透明质酸的交联酰胺衍生物及其生产方法

摘要

本发明涉及非水溶性的、透明质酸的交联酰胺衍生物及其生产方法。此处的透明质酸酰胺衍生物的特征为，是将具有两个或两个以上氨基的高聚物或低聚物与透明质酸或透明质酸盐通过酰胺化反应发生交联后得到的产物。本发明制得的这种非水溶性的、透明质酸的交联酰胺衍生物可广泛应用于防止外科手术后的组织粘连、面部皱纹的矫正、皮肤增长、组织工程及骨关节炎的粘性添加剂等方面。

说明书

技术领域

本发明涉及透明质酸的交联酰胺衍生物及其生产方法，特别是涉及一种非水溶性的透明质酸的交联酰胺衍生物，其特征为，所述衍生物是具有两个或两个以上氨基的高聚物或低聚物与透明质酸或透明质酸盐通过酰胺化反应发生交联后得到的产物。

背景技术

透明质酸(后文用缩写“HA”代替)是一种生物聚合物材料。它的重复单元包括N-乙酰基-D-葡糖胺和D-葡糖醛酸，且线性重复联接。这种聚合材料大量地存在于眼睛中的玻璃状液、滑液和结缔组织等中。本说明书中，术语“HA”意思是透明质酸和它的任何一种盐类。本发明所指的透明质酸盐包括，但不仅限于，无机盐，如透明质酸钠、透明质酸钾等等；和有机盐，如透明质酸四丁铵盐等。根据本发明，在透明质酸盐类中优选透明质酸钠。

HA的衍生物已经开发出很多用途，如防止外科手术后的组织粘连、面部皱纹的矫正、皮肤增长(dermal augmentation)、组织工程及骨关节炎的粘性添加剂(osteoarthritic viscosupplement)等方面。HA衍生物根据其水溶性可以大致地分为水溶性衍生物和非水溶性衍生物。对于非水溶性衍生物而言，其生产方法可以大致地分为两类：一是HA与单官能团的化合物反应，并以HA的线性链与该化合物结合；另一种是HA与双官能团或多官能团的化合物反应以形成交联的HA。

一些文献曾经报道过各种各样采用双官能团化合物，如二乙烯基砜、二环氧化物、二卤化物、甲醛等合成许多交联的、非水溶性的HA衍生物的例子。

美国专利4,582,865号曾经报道过选用二乙烯基砜来交联HA。美国专利4,713,448号中使用甲醛以完成交联反应。PCT专利公开号WO86/00912中也报道过使用具有环氧基的化合物交联各种具有羧基的多糖的例子。

有报道称，如果HA的羧基在水溶液状态下被EDC[1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸盐]活化，然后与含单个氨基的化合物反应形成酰胺键，则HA衍生物的水溶性将有所下降(见美国专利4,937,270号)。另一个例子中，HA被EDC活化后与各种多阴离子多糖发生交联反应(见美国专利5,017,229号)。

发明内容

本发明的目的是提供一种非水溶性的、HA的交联酰胺衍生物，所述衍生物的特征为是具有两个或两个以上氨基的高聚物或低聚物与HA通过酰胺化反应交联而得到的产物。

本发明的另一个目的是提供如上所述的非水溶性的、HA的交联酰胺衍生物的生产方法。

本发明涉及HA的交联酰胺衍生物及其生产方法。上述衍生物可以通过酰胺化反应由具有两个或两个以上氨基的、不同分子量的高聚物或低聚物与各种分子量的HA交联而获得。上述高聚物或低聚物优选多阳离子高聚物或低聚物。本发明制得的HA的交联酰胺衍生物具有良好的粘弹性，因此它们的用途非常广泛。本发明制得的HA的交联酰胺衍生物也可以具有类似海绵或橡胶那样的特性。

具体而言，本发明具有这样的特征：当具有两个或两个以上氨基的多阳离子高聚物或低聚物与具有羧酸酯基的HA反应时，上述多阳离子高聚物或低聚物与上述HA将因氨基和羧基之间的静电引力而彼此靠近，因此能得到更快的反应速率和更高的反应产率。因为具有两个或两个以上的氨基的多阳离子高聚物或低聚物与HA不形成离子键而只能通过酰胺化反应形成共价键，因此根据本发明得到的HA的交联酰胺衍生物是一种抗活体内各种生理条件，即高盐浓度、低pH值等的生物材料。而那些可能被称为是新生物材料的化合物具有不同于现有的使用EDC交联而得到的非水溶性的HA衍生物的性质。

根据本发明制得的非水溶性的、HA的交联酰胺衍生物具有如下的特征：该化合物不仅显示了高粘弹性，具有生物学上可接受材料的极好特性，更是一类克服了现有的非水溶性HA衍生物易于在活体中分解和易于在如酸性等苛刻的条件下溶解等缺点的新型生物材料。

本发明提供了非水溶性的、HA的交联酰胺衍生物，所述化合物由具有两个或两个以上氨基的多阳离子高聚物或低聚物与HA通过酰胺化反应彼此交联得到。具有两个或两个以上氨基的高聚物或低聚物的意思是每个高聚物或低聚物分子具有两个或两个以上氨基。在优选的情况下，本发明提供了非水溶性的、HA的交联酰胺衍生物，其特征为，所述高聚物或低聚物具有可接受质子的氨基，以便其在酸性或中性条件下具有正电荷；并且上述具有氨基的高聚物或低聚物与HA的羧基在羧基活性剂存在的条件下发生酰胺化反应，以产生本发明的非水溶性的、HA的交联酰胺衍生物，所述酰胺化反应由高聚物或低聚物的氨基与HA的羧基之间的静电引力的诱导而发生。在优选的情况下，本发明提供了非水溶性的、HA的交联酰胺衍生物，其特征为，反应混合物中HA的羧基与多阳离子高聚物或低聚物的氨基的比率为从1∶0.01到100。在更优选的情况下，本发明提供了非水溶性的、HA的交联酰胺衍生物，其特征为，具有两个或两个以上氨基的高聚物或低聚物与具有羧基的HA在羧基活性剂存在下发生酰胺化反应以产生本发明的非水溶性的、HA的交联酰胺衍生物。在更优选的情况下，本发明提供了非水溶性的、HA的交联酰胺衍生物，其特征为，所述酰胺化反应在酸性或中性条件下发生；所述高聚物或低聚物是通过对其氨基质子化而带正电荷的多阳离子高聚物或低聚物，因此多阳离子高聚物或低聚物的氨基与HA的羧基通过该两个基团之间的静电引力的促进而发生酰胺化反应。

本发明也提供了非水溶性的、HA的交联酰胺衍生物的生产方法，其特征为，该方法包括将具有两个或两个以上氨基的高聚物或低聚物与HA反应的步骤。在更优选的情况下，本发明提供了非水溶性的、HA的交联酰胺衍生物的生产方法，其特征为，所述高聚物或低聚物具有可接受质子的氨基，以便其在酸性或中性条件具有正电荷，而使高聚物或低聚物的氨基与HA的羧基发生反应。在更优选的情况下，本发明提供了非水溶性的、HA的交联酰胺衍生物的生产方法，其特征为，反应混合物中HA的羧基与高聚物或低聚物的氨基的比率为从1∶0.01到100。在更优选的情况下，本发明提供了非水溶性的、HA的交联酰胺衍生物的生产方法，其特征为，所述酰胺化反应在酸性或中性条件下发生；所述高聚物或低聚物是通过对其氨基质子化而带正电荷的多阳离子高聚物或低聚物，由此高聚物或低聚物的氨基与HA的羧基发生反应。

上述具有两个或两个以上氨基的高聚物或低聚物的例子有具有两个或两个以上氨基的天然材料、使用这些天然材料合成的合成材料及这些高聚物或低聚物的衍生物。上述高聚物的分子量优选从约3,000到10,000,000，而上述低聚物的分子量优选从约300到3,000。

在更优选的情况下，本发明提供了非水溶性的、HA的交联酰胺衍生物的生产方法，其特征为，该方法包括了以下步骤：将HA的水溶液与具有两个或两个以上氨基的高聚物或低聚物的水溶液混合以诱导HA与高聚物或低聚物之间的静电引力；使现有的、彼此接近的两个官能团，即HA的羧基与高聚物或低聚物的氨基发生反应以生成非水溶性的生物材料；用水或酸溶液等洗涤反应产物；分离精制材料并干燥所得的材料。

本发明的生产方法具有简易反应、简单的分离工序和不需要使用有毒的有机溶剂的特征。

加入酰胺化反应中用于活化羧基的羧基活性剂的例子有碳化二亚胺类化合物。优选的碳化二亚胺选自易溶于水的化合物，如EDC[1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸盐]、与EDC具有相似结构的1-烷基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺类、ETC(1-乙基-3-(3-(三甲基氨溶)丙基)碳化二亚胺)和CMC(1-环己基-3-(2-吗啉代乙基)碳化二亚胺)。

更优选地，上述酰胺化反应可视需要选择性地加入助剂。可溶于水、能形成活性酯的材料均可作为上述酰胺化反应的助剂。助剂的例子可选自：NHS(N-羟基丁二酰亚胺)、HOBt(1-羟基苯并三唑)，HOOBt(3，4-二氢-3-羟基-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪)、HOAt(1-羟基-7-氮杂苯并三唑)及Sulfo-NHS(N-羟基磺基丁二酰亚胺)等。

与不使用助剂相比，使用助剂如NHS，可以减少副产物如N-酰基脲的生成，而两种情况下所得到的HA的交联酰胺衍生物的材料特性并无显著差异。

为了活化羧基基团，本发明优选的例子中EDC的添加量为0.0001到100mg/ml，NHS的添加量为0到100mg/ml。

根据本发明，优选用于HA的交联酰胺衍生物及其生产方法的HA的分子量在10,000至10,000,000的范围内；HA的浓度可以为0.01至100mg/ml。

根据本发明，具有两个或两个以上氨基的高聚物或低聚物的例子可选自壳聚糖、壳聚糖衍生物、脱酰基的HA、脱酰基的HA衍生物、具有两个或两个以上可反应和可接受质子的氨基的聚乙二醇或蛋白质或多肽等化合物。

根据本发明，优选用于HA的交联酰胺衍生物及其生产方法的、具有两个或两个以上氨基的高聚物或低聚物是能在pH值为2至8的水溶液中实质溶解的那些化合物。

根据本发明，优选用于酰胺化反应的溶剂可以是水、缓冲水溶液等，但不仅限于这些。根据本发明，优选酰胺化反应的温度为0至40℃，更优选地，可以为室温。根据本发明，优选酰胺化反应的pH值可以为2至8，更优选地，可以为4到6。根据本发明，优选酰胺化反应的时间为0.5到20小时，更优选地，为2小时。

本发明的非水溶性的、HA的交联酰胺衍生物可被制成凝胶状、膜状、小球状和网状等。

对于本说明书中的每一个反应，其产物可以根据公知技术中通常的方法从该反应体系中分离和/或精制。分离和/或精制的示例可以从以下操作方法里选取：常压或真空蒸馏、重结晶、柱色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法、亲和色谱法、薄层色谱法、相分离、溶剂萃取和洗涤等。精制操作可以在每一步或一系列反应之后进行。

根据本发明，用于酰胺衍生物合成所需的试剂和起始反应物材料可以很容易地根据已知文献所公开的方法或以上提及的方法来制备或从世界各地的许多生产商那里购买。

附图说明

图1为实施例3表2中样品A的红外图谱。

图2为实施例3表2中样品B的红外图谱。

图3为实施例3表2中样品C的红外图谱。

图4为实施例3表2中样品D的红外图谱。

图5为有关透明质酸衍生物与壳聚糖发生交联反应的结构和合成步骤的图解表达式。

具体实施方式

通过下文给出的实施例和仅用于说明的附图和图表，本发明将得到更完整的理解，但这些并非是对本发明的限定性说明。

实施例1：与壳聚糖交联的HA酰胺衍生物的制备

制备1.25mg/ml的透明质酸钠水溶液(分子量≥2,000,000)和0.625mg/ml的壳聚糖-盐酸水溶液。将以上的透明质酸钠水溶液不断搅拌，同时在该水溶液中加入以上的壳聚糖-盐酸水溶液。在壳聚糖-盐酸水溶液加完后，壳聚糖-透明质酸盐沉淀下来。两种溶液混合完毕后溶液的pH值为4至5。根据表1所示的浓度，缓慢地向上述混合溶液中加入EDC和NHS并不断搅拌。加完反应物后，反应在25℃下进行2小时。

表1

    样品             EDC              NHS  浓度[mg/ml] [EDC]/[HA中 的COOH]  浓度[mg/ml]   [NHS]/[HA中   的COOH]    A  0 0  0   0    B  0.2 1/3  0.24   2/3    C  0.4 2/3  0.48   4/3    D  0.6 1  0.72   2    E  1.2 2  1.44   4

表1中未加入EDC和NHS的样品，即壳聚糖和透明质酸以离子键的形式结合并沉淀的样品，可以在高盐浓度或低pH值的条件下溶于水。向上述混合溶液中缓慢地加入1N的盐酸水溶液直至该样品(表1中A组样品)完全溶解。对于100ml的上述混合溶液，这次加料需要约30分钟的时间和约3ml的1N的盐酸水溶液才能完全溶解样品。其余样品(添加过EDC和NHS，表1中B、C、D和E组样品)在同样条件下得到处理，并且未反应的壳聚糖和HA将简单地以离子键结合、沉淀，并从通过酰胺化反应得到的HA与壳聚糖交联的酰胺衍生物里除去。将上述酸处理后仍未溶解的剩余部分用水充分地冲洗以使之完全除去未反应的EDC或NHS和这些物质的副产物。冲洗后再将这些剩余部分置于真空下，于25℃干燥。非水溶性的、HA与壳聚糖交联的酰胺衍生物能够通过以上步骤得到。反应中EDC和NHS的添加量越大，则最终产物的产量也越高。以下的产物百分率即为从各组样品中得到的HA与壳聚糖交联的酰胺衍生物的产率：B组为49％；C组为58％；D组为71％；E组为77％。

实施例2：与壳聚糖交联的HA酰胺衍生物的制备

制备1.25mg/ml的透明质酸钠水溶液(分子量≤2,000,000)和0.625mg/ml的壳聚糖-盐酸水溶液。通过上述两种材料之间的反应得到非水溶性的、HA与壳聚糖交联的酰胺衍生物，再按实施例1所描述的步骤精制产物。如同实施例1所描述的，反应中EDC和NHS的添加量越大，则最终产物的产量也越高。以下的产物百分率即为从各组样品中得到的HA与壳聚糖交联的酰胺衍生物的产率：B-1组为53％；C-1组为62％；D-1组为69％；E-1组为77％。

实施例3：与壳聚糖交联的HA酰胺衍生物的耐酸性和抗高盐度的测试及形成酰胺的确定

制备1.25mg/ml的透明质酸钠水溶液和0.625mg/ml的壳聚糖-盐酸水溶液。将以上的透明质酸钠水溶液不断搅拌，同时在该水溶液中加入以上的壳聚糖-盐酸水溶液。在壳聚糖-盐酸水溶液加完后，壳聚糖-透明质酸盐沉淀下来。两种溶液混合完毕后溶液的pH值为4至5。根据下面表2所示的浓度，缓慢地向上述混合溶液中加入EDC和NHS并不断搅拌。加完反应物后，反应在25℃下进行2小时。

假如上述产物不用酸处理而直接用水冲洗几次后真空干燥精制，则由离子键连接的壳聚糖-HA络合沉淀物仍然混合存在于最终产物中。如果在反应物中加入EDC和NHS，经过实施例1中所描述的酸处理和精制工序得到最终产物(表2样品A、B和C)；而若在反应物中未加入EDC和NHS，经过精制工序但不用酸处理，则得到由离子键连接的壳聚糖-HA络合沉淀物(表2样品D)。两者真空干燥后，分别分散于0.1N的盐酸水溶液中，并使每个样品浓度均为0.02％(重量体积比)，再测定各样品完全溶解所需的时间，结果列于表2。

表2

    样品   EDC[mg/ml]    NHS[mg/ml]  完全溶解所需的时间    A   1.2    1.44  大于120小时    B   0.6    0.72  大于120小时    C   0.2    0.24  80小时    D   0    0  小于1小时

为了观察表2样品在1N的盐酸水溶液中的行为，将每个样品分散于1N的盐酸水溶液使之浓度为1％(重量体积比)，再将每个样品溶液搅拌24小时，之后观察现象并记录结果于表3。

表3

  样品将各样品[1％(重量/体积)]置于1N盐酸水溶液中24小时后的状态  A仍有不透明小颗粒未溶解，但分散于整个溶液  B已形成溶液且不透明凝胶和透明凝胶共存于溶液  C一般已形成透明溶液，但仍可观察到纤细颗粒  D固体完全溶解，并已形成透明溶液

为了检测表2所列样品耐高盐浓度的性能，将表2中的样品加入1N的氯化钠水溶液中并不断搅拌该溶液最终达到1％(重量百分比)的浓度。只有样品D的沉淀物在30分钟后完全溶解且形成透明溶液，其余样品均保持各自的形态达10天以上。这个结果意味着样品A、B和C并没有通过离子键形成络合物，而是通过壳聚糖和HA之间的共价键交联在一起。

样品A至D按实施例3所描述的程序制备和精制，再用真空干燥后，测其红外光谱图谱，列于图1至4。样品中一部分HA与已接受质子的壳聚糖上的氨基形成盐，其羧基上的羰基伸缩振动造成了图上1728.6cm^-1左右的峰，图谱显示，该峰随交联反应的进行而相对衰减(参考图1至4)。图上1557.5cm^-1的峰由壳聚糖上已接受质子的伯胺的变形所引起，图谱显示，该峰随交联反应的进行而相对衰减，直至样品A的图谱时仅为一个肩峰(参考图1至4)。这个结果表明形成离子键(盐形式)的氨基和羧基的量均随它们之间反应的进行而减少。这与图上酰胺的羰基伸缩振动峰1600.6cm^-1随交联反应的进行而相对增大的事实是相符合的(参考图1至4)。因为众所周知，随着交联反应的进行，样品中氢键数目将会增多，从而使得酰胺上羰基的伸缩振动峰移往更低的波数，因此图谱上该峰(1600.6cm^-1)所在的波数低于普通酰胺峰的位置(大约1660cm^-1，J.Bioactive & Compatible Polymers，9，429-447(1994))的事实是与根据本发明的材料如耐酸性和耐高盐度性能测试所示已经交联的事实相吻合的。这些数据证实，根据本发明，HA的这些衍生物已经通过酰胺形式交联在一起。图谱中并未观察到可能在副反应中生成的酯(1745至1760cm^-1)和羧酸酸酐(1800cm^-1)的形成(Silverstein等，Spectrometric Identification ofOrganic Compounds，122至124页，John Wiley and Sons，纽约(1981))。图谱中也未观察到在使用EDC时可能带来的副产物N-酰基脲(1700cm^-1)的形成(见美国专利号5,527,893)。

总结以上图谱的分析结果和以上耐酸性、耐高盐度性能测试结果，图5概略地显示了HA与壳聚糖交联的酰胺衍生物的结构和它的合成步骤。

实施例4：用脱酰基的HA制备HA的交联酰胺衍生物

如果将HA溶液在高或低pH值条件下升高温度，其将伴随着链分解发生脱酰基化以至于形成一个真正的活性胺。该胺可以遵循如实施例1或2中的壳聚糖一样的化学原理与羧酸基团形成酰胺键。

为了脱去HA上的酰基，将HA与0.2至10N的氢氧化钠水溶液在25至50℃下反应1至30小时。用盐酸中和来终止反应，透析该溶液后，再将它冷冻干燥即可得到脱酰基的HA。用Roth’s荧光测定法(见Anal.Chem.，1971，43，880至882页；J.Chromatogr.，1973，83，353至356页；Clin.Chem.Clin.Biochem.，1976，14，361至364页)测定生成的氨基的量后，即可确定脱酰度，并作为反应结果。脱酰度可以用以下的公式进行计算。

脱酰度＝[生成的胺的浓度]/[HA重复单元的浓度]×100％

根据HA每个重复单元只有一个羧基的假定，通过测定HA中羧基的量可得到HA的重复单元的浓度。羧基定量分析可以采用咔唑法(Anal.Biochem.，1962，4，330)。

作为上述反应结果，脱酰度为1至40％。将上述方法得到的脱酰基的HA进行酰胺化反应。在脱酰基的HA(10mg/ml)中加入EDC(2.4mg/ml)和NHS(2.9mg/ml)，反应在25℃下持续2小时，再将形成的衍生物精制和真空干燥。形成的非水溶性凝胶产率为51％。作为以上形成的非水溶性的、HA的交联酰胺衍生物的耐酸性和耐高盐度性能的测试结果，上述HA酰胺衍生物在0.1N的盐酸水溶液中能保持它的不溶解状态达48小时以上，在1N的氯化钠水溶液中可以长达10天以上保持它的不溶解状态。此处的测试方法和上述实施例3相同。

实施例5：用脱酰基的HA制备HA的交联酰胺衍生物

在脱酰基的HA中，有很多像壳聚糖中一样的、能与羧基发生反应的氨基。因此可得到采用这些氨基并像实施例1中所描述的非水溶性的、HA酰胺衍生物。将脱酰基的HA的水溶液与透明质酸钠(分子量≥2,000,000)的水溶液混合后得到浓度均为0.5mg/ml的混合溶液，向混合溶液内加入EDC(0.2mg/ml)与NHS(0.24mg/ml)并在25℃下反应2小时。然后将产物精制和干燥。结果形成的非水溶性凝胶的产率为56％。作为以上形成的非水溶性的、HA的交联酰胺衍生物的耐酸性和耐高盐度性能的测试结果，上述HA酰胺衍生物在0.1N盐酸水溶液中能保持它的不溶解状态达48小时以上，在1N的氯化钠水溶液中可以长达10天以上保持它的不溶解状态。此处的测试方法和上述实施例3相同。

实施例6：生产与壳聚糖交联的HA酰胺衍生物制成的膜

制备1.25mg/ml的透明质酸钠水溶液(分子量≥2,000,000)和0.625mg/ml的壳聚糖-盐酸水溶液。将上述透明质酸钠水溶液灌注到玻璃板上，再将EDC和NHS像表1中的B、C、D和E组一样按不同浓度加入上述透明质酸钠水溶液。等它们混合均匀后，将上述壳聚糖-盐酸水溶液加至板上以于板上生成白色薄膜。通过干燥上述白色薄膜可得到由与壳聚糖交联的HA的酰胺衍生物制成的膜。以下的产物百分率即为从各组样品中得到的与壳聚糖的HA交联酰胺衍生物的产率：B-2组为51％；C-2组为63％；D-2组为70％；E-2组为79％。

为了检测如实施例3中所描述的耐高盐度性能，在1N氯化钠水溶液中加入上述得到的由与壳聚糖交联的HA酰胺衍生物制成的膜并不断搅拌，得到1％(重量体积比)浓度的溶液，性能测试结果表明，该膜可保持形态长达十天以上。

实施例7：生产由与壳聚糖交联的HA酰胺衍生物制成的膜

制备1.25mg/ml的透明质酸钠水溶液(分子量≤2,000,000)和0.625mg/ml的壳聚糖-盐酸水溶液。将上述透明质酸钠水溶液灌注到玻璃板上，再将EDC和NHS像表1中的B、C、D和E组一样按不同浓度加入到上述透明质酸钠水溶液。等它们混合均匀后，将上述壳聚糖-盐酸水溶液加至板上以于板上生成白色薄膜。通过干燥上述白色薄膜可得到由与壳聚糖交联的HA酰胺衍生物制成的膜。以下的产物百分率即为从各组样品中得到的与壳聚糖交联的HA酰胺衍生物的产率：B-3组为47％；C-3组为61％；D-3组为70％；E-3组为78％。

为了检测如实施例三中所描述的耐高盐度性能，在1N氯化钠水溶液中加入上述得到的由与壳聚糖交联的HA酰胺衍生物制成的膜并不断搅拌，得到1％(重量体积比)浓度的溶液，性能测试结果表明，该膜可保持形态长达十天以上。

实施例8：生产由与壳聚糖交联的HA酰胺衍生物制成的珠

把根据上述实施例1得到的已干燥的HA酰胺衍生物磨成细粉末，然后均匀分散至水或生理盐水等溶剂中，即可得到HA酰胺衍生物溶液，所述溶液可用于注射器挤出制备珠状与壳聚糖交联的HA酰胺衍生物。

实施例9：生产由与壳聚糖交联的HA酰胺衍生物制成的珠

把根据上述实施例2得到的已干燥的HA酰胺衍生物磨成细粉末，然后均匀分散至水或生理盐水等溶剂中，即可得到HA酰胺衍生物溶液，所述溶液可用于注射器挤出制备珠状与壳聚糖交联的HA酰胺衍生物。

实施例10：制备由与壳聚糖交联的HA酰胺衍生物制成的水合凝胶

制备1.25mg/ml的透明质酸钠水溶液(分子量≤2,000,000)和0.625mg/ml的壳聚糖-盐酸水溶液。将以上的透明质酸钠水溶液不断搅拌，同时在该水溶液中加入以上的壳聚糖-盐酸水溶液。在上述混合溶液中加入EDC(0.2至1.2mg/ml)和NHS(0.24至1.44mg/ml)，再在25℃下反应2小时并精制和真空干燥以上产物。干燥后，即得到HA酰胺衍生物(200至700mg)。称量好上述干燥的产物后，将定量的HA酰胺衍生物浸入水中48小时，然后取出并擦去其外部的水，可通过测定其增重来确定单位重量的HA酰胺衍生物中所含的水分。使用流变仪可测定此含水凝胶的流变性质。由此得到以下的测量值作为测试结果。

[水的质量]/[HA衍生物的质量]＝1.5至3.0

频率0.01至0.1赫兹之间的储能模量＝50至300千帕

频率0.01至0.1赫兹之间的损耗模量＝8至50千帕

这些模量值与橡胶的模量值范围较为相似。这个结果与本发明所制得的材料实质上交联的事实是相符合的，因此也表明，这种材料可以用作皮肤增长的移植物。为本领域技术人员所公知的是，高储能模量意味着高弹性，而高损耗模量则意味着高粘度。可用上述方法制备具有高粘弹性的HA酰胺衍生物的水合凝胶形式。

实施例11：制备由与壳聚糖交联的HA酰胺衍生物制成的水合凝胶

制备1.25mg/ml的透明质酸钠水溶液(分子量≥2,000,000)和0.625mg/ml的壳聚糖-盐酸水溶液。将以上的透明质酸钠水溶液不断搅拌，同时在该水溶液中加入以上的壳聚糖-盐酸水溶液。在上述混合溶液中加入EDC(0.2至1.2mg/ml)和NHS(0.24至1.44mg/ml)，再在25℃下反应2小时并精制和真空干燥以上产物。干燥后，即得到HA酰胺衍生物(200至700mg)。称量好上述干燥的产物后，将定量的HA酰胺衍生物浸入水中48小时以产生水合凝胶形式的HA酰胺衍生物。擦去上述以水合凝胶形式存在的HA酰胺衍生物外部的水。为确定单位重量的HA酰胺衍生物中所含的水分，可测定其增重。使用流变仪可测定此含水凝胶的流变性质。由此得到以下的测量值作为测试结果。

[水的质量]/[HA衍生物的质量]＝1.2至3.0

频率0.01至0.1赫兹之间的储能模量＝60至330千帕

频率0.01至0.1赫兹之间的损耗模量＝10至50千帕

可用上述方法制备具有高粘弹性的HA酰胺衍生物的水合凝胶形式。

实施例12：根据HA和壳聚糖的分子量及浓度与EDC和NHS的浓度来制备具有不同材料特性的交联酰胺衍生物

通过结合以下不同的参数，可制备具有不同材料特性的HA的交联酰胺衍生物。

透明质酸钠的分子量：低于300,000；300,000至3,000,000；高于3,000,000。

HA浓度(mg/ml)：0.02、0.1、1.0、10和80。

以其溶液的粘度值描述的壳聚糖的分子量(使用Brookfield粘度计测定溶于1％乙酸溶液、浓度为1％的壳聚糖溶液的粘度)：低分子量(20至200周每秒)；中等分子量(200至800周每秒)；高分子量(800至2000周每秒)。

壳聚糖浓度(mg/ml)：0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10、20、40和80。

EDC浓度(mg/ml)：0.00096、0.0048、0.0096、0.024、0.048、0.24、0.48、2.4、3.84、4.8、19.2、38.4和76.8。

NHS浓度(mg/ml)：0、0.000576、0.001 152、0.001728、0.00288、0.00576、0.00864、0.01152、0.0144、0.01728、0.0288、0.0432、0.0576、0.0864、0.144、0.288、0.432、0.576、0.864、1.44、2.304、2.88、4.32、4.608、5.76、6.912、8.64、11.52、23.04、34.56、46.08、69.12和92.16。

HA酰胺衍生物的水合凝胶形式可以像实施例10中所描述的那样利用得到的与壳聚糖交联的HA酰胺衍生物制得。使用流变仪可得到以下的测量值以作为对这种水合凝胶流变性质的测定结果。

[水的质量]/[HA衍生物的质量]＝1.0至5.0

频率0.01至0.1赫兹之间的储能模量＝20至410千帕

频率0.01至0.1赫兹之间的损耗模量＝2至60千帕

工业实用性

因为由本发明而制得的非水溶性的、HA的交联酰胺衍生物具有优异的粘弹性，因此它在许多方面具有应用价值。根据本发明，这种非水溶性的、HA的交联酰胺衍生物可广泛应用于防止外科手术后的组织粘连、面部皱纹的矫正、皮肤增长、组织工程及骨关节炎的粘性添加剂等等。

具体而言，本发明具有这样的特征：当具有两个或两个以上氨基的多阳离子高聚物或低聚物和上述HA反应时，两者因为氨基和羧基之间的静电引力而彼此靠近，因而能得到更快的反应速率和更高的反应产率。因为具有两个或两个以上氨基的多阳离子高聚物或低聚物和HA之间并非形成离子键而是通过酰胺化反应形成共价键，因此本发明的HA的交联酰胺衍生物是抗活体内生理条件，即高盐浓度、低pH值等条件的生物材料。而那些可以被称为新生物材料的化合物具有不同于现有的使用EDC交联而得到的非水溶性的HA衍生物的性质。根据本发明制得的非水溶性的、HA的交联酰胺衍生物具有如下的特征：该衍生物不仅显示出高粘弹性，具有生物学上可接受材料的极好特性，更是一类克服了现有的非水溶性HA衍生物易于在活体中分解和易于在如酸性等苛刻的条件下溶解等缺点的新型生物材料。

更特别的是，本发明提供了生产非水溶性的、HA的交联酰胺衍生物的方法，其特征为，该方法包括：混合HA水溶液与具有两个或两个以上氨基的高聚物或低聚物的水溶液以诱导HA和高聚物或低聚物之间的静电引力；使现有的两个互相接近的官能团发生反应，即HA上的羧酸盐和高聚物或低聚物上的氨基反应生成非水溶性的生物材料；用水和酸等溶剂冲洗；分离精制材料；和干燥产物。本发明所提供的生产方法具有简易反应、简便的分离操作和不需要使用毒性有机溶剂等特征。

鉴于上文已经用重点突出的具体实施例详细解释了本发明，显然，对本领域的技术人员来说，它们不同的变化和修改可能属于本发明的范畴和本发明的技术原理范围内。因此，这些变化和修改属于附加的专利权利要求范围也是相当合理的。