys；ArgArgIle(I)Leu；Val；Met；Ala；PheLeuLeu(L)Ile；Val；Met；Ala；PheIleLys(K)Arg；Gln；AsnArgMet(M)Leu；Phe；IleLeuPhe(F)Leu；Val；Ile；Ala；TyrLeuPro(P)AlaAlaSer(S)ThrThrThr(T)SerSerTrp(W)Tyr；PheTyrTyr(Y)Trp；Phe；Thr；SerPheVal(V)Ile；Leu；Met；Phe；AlaLeu

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链或双链。DNA可以是编码链或非编码链。对Ljcyc1而言，编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“Ljcyc1的简并变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。对Ljcyc2而言，编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：3所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。“Ljcyc2的简并变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：4的蛋白质，但与SEQ ID NO：3所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少60％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸，最佳地至少90％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码LJCYC1和LJCYC2蛋白的多聚核苷酸。

本发明的百脉根Ljcyc1和Ljcyc2核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用常规方法提取的DNA、或市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的载体和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或LJCYC1和LJCYC2蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的LJCYC1和LJCYC2多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码百脉根LJCYC1和LJCYC2多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，百脉根LJCYC1和LJCYC2完整多核苷酸序列或部分多核苷酸序列可正向或方向插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7的表达载体，在植物细胞中表达的pCAMBIA表达载体等。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含百脉根LJCYC1和LJCYC2编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体P_L启动子；农杆菌的Nos启动子，Ocs启动子，tml启动子；真核启动子包括泛素启动子，肌动蛋白启动子，RuBP羧化酶启动子，热击蛋白启动子等；植物病毒的CaMV 35S启动子，CaMV基因VI启动子；反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的β-葡萄糖酸酶基因(Gus基因)，氯霉素乙酰转移酶基因(Cat基因)，二氢叶酸还原酶(DHFR基因)、新霉素磷酸转移酶基因(Npt-II基因，潮霉素磷酸转移酶基因(HPT基因)，PPT乙酰转移酶基因(bar基因)以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质或抑制植物宿主细胞中对应蛋白的正常表达。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：细菌细胞如大肠杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。优选的是植物细胞，尤其是豆科植物的细胞，其中包括豆类作物，如大豆、花生、蚕豆、绿豆、扁豆等；牧草和绿肥作物，如苜蓿、紫云英、百脉根，三叶草等；药用植物，如决明、黄芪、苦参等；观赏植物，如金雀花、紫藤、香豌豆属、龙牙豆属等；绿化树种，如黄檀、凤凰木、格木、铁刀木、台湾相思等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转化和转染方法：根癌农杆菌Ti质粒介导的基因转化，发根农杆菌Ri质粒介导的基因转化，植物病毒载体介导的基因转化，磷酸钙共沉淀法，和DNA直接导入基因的转化方法如基因枪法，显微注射，电穿孔，超声波介导，激光微束介导，脂质体包装，物理诱导，化学诱导等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。通过常规的植物组织培养技术，可以将转化的植物细胞再生成完全的植株。在所获转基因植株中，Ljcyc1或Ljcyc2得以异位过量表达或抑制其正常表达，从而使植物的花型和花序结构发生变化，产生具有新表型的植株。本发明还包括用本发明方法获得的转基因植物及其子代，包括转基因植物与普通植物的杂交后代。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

重组的百脉根LJCYC1和LJCYC2蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)：用于改变植物的花型和花序，用于筛选促进或对抗LJCYC1和LJCYC2蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。

利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与LJCYC1和LJCYC2蛋白发生相互作用的物质，如受体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。当本发明蛋白激动剂或抑制剂等在农业上进行施用时，可提供不同的效果。

另一方面，本发明还提供了对百脉根LJCYC1和LJCYC2 DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。

豆科(Leguminosae)是被子植物中仅次于菊科和兰科的三个最大的科之一，约650属，18000种，广布于全世界。我国有172属，1485种，13亚种，153变种，16变型。豆科分为3个亚科：含羞草亚科(Mimosaceae)、云实亚科(Caesalpiniacae)和蝶形花亚科(Papilionaceae)。其中含羞草亚科花呈辐射对称，蝶形花亚科花呈两侧对称，而云实亚科界于二者之间，既有两侧对称花，又有辐射对称花。豆科植物具有重要的经济价值，是人类食品中淀粉、蛋白质、油和蔬菜的重要来源之一。

本发明不仅有助于了解豆科中Cyc基因家族功能的衍变与花型进化之间的关系，而且利用这两种基因及其类似基因可实现对植物花型的改造和新种质的培育，为创造植物的新品种开辟了新的途径。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1.百脉根中Ljcyc1和Ljcyc2基因的分离

根据TCP结构域序列，设计简并性引物和特异性引物(表A)，以百脉根(Lotusjaponicus Gifu cultivar)花芽发育早期顶端分生组织中的mRNA的反转录产物为模板B26为引物合成cDNA第一条连，通过5’RACE和3’RACE的方法从豆科模式植物百脉根花芽材料中分离到Ljcyc1和Ljcyc2基因。具体而言，用引物GPcyc2和B25来获得Ljcyc1的3′端；用引物G3768和引物GrPcyc1来获得Ljcyc1的5′端；用引物SL0146和引物SL0147来获得Ljcyc1的编码区。用引物GPcyc1和B25来获得Ljcyc2的3′端；用引物G3768和引物GrPcyc2来获得Ljcyc2的5′端；用引物G3889和引物SL0067来获得Ljcyc2的编码区。Ljcyc1 cDNA编码区长1110bp(SEQID NO：1)，编码370个氨基酸(图1A和SEQ ID NO：2)；Ljcyc2 cDNA编码区长1239bp(SEQ ID NO：3)，编码413个氨基酸(图1B和SEQ ID NO：4)。

利用LJCYC1和LJCYC2基因筛选基因组文库，获得了它们的基因克隆。比较cDNA和基因组序列发现：Ljcyc1在-235位处存在CAAT盒(box)，-139位为转录其始位点，在+1158位存在一个612bp的内含子，终止密码在+1815位(图2A)；Ljcyc2在+1187位存在一个235bp的内含子，终止密码在+1476位(图2B)。

                                    表A

引物名称    序列(5’至3’) SEQ ID NO：B26 5′-GAC-TCG-AGT-CGA-CAT-CGA-(T)₁₇-3′    7GPcyc2 5′-AGC-AAC/T-ACA/G-CTT/C-GAG/A-TGG-C-3′    8B25 5′-GAC-TCG-AGT-CGA-CAT-CG-3′    9G3768 5′-CTA-GGC-CAC-GCG-TGG-ACT-AGT-AC-3′    10GrPcy1 5′-GCC/T-TTG/A-TCG/A-AAC-CCC/T-AGC-AT-3′    11S10146^* 5′-AAGCTTCA-CTG-CAA-AAT-CTT-CAG-ATG-3′    12SL0428 5′-GTG-TAG-TAG-AGG-ACT-GGT-G-3′    13GPcyc1 5′-ATG-CTA/C-GGG-TTT/C-GAC/T-AAA/G-GC-3′    14GrPcyc2 5′-GCC-TT/CT-CA/GA-GC/TG-TA/GT-TGC-T-3′    15G3889 5′-TCT-TCA-AAT-GTT-CCC-TTT-C-3′    16S10067 5′-CTA-GTG-ACG-TGG-ATT-TGT-GC-3′    17

注：引物S10146带HindIII位点。

实施例2.百脉根Ljcyc1和Ljcyc2基因的时空表达

按常规方法进行Southern杂交，结果证明这些基因在百脉根中以单拷贝形式存在(数据未示出)。

百脉根(Lotus japonicus Gifu cultivar)在温室种植后20天开始采样，每天取材一次，每次20株，15株用于原位杂交材料的包埋，5株用于扫描电镜观察。根据扫描电镜结果和冯献忠和罗达方法(1999，原位杂交，《现代植物生理学实验指南》，科学出版社)，分别对营养时期和生殖生长不同阶段的材料制片和杂交。杂交温度50℃，每毫升杂交液中含有10×salts 125μl、去离子甲酰胺500μl、tRNA(100mg/ml)12.5μl、50×Denhardt′s 25μl、50％硫酸葡聚糖(dextransulphate)250μl和DEPC-水87.5μl。

原位杂交结果显示：

(a)Ljcyc1在营养生长期向生殖生长转化时，在顶端分生组织中表达，通常表达部位在顶端分生组织的一侧；在花序生长进入I5期后，Ljcyc1在花序原基中央起始表达，并逐渐向背部区域延伸(I6期-I7期)。与Ljcyc2的表达不同，在花原基发育的前期(F0-F4期)，Ljcyc1在花原基中央和背部形成一个楔型的表达区域；当花原基发育进入F5期后，Ljcyc1的表达集中在背部的萼片、花瓣和雌蕊中；F6期以后，表达集中于背部花瓣。

(2)Ljcyc2首先进入生殖生长期的茎顶端分生组织的侧部表达，位于即将起始花序原基与茎顶端分生组织划分处(I0期)，并维持到花序原基的起始(I1期)；随着花序原基的生长，其表达区域局限在花序原基同顶端分生组织的连接处(I2期-I3期)，表达减弱并逐渐消失。花序原基进入I4期后，Ljcyc2在花序原基中央重新起始表达。当花序原基开始分化形成花原基时，Ljcyc2的表达区域逐渐由花序的中央转移到花原基的背部(I6期-I7期)。在花原基发育的前期(F0-F4期)，Ljcyc2的表达在花原基的背部；当花原基发育进入F5期后，其表达集中在背部的花瓣和萼片中；F6期以后，其表达集中于背部花瓣。

实施例3.调控Ljcyc1和Ljcyc2基因表达的工程质粒

为了鉴定所获Ljcyc1和Ljcyc2基因的功能，利用表B中所示的引物获得各种基因片段，然后经酶切后与载体pBIN19、pCAMBIA1300和pCAMBIA1301(这些载体具有双35S启动子)连接，构建了含有不同基因片段的十一种工程质粒编号分别为：pCSL0027，pCSL0053，pCSL0054，pCSL0056，pCSL0057，pCSL0058，pCSL0059，pCSL0060，pCSL0061，pCSL0062，pCSL0063，pCSL0065，pCSL0066，pCSL0071，pCSL0072。这些质粒的具体信息如图C，图谱见图3A-3K。

                                 表B

  引物名称    序列(5’至3’)SEQ ID NO：  G4000  5′-CCA-TCA-ATC-CAT-GGT-CCC-TTT-CAG-CTC-AAG-CCC-TTA-CC-3′    18  G4001  5′-CCT-CTA-GAG-GAT-CCT-CAC-AAT-GGA-TTC-CTC-AAT-AAC-3′    19  G3849  5′-GGA-CAG-AAA-AGT-TAC-TGG-TG-3′    20  G3848  5′-CCA-CAC-TTT-AAA-TAT-TGG-TC-3′    21

                                           表C

质粒名称    插入基因 引物    酶切    位点  插入  方向  载体 pCSL0027  Ljcyc2起始密码子后960bp片段 G4000/G4001 KpnI/EcoRV  反向pBIN19 pCSL0053  Ljcyc2 ORF G3889/SL0067 SacI/EcoRV  正向pCAMBIA1300 pCSL0054  Ljcyc2 ORF G3889/SL0067 SacI/EcoRV  正向pCAMBIA1301 pCSL0056  Ljcyc2 ORF+3′-UTR 126bp G3889/G3849 SacI/EcoRV  反向pCAMBIA1300 pCSL0057  Ljcyc2 ORF+3′-UTR 126bp G3889/G3849 SacI/EcoRV  反向pCAMBIA1301 pCSL0058  Ljcyc1 3′端896bp Gpcyc1/G3848 SacI/EcoRV  反向pCAMBIA1300 pCSL0059  Ljcyc1 3′端896bp Gpcyc1/G3848 SacI/EcoRV  反向pCAMBIA1301 pCSL0065 126^*+126 3′端183bp SacI/EcoRV  反向pCAMBIA1300 pCSL0066 126+126 3′端183bp SacI/EcoRV  反向pCAMBIA1301 pCSL0071 Ljcyc2 ORF+3′-UTR 126bp G3889/G3849 SacI/EcoRV  正向pCAMBIA1300 pCSL0072 Ljcyc2 ORF+3′-UTR 126bp G3889/G3849 SacI/EcoRV  正向pCAMBIA1301

^*126为Ljcyc1 5′-RACE产物，全长316bp，由引物G3768/GrPcyc1扩增而来。

实施例4.农杆菌介导的百脉根高效转化豆科植物

建立了以百脉根下胚轴为材料，由农杆菌介导的稳定高效转化体系，将实施例3中制备的各质粒转入。在4-5个月内可以获得抗性植株，转化率约为10％。

具体实施过程如下：

将百脉根的种子用砂纸磨毛，浸入0.1％升汞溶液12-15分钟，然后用无菌水洗涤数次。灭菌以后的种子接种至无激素的MS固体培养基上，在25℃±2℃下暗培养至种子发芽，然后转至每日16h光/8h暗、2000Lux光照条件下生长7-10天。在超净台上切取7-10天苗龄的百脉根的无菌苗下胚轴约0.5cm长的切段接种至愈伤组织诱导培养基上，暗中预培养2天。

含转化质粒的菌株在MG培养基上进行繁殖和保存。液体悬浮培养时，从固体培养基上挑选含挑选含目的基因质粒的LBA4404菌株的单菌落接种至3ml MG+100mg/L利福平(rif)+25mug/L链霉素(str)+50mg/L卡那霉素(Km)的培养液中，28℃、200rpm摇床上振荡培养24h，然后以1∶100的稀释比例扩大培养16h左右。

将预培养2天的百脉根的下胚轴分别浸入预先准备好的菌液(0.D600值为0.5左右)中15-20分钟，然后用无菌滤纸吸干多余的菌液，转移至愈伤组织诱导培养基上，共培养2-3天。将共培养后的外植体分别转移至附加羧苄霉素(Cb)300mg/L和Hygromycin 15mg/L的B5筛选培养基上，继续光照培养，筛选转化体。筛选期间，每两周更换一次筛选培养基。30天左右可筛选到抗性愈伤。将筛选得到的抗性愈伤转移至分化培养基上进行分化试验。六周左右可陆续分化出抗性芽，然后将抗性芽转移至伸长培养基上，待苗长至2-3cm左右时，切下并转移至附加NAA0.5mg/L的1/2 B5生根培养基上诱导生根。30天左右陆续诱导出根，然后洗净根上所带的培养基，剪掉发黄、变褐的叶子，将小苗移栽到花盆中，加少量水，先在光照培养箱下放3-4天，使其长出新根，然后再转放到人工气候室中，观察其生长情况。

结果

1.改变花型的转基因植株

野生型百脉根每朵花的5枚花瓣具三种不同类型，其中腹部花瓣(龙骨瓣)2枚，背部花瓣(旗瓣)1枚，侧部花瓣(翼瓣)2枚。腹部花瓣和侧部花瓣的本身形状是不对称的，而背部花瓣为两侧对称型。在导入Licyc2正义工程质粒pCSL0072后，转基因植株I-9的两个侧部的翼瓣出现背部的旗瓣的特征(图4)。而在转入Ljcyc2的反义工程质粒pCSL0057的转基因植株中，两个侧部的翼瓣呈现腹部龙骨瓣的特征，背部花瓣一侧出现缺裂(图5)。在另一种转入含反向Ljcyc2的pCSL0027的转基因植株中，腹部龙骨瓣打开，翼瓣呈现腹部龙骨瓣的特征(图6)。在野生型的百脉根中，就单个花瓣而言，其背部旗瓣为两侧对称，而侧部的翼瓣和腹部的龙骨瓣均为不对称。在转入含反向Ljcyc1的pCSL0066质粒转基因植株中，背部的花瓣除体积变小外形状没有变化，但侧部的翼瓣和腹部的龙骨瓣发生了变化(图7)。

除了对花瓣形态的改变以外，Ljcyc1和Ljcyc2基因改变花型的另一类重要表型为花器官数目的改变，野生型百脉根每朵花具三种不同类型的5枚花瓣，而转入含反向Ljcyc1的pCSL0066质粒转基因植株中，获得了稳定遗传的有两个旗瓣的花，在这种类型的花中，花瓣为6枚(图8)。在转入含反向Ljcyc2的pCSL0057质粒转基因植株中，更多得是观察到两朵花融合的情况(图9)。

2.改变花序结构的转基因植株

野生型百脉根为腋生的伞型花序，在Ljcyc2的转基因植物中，花序的结构经常发生变化。这些变化主要包括三种：在次级花序中有出现新一级的花序(图10)；茎顶端被次级花序替代(图11)；在同一节出现两个并生的次级花序(图12)。

因此，Ljcyc2基因的功能应与多个发育途径有关：(1)次级花序原基从初级花序原基周缘区域的发育，(2)调控次级花序原基以及花芽的分化(3)建立花芽原基之间的边界。同时，Ljcyc1基因通过参与(1)背部花瓣原基的起始，(2)背部花瓣数目的决定，(3)改变侧部翼瓣和腹部龙骨瓣本身的形态而实现对百脉根花型的控制。

综上所述，百脉根Ljcyc1与Ljcyc2都可以参与调控植物的花型和花序结构。它们通过影响花器官起始的位置和属性，决定不同位置花瓣的形态建成。实施例5 LJCYC1与LJCYC2蛋白重组表达和纯化

为了研究LJCYC1与LJCYC2蛋白的生化功能和蛋白不同区段的功能，将它们全长和部分编码区在原核生物中进行体外表达。

(a)LJCYC2的表达

将Ljcyc2的ORF区以及在引物G4000/G4001之间的部分ORF区，并将其克隆到pET32C载体中，构建了Ljcyc2-Txr融合表达的质粒pCSL099和pCSL0100。转化表达宿主菌BL21(DE3)，用IPTG诱导LJCYC2融合蛋白表达，并用Ni柱纯化LJCYC2融合蛋白。将纯化的LJCYC2融合蛋白免疫兔，得到了抗LJCYC2的兔血清。

对抗Ljcyc2的兔血清进行了效价测定，在对不同来源百脉根植物材料的总蛋白进行Western blot测定时，只有在花芽材料中有阳性信号，而在Ljcyc2基因无表达的叶片等材料中无表达。此抗血清已成功的应用于转基因植物的分析鉴定。

(a)LJCYC1的表达

按与(a)相同的方式表达LJCYC1，不同点仅在于用LJCYC1的编码序列代替LJCYC2的编码序列。结果同样获得了LJCYC1的重组蛋白。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                序列表<110>中国科学院上海植物生理研究所<120>百脉根花型和花序结构调控基因、编码蛋白及其应用<130>023361<160>21<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>1113<212>DNA<213>百脉根(Lotus japonicus)<220><221>CDS<222>(1)..(1110)<400>1atg ttc cct aat tcc agt tac cct tac cct tat ttt cct tct tcc tca     48Met Phe Pro Asn Ser Ser Tyr Pro Tyr Pro Tyr Phe Pro Ser Ser Ser1               5                   10                  15tct tct tct cct tca cca tac cct cct ttc aat ttc ctc aac cct gga     96Ser Ser Ser Pro Ser Pro Tyr Pro Pro Phe Asn Phe Leu Asn Pro Gly

        20                  25                  30aat gct tca aca aac aac atc ttc ctc cat gac cct cct cct ctt cct    144Asn Ala Ser Thr Asn Asn Ile Phe Leu His Asp Pro Pro Pro Leu Pro

    35                  40                  45tct gtc ccc tac aca aac aac acc acc aac act cac cac cac cat gcc    192Ser Val Pro Tyr Thr Asn Asn Thr Thr Asn Thr His His His His Ala

50                  55                  60cct cca acc tgc tca gaa acc ttc acc aat tgg gca ctt gca gat gca    240Pro Pro Thr Cys Ser Glu Thr Phe Thr Asn Trp Ala Leu Ala Asp Ala65                  70                  75                  80atg ctc aag caa gaa aac ctc act ggt ggg ccc cac cat cac tac aac    288Met Leu Lys Gln Glu Asn Leu Thr Gly Gly Pro His His His Tyr Asn

            85                  90                  95ctc tcc aac ttc ctc acc aga aaa cta cca gca gca aaa aaa cca gcc    336Leu Ser Asn Phe Leu Thr Arg Lys Leu Pro Ala Ala Lys Lys Pro Ala

        100                 105                 110aag aag gac agg cac agc aag att cac acc tct cag ggc ttg agg gac    384Lys Lys Asp Arg His Ser Lys Ile His Thr Ser Gln Gly Leu Arg Asp

    115                 120                 125agg agg gtg agg ctt tca atc gag atc gcg cga aag ttc ttc gat ctt    432Arg Arg Val Arg Leu Ser Ile Glu Ile Ala Arg Lys Phe Phe Asp Leu

130                 135                 140caa gac atg tta ggg ttt gac aaa gcc agc aat acc ctc gag tgg ctc    480Gln Asp Met Leu Gly Phe Asp Lys Ala Ser Asn Thr Leu Glu Trp Leu145                 150                 155                 160ttc agc aaa tca aac aaa gca att gaa gag ctt ttc aga agc aag cat    528Phe Ser Lys Ser Asn Lys Ala Ile Glu Glu Leu Phe Arg Ser Lys His

            165                 170                 175agt gat aat aac aat agc act ggt gct tgt gct gct gat ggt gat ggt    576Ser Asp Asn Asn Asn Ser Thr Gly Ala Cys Ala Ala Asp Gly Asp Gly

        180                 185                 190gat ggt gat gat gac agc ttc tcc tct tcc tct tca gaa gat gaa gtt     624Asp Gly Asp Asp Asp Ser Phe Ser Ser Ser Ser Ser Glu Asp Glu Val

    195                 200                 205gtt tct gtg aaa agg gca cag aaa gaa aaa gaa cct tct ggt gtt caa     672Val Ser Val Lys Arg Ala Gln Lys Glu Lys Glu Pro Ser Gly Val Gln

210                 215                 220gca aag atg aag gaa tca agg gaa aaa gca agg gca aga gca agg gaa     720Ala Lys Met Lys Glu Ser Arg Glu Lys Ala Arg Ala Arg Ala Arg Glu225                 230                 235                 240agg act agt aac aag atg tgc cct gaa act gaa aat cct caa atg cag     768Arg Thr Ser Asn Lys Met Cys Pro Glu Thr Glu Asn Pro Gln Met Gln

            245                 250                 255ctt cac caa ttc agt tca gag ttt cag cct cat cag gaa ctg cat aga     816Leu His Gln Phe Ser Ser Glu Phe Gln Pro His Gln Glu Leu His Arg

        260                 265                 270gat gat gat ttc aag gtt ttt gag gaa tcc att gtg atc aag agg aag     864Asp Asp Asp Phe Lys Val Phe Glu Glu Ser Ile Val Ile Lys Arg Lys

    275                 280                 285ttg aag caa tca ttg atg tct tct tct cat cat cac cag aac caa aac     912Leu Lys Gln Ser Leu Met Ser Ser Ser His His His Gln Asn Gln Asn

290                 295                 300att ggg atc cct aag gaa gca agt ttc aac aac aac aac aat agt gag     960Ile Gly Ile Pro Lys Glu Ala Ser Phe Asn Asn Asn Asn Asn Ser Glu305                 310                 315                 320tgt ccc tct tcc ttc cct atg tct cca aat tgg gat gct agt ggt gcc    1008Cys Pro Ser Ser Phe Pro Met Ser Pro Asn Trp Asp Ala Ser Gly Ala

            325                 330                 335act cca cgc tca aac att tgt gca ata gcc agc gtg aat ctc tca aca    1056Thr Pro Arg Ser Asn Ile Cys Ala Ile Ala Ser Val Asn Leu Ser Thr

        340                 345                 350ggg ctt caa atc ttt gga aaa tct tgg gag gag tgc acc agt cct cat    1104Gly Leu Gln Ile Phe Gly Lys Ser Trp Glu Glu Cys Thr Ser Pro His

    355                 360                 365cta cac taa                                                        1113Leu His

370<210>2<211>370<212>PRT<213>百脉根(Lotus japonicus)<400>2Met Phe Pro Asn Ser Ser Tyr Pro Tyr Pro Tyr Phe Pro Ser Ser Serl               5                   10                  15Ser Ser Ser Pro Ser Pro Tyr Pro Pro Phe Asn Phe Leu Asn Pro Gly

        20                  25                  30Asn Ala Ser Thr Asn Asn Ile Phe Leu His Asp Pro Pro Pro Leu Pro

    35                  40                  45Ser Val Pro Tyr Thr Asn Asn Thr Thr Asn Thr His His His His Ala

50                  55                  60Pro Pro Thr Cys Ser Glu Thr Phe Thr Asn Trp Ala Leu Ala Asp Ala65                  70                  75                  80Met Leu Lys Gln Glu Asn Leu Thr Gly Gly Pro His His His Tyr Asn

            85                  90                  95Leu Ser Asn Phe Leu Thr Arg Lys Leu Pro Ala Ala Lys Lys Pro Ala

        100                 105                 110Lys Lys Asp Arg His Ser Lys Ile His Thr Ser Gln Gly Leu Arg Asp

    115                 120                 125Arg Arg Val Arg Leu Ser Ile Glu Ile Ala Arg Lys Phe Phe Asp Leu

130                 135                 140Gln Asp Met Leu Gly Phe Asp Lys Ala Ser Asn Thr Leu Glu Trp Leu145                 150                 155                 160Phe Ser Lys Ser Asn Lys Ala Ile Glu Glu Leu Phe Arg Ser Lys His

            165                 170                 175Ser Asp Asn Asn Asn Ser Thr Gly Ala Cys Ala Ala Asp Gly Asp Gly

        180                 185                 190Asp Gly Asp Asp Asp Ser Phe Ser Ser Ser Ser Ser Glu Asp Glu Val

    195                 200                 205Val Ser Val Lys Arg Ala Gln Lys Glu Lys Glu Pro Ser Gly Val Gln

210                 215                 220Ala Lys Met Lys Glu Ser Arg Glu Lys Ala Arg Ala Arg Ala Arg Glu225                 230                 235                 240Arg Thr Ser Asn Lys Met Cys Pro Glu Thr Glu Asn Pro Gln Met Gln

            245                 250                 255Leu His Gln Phe Ser Ser Glu Phe Gln Pro His Gln Glu Leu His Arg

        260                 265                 270Asp Asp Asp Phe Lys Val Phe Glu Glu Ser Ile Val Ile Lys Arg Lys

    275                 280                 285Leu Lys Gln Ser Leu Met Ser Ser Ser His His His Gln Asn Gln Asn

290                 295                 300Ile Gly Ile Pro Lys Glu Ala Ser Phe Asn Asn Asn Asn Asn Ser Glu305                 310                 315                 320Cys Pro Ser Ser Phe Pro Met Ser Pro Asn Trp Asp A1a Ser G1y A1a

            325                 330                 335Thr Pro Arg Ser Asn Ile Cys Ala Ile Ala Ser Val Asn Leu Ser Thr

        340                 345                 350Gly Leu Gln Ile Phe Gly Lys Ser Trp Glu Glu Cys Thr Ser Pro His

    355                 360                 365Leu His

370  <210>3<21l>1245<212>DNA<213>百脉根(Lotus japonicus)<220><221>CDS<222>(1)..(1239)<400>3atg ttc cct ttc agc tca agc cct tac cct tcc ttt cct tca tct tct     48Met Phe Pro Phe Ser Ser Ser Pro Tyr Pro Ser Phe Pro Ser Ser Ser1               5                   10                  15tct tct cct ttc cac cct ttt tct ttc ctc aat cct gaa aat gtt tca     96Ser Ser Pro Phe His Pro Phe Ser Phe Leu Asn Pro Glu Asn Val Ser

        20                  25                  30gca agt aac aac acc ctt gtt ctt gat cca ctt tct gtt ccc tac ata    144Ala Ser Asn Asn Thr Leu Val Leu Asp Pro Leu Ser Val Pro Tyr Ile

    35                  40                  45cca caa act cac cac cac cac cac cac cat cac aac aac cct cca gca    192Pro Gln Thr His His His His His His His His Asn Asn Pro Pro Ala

50                  55                  60ctc cca gaa aca cta acc aat tta gcg gtt gcc ggc agt cct gat aac    240Leu Pro Glu Thr Leu Thr Asn Leu Ala Val Ala Gly Ser Pro Asp Asn65                  70                  75                  80tgt ttc gca atg cct aaa cca gat cct agt ggc cct cac tat ggc att    288Cys Phe Ala Met Pro Lys Pro Asp Pro Ser Gly Pro His Tyr Gly Ile

            85                  90                  95tcc tgt ctc ctc act aag aga cca gct aag aaa gac cgg cac agc aag    336Ser Cys Leu Leu Thr Lys Arg Pro Ala Lys Lys Asp Arg His Ser Lys

        100                 105                 110att tac acc tct cag ggg ctg agg gac cgg agg gtg agg ctc tca atc    384Ile Tyr Thr Set Gln Gly Leu Arg Asp Arg Arg Val Arg Leu Ser Ile

    115                 120                 125gag atc gca aga aag ttc ttt gat ctt caa gac atg ctg ggg ttt gat    432Glu Ile Ala Arg Lys Phe Phe Asp Leu Gln Asp Met Leu Gly Phe Asp

130                 135                 140aag gcc cgc aac acc ctc gag tgg ctc ttc aac aag tcc aag aga gcc    480Lys Ala Arg Asn Thr Leu Glu Trp Leu Phe Asn Lys Ser Lys Arg Ala145                 150                 155                 160atc aag gat ttc gct cgg agc aag aac agc aac agt ggt ggt ggt ggt    528Ile Lys Asp Phe Ala Arg Ser Lys Asn Ser Asn Ser Gly Gly Gly Gly

            165                 170                 175gac cat gac aac aac aag agc ttc tct tcc gaa gaa gat gaa gac tgt    576Asp His Asp Asn Asn Lys Ser Phe Ser Ser Glu Glu Asp Glu Asp Cys

        180                 185                 190gaa gtt gtc tca tca aac cta caa caa gat caa gag caa agg tta gat    624Glu Val Val Ser Ser Asn Leu Gln Gln Asp Gln Glu Gln Arg Leu Asp

    195                 200                 205tca aac cat aat aaa ggg ggt ggt gct gaa aaa gag ctg ttg aat aag    672Ser Asn His Asn Lys Gly Gly Gly Ala Glu Lys Glu Leu Leu Asn Lys

210                 215                 220ttg aaa agg gca cag aag gaa cct tct tgt gct cgt gca aag ata aag     720Leu Lys Arg Ala Gln Lys Glu Pro Ser Cys Ala Arg Ala Lys Ile Lys225                 230                 235                 240gaa tca agg gag aaa gca aga gca aga gca agg gaa agg aca agt aac     768Glu Ser Arg Glu Lys Ala Arg Ala Arg Ala Arg Glu Arg Thr Ser Asn

            245                 250                 255aag atc tgc aac aac aac aac aac acc acg ctg aag aaa aag ctc cct     816Lys lle Cys Asn Asn Asn Asn Asn Thr Thr Leu Lys Lys Lys Leu Pro

        260                 265                 270gct act gaa aac tct cta atc tta cag caa cca aag tct cca cca agg     864Ala Thr Glu Asn Ser Leu Ile Leu Gln Gln Pro Lys Ser Pro Pro Arg

    275                 280                 285atg ctt cac cac cct cac cct cat cat ctt cat cac cac ctt gtg ggc     912Met Leu His His Pro His Pro His His Leu His His His Leu Val Gly

290                 295                 300ggt gag gcg cca aga gat gac ttc aac gtt att gag gaa tcc att gtg     960Gly Glu Ala Pro Arg Asp Asp Phe Asn Val Ile Glu Glu Ser Ile Val305                 310                 315                 320atc aag aga aaa ttg aag cca tgg ttg atg tct tct tct tct cat cat    1008Ile Lys Arg Lys Leu Lys Pro Trp Leu Met Ser Ser Ser Ser His His

            325                 330                 335cat cat cac caa caa caa caa cac cat aat ctt gtg atc cct aag gaa    1056His His His Gln Gln Gln Gln His His Asn Leu Val Ile Pro Lys Glu

        340                 345                 350ggg agt ttc aac aac aac agt gaa tac cac tcc ttc ccc aat tca tct    1104Gly Ser Phe Asn Asn Asn Ser Glu Tyr His Ser Phe Pro Asn Ser Ser

    355                 360                 365cca aat tgg gat aac aac act agc aac agt gcc act agc cgc tcc aac    l152Pro Asn Trp Asp Asn Asn Thr Ser Asn Ser Ala Thr Ser Arg Ser Asn

370                 375                 380ttt tgt aca ata gcc agc atg aac cta tca aca ggg ctc caa atc ttt    1200Phe Cys Thr Ile Ala Ser Met Asn Leu Ser Thr Gly Leu Gln Ile Phe385                 390                 395                 400gga aag tct tgg gag gag tgc aca aat cca cgt cca cac tag taa        1245Gly Lys Ser Trp Glu Glu Cys Thr Asn Pro Arg Pro His

            405                 410<210>4<21l>413<212>PRT<213>百脉根(Lotus japonicus)<400>4Met Phe Pro Phe Ser Ser Ser Pro Tyr Pro Ser Phe Pro Ser Ser Ser1               5                   10                  15Ser Ser Pro Phe His Pro Phe Ser Phe Leu Asn Pro Glu Asn Val Ser

        20                  25                  30Ala Ser Asn Asn Thr Leu Val Leu Asp Pro Leu Ser Val Pro Tyr Ile

    35                  40                  45Pro Gln Thr His His His His His His His His Asn Asn Pro Pro Ala

50                  55                  60Leu Pro Glu Thr Leu Thr Asn Leu Ala Val Ala Gly Ser Pro Asp Asn65                  70                  75                  80Cys Phe Ala Met Pro Lys Pro Asp Pro Ser Gly Pro His Tyr Gly Ile

            85                  90                  95Ser Cys Leu Leu Thr Lys Arg Pro Ala Lys Lys Asp Arg His Ser Lys

        100                 105                 110Ile Tyr Thr Ser Gln Gly Leu Arg Asp Arg Arg Val Arg Leu Ser Ile

    115                 120                 125Glu Ile Ala Arg Lys Phe Phe Asp Leu Gln Asp Met Leu Gly Phe Asp

130                 135                 140Lys Ala Arg Asn Thr Leu Glu Trp Leu Phe Asn Lys Ser Lys Arg Ala145                 150                 155                 160Ile Lys Asp Phe Ala Arg Ser Lys Asn Ser Asn Ser Gly Gly Gly Gly

            165                 170                 175Asp His Asp Asn Asn Lys Ser Phe Ser Ser Glu Glu Asp Glu Asp Cys

        180                 185                 190Glu Val Val Ser Ser Asn Leu Gln Gln Asp Gln Glu Gln Arg Leu Asp

    195                 200                 205Ser Asn His Asn Lys Gly Gly Gly Ala Glu Lys Glu Leu Leu Asn Lys

210                 215                 220Leu Lys Arg Ala Gln Lys Glu Pro Ser Cys Ala Arg Ala Lys Ile Lys225                 230                 235                 240Glu Ser Arg Glu Lys Ala Arg Ala Arg Ala Arg Glu Arg Thr Ser Asn

            245                 250                 255Lys Ile Cys Asn Asn Asn Asn Asn Thr Thr Leu Lys Lys Lys Leu Pro

        260                 265                 270Ala Thr Glu Asn Ser Leu Ile Leu Gln Gln Pro Lys Ser Pro Pro Arg

    275                 280                 285Met Leu His His Pro His Pro His His Leu His His His Leu Val Gly

290                 295                 300Gly Glu Ala Pro Arg Asp Asp Phe Asn Val Ile Glu Glu Ser Ile Val305                 310                 315                 320Ile Lys Arg Lys Leu Lys Pro Trp Leu Met Ser Ser Ser Ser His His

            325                 330                 335His His His Gln Gln Gln Gln His His Asn Leu Val Ile Pro Lys Glu

        340                 345                 350Gly Ser Phe Asn Asn Asn Ser Glu Tyr His Ser Phe Pro Asn Ser Ser

    355                 360                 365Pro Asn Trp Asp Asn Asn Thr Ser Asn Ser Ala Thr Ser Arg Ser Asn

370                 375                 380Phe Cys Thr Ile Ala Ser Met Asn Leu Ser Thr Gly Leu Gln Ile Phe385                 390                 395                 400Gly Lys Ser Trp Glu Glu Cys Thr Asn Pro Arg Pro His

            405                 410<210>5<211>2289<212>DNA<213>百脉根(Lotus japonicus)<400>5gtccagtcca ccacacccag atagatatgg aggtttctta ctgtgtaaac ccaacccgag      60ttcaatctca ttggcctaaa tgaaatcctt cctctcatca gtttctttca aaccactttc     120caacctttct ccttggctgt gttatacttc ttcctactca tcatcatcat aaccagttcc     180tttaatttca tctgacaact gaaaggtact ttgaatctga gaaaaagaac ctagccattt     240catcatcaca aacaagaaca tagctagggt ttttgtccac tgcaaaatct tcagatgttc     300cctaattcca gttaccctta cccttatttt ccttcttcct catcttcttc tccttcacca     360taccctcctt tcaatttcct caaccctgga aatgcttcaa caaacaacat cttcctccat     420gaccctcctc ctcttccttc tgtcccctac acaaacaaca ccaccaacac tcaccaccac     480catgcccctc caacctgctc agaaaccttc accaattggg cacttgcaga tgcaatgctc     540aagcaagaaa acctcactgg tgggccccac catcactaca acctctccaa cttcctcacc     600agaaaactac cagcagcaaa aaaaccagcc aagaaggaca ggcacagcaa gattcacacc     660tctcagggct tgagggacag gagggtgagg ctttcaatcg agatcgcgcg aaagttcttc     720gatcttcaag acatgttagg gtttgacaaa gccagcaata ccctcgagtg gctcttcagc     780aaatcaaaca aagcaattga agagcttttc agaagcaagc atagtgataa taacaatagc     840actggtgctt gtgctgctga tggtgatggt gatggtgatg atgacagctt ctcctcttcc     900tcttcagaag atgaagttgt ttctgtgaaa agggcacaga aagaaaaaga accttctggt     960gttcaagcaa agatgaagga atcaagggaa aaagcaaggg caagagcaag ggaaaggact    1020agtaacaaga tgtgccctga aactgaaaat cctcaaatgc agcttcacca attcagttca    1080gagtttcagc ctcatcagga actgcataga gatgatgatt tcaaggtttt tgaggaatcc    1140attgtgatca agaggaagtt gaagcaatca ttgatgtctt cttctcatca tcaccagaac    1200caaaacattg ggatccctaa ggaagcaagt ttcaacaaca acaacaatag tgagtgtccc    1260tcttccttcc ctatgtctcc aaattgggat gctagtggtg ccactccacg ctcaaacatt    1320tgtgcaatag ccagcgtgaa tctctcaaca ggtgagcgtg tgtgtgtcag tgtgtgtgtt    1380tcatcaagaa gcagccaata acatgtttgg gtcaatataa tatctattag tacatcggag    1440tgaatttgaa acacataagt tactcacaga agcattttat attattatag aagaattatt    1500acattttgaa aaccattctg caattgattc caaagctaga atcaattcta gggaaaaacc    1560tatgtgagta gcttttaagt atcataattt gattttgagg ggagagaaat tgatctaaac    1620atgctatata ttaatcctaa aaaggatttc caaatatgac tgactttttc ttgaactctt    1680ttcttataga tgtttcatca aaatcattta tgaaatgtag atggtacttg aagaagtttc    1740tccccaaatt ctgaattcag aattattatt ccataattaa aaaaactttt gctattaatt    1800ctaaagtagt cagaaattca ggggagaagt taaaacttgg gtgttttcag aactaatgat    1860actggttatg aggaaagaga atttgatttt tgactttcct ttcttgcaat ctctattttg    1920atttttgtca tatatactta caattgtgaa gtcataattt ttagggcttc aaatctttgg    1980aaaatcttgg gaggagtgca ccagtcctca tctacactaa aatatgttag ttttcatcat    2040aatctatgat ctgagtgaag tctcaagtac tttgccaagg aattattaat catggaggca    2100tctttcaatt ctgtgacatt ttctctgtgc ccgatctttc tctttggacg atgtctgtac    2160ttatcttttt gctcatgatc aaccagggcc tgtgacagtt ggcaaaacaa tttaaaggat    2220gctagctgcg cgtattgttt atgaccaata tttaaagtgt ggctcatgtc atataaaggc    2280caactatgt                                                            2289<210>6<211>1708<212>DNA<213>百脉根(Lotus japonicus)<400>6ccttcttctt tcttcttctg tactgttgag tgctgggcgg tcctcctctc acaaaagtta      60gggctctttt gtcctctaca gttaaattaa aaaaaaaaag atcttcaaat gttccctttc     120agctcaagcc cttacccttc ctttccttca tcttcttctt ctcctttcca ccctttttct     180ttcctcaatc ctgaaaatgt ttcagcaagt aacaacaccc ttgttcttga tccactttct     240gttccctaca taccacaaac tcaccactac caccaccacc atcacaacaa ctctccagca     300ctcccagaaa cactaaccaa tttagcggtt gccggcagtc ctgataactg ttcggcaatg     360cctaaaccag atcctagtgg ccctcactat ggcatttcct gtctcctcac taagaaacca     420gctaagaaag accggcacag caagatttac acctctcagg ggctgaggga ccggagggtg     480aggctctcaa tcgagatcgc aagaaagttc tttgatcttc aagacatgct agggtttgat     540aaagccagca acaccctcga gtggctcttc aacaagtcca agagagccat caaggatctc     600gctcggagca agaacagcaa cagtggtggt ggtggtgacc atgacaacaa caagagcttc     660tcttccgaag aagatgaaga ctgtgaagtt gtctcatcaa acctacaaca agatcaagag     720caaaggttag attcaaacca taataaaggg ggtggtgctg aaaaagagct gttgaataag     780ttgaaaaggg cacagaagga accttcttgt gctcgtgcaa agataaagga atcaagggag     840aaagcaagag caatagcaag ggaaaggaca agtaacaaga tctgcaacaa caacaacaac     900accacgctga ataaaaagct ccctgctact gaaaactctc taatcttaca gcaaccaaag     960tctccaccaa ggatgcttca ccaccctcac cctcatcatc ttcatcacca ccttgtgggc    1020ggtgaggcgc caagagatga cttcaacgtt attgaggaat ccattgtgat caagagaaaa    1080ttgaagccat ggttgatgtc ttcttcttct catcatcatc atcaccaaca acaacaacac    1140cataatcttg tgatccctaa ggaagggagt ttcaacagca acagtgaata ccactccttc    1200cccaattcat ctccaaattg ggataacaac actagcaaca gtgccactag ccgctccaac    1260ttttgtacaa tagccagcat gaacctatca acaggtatgt gcttgtgtgt gtaagtctct    1320ctttcttgaa atttagctcg gatcggggtt ataaattgcg gctacagcaa actgaaattt    1380gatgcggttg caattgcggt cgcgatgtcg ctgagggaaa ttcaaaaccc ttttatgtgg    1440ccaccccaac tgcagttgtg gatcgcaatt tgaaaccctg gctaggatct tgatggaatt    1500tacagttcta caagttatga ttttttcagg gctccaaatc tttggaaagt cttgggagga    1560gtgcacaaat ccacgtccac actagtaaat aatgttggtg tgttttcagt atatcatctt    1620ctgatcttga aactcaatct agtgccttgc caagga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